专利名称：水稻不定根控制基因arlr1及其应用的制作方法
水稻不定根控制基因ARLR1及其应用技术领域
本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种反向遗传学途径克隆的水稻ARLRl (Adventitious rootlessl recoveryl)基因，以及转基因回复及RNAi技术实验鉴定该基因；还涉及利用该基因物调控水稻不定根发生能力从而调节水稻的根系结构提高农作物的产量。
背景技术：
根系是植物锚定和从土壤中吸收水分和养分的重要器官。植物根系主要可分为直根系和须根系。须根系植物根系由种子根、不定根以及侧根组成，不定根是须根系植物根系最重要的组成部分。水稻是全球主要的粮食作物之一，也是须根系植物的模式植物。
不定根为胚后发育的器官，在水稻的茎节位产生。正常情况下，水稻的各个节位都有不定根原基发生，但一般只在基部节位的不定根原基才能发育并突破表皮形成不定根。
水稻不定根原基起始于根茎结合部邻近维管束的中柱鞘最内层的分生细胞。根据 Itoh等(2005)的报道，水稻不定根的发生发育过程可以分为以下7个阶段不定根原基起始细胞形成；不定根原基起始细胞变大形成表皮-内皮层起始细胞、中央维管束起始细胞及根冠起始细胞；表皮-内皮层起始细胞分化生成表皮和内皮层；内皮层细胞分化产生皮层细胞；产生根冠柱，不定根的基本结构建成；中柱基部细胞开始伸长，皮层细胞开始空泡化；不定根原基最后突破茎表皮成为成熟的不定根。
分子水平的研究远不及组织形态学的研究，到目前为止，虽然有几个基因报道影响不定根的发生发育，但相关信息还比较比较零碎。CRL1/ARL1和CRL4/GN0M1的突变都在不定根原基起始阶段产生缺陷，这两个突变体分别与生长素的信号和转运相关(Inukai et al. , 2005; Liu et al. , 2005; Kitomi et al. , 2008; Liu et al. , 2009)。另外内源生长素IAA3增强表达及IAA23的功能获得性突变体也影响不定根发生(Nakamura et al.， 2006; Ni et al. , 2011)。WOXll和CRL5的突变导致不定根原基大量减少，这两个突变体参与生长素和细胞分裂素信号，并且在不定根发育过程中分别调控RR2和RRl基因的表达 (Zhao et al. , 2009)。
所涉及的参考文献具体如下
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本发明要解决的技术问题是提供一种水稻不定根控制基因ARLRl及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻不定根控制基因ARLRl编码的蛋白质，为SEQ ID NO :2所不的氣基酸序列。
本发明还同时提供了编码上述蛋白质的基因，该基因的核苷酸序列与SEQ ID NO I所示的序列一致。
本发明还同时提供了上述基因及在其核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的等位基因和衍生物在构建转基因植物中的用途。
本发明还同时提供了一种转基因植物细胞，包含上述基因及在其核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的等位基因和衍生物。
本发明还同时提供了一种对水稻植株进行不定根发生能力改造(调节不定根的数目)的方法包括用上述基因转化水稻细胞，将转化的水稻细胞培育成植株。
本发明的目的是提供 一种从水稻中克隆的新基因ARLR1,如SEQ ID NO 1所示的 DNA序列，也包括与SEQ ID NO 1所示的DNA序列至少有70%同源性的基因序列。本发明中的SEQ ID N02所示的蛋白质属于AGC激酶基因家族，其中进行一个或几个替换，插入或缺失所获得的功能类似物。另外，也包括在SEQ ID NO 1中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本发明的目的。
本发明的另一个目的是提供一种用ARLRl基因进行高效的植物转化的方法，具体地说，本发明提供了具有SEQ ID N01所示序列的基因或基因部分片段的载体，该载体可以表达有上述核苷酸序列编码的多肽或其同源类似物。
本发明还提供了一种利用植物表达载体转化植物细胞影响水稻不定根发生能力的方法。
发明人通过候选差异表达基因筛选到ARLl的下游候选基因ARLR1。ARLRl属于 AGC激酶基因家族，在动物中AGC激酶家族基因参与生长、代谢、细胞分裂、增殖以及凋亡 (Pearce et al.，2010)。在植物中AGC家族成员参与子叶发育、向光性、向地性及抗病性等(Briggs and Christie, 2002; Bogre et al. , 2003; Rentel et al. , 2004; Matsui et al. , 2010; Hirt et al.，2011)。拟南中与ARLRl最同源的基因功能尚不明确，但同源性比较高的基因有PH0T1，2参与向光性反应及气孔开放(Briggs and Christie, 2002)。
本发明是首次发现AGC家族基因ARLRl具有控制水稻不定根发育的功能，且ARLRl 是ARLl的下游基因。由于不定根的正常发生发育对维持须根系植物生长发育以及高产稳产是必不可少的，因此在分子育种中存在较大的应用潜力。
下面结合附图对理解本发明作进一步的详细描述，但并非对发明作限定。
图1是RT-PCR鉴定ARLRl的表达模式图。
A，ARLRl在野生型(WT)，aril突变体及ARLl增强表达材料(ARLlOV)中的表达。 B，ARLRl在根、茎基部及叶片中的表达模式。
图2是在aril突变体中表达ARLRl部分恢复不定根生长图。
A、20天水培苗根茎结合部图，Bar=Icm; B,野生型、aril突变体及ARLRl转基因苗茎基部横切图；C，dCAPS标记确证转基因苗是aril背景的。D，利用RT-PCR技术检测 ARLRl的表达水平，ACTINl作为内参。E、利用定量RT-PCR技术检测转基因苗ARLRl的表达。F，不同水培时间野生型、aril突变体、ARLRl转基因苗的(aril背景)不定根数统计。
图3是降低ARLRl的表达量(RNAi )减少不定根数目图。
A, 25天野生型及RNAi转基因株系苗(Ri)根茎结合部；B，RNAi苗中ARLRl的表达；C，水培20、30天苗不定根数统计结果，**表明在野生型和RNAi株系间存在极显著差异 P〈0.01 (T-test, N=15)。
图4是超表达及RNAi转化载体PCAMBIA1300改的结构示意图。
具体实施方式
实现本发明的具体技术步骤如下
一、ARLRl的克隆、鉴定
通过RT-PCR筛选在野生型`、aril突变体、ARLl增强表达材料间有表达差异的候选基因，我们获得了一个在ARLl增强表达材料里表达上调而在突变体中表达下调的基因(图 1A)。定量RT - PCR分析表明该基因在茎基部表达量最高，而在叶中表达较弱(图1B)。
二、增强表达ARLRl基因能部分回复aril突变体不定根缺失的表型
我们构建了增强表达载体，通过转基因在aril突变体中增强表达ARLRl基因，发现转基因苗能部分回复不定根缺失的表型(图2A，2F)，切片分析表明转了 ARLRl的转基因苗不定根原基发生得到恢复(图2B)。dCAPS分析证明了转基因苗是aril突变体背景的，而定量RT - PCR及半定量RT - PCR分析表明转基因株系中ARLRl得到增强表达(图2D，2E)。 表明ARLRl参与不定根的发生。
三、抑制ARLRl基因在水稻中的表达减少不定根数目。
我们构建了 RNAi载体，通过转化野生型水稻获得一系列RNAi转基因苗，定量 RT - PCR结果表明RNAi转基因苗中ARLRl基因的表达得到一定程度的抑制。而对这些 RNAi的不定根数目统计结果表明不定根数目减少了约30% (图3)，表明我们获得了不定根数目减少的转基因水稻，不定根数目与ARLRl基因的表达量相关，证明降低ARLRl基因表达能够调节不定根的数目(图3)。
上述结果表明，我们克隆的水稻ARLRl基因具有一定的应用价值，可以通过利用该基因对作物根系结构进行转基因改造。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。
实施例1、ARLRl基因克隆、鉴定
利用基因芯片分析了野生型(WT，石狞白茅可购自中国水稻研究所的种子库)、 aril突变体(由本实验室筛选)及ARLl增强表达材料(ARLlOV)(由本实验室创制)的基因表达差异，发现其中ARLRl这个基因在ARLl增强表达材料中表达上调而在突变体中下调(图1)，利用定量RT-PCR(qRT-PCR)也验证了这一结果(图1)。qRT_PCR实验应用Roche 公司的 Real Time PCR 专用试剂 LightCycler 480 SYBR Green I Master, PCR 反应在 LightCycIer 480 (Roche, USA)定量PCR仪上进行。我 们通过PCR方法克隆了该基因，测序分析表明该基因编码区序列如SEQ ID N0:1所示为1368bp(包含终止密码子)，编码一个包含455个氨基酸的蛋白如SEQ ID NO :2。
备注说明野生型(WT)为石狩白茅,突变体aril (adventitious rootless I)为石狞白茅背景下筛选出来的ARLl基因突变的突变体；ARL1增强表达材料(ARLlOV)为ARLl 基因增强表达的转基因材料，ARLlOV的载体见(Liu et.，2005)。
实施例2、水稻转基因
农杆菌(EHA105)介导的水稻遗传转化体系主要应用Hiei等人(1994)报道的方法基础上进行优化。具体过程如下
水稻成熟胚愈伤组织的准备
水稻(石狞白茅，SSBM)成熟种子脱壳后，挑选饱满光洁无菌斑的种子放入烧杯中， 用70% (体积比浓度)酒精消毒2min ；
倒去酒精，加入25% (v/v) NaClO溶液消毒30min ；
倒去NaClO溶液，用无菌水清洗5遍，最后I遍在无菌水中浸泡30min ；
倒去无菌水，将种子放在无菌滤纸上吸干，种子平放于籼稻成熟胚诱导培养基中， 28°C暗培养10天；
在超净工作台上打开培养皿，用镊子将芽和胚乳去掉，留下胚性愈伤组织(淡黄色，致密不规则)，移入籼稻继代培养基中，28°C暗培养5-10天。
农杆菌的培养
挑取农杆菌单克隆或吸取所保农杆菌菌液ΙΟΟμΙ于5ml YEP (含50mg/L Kan和 50mg/L Str)培养液中，28°C，250rpm振荡培养12-36h至菌液0D600饱和；
从上述饱和的菌液中吸取500μ1于30ml YEP (含50mg/L Kan和50mg/L Str)培养液中，28°C，250rpm 振荡培养 12_16h 至菌液 0D600=0. 8-1. 5。
共培养及抗性愈伤的筛选
取培养好的菌液15ml于50ml离心管中，4°C, 4000rmp,离心IOmin,去上清；
用含200Mmol/L As的30ml AAM感菌液制成悬浮液，使菌液0D600的终浓度为O.4-0. 7 ；
将长到一定大小(约l_2mm)的水稻愈伤组织挑出，切割成粒状，放入农杆菌悬浮液，振荡培养30min ；
将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上浙干30min ；
然后将愈伤组织置于放有一层滤纸的共培养基上；
25°C暗培养2. 5天后，将愈伤组织取出，用无菌水清洗5-6次，其间需不停的振荡；
再用含250mg/L羧苄青霉素钠的无菌水清洗1-2遍；
最后置于无菌滤纸上浙干2小时；
将晾干的愈伤转入含250mg/L羧苄青霉素钠和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，280C，暗培养14天；
将长大的初始愈伤转到含250mg/L羧苄青霉素钠和50mg/L潮霉素选择培养基上进行第二轮选择，280C，暗培养14天，此时抗性愈伤组织长出。
抗性愈伤的分化及成苗
挑取从同一愈伤来的抗性愈伤2-3颗置于分化培养基上，25°C光照培养(16h/8h 光周期，光强为20001x)；
分化培养30天左右愈伤组织会分化出小苗，当小苗长至3_5cm左右，转入生根培养基中，25°C光照培养(16h/8h光周期，光强为20001x)。
转基因苗的锻炼和移栽
生根14天后，将苗根部和茎叶分化得较完好的试管挑出，打开封口膜，加入适量蒸馏水或无菌水，在培养室炼苗2-3天；
洗去琼脂，转入水稻营养液中培养2周，所得苗为Ttl代转基因苗，将获得的转基因阳性苗移入大田或盆栽，收种。
转基因阳性苗的鉴定
T0代阳性转基因苗的筛选
T0代转基因苗在正常条件下(温度白天30°C，晚上22°C ;湿度>60% ;光照度3万 LUX,白天晚上时间分别为12小时)溶液培养一周之后，取Icm长的叶片提取基因组DNAjlJ 用抗性筛选标记基因对转基因苗进行鉴定，筛选成功的转化株系。
基因组DNA的提取(TPS法)
1.取2 cm叶片置于2 ml离心管中，加入200 μ TPS抽提液(100 mM Tris-HCl (pH 8. 0),10 mM EDTA (pH 8· O)，I M KCl )，加入一枚钢珠，盖紧离心管盖，在组织捣碎仪 TissueLyser II (QIAGEN, U. S. Α)震荡1. 5 min。
2.将捣碎的组织匀浆转移至新的1. 5 ml离心管中，70 °C温浴30 min。
3. 12000 rpm离心10 min,取上清于另一新的1. 5 ml离心管中。
4.加等体积异丙醇,上下颠倒混勻之后，12000 rpm离心10 min,弃上清。
5.加 900 μ 70% 乙醇洗漆沉淀，12000 rpm 离心 5 min。
6.弃去乙醇，晾干DNA，之后用30 μ ddH20溶解。
潮霉素抗性基因检测
潮霉素抗性基因引物序列为
上游引物5，TTTCTTTGCCCTCGGACGAGTGCT3，
下游引物5’ATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGAC 3’ ；
PCR体系为=DNA 100 ng、上游引物O. 2MM、下游引物O. 2μΜ、IOX PCR buffer μ 、 dNTP O. 2mM、TAQ DNA 聚合酶 IU (宝生公司)、加 ddH20 到 10μ1。
PCR条件是94 V变性5 min，然后进入循环反应94 V 30s, 60 V 30s, 72 V lmin，循环数为28，最后延伸5min结束。取2 μ I PCR产物在O. 8%琼脂糖凝胶上电泳检测， 然后用Gel Doc XR+ (BIO-RAD, USA)成像系统记录实验结果。
当检测结果为有扩增产物时，认定·该Ttl代转基因苗为潮霉素阳性转基因苗，相反则为潮霉素阴性苗。
实施例3、在aril突变体增强表达ARLRl基因
增强表达载体P35S: :ARLR的构建
通过PCR扩增方法克隆了 ARLR全长cDNA序列(SEQ ID NO :1所示)，引物序列如下，上下游引物末端分别加上KpnI和XbaI的识别位点(下划线标记)。
上游引物5,AAAAGGTACCATGCAGCAGCAGCAGCAG 3'
下游引物5'ACGATCTAGATCAGAACTCCGGCAAGAACTCCGT 3'
PCR反应中所用模板为7天苗龄SSBM野生型的cDNA，所用聚合酶为PrimeSTAR HS DNA Polymerase (宝生公司)。
PCR体系为=DNA 100 ng、上游引物O. 2MM、下游引物O. 2μΜ、IOX PCR buffer 2μ1、 dNTP O. 2mM、TAQ DNA 聚合酶 IU (宝生公司)、加 ddH20 到 20μ1。
PCR 反应程序为98 O 变性 30 sec ；98 °C 10 sec,60 °C 7sec,72 °C 90sec, 30cycles ;72°C延伸10 min结束。通过1. 0%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，割胶回收目的条带，连接pEASY-Blunt Simple Cloning Vector (宝生公司)测序载体。提取质粒酶切鉴定之后，对阳性质粒上的ARLR基因区域进行测序，将无突变的质粒命名为ARLRCDS-T。 用KpnI/Xbal双酶切ARLRCDS-T质粒，电泳分离并割胶回收目的片段，连入经实验室改造的 PCAMBIA1300改载体中(图4)(Jia et al. 2011)。通过酶切鉴定，获得阳性载体P35s: :ARLR。 通过实施例2所说的农杆菌介导法将ARLR增强表达载体P35S: :ARLR转化aril突变体。获得一系列转基因苗，通过潮霉素抗性基因检测、RT-PCR表明转基因苗ARLRl得到增强表达 (图 2D，2E)。
备注说明pCAMBIA1300改载体的改造方法如下为在pCAMBIA1300载体的EcoRI 及XmaI两个酶切位点间接入一个35S启动子，在PstI及HindIII两个酶切位点间接入一个 NOS 终止子，见(Jia et al. 2011)。
阳性转基因苗的RT-PCR鉴定如下
选取10个潮霉素阳性株系和一个潮霉素阴性对照株系提取RNA，做反转录，用 RT-PCR方法检测ARLR的相对表达量。具体过程如下
RNA提取采用天根公司的植物RNA提取试剂盒提取总RNA，实验分7步1.将研钵研杵于180°C烘烤2小时以除去RNase备用；2.取50_100mg植物样品速冻于液氮之中； 3.在冷冻状态下将样品充分研磨粉碎；4.加入提取液使细胞充分裂解；5.过滤除去组织碎片；6.纯化层析柱中的RNA (去蛋白、去DNA、脱盐)；7.RNaSe-free H20洗脱获取RNA。具体操作过程参照试剂盒附带说明书。
cDNA的合成采用Invitrogen公司的superscript II RT试剂盒完成，反转录体系中总RNA的用量为3 μ g，具体过程参照试剂盒附带说明书。
用定量和半定量RT-PCR方法对阳性转化株系做鉴定，定量RT-PCR分析与实例I 中qRT-PCR所述方法完全一致。半定量RT-PCR鉴定时，首先通过内参基因OsActinl (水稻肌动蛋白)将各样品的cDNA浓度调到基本一致，再以调好浓度的样品为模板做PCR，扩增 ARLR基因的一段大小为234bp的序列。PCR产物在1. 2%(m/v)的琼脂糖凝胶上电泳分离， 然后用Gel Doc XR+ (BIO-RAD，USA)成像系统记录实验结果。半定量RT-PCR鉴定所用引物如下表1:其中0sActin385F及0sActin385R用于内参基因OsAcinl扩增，而ARLR-RT-F2 及ARLR-RT-R2则用于ARLRl的扩增。结果ARLRl相比arlI突变体表达量高2部以上的株系为增强表达转基因株系。
表I
权利要求
1.水稻不定根控制基因ARLRl编码的蛋白质，其特征是为SEQID NO 2所示的氨基酸序列。
2.一种编码如权利要求1所述蛋白质的基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列与SEQID NO 1所示的序列一致。
3.权利要求2所述的基因及在其核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的等位基因和衍生物在构建转基因植物中的用途。
4.一种转基因植物细胞，其特征在于包含权利要求2所述的基因及在其核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的等位基因和衍生物。
5.一种对水稻植株进行不定根发生能力改造的方法，其特征是包括用权利要求2所述的基因转化水稻细胞，将转化的水稻细胞培育成植株。
全文摘要
本发明公开了一种水稻不定根控制基因ARLR1编码的蛋白质，为SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本发明还同时公开了编码上述蛋白质的基因，该基因的核苷酸序列与SEQ ID NO1所示的序列一致。本发明还同时公开了一种对水稻植株进行不定根发生能力改造的方法，包括用上述基因转化水稻细胞，将转化的水稻细胞培育成植株。本发明是首次发现AGC家族基因ARLR1具有控制水稻不定根发育的功能，且ARLR1是ARL1的下游基因。由于不定根的正常发生发育对维持须根系植物生长发育以及高产稳产是必不可少的，因此在分子育种中存在较大的应用潜力。
文档编号C12N9/12GK103045555SQ201210527558
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月5日 优先权日2012年12月5日
发明者毛传澡, 吴平, 刘绍军, 任美燕, 马孝霞, 吴运荣 申请人:浙江大学