伤， W使基质表面的"桐"或磨损更明显，然而在灌注脱细胞化的器官中，所述囊是完整的。
[0097] 图7显示了脱细胞化的肾脏的沈M照片。图7A显示了灌注脱细胞化的肾脏，而图 7B显示了浸入脱细胞化的肾脏。图8A显示了灌注脱细胞化的屯、脏的沈M照化而图8B显 示了浸入脱细胞化的屯、脏的沈M照片。运些图像进一步显示了浸入脱细胞化引起的器官超 微结构的损伤W及灌注脱细胞化之后基质的活力。
[0098]连施俩I2
[0099] 用于本发巧的方法的示例忡颗粒
[0100] 用于本发明的方法的颗粒包括纳米颗粒或微粒，例如纳米球或微球，其可由多种 不同的生物相容性材料形成，所述生物相容性材料为例如可降解的或不可降解的合成材 料、生物（天然）材料或修饰的生物材料。可形成纳米颗粒或微粒的材料的实例包括，但不 限于：藻酸盐、多糖、胶原、右旋糖酢、透明质酸、玻璃、陶瓷、金属（包括铁）、具有铁忍的颗 粒、PLA、PGA、PLA/PGA、单分散S聚氯胺树脂颗粒、聚苯乙締、尼龙、PMMA等。W举例方式而 非限制的方式，合适的聚合材料可包括下述聚合物：聚氧化物（polyoxides)，如聚（环氧乙 烧）和聚（环氧丙烷）；聚醋，如聚（对苯二甲酸乙二醋）；聚氨醋；聚横酸盐；聚硅氧烷，如 聚（二甲基硅氧烷）；聚硫化物；聚乙烘；聚讽；聚横酷胺；聚酷胺，如聚己内酷胺和聚（己 二酷己二胺）；聚酷亚胺；聚脈；杂环聚合物，如聚乙締化晚和聚乙締化咯烧酬；天然存在的 聚合物，如天然橡胶、明胶、纤维素；聚碳酸醋；聚酸酢；W及聚締控，如聚乙締、聚丙締和乙 締-丙締共聚物。聚合材料还可包含功能基团如簇化物、醋、胺、醒、醇或面化物，W提供例 如用于连接化学或生物部分的位点，所述化学或生物部分期望增强化学或生物分析物中的 颗粒效用。
[0101] 由聚合物制备纳米颗粒或微粒的方法在本领域是众所周知的。例如，可将蛋白与 非蛋白聚合物组合W形成复合纳米球或微球。在一个实施方案中，颗粒是生物溶蚀性的合 成或天然聚合物。本文使用的术语"生物溶蚀性的"或"生物可降解的"指酶、热、电、离子 强度、pH、机械或化学降解的或者离解成更简单的化学物质的材料。天然聚合物的实例为 多糖。体内降解为无害产物的合成聚合物包括聚（乳酸）（PLA)、聚（乙醇酸）（PGA)W及 PLA和PGA的共聚物、聚原酸醋、聚酸酢、聚憐腊、聚己酸内醋、聚径基下酸醋、它们的混合物 W及共聚物。PLA、PGA和PLA/PGA共聚物尤其适用于形成谷醇溶蛋白复合微球。通常由乳 酸的环醋来制备PLA聚合物。L(+)和D(-)型乳酸W及D(-)和L(+)乳酸混合物的非旋光 性Dk乳酸混合物均可用于制备PLA聚合物。在专利文献中清楚地记录了制备聚乳酸的方 法。下述美国专利详细描述了合适的聚乳酸、它们的特性及制备，在此将该专利的教导W引 用的方式并入：Dorou曲的 1，995, 970;Schneider的 2, 703, 316;Salzberg的 2, 758, 987 ; Zeile的 2, 951，828;Higgins的 2, 676, 945 ;W及 2, 683, 136 ;3, 531，561-Trehu。溫敏性聚 合物包括但不限于：聚（N-异丙基丙締酷胺）、径丙基纤维素、聚（乙締基己内酷胺）、聚乙 締甲基酸（p〇lyvin}dmeth}dether)、聚乙締甲基酸（polyvin}dme1:h5dethe;r)W及聚径乙 基甲基丙締酸甲醋。
[0102] 在一个实施方案中，颗粒由可被酶（如淀粉酶）容易降解的多糖形成。运将允许 在移植之前快速移除颗粒。
[0103] 颗粒的直径可与红血细胞的直径类似，W使单一颗粒通过毛细血管床。颗粒可W 为，例如约0.Olym至约30Jim、约0. 5Jim至约20Jim或者约5Jim至约10Jim。
[0104] 颗粒可W为适合穿过脉管系统的任何形状，包括但不限于：球体、楠圆形、盘状、炸 面圈形或者星形，颗粒具有凹陷或凸起的表面，并且可W具有光滑至不光滑的表面。
[0105] 颗粒可W具有或者被修饰为具有下述特性，包括但不限于：亲水表面W确保容易 通过；表面在压力下进行收缩的能力，如水凝胶或蛋白包衣；通过降解、机械（如磁聚集） 或能量能够从基质移除，W使其分解成可从基质中被成功排出的更小块。
[0106] 为了确保形成的毛细血管具有足够的直径，W使移植之后红血细胞不被截留，可 在内皮细胞接种时或者在细胞接种后约12至96小时或高达数周添加颗粒。例如，为了增 加在另外的脱细胞化的移植物或者用除内皮细胞之外的细胞再细胞化的移植物中的再内 皮化的血管的直径，可通过下述方法迫使毛细血管开放：开始用小颗粒尺寸，然后随小时/ 天缓慢增加颗粒尺寸，直至期望的尺寸能够经基质灌注。
[0107] 在一个实施方案中，颗粒由通过溫度变化可容易降解或离解的溫敏性聚合物形 成。运将允许在移植前快速移除颗粒。
[0108] 在一个实施方案中，颗粒由磁性聚合物形成，并且在循环溶液中添加磁源使得在 移植之前能够移除循环颗粒。
[0109] 在一个实施方案中，在移植之前将颗粒从再内皮化的组织或器官中移除。对于生 物可降解颗粒，将添加特定试剂或条件W将颗粒降解、溶解或消化，然后洗涂。颗粒的移除 可发生在移植前数周/天，或就在移植之前发生。
[0110] 红血细胞的正常浓度为约3百万至约5百万/iiL。由于脉管系统占全部组织 或器官空隙体积的约10%，颗粒的浓度可W为每yL组织或器官灌注（或空隙）体积约 300-500, 000 或高达 5000 万。
[0111] 为了确定颗粒在维持毛细血管腔直径、增加毛细血管腔直径或降低毛细血管腔直 径的减小方面的功效，测定生理压力下将颗粒灌注通过再内皮化的基质之后，回收的颗粒 的百分数。例如，用于所述方法的颗粒为那些，例如在灌注通过组织或器官之后，具有近似 血细胞直径的尺寸或者具有约5至8ym的平均直径的颗粒中有巧0 %、60 %、70 %或更多颗 粒被回收，或者在生理压力下能够灌注通过组织或器官的血液，有巧〇%、60%、70%返回。 在非再细胞化的器官、组织或其部分中，大部分颗粒巧至8ym)驻留于间隙中，并且不显示 明显返回。在未经颗粒处理的再内皮化的器官、组织或其部分中，大部分颗粒（例如约Sym 至约8ym的那些颗粒）驻留于脉管系统中，并且不通过毛细血管床。
[0112] 将所有出版物、专利和专利申请W引用的方式并入本文。虽然在前述说明书中，本 发明所述设及其某些优选实施方案，且为了示例说明的目的阐述了许多细节，但是本发明 易受另外的实施方案的影响且在不脱离本发明的基本原则的情况下，本文的某些细节可能 会发生大的改变，运对本领域那些技术人员是显而易见的。
【主权项】
1. 在具有完整血管床的哺乳动物器官、组织或其部分的再内皮化的细胞外基质中维持 毛细血管腔直径、降低毛细血管腔直径的减小或增加毛细血管腔直径的方法，其包括： 提供具有完整血管床的哺乳动物器官、组织或其部分的脱细胞化的细胞外基质，以及 内皮细胞群体或能够分化成内皮细胞的干细胞或祖细胞群体；以及 向所述脱细胞化的细胞外基质引入一定量的所述细胞以及含有一定量的生物相容性 微粒的第一水性溶液，其中所述细胞的量能有效地将所述脱细胞化的细胞外基质的脉管系 统的再内皮化，并且其中在再内皮化期间或在其之后，相对于相应的缺少所述微粒的再内 皮化的脱细胞化的细胞外基质，当所述微粒通过所述脉管系统循环时，所述微粒的量维持 所述脉管系统内的毛细血管腔直径、降低所述脉管系统内的毛细血管腔直径的减小或增加 所述脉管系统内的毛细血管腔直径。2. 如权利要求1所述的方法，其中所述微粒维持通过所述毛细血管床的流动。3. 如权利要求1或2所述的方法，其中所述微粒是生物可降解的。4. 如权利要求1或2所述的方法，其中所述微粒不是生物可降解的。5. 如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述微粒是球形或椭圆形。6. 如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述微粒是可变形的。7. 如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述微粒由聚合物形成。8. 如权利要求7所述的方法，其中所述聚合物是天然存在的聚合物。9. 如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述微粒包括藻酸盐、多糖、胶原、右 旋糖酐、透明质酸、玻璃、陶瓷、金属、聚乳酸（PLA)、聚谷氨酸（PGA)或PLA和PGA的共聚物 (PLA/PGA)〇10. 如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述聚合物是非天然存在的聚合物。11. 如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述微粒经过修饰而包含羧化物、 酯、胺、醛、醇或卤化物。12. 如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述微粒由蛋白聚合物和非蛋白聚 合物形成。13. 如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述微粒的平均直径为约0. 5ym至 约 20ym。14. 如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述微粒包含亲水表面。15. 如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述微粒是磁性的。16. 如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述微粒包含能与配体结合的表面 修饰。17. 如权利要求1或6所述的方法，其中所述微粒包含水凝胶。18. 如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中在再内皮化之后添加所述溶液。19. 如权利要求1至18中任一项所述的方法，其进一步包括引入含有生物相容性微粒 的第二水性溶液，所述微粒的平均直径比所述第一溶液中微粒的平均直径大至少10%。20. 如权利要求19中任一项所述的方法，其进一步包括引入含有生物相容性微粒的第 三水性溶液，所述微粒的平均直径比所述第二溶液中微粒的平均直径大至少10%。21. 如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中每yL的所述第一溶液包含约300 至约500, 000个微粒。22. 如权利要求1至20中任一项所述的方法，其进一步包括用不含所述微粒的溶液洗 涤所述脉管系统。23. 如权利要求22所述的方法，其中所述不含纳米颗粒或微粒的溶液包含能降解所述 微粒的试剂。24. 如权利要求22所述的方法，其中将所述不含纳米颗粒或微粒的溶液与能降解或移 除所述微粒的外在因素同时应用，所述外在因素包括温度、PH、超声、光或电能。25. 如权利要求1至7、10至11、13至16或18至24中任一项所述的方法，其中所述微 粒包含聚苯乙烯。26. 如权利要求1至8、10至11、13至16或18至24中任一项所述的方法，其中所述微 粒包含多糖。27. 如权利要求25或26所述的方法，其中所述微粒的平均直径为约5至约20微米。28. 如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述器官为心脏、胰腺、骨、肝脏、肾 脏或肺。29. 如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述细胞从iPS细胞获得。30. 如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中通过注射或灌注或它们的组合将所 述群体引入所述基质。31. 如权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述群体包含原代细胞。32. 如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述群体包含多种不同的细胞类型。33. 如权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述群体包含人胚胎干细胞。34. 如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述灌注脱细胞化的器 官或组织是同种异体的。35. 如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述灌注脱细胞化的器 官或组织是异种的。
【专利摘要】本发明提供在具有完整的细胞外基质血管网络的再内皮化的脱细胞化的器官或组织移植物中维持毛细血管腔直径、降低毛细血管腔直径的减小或增加毛细血管腔直径的方法。所述方法基于向脱细胞化的ECM施用内皮细胞和微粒。
【IPC分类】C12N5/00, C12N5/07, A61L27/38, A61L27/36
【公开号】CN105188786
【申请号】CN201480024707
【发明人】杰弗里·罗斯, 多米尼克·西塔潘
【申请人】米罗马特里克斯医疗公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2014年3月13日
【公告号】CA2907144A1, EP2968672A1, US20160030637, WO2014168719A1, WO2014168719A8