杯中。向杯子中添加20g作为 洗涂液的盐水，且在25°C振荡5小时。将洗涂液替换为新的洗涂液，且将杯子再振荡2小时 W得到实施例1的微粒脱细胞组织。
[0046]连施俩I2 重复实施例1的程序，除了将猪肝替换为猪脑W得到实施例2的微粒脱细胞组织。
[0047]连施俩I3 重复实施例1的程序，除了将猪肝替换为猪脊髓W得到实施例3的微粒脱细胞组织。
[0048]比巧俩I1 向灭菌杯中添加5g如实施例1中粉碎的猪肝的细粒和作为脱细胞溶液的15g包含 0. 5%十二烷基硫酸钢的Hanks平衡盐溶液。将杯子在25°C储存5小时。然后，去除脱细 胞溶液，且向杯子中添加20g作为洗涂液的不包含表面活性剂的Hanks平衡盐溶液，且在 25°C振荡5小时。将洗涂液替换为新的洗涂液，且将杯子再振荡2小时W得到比较例1的 微粒脱细胞组织。
[0049]比巧俩I2 重复比较例1的程序，除了将猪肝替换为猪脑W得到比较例2的微粒脱细胞组织。
[0050]比巧俩I3 重复比较例I的程序，除了将猪肝替换为猪脊髓W得到比较例3的微粒脱细胞组织。 [00引]细胸巧務测试 L929细胞（小鼠成纤维细胞）在37°C用MEM培养基培养24小时W进行饥饿。向24 孔板培养皿中添加1HiL含有5 %粉末状脱细胞组织的MEM培养基，且在各孔中设置细胞培 养插入物（孔径8ym)。将在MEM培养基中培养的L929细胞接种至插入物（1.0X1〇5个 细胞/孔），且在37°C培养1至3小时，且测量迁移至插入物下的孔的细胞的数目。细胞数 目的测量在DAPI染色之后用巧光显微镜实施，且计算5个孔的平均数目。包括不使用粉末 状脱细胞组织的空白。结果显示于表1中。
[0052]表 1
[0053] 在细胞迁移测试中，本发明的粉末状脱细胞组织显示高细胞迁移，表明本发明的 粉末状脱细胞组织具有细胞吸引的效果。在比较例1中，在部分细胞中观察到细胞死亡。
[0054] 神经突蜡牛测试 将PC12细胞（来自大鼠肾上腺髓质的嗜铭细胞瘤）接种至具有含有10 %马血清和5 % 胎牛血清（FB巧的RPMI培养基的胶原包被的24孔板培养皿（1.0XIO4个细胞/孔），且 在37°C培养24小时。将培养基更换为含有0. 1 %马血清的RPMI培养基，且在各孔中设置 细胞培养插入物（孔径8ym)。向插入物中添加200yL含有5%脱细胞粉末的盐水，且 在添加和不添加50ng神经生长因子的情况下继续培养24小时。用相差显微镜观察细胞 W根据W下标准来估计神经突增生的效果。结果显示于表2中。
[00巧]◎:明显观察到神经突增生的效果。
[0056] O:部分观察到神经突增生的效果。
[0057] A:没有观察到神经突增生的效果。
[0058] X:在部分或所有细胞中观察到细胞死亡。
[0059] 表 2
[0060] 在神经突增生测试中，本发明的粉末状脱细胞组织明显显示神经突增生的效果， 甚至在没有NGF的情况下，表明本发明的粉末状脱细胞组织具有诱导细胞分化的效果。在 比较例中，观察到细胞死亡，表明比较例的粉末状脱细胞组织具有细胞毒性。
[0061] 巧下填补法（enthesis)测试 将大鼠（Wistar大鼠，雄性，8至12周）麻醉，在背上剌毛，且剌光部分用聚维酬舰溶液 消毒。用剪刀将大鼠的背部切开约1. 5cmW生成皮下囊袋，向其中嵌入约20mg脱细胞的 粉末。用缝合线缝合切开部分，且用聚维酬舰溶液再次消毒缝合部分。二十八天后，收集大 鼠皮下囊袋且用苏木精/伊红染料染色用于组织学估计。包括在不嵌入脱细胞粉末的情况 下进行缝合的空白。结果显示于表3中。
[006引O:没有观察到炎症反应，且证实细胞吸引。
[0063] A:没有观察到炎症反应，但细胞吸引是不清楚的。
[0064] X:观察到炎症反应，且没有证实细胞吸引。
[00巧]冻伤横巧测试 将大鼠（Wistar大鼠，雄性，8至12周）麻醉，在背上剌毛，且剌光部分用聚维酬舰溶液 消毒。在大鼠的背部，生成中皮层（mid-dermallayer)(直径15mm)的缺陷，且向其按压 用液氮冷却的金属体60秒W生成冻伤伤口。向伤口应用实施例1或比较例2的脱细胞粉 末，用粘合膏覆盖伤口区域，且用纱布覆盖大鼠的躯干的整个周长。屯天后，收集伤口区域 且用苏木精/伊红染料染色用于组织学估计。包括在不应用脱细胞粉末的情况下用粘合膏 覆盖伤口区域的空白。结果显示于表3中。
[0066] ◎:观察到组织再生，且没有观察到李缩。
[0067] O:观察到组织再生，但在一定程度上观察到李缩。
[006引A:观察到组织再生，但明显观察到李缩。
[0069] X:观察到患病部分的恶化。
[0070] 表 3
[0071] 皮下填补法测试和冻伤模型测试掲示，本发明的粉末状脱细胞组织对于再生和愈 合是高度有效的。
[0072] 产业实用性 本发明的微粒脱细胞组织具有较低细胞毒性，且具有促进细胞分化的效果和细胞吸引 的效果。因此，本发明的微粒脱细胞组织可W合适地用作疾病的治疗材料、组织移植的辅助 材料、用于再生治疗的支架材料、用于细胞培养的基础材料等。当本发明的微粒脱细胞组织 用作疾病的治疗材料、组织移植的辅助材料或用于再生治疗的支架材料时，其可W原样或 将其加工成凝胶、片材、=维结构等之后应用于患病部分。或者，本发明的微粒脱细胞组织 可W用于细胞培养，然后应用于患病部分。
【主权项】
1. 用于制备微粒脱细胞组织的方法，其包括将高流体静力压应用于介质中的动物来源 的组织的步骤。2. 根据权利要求1的用于制备微粒脱细胞组织的方法，其中所述高流体静力压为2至 1，500MPa。3. 根据权利要求1或2的用于制备微粒脱细胞组织的方法，其中在粉碎动物来源的组 织之后应用所述高流体静力压。4. 根据权利要求1或2的用于制备微粒脱细胞组织的方法，其中粉碎通过将高流体静 力压应用于介质中的所述动物来源的组织而获得的动物来源的脱细胞组织。5. 根据权利要求1至4中任一项的用于制备微粒脱细胞组织的方法，其中用不包含阴 离子表面活性剂和/或非离子表面活性剂的洗涤液洗涤通过将高流体静力压应用于介质 中的所述动物来源的组织而获得的动物来源的脱细胞组织。6. 微粒脱细胞组织，其通过根据权利要求1至5中任一项的用于制备微粒脱细胞组织 的方法制备。7. 使用根据权利要求6的微粒脱细胞组织的用于移植或治疗的材料。8. 使用根据权利要求6的微粒脱细胞组织的用于细胞培养的材料。
【专利摘要】提供了微粒脱细胞组织，其具有足够的组织再生效果且当用作细胞培养材料时不显示细胞毒性。通过用于产生微粒脱细胞组织的方法获得了微粒脱细胞组织，所述微粒脱细胞组织不显示细胞毒性，具有细胞诱导效果和分化诱导效果且还具有高组织再生效果，所述方法的特征在于包括将高流体静力压应用于介质中的来源于动物的组织的步骤。
【IPC分类】A61L27/00
【公开号】CN105188781
【申请号】CN201480025727
【发明人】岸田晶夫, 木村刚, 根岸淳, 日渡谦一郎, 田崎晃子
【申请人】国立大学法人东京医科齿科大学, 株式会社艾迪科
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2014年5月2日
【公告号】EP2995325A1, US20160058910, WO2014181767A1