用于制备微粒脱细胞组织的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及用于制备可W合适地用于再生治疗、细胞培养等的微粒脱细胞组织的 方法。
【背景技术】
[0002] 当从其他的生物组织移植移植物时，接受移植物的主体的组织的排斥成为问题。 为了解决此问题，预期开发假体。已经尝试各种大分子作为材料。然而，由于此材料和生物 组织之间的相容性低，移植物可W从接合部位掉出或可能发生传染病。因此，为了改善与 生物组织的相容性，已经开发技术W使用脱细胞生物组织，其是作为移植物的在从生物组 织去除细胞之后保留的支持组织。对于生物组织的脱细胞，已知的方法是使用表面活性剂 (例如参考专利参考文献1和2)，使用酶（例如参考专利参考文献3)，使用酸化剂（例如参 考专利参考文献4)，用超高流体静力压处理（例如参考专利参考文献5至7)等。
[0003] 粒状或粉状形式的脱细胞组织（微粒脱细胞组织）也是已知的。微粒脱细胞组织 已经用于通过其向患病部位（affectedsites)注射而促进患病部位的再生和治愈，或模塑 用作移植物（例如参考专利参考文献8至10)。迄今已知的微粒脱细胞组织已经通过使用 表面活性剂来制备。然而，通过用超高流体静力压处理制备的微粒脱细胞组织是未知的。
[0004] 专利参考义献1:日本专利公开号60-501540 专利参考专献2:日本专利公开号2003-518981 专利参考专献3:日本专利公开号2002-507907 专利参考专献4:日本专利公开号2003-525062 专利参考专献5:日本专利公开号2004-094552 专利参考专献6:W0 2008/1。530 专利参考专献7:日本专利公开号2013-502275专利参考专献8:日本专利公开号07-509638 专利参考专献9:日本专利公开号2002-518319 专利参考专献10:日本专利公开号2012-505013。
[0005] 发明公开内容 (本发明待解决的技术问题） 迄今已知的微粒脱细胞组织不引起移植物排斥，且可用于患病部位的再生和治愈。然 而，存在其不显示足够有效的组织再生和当用作用于细胞培养的材料时显示细胞毒性的问 题。
[0006] (用于解决问题的方式） 本发明人已经认真研究W解决上述问题，且作为结果，已经发现，通过在介质中应用高 流体静力压而脱细胞的微粒动物组织显示细胞吸引的效果和诱导细胞分化的效果，但在细 胞培养的同时不显示细胞毒性，从而完成了本发明。因此，本发明设及用于制备微粒脱细胞 组织的方法，其包括将高流体静力压应用于介质中的动物来源的组织的步骤。
[0007] 具体地，本发明包括W下发明。
[0008] [1]用于制备微粒脱细胞组织的方法，其包括将高流体静力压应用于介质中的动 物来源的组织的步骤。
[0009] [2]根据[1]的用于制备微粒脱细胞组织的方法，其中所述高流体静力压为2至 1, 500MPaO
[0010] 閒根据山或凹的用于制备微粒脱细胞组织的方法，其中在粉碎动物来源的组 织之后应用所述高流体静力压。
[0011] W根据山或凹的用于制备微粒脱细胞组织的方法，其中粉碎通过将高流体静 力压应用于介质中的所述动物来源的组织而获得的动物来源的脱细胞组织。
[001引 閒根据山至M中任一项的用于制备微粒脱细胞组织的方法，其中用不包含阴 离子表面活性剂和/或非离子表面活性剂的洗涂液洗涂通过将高流体静力压应用于介质 中的所述动物来源的组织而获得的动物来源的脱细胞组织。
[001引 [6]微粒脱细胞组织，其通过根据山至閒中任一项的用于制备微粒脱细胞组织 的方法制备。
[0014] [7]使用根据[6]的微粒脱细胞组织的用于移植或治疗的材料。
[001引 閒使用根据[6]的微粒脱细胞组织的用于细胞培养的材料。
[001引发明效果 根据本发明的方法，获得微粒脱细胞组织，其不显示细胞毒性，但显示细胞吸引的效果 和诱导细胞分化的效果，且显示组织再生的高效果。由于其微粒形式，通过本发明的方法获 得的微粒脱细胞组织，不限于其可应用的部位，而是可W应用于各种部位。
[0017] 附图简述 图1显示不添加NGF的实施例2中的神经突增生测试的结果。
[001引图2显示不添加NGF的实施例3中的神经突增生测试的结果。
[0019] 图3显示不添加NGF的空白的神经突增生测试的结果。
[0020] 图4显示添加NGF的空白的神经突增生测试的结果。
[0021] 图5显示实施例1中的皮下填补法测试中在第28天的皮下囊袋（左图）和染色 的大鼠组织的切片（右图）。
[0022] 图6显示实施例1中的冻伤模型测试中的测试前外观（左上图）、测试后外观（右 上图）和染色的大鼠组织的切片（下图）。
[0023] 图7显示冻伤模型测试中的空白的测试前外观（左上图）、测试后外观（右上图） 和染色的大鼠组织的切片（下图）。
[0024] 实施本发明的最佳方式 下面详细解释本发明。
[00巧]牛物紀织 本发明的用于制备微粒脱细胞组织的方法中使用的生物组织没有特别限制，只要它们 包含来自脊椎动物的细胞，但鉴于低排斥优选地是来自哺乳动物或禽类的那些，且鉴于可 用性更优选地是来自哺乳动物的家畜或禽类的家畜或人的那些。哺乳动物的家畜包括牛、 马、骆驼、美洲驼、驴、巧牛、绵羊、猪、山羊、鹿、羊驼、狗、狸、關鼠、狐狸、猫、兔、仓鼠、豚鼠、 大鼠、小鼠、松鼠、綻熊等。禽类的家畜包括长尾婴鸟醋、婴鸟醋、鸡、鸭、火鸡、碟、珍珠鸡、锥、驼 鸟、鹤譜等。其中，鉴于稳定的可用性，来自猪、兔和人的生物组织是优选的。
[0026]由其获得生物组织的身体部位可W是具有细胞外基质结构的那些，包括肝、肾、输 尿管、膀脫、尿道、舌、扁桃体、食管、胃、小肠、大肠、肛口、膜腺、屯、脏、血管、脾、肺、脑、骨、脊 髓、软骨、睾丸、子宫、输卵管、卵巢、胎盘、角膜、骨骼肌、肌腫、神经、皮肤等。鉴于其高组织 再生，由其获得生物组织的身体部位优选地是软骨、骨、肝、肾、屯、脏、肺、脑和脊髓。去除之 后，优选处理生物组织，用于防止腐败或功能降低，包括用化学品杀菌处理，通过冷藏冷冻 处理等，鉴于对组织的低伤害，优选冷冻处理。
[0027] 粉巧巧骤 在本发明的用于制备微粒脱细胞组织的方法中，可W在从去除生物组织、将高流体静 力压应用于生物组织、洗涂和去除破坏的细胞至获得微粒脱细胞组织的任何阶段将生物组 织（或脱细胞组织）粉碎成微粒。然而，它们可W优选至少在洗涂和去除细胞之前粉碎，因 为微粒形式的破坏的细胞可W比其在形状得到维持的生物组织中更容易地洗涂和去除。
[0028] 用于粉碎生物组织的方法包括，但不限于，当生物组织在常溫时粉碎生物组织，冷 藏生物组织和在冷冻条件下将其粉碎，等。然而，在常溫下难W粉碎的生物组织诸如软组织 (例如，肾）的情况下，它们优选在冷冻条件下进行粉碎。在冷冻条件下粉碎的情况下，由 于组织有时由于在约〇°C的冰晶生长而受损，粉碎溫度优选为-80°c至-5°c，更优选-50°c 至-l〇°C，最优选-40°C至-15°C。由于优选在冷冻条件下保存生物组织，因此在冷冻条件下 保存的生物组织的粉碎将简化该步骤，且允许用高流体静力压处理微粒生物组织。
[0029] 生物组织也可W在干燥之后粉碎，其中粉碎之后的分类是更容易的。生物组织的 干燥方法包括用加热干燥、减压下干燥、冻干、用有机溶剂脱水等，优选冻干和用有机溶剂 脱水，鉴于细胞和核酸的