专利名称：用真菌过氧酶区域选择性羟化脂族烃类化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有过氧酶(peroxygenase)活性的多肽用于脂族烃类化合物的位点特异性羟化的用途。背景发现来自伞菌类担子菌菌株Agrocybe aegerita (菌株TM-A1)、称为AaP的过氧酶氧化芳族醇和醛。AaP过氧酶从A.aegerita TM Al通过数个步骤的离子层析和SDS-PAGE 纯化，其分子量和N端14氨基酸序列在2D电泳之后确定，但并未分离编码的基因(Ullrich等，2004，Appl. Env. Microbiol. 70(8):4575-4581)。WO 2006/034702 公开了使用 Agrocybe aegerita TM Al 的 AaP 过氧酶对未活化的烃如萘、甲苯和环己烷进行酶羟化的方法。这亦描述于Ullrich和Hofrichter, 2005, FEBSLetters 579:6247-6250。WO 2008/119780 公开了来自 Agrocybe aegerita、灰盖鬼伞(Coprinopsiscinerea)、Laccaria bicolor和幅毛鬼伞(Coprinus radians)的八种不同的过氧酶，在本申请中亦示为SEQ ID NO: 1-8。DE 103 32 065 Al 公开了通过使用 Agrocybe aegerita TM Al 的 AaP 过氧酶从醇通过中间形成醛酶法制备酸的方法。报道了迅速和选择性分光光度法直接检测AaP过氧酶芳族羟化的方法(Kluge等，2007，Appl Microbiol Biotechnol 75:1473-1478)。公知将氧官能团直接区域选择性导入有机分子(加氧)在化学合成中构成问题。脂族糖的选择性羟化的催化是特别困难的。其产物可在广泛种类的不同合成中用作重要的中间物。具体而言，烷的化学强化相对复杂，需要强烈的/毒性化学品/催化剂，并导致一系列不希望的副产物。已知一种胞内酶，甲烷单加氧酶(ΜΜ0，EC 14. 13. 25)，使一些烃化合物的末端碳氧合/羟化。所述MMO酶由数个蛋白质组分组成，并由甲基营养型细菌(例如荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus))形成；其需要复合的电子供体如NADH或NADPH,辅助蛋白(黄素还原酶，调节蛋白)和分子氧(O2)。MMO的天然底物是甲烷，其氧化为甲醇。作为特别非特异性的生物催化剂，除甲烷之外，MMO还氧合/羟化一系列其他底物如正烷烃及其衍生物，环烷烃，芳族化合物，一氧化碳和杂环化合物。该酶在生物技术中的应用目前尚不可能，因为其像大部分胞内酶一样，难于分离；其具有低稳定性；且其所需的共底物相对昂贵
发明内容
在第一个方面，本发明的发明人提供了在取代或未取代的、直链或支化的脂族烃类化合物的任一末端的2或3位进行羟化的方法，所述脂族烃类化合物具有至少3个碳并具有在2或3位附接于碳的氢，所述方法包括将所述脂族烃类化合物与过氧化氢和具有过氧酶活性的多肽相接触，其中所述多肽包含a)氨基酸序列，其与SEQ ID NO: I, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQID NO:4, SEQ IDNO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID N0:7 或 SEQ ID NO:8 具有至少 50% 同一性；和b)氨基酸序列，其由一种或多种下述基序所表示基序I :[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N (SEQ ID NO:9)；基序II :G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH] [LF]R (SEQ ID NO: 10)；基序III :RXXRI[QE] [DEQ]S[M]ATN(SEQ ID NO: 11)；
基序IV S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL] (SEQ ID NO: 12)；基序V :P[PDK] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)；基序VI [TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)。在一个实施方案中，所述脂族烃类化合物是脂肪酸。在另一个实施方案中，提供了在脂质的酰基的末端的2或3位进行羟化的方法，其包括将所述脂质与过氧化氢和具有过氧酶活性的多肽相接触，其中所述多肽包含a)氨基酸序列，其与SEQ ID NO: I, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQID NO:4, SEQ IDNO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID N0:7 或 SEQ ID NO:8 具有至少 50% 同一性；和b)氨基酸序列，其由一种或多种下述基序所表示基序I :[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N (SEQ ID NO :9)；基序II :G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH] [LF]R (SEQ ID NO: 10)；基序III :RXXRI[QE] [DEQ]S[M]ATN(SEQ ID NO: 11)；基序IV S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL] (SEQ ID NO: 12)；基序V :P[PDK] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)；基序VI [TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)。定义过氧酶活性术语“过氧酶活性”在本文中定义为使用过氧化氢羟化萘的能力，亦称作“非特异性过氧酶”，EC I. 11. 2. I。其为血红素硫醇盐蛋白(heme-thiolate protein)。该类型的酶包括由伞菌类担子菌分泌的糖蛋白。它们催化从H2O2将氧原子插入广泛种类的底物，包括芳环如萘、甲苯、菲、花和对硝基苯酹，顽固的(recalcitrant)杂环化合物如批啶、二苯并呋喃，多种醚(导致O-去烷基化)，和烷如丙烷、己烷和环己烷。其他可由过氧酶催化的反应包括轻化、环氧化、N-氧化、硫氧化(sulfooxidation)、0_和N-去烧基化、溴化和单电子氧化。它们对于氯几乎无或无活性。就本发明而言，过氧酶活性根据Kluge等(2007，ApplMicrobiolBiotechnol75:1473-1478)描述的分光光度方法确定。本发明的多肽具有SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7或8的成熟多肽的过氧酶活性的至少20%，优选至少40%，更优选至少50%，更优选至少60%，更优选至少70%，更优选至少80%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少100%。分离的多肽术语“分离的多肽”用于本文指从来源分离的多肽。在一个优选的方面，所述多肽如通过SDS-PAGE确定，为至少1%纯，优选至少5%纯，更优选至少10%纯，更优选至少20%纯，更优选至少40%纯，更优选至少60%纯，甚至更优选至少80%纯，并且最优选至少90%纯。基本上纯的多肽术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制备物，其含有按重量计至多10%，优选至多8%，更优选至多6%，更优选至多5%，更优选至多4%，更优选至多3%，甚至更优选至多2%，最优选至多1%，并且甚至最优选至多O. 5%的与其天然或重组结合的(associated)的其它多肽材料。因此，优选所述基本上纯的多肽是按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计至少92%纯，优选至少94%纯，更优选至少95%纯，更优选至少96%纯，更优选至少96%纯，更优选至少97%纯，更优选至少98%纯，甚至更优选至少99%，最优选至少99. 5%纯，并且甚至最优选100%纯。本发明的多肽优选是基本上纯的形式，即，所述多肽制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多肽材料。例如，这能够通过以下实现通过公知的重组方法或由经典纯化方法制备多肽。
成熟多肽术语“成熟多肽”在本文中定义为具有过氧酶活性的多肽，所述多肽以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在，所述修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一个优选的方面，所述成熟多肽具有基于N端肽测序数据(Ullrich等,2004, Appl. Env. Microbiol. 70 (8) :4575-4581)(其阐明AaP过氧酶的成熟蛋白的开始部分)的SEQ ID NO: I的位置I至330中所示的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述成熟多肽具有示于SEQ ID NO:2中位置I至328的氨基酸序列。同一性由参数“同一性”描述的两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice等，2000，Trendsin Genetics 16:276-277)的Needle程序，优选3. 0. 0版或更高版本中执行的Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch, 1970, J Mol. Biol. 48:443-453)来确定。使用的任选参数为缺口罚分(gap penalty) 10,缺口延伸罚分(gap extension penalty)0. 5和EBL0SUM62取代矩阵(BL0SUM62的EMBOSS版)。使用Needle标记为“最高同一性(longestidentity) ” (使用-nobrief选项获得)的输出结果作为百分比同一性，并计算如下(相同的残基X100)/(比对长度一比对中缺口的总数)就本发明而言，两个核苷酸序列之间的同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000，见上文)的Needle程序，优选3. 0. O或更高版本中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch, 1970，见上文)来测定。使用的任选参数为缺口罚分10，缺口延伸罚分0. 5和EDNAFULL取代矩阵(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版)。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下(相同的脱氧核糖核苷酸X100)/(比对长度一比对中缺口的总数)修饰术语“修饰”在本文中意指对由SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7或8或其同源序列的成熟多肽组成的多肽的任何化学修饰，以及对编码此种多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可为取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸，以及替代一个或多个(几个)氨基酸侧链。
发明详述具有过氧酶活性的多肽(过氧酶)本发明涉及具有过氧酶活性的分离的多肽(其优选为重组产生的)的用途，所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NOiUSEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7 或 SEQ ID NO:8 的多肽具有至少 50% 同一性，优选至少 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 或 98% 同一性。在一个优选实施方案中，所述多肽包含由一个或多个下述基序表示的氨基酸序列，优选包含两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或六个下述基序基序I :[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N(SEQ ID NO :9)；基序II :G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH] [LF]R(SEQ ID NO: 10)； 基序III :RXXRI[QE] [DEQ]S[M]ATN(SEQ ID NO: 11)；基序IV S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL](SEQ ID NO: 12)；基序V :P[PDK] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)；基序VI [TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)。在另一个实施方案中，所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列具有取代、缺失和 / 或插入一个或几个氨基酸的 SEQ ID N0:1, SEQ ID NO:2，SEQID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7 或 SEQ ID NO:8 的成熟多肽。还在另一个实施方案中，第一个方面的多肽包含SEQ ID NO: 1,SEQ IDN0:2,SEQ IDNO: 3，SEQ ID NO: 4，SEQ ID NO: 5，SEQ ID NO: 6，SEQ IDN0:7 或 SEQ ID NO: 8 的氨基酸序列或其具有过氧酶活性的片段，或由所述氨基酸序列或片段组成；优选所述多肽包含SEQ IDNO: 1，SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7或SEQ ID N0:8的成熟多肽或由所述成熟多肽组成。优选地,氨基酸改变对性质是较不重要的(of a minor nature),即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为I至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(polyhistidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。保守取代的实例是在以下组之内碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specificactivty)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H. Neurath和R. L. Hill, 1979,于TheProteins, Academic Press, New York 中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、VGl/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 和 Asp/Gly。除了 20个基本氨基酸，非基本氨基酸(例如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2_氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上能够获得的，包括六氢吡啶羧酸(pipecolic acid)、噻唑烧羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脑氨酸、3_ 和4-甲基脯氨酸，和3，3- 二甲基脯氨酸。或者，氨基酸改变具有这样的性质以使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改进多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适PH等。能够根据本领域已知的方法,例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells, 1989, Science 244:1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即，过氧酶活性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等，1996，J.Biol. Chem. 271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等，1992，Science 255:306-312 ；Smith等，1992，J.Mol· Biol. 224:899-904 ；fflodaver 等，1992, FEBSLett. 309:59-64。必需氨基酸的同一性也能够从与多肽的同一性分析来推断，所述多肽与根据本发明的多肽相关。
能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuff Iing)方法，然后是有关的筛选方法，例如由 Reidhaar-Olson 和 Sauer, 1988，Science 241:53-57 ；Bowie 和Sauer, 1989, Proc. NGtl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156 ；W0 95/17413;或 WO 95/22625 公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等，1991, Biochem. 30:10832-10837 ;美国专利号 5，223，409 ；W0 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire 等，1986，Gene 46:145 ；Ner等，1988，DNA 7:127)。诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等，1999，Nature Biotechnology 17:893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速测定感兴趣的多肽中单个氨基酸残基的重要性，并且能够应用于未知结构的多肽。SEQ ID NO: I, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5, SEQ IDNO:6, SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:8的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是10，优选9，更优选8，更优选7，更优选至多6，更优选5，更优选4，甚至更优选3，最优选2，并且甚至最优选I。优选第一个方面的多肽由包含于大肠杆菌NN049991中的质粒中所含的多核苷酸编码，所述大肠杆菌NN049991在2008年3月14日根据布达佩斯条约的条款以登录号DSM21289保藏于DSMZ ;或者所述多肽由包含于大肠杆菌NN049992中的质粒中所含的多核苷酸编码，所述大肠杆菌NN049992在2008年3月14日根据布达佩斯条约的条款以登录号DSM 21290 保藏于 DSMZ。另一个优选实施方案涉及本发明第一个方面的多肽，其中所述成熟多肽是SEQ IDNO: I的氨基酸I至330。还有另一个优选实施方案涉及本发明第一个方面的多肽，其中所述成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸I至328。
还有另一个优选实施方案涉及本发明第一个方面的多肽，其中所述成熟多肽是SEQ ID NO:4的氨基酸I至344。过氧化氢过氧酶所需的过氧化氢可作为过氧化氢的水溶液,或作为用于原位产生过氧化氢的过氧化氢前体提供。任何在溶解时释放可由过氧酶使用的过氧化物的固体实体均可用作过氧化氢的来源。当溶解于水或合适的水基介质时产生过氧化氢的化合物包括但不限于金属过氧化物，过碳酸，过硫酸，过磷酸，过氧酸，烷基过氧化物，酰基过氧化物，过氧酯(peroxyesters),尿素过氧化物,过硼酸和过氧羧酸,或它们的盐。过氧化氢的另一种来源是过氧化氢生成酶系统，如氧化酶和氧还酶的底物。氧化酶和底物的组合的实例包括但不限于氨基酸氧化酶(参见例如US6，248，575)和合适的氨基酸，葡糖氧化酶(参见例如WO 95/29996)和葡萄糖，乳酸氧化酶和乳酸，半乳糖氧化酶(参见例如WO 00/50606)和半乳糖，以及醛糖氧化酶(参见例如WO 99/31990)和合适的醛 糖。通过研究EC I. I. 3.，EC I. 2. 3.，EC I. 4. 3.和 EC I. 5. 3.或类似的类型(根据International Union of Biochemistry),本领域技术人员可容易地识别此类氧化酶和底物的组合的其他实例。可在本发明的方法开始时或过程中添加过氧化氢或过氧化氢源，例如作为过氧化氢的一次或多次单独添加，或连续地作为补料分批添加。过氧化氢的通常量对应于0. OOlmM至25mM水平，优选0. 005mM至5mM的水平，且特别是0. 01至ImM过氧化氢的水平。过氧化氢亦可以对应于0. ImM至25mM的水平，优选0. 5mM至15mM的水平，更优选ImM至IOmM的水平，且最优选2mM至8mM过氧化氢的水平的量使用。表面活性剂本发明的方法可包括施用表面活性剂(例如作为洗涤剂配制物的一部分或作为湿润剂)。适合于施用的表面活性剂可以是非离子的(包括半极性的)、阴离子的、阳离子和/或两性离子的；优选所述表面活性剂是阴离子的(如线性烷基苯磺酸酯(linearalkylbenzenesulfonate)、α -烯经横酸酯(alpha-olefinsulfonate)、烧基硫酸酯(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸酯、仲烷磺酸酯、α -磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或皂)或非离子的(如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多聚糖苷、烷基二甲胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烃基衍生物(“葡糖酰胺”))，或其混合物。当包括在本发明方法中时，表面活性剂的浓度通常为按重量计约0. 01%至约10%，优选约0. 05%至约5%，和更优选约0. 1%至约1%。脂族经类化合物(aliphatichydrocarbons)在本发明方法中羟化的烃是脂族烃类化合物，所述脂族烃类化合物具有至少3个碳的链，并具有在2或3位附接于碳的氢。优选地，所述脂族烃类化合物是烷或烯；更优选地，所述脂族烃类化合物是烷，如丙烷、丁烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷或癸烷，或其异构体。所述脂族烃类化合物是直链或支化的，但非环化的，因为位点特异性羟化对环烃类化合物是不可能的。支化的烃类化合物对应于直链烃类化合物的异构体。
所述脂族烃类化合物是取代或未取代的。优选地，所述脂族烃类化合物是未取代的，如非活化的烃类化合物。当脂族烃类化合物是取代的时(附接有官能团)，优选的取代基为卤素、羟基、羧基、氨基、硝基、氰基、巯基、磺酰基、甲酰基、乙酰基、甲氧基、乙氧基、苯基、苄基、二甲苯基、氨基甲酰基和氨磺酰基；更优选的取代基为氯、羟基、羧基和磺酰基；且最优选的取代基为氯和羧基。所述脂族烃类化合物可具有多至10个取代基，多至8个取代基，多至6个取代基，多至4个取代基，多至2个取代即或多至一个取代基的取代。在一个优选实施方案中，所述脂族烃类化合物是脂肪酸(取代基是羧基)。脂肪酸的实例包括但不限于丁酸(酪酸)，戊酸(缬草酸)，己酸(羊油酸)，庚酸(葡萄花酸)，辛酸(羊脂酸)，壬酸(天竺葵酸)，癸酸(羊蜡酸)，十二酸(月桂酸)，十四酸(肉豆蘧酸)，
十六酸(棕榈酸)，十八酸(硬脂酸)，二十酸(花生酸)，亚油酸，亚麻酸，花生四烯酸，二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。在第二个方面，所述脂族烃类化合物是脂质如甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯，磷脂或鞘脂的酰基；且羟化发生在酰基末端的2或3位。所述酰基必须具有至少一个与末端的2或3位的碳附接的氢。所述酰基可为饱和/或不饱和的，并可任选地附接有官能团(取代基)。酰基的实例包括但不限于丁酸(酪酸)，戊酸(缬草酸)，己酸(羊油酸)，庚酸(葡萄花酸)，辛酸(羊脂酸)，壬酸(天竺葵酸)，癸酸(羊蜡酸)，十二酸(月桂酸)，十四酸(肉豆蘧酸)，十六酸(棕榈酸)，十八酸(硬脂酸)，二十酸(花生酸)，亚油酸，亚麻酸，花生四烯酸，二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的酰基形式。方法和用途本发明提供了使用过氧酶和过氧化氢在脂族烃类化合物的2或3位进行位点特异性羟化的方法。该脂族烃类化合物必须包括至少3个碳的链，且脂族烃类化合物的任一(一个或多个)端可用作起始点以确定哪个碳为2或3位。所述脂族烃类化合物必须在2或3位具有至少一个附接于碳的氢(其被羟化)。在一个优选实施方案中，在2或3位的碳(用过氧酶羟化)是不饱和的(在进行羟化之前)。相应地，在第一个方面，本发明提供了在取代或未取代的、直链或支化的脂族烃类化合物任一端(一个或多个端)的2或3位进行羟化的方法，所述脂族烃类化合物具有至少3个碳，并在2或3位具有附接于碳的氢，所述方法包括将所述脂族烃类化合物与过氧化氢和具有过氧酶活性的多肽相接触，其中所述多肽包含a)氨基酸序列，其与SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 2，SEQ ID NO: 3，SEQID NO:4，SEQ IDNO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID N0:7 或 SEQ ID NO:8 具有至少 50% 同一性；和b)氨基酸序列，其由一种或多种下述基序所表示基序I :[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N(SEQ ID NO :9)；基序II :G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH] [LF]R(SEQ ID NO: 10)；基序III :RXXRI[QE] [DEQ]S[M]ATN(SEQ ID NO: 11)；基序IV S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL](SEQ ID NO: 12)；基序V :P[PDK] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)；基序VI [TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)。
本发明的方法可用于多种目的，如大量化学合成(生物催化)，增加脂族烃类化合物的水溶性，生物治疗，和食品特征的修饰。本发明的方法亦可用于多种工业工艺，其中所述羟化反应是有益的。此种用途的一个实例是纸浆和纸产品的制造，其中存在于木质(树脂)中的烷和其他相关的脂族烃类化合物可导致纸浆和纸制造工艺中的沉积问题。这些疏水化合物是纸浆和纸制造工艺中所谓树脂沉积物(Pitch deposit)的前体。树脂沉积导致低品质纸浆，并可导致纸浆厂运转的停工。涉及具有高提取物含量的纸浆的特定问题包括流动性问题，纸中的污点和孔洞，以及纸张破裂(sheet break)。用过氧酶处理可增加所述化合物的溶解性,并由此减轻问题。还有另一种本发明的方法的用途是，即用于油或煤精炼，其中过氧酶催化的羟化可用于改变烃类化合物的溶解性、粘性和/或燃烧特征。具体而言，所述处理可导致接受该处理的烃类化合物的烟点、着火点(kindling point)、燃点(fire point)和沸点(boilingpoint)的变化。在大量化学品、农业化学品(包括农药)、特种化学品和药物的合成中，本发明的 方法显然在将羟基基团选择性导入底物，由此影响修饰的化合物的可溶性方面是重要的。此外，所述选择性羟化为通过有机化学合成和化学酶合成领域中已知的方法进行进一步修饰提供了位点。将天然气彻底加工以去除高级烷烃。此类高级烷烃的羟化可用于改善其水溶性，并因此便于通过洗涤天然气流来去除所述高级烷烃。可在井中或在精炼过程中进行去除。油废物的羟化会显著改善生物可降解性，并可应用于涉及来自精炼厂的废水处理和污染的地面或水的生物治疗的方面。在第二个方面，本发明提供了在脂质的酰基的末端的2或3位进行羟化的方法，所述方法包括将所述脂质与过氧化氢和具有过氧酶活性的多肽相接触，其中所述多肽包含a)氨基酸序列，其与SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 2，SEQ ID NO: 3，SEQID NO:4，SEQ IDNO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID N0:7 或 SEQ ID NO:8 具有至少 50% 同一性；和b)氨基酸序列，其由一种或多种下述基序所表示基序I :[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N(SEQ ID NO :9)；基序II :G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH] [LF]R(SEQ ID NO: 10)；基序III :RXXRI[QE] [DEQ]S[M]ATN(SEQ ID NO: 11)；基序IV S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL](SEQ ID NO: 12)；基序V :P[PDK] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)；基序VI :[TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)。脂肪酰基的羟化通常改善脂质的水溶性。相应地，本发明的方法可用于通过将衣物(laundry)与过氧酶和过氧化氢源和任选的表面活性剂相接触而从衣物去除或减少含油或脂质的污迹，如巧克力。本发明的方法可用具有过氧酶活性的固定化的多肽(过氧酶)进行。本发明的方法可在水性溶剂(反应介质)，多种醇、醚、其他极性或非极性溶剂，或其混合物中进行。通过研究用于本发明的方法的脂族烃类化合物的特征，本领域技术人员可容易地识别溶剂的合适实例。通过提高或降低羟化进行的压力，可在反应温度将溶剂(反应介质)和脂族烃类化合物维持在液相中。
根据本发明的方法可在O至90摄氏度,优选5至80摄氏度,更优选10至70摄氏度，甚至更优选15至60摄氏度，最优选20至50摄氏度，以及特别是20至40摄氏度的温
度进行。本发明的方法可采用10秒至(至少)24小时，优选I分钟至(至少)12小时，更优选5分钟至(至少)6小时，最优选5分钟至(至少)3小时，且特别是5分钟至(至少)I小时的处理时间。在另一个方面，本发明的方法可用于通过将衣物与过氧酶和过氧化氢源以及任选的表面活性剂相接触而从衣物减少不愉快的气味。本发明的方法导致衣物中丁酸(酪酸)的量的减少。丁酸在衣物洗涤过程中，当某些动物脂肪和植物油由例如洗涤剂脂肪酶水解以产生游离脂肪酸(包括丁酸)时形成。丁酸具有极端不愉快的气味。过氧酶将丁酸羟化为2-羟基丁酸(α -羟基丁酸)或3-羟基丁酸(β -羟基丁酸)。除非另行指明，使用的命名法是标准IUPAC命名法。 本发明进一步通过下述实施例描述，但不应视为对本发明范围的限制。
实施例来自Agrocybe aegerita的具有过氧酶活性的多肽,示为SEQ ID N0:2,在下述实施例中称作AaeAPO。实施例IιΗ己烷的羟化己烷的酶羟化在含有作为水性酶溶液(10 μ I)添加的2U πιΓ1 (O. 31nmol) AaeAPO的醇底物(正己烷，>97%，Sigma Aldrich)中进行。在I小时期间通过注射泵添加H2O2 (4mM)。实验以200 μ I规模(总体积)在用磁力搅拌器搅拌的Iml玻璃小瓶中完成。通过直接注射反应混合物由GC-MS(Varian)分析产物。对照以相同方式处理，只是添加水(IOyl)替代酶溶液。具有活性酶(AaeAPO)和正己烷的样品的气相色谱和质谱显示高量2_己醇和3-己醇的形成；不含酶的对照不含任何这些峰。实施例2ιΗ癸烷的羟化酶转化(200 μ I总体积中)在补充2UmF1 (O. 31nmol) AaeAPO的纯正癸烷(>97%,Sigma Aldrich)中完成。在2小时期间通过注射泵添加H2O2(8mM)并用磁力搅拌器搅拌样品。产物通过GC-MS测量。对照以相同方式处理，只是添加水(10μ1)替代酶。具有活性酶(AaeAPO)和正癸烷的样品的气相色谱和质谱显示高量的两种正烷醇，3-癸醇和2-癸醇的形成；不含酶的对照不含任何这些峰。实施例3月桂酸的酶羟化 月桂酸的酶羟化使用4ml的总反应混合物进行，所述反应混合物含有50mM磷酸钾缓冲液，40v/v%乙腈，ImM月桂酸(>98%纯,将Aldrich W261408溶解于乙腈),0. Olmg过氧酶蛋白/ml (如SEQ ID NO:4所示的过氧酶)，并根据下表添加2mM抗坏血酸。反应通过将对应于O. 5mM浓度的过氧化氢添加于反应混合物中而起始。将反应混合物在35°C使用加热块温育60分钟。在30分钟温育之后添加过氧化氢的二次添加至ImM的总浓度。反应通过在水浴中在85°C进行5分钟的热处理停止。通过在100°C在分流模式(split mode)以10:1的比例注射(氦以25ml/分钟的恒定流速用作载气)由GC-FID (Varian 3900)测量产物。施加温度梯度以10°C /分钟的速率加热至200°C，然后以500C /分钟的速率进行至360°C。结果记录为峰面积(参见表I)。表I
处理月桂酸(面积@3. 2分钟)产物(面积@4. 3分钟)
过氧酶+H2O2无峰无峰
月桂酸+H2O2+抗坏血酸1601191
月桂酸+过氧酸+H2O2+抗坏血酸14406395. 5产物峰在过氧酶的存在下出现。产物的洗脱时间相对于12-羟基十二烷酸(其为2-羟基月桂酸和3-羟基月桂酸的异构形式)略有偏移。因此，该洗脱时间符合预期的在2或3位羟化的产物。实施例4棕榈酸的酶羟化棕榈酸的酶羟化使用4ml的总反应混合物进行，所述反应混合物含有50mM磷酸钾缓冲液，40v/v%乙腈，ImM棕榈酸(>99%纯Sigma P0500)和O. Olmg过氧酶蛋白/ml (如SEQID N0:4所示的过氧酶)。反应通过将对应于ImM浓度的过氧化氢添加于反应混合物中而起始。将反应混合物在35°C使用加热块温育1、2、3和10分钟。反应通过在水浴中在85°C进行5分钟的热处理停止。通过在100°C在分流模式(split mode)以10:1的比例注射(氦以25ml/分钟的恒定流速用作载气)由GC-FID (Varian 3900)测量产物。施加温度梯度以10°C /分钟的速率加热至200°C，然后以50°C /分钟的速率进行至360°C。结果记录为峰面积(参见表2)。表2
温育时间(分钟)棕榈酸(面积)产物(面积)
~O1799.5^il
~ 1481.282 8
2979. I191.3产物峰在I分钟的温育之后已经出现，并在两分钟温育之后增加。洗脱谱(profile)相对于16-羟基十六烷酸(其为2-羟基棕榈酸和3-羟基棕榈酸的异构形式)略有偏移。因此，该洗脱时间符合预期的在2或3位羟化的产物。
权利要求
1.一种在取代或未取代的、直链或支化的脂族烃类化合物的任一末端的2或3位进行羟化的方法，所述脂族烃类化合物具有至少3个碳并具有在2或3位附接于碳的氢，所述方法包括将所述脂族烃类化合物与过氧化氢和具有过氧酶活性的多肽相接触，其中所述多肽包含 a)氨基酸序列，其与SEQ ID NO: I, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQID NO:4, SEQ IDNO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID N0:7 或 SEQ ID NO:8 具有至少 50% 同一性；和 b)氨基酸序列，其由一种或多种下述基序所表示 基序 I : [FL]XX[YF] S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N(SEQ ID NO:9)； 基序 II G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH] [LF]R(SEQ ID NO: 10)； 基序 III RXXRI [QE] [DEQ] S [IM] ATN(SEQ ID NO: 11)；基序 IV S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL](SEQ ID NO: 12)； 基序 V :P[H)K] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)； 基序 VI [TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)。
2.权利要求I的方法，其中所述羟化的2和3位的碳在与过氧酶相接触前是未取代的。
3.权利要求1-2任一项的方法，其中所述多肽包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与 SEQ ID NO: I, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少55%同一性，优选至少60%同一性，更优选至少65%同一性,更优选至少70%同一性,更优选至少75%同一性,更优选至少80%同一性，更优选至少85%同一性，最优选至少90%同一性，并且特别是至少95%同一性。
4.权利要求1-3任一项的多肽，包含如下或由如下组成SEQID NO: I, SEQ ID NO:2,SEQ ID NO: 3，SEQ ID NO: 4，SEQ ID NO: 5，SEQ ID NO: 6，SEQ ID NO: 7 或 SEQ ID NO: 8 的氨基酸序列，或其具有过氧酶活性的片段。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述脂族烃类化合物的取代基选自下组卤素、羟基、羧基、氨基、硝基、氰基、巯基、磺酰基、甲酰基、乙酰基、甲氧基、乙氧基、苯基、苄基、二甲苯基、氨基甲酰基和氨磺酰基。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中所述取代基选自下组氯、羟基、羧基和磺酰基，特别是氯和羧基。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述脂族烃类化合物是未取代的。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述脂族烃类化合物是直链的。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述脂族烃类化合物是烷。
10.权利要求9的方法，其中所述烷是丙烷、丁烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷或癸烷，或其异构体。
11.权利要求1-4任一项的方法，其中所述脂族烃类化合物是脂肪酸。
12.一种在脂质的酰基的末端的2或3位进行羟化的方法，所述方法包括将所述脂质与过氧化氢和具有过氧酶活性的多肽相接触，其中所述多肽包含 a)氨基酸序列，其与SEQ ID NO: I, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQID NO:4, SEQ IDNO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 或 SEQ ID NO:8 具有至少 50% 同一性；和 b)氨基酸序列，其由一种或多种下述基序所表示基序 I : [FL] XX [YF] S [AN] X [FHY] G [GN] GX [YF] N(SEQ ID NO :9)； 基序 II G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH] [LF]R(SEQ ID NO: 10)； 基序 III RXXRI [QE] [DEQ] S[IM]ATN(SEQ ID NO: 11)；基序 IV S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL](SEQ ID NO: 12)； 基序 V :P[H)K] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)； 基序 VI [TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)。
13.权利要求12的方法，其中所述多肽包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与 SEQ ID NO: I, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ IDNO:4, SEQ ID N0:5, SEQ IDNO: 6, SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8的成熟多肽具有至少55%同一性，优选至少60%同一性，更优选至少65%同一性，更优选至少70%同一性，更优选至少75%同一性，更优选至少80%同一性，更优选至少85%同一性，最优选至少90%同一性，并且特别是至少95%同一性。
14.过氧酶用于在脂族烃类化合物任一端的2或3位进行羟化的用途。
15.权利要求14的用途，其中所述脂族烃类化合物是脂肪酸，烷或脂质的酰基。
16.过氧酶用于从衣物减少不愉快的气味的用途，包括将衣物与过氧酶和过氧化氢源相接触。
17.过氧酶用于从衣物减少或去除的含油或脂质的污迹的用途，其是通过将衣物与过氧酶和过氧化氢源相接触而进行。
全文摘要
本发明涉及用于在取代或未取代的、直链或支化的脂族烃类化合物的2或3位进行羟化的酶方法。
文档编号C12P7/04GK102822348SQ201180016868
公开日2012年12月12日 申请日期2011年3月28日 优先权日2010年3月28日
发明者M.霍夫里克特, K.希布纳, R.乌尔里克, M.基恩, S.彼得, H.伦德, L.卡鲁姆 申请人:诺维信公司