专利名称：激肽原第五结构域-肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的融合蛋白及其制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及DNA重组技术和药物领域。更具体地，本发明涉及人激肽原第五结构域(Kininogen D5)与人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(以下简称TRAIL)的融合蛋白，编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该融合蛋白的方法，以及该融合蛋白在如肿瘤等疾病治疗中的应用。
背景技术：
激肽原(Kininogen)发现至今已有近二十年，其主要功能为抗凝血，所以在纤溶、血栓病、炎症等中皆发挥重要作用。人激肽原由644个氨基酸组成，氨基酸序列见GenBank No.ABB59550，其基因所编码的产物在激肽释放酶的作用下，切除其中的一个结构区域(即D4)，其余的D1、2、3和D5、6通过一个二硫键连接成激肽原(即Kininogen)，核苷酸序列见GenBank No.AH005302。近年发现其具有抗肿瘤的作用(主要集中在Kininogen D5部分)，已证明激肽原的N-端第402-626位氨基酸(即Kininogen D5的24-248位氨基酸)或其中的部分序列组成的蛋白质[Blood，2000；95(2)543-550]，或多肽[Arterioscler Thromb Vasc Biol，2001；21(9)1427-1433]可通过抑制内皮细胞的增殖、迁移和诱导其凋亡而在体内产生抑制肿瘤新生血管的作用，从而具有抗肿瘤功能。
1995年，国外报道从人表达标签序列文库(expressed sequence tag，EST)中筛选到一种编码抗肿瘤蛋白质的基因，该基因编码的蛋白质称为肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)，又称肿瘤凋亡素(apoptotin-2 ligand，简称Apo-2L)，是肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor，TNF)家族成员之一，其通过启动细胞固有的凋亡程序，可有效地诱导肿瘤和转化细胞凋亡，而对正常细胞无影响。人TRAIL基因的编码序列有843个核苷酸(SEQ ID NO.3)，核苷酸序列见GenBank No.NM_003810，编码的蛋白质TRAIL由281个氨基酸组成(SEQ ID NO.4)。业已证明TRAIL是典型的II型跨膜蛋白，其N-端第95或114位开始的胞外区可形成游离的可溶性肿瘤凋亡素蛋白，同样具有肿瘤凋亡作用。目前该基因可从生物技术公司(http//www.invivogen.com)获得。
由于Kininogen D5与TRAIL对抑制肿瘤生长作用在不同的环节，用合适的氨基酸连接臂[Protein Eng，2003；15(11)871-879]使两者融合表达，由此所产生的重组融合蛋白质既可以通过TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡而抑制肿瘤，还可以通过Kininogen D5抑制肿瘤新生血管内皮细胞生长而抗肿瘤。因此，本发明所得到的融合蛋白质可以在两者的协同下增强抗肿瘤的效果，还可减少两者分别给药给患者所带来的麻烦和痛苦，为抗肿瘤等疾病的治疗提供新的药物或制剂。因此，本领域迫切需要开发新的具有Kininogen D5和TRAIL两者生物活性的药物。此外，本领域还迫切需要开发成本低廉和或步骤简便的生产工艺。
发明内容
本发明的一个目的就是提供一种新的具有Kininogen D5和TRAIL两者生物活性的药物，它是Kininogen D5和TRAIL的融合蛋白。
本发明的另一目的是提供编码所述融合蛋白的DNA、含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞。
本发明的另一目的是提供一种成本低廉和\或步骤简便的生产所述KininogenD5-TRAIL融合蛋白的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，它包括(a)激肽原第五结构域元件，该元件具有人激肽原第五结构域或其活性片段的氨基酸序列；(b)肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体元件，该元件具有人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体或其活性片段的氨基酸序列；以及(c)位于激肽原第五结构域元件和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体元件之间的1-20个氨基酸的连接序列。
更佳的，所述的激肽原第五结构域元件具有SEQ ID NO.2中第1-266位、24-153位、或60-148位的氨基酸序列；所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体元件具有SEQ ID NO.4中第1-281位、95-281位、114-281位的氨基酸序列；而且，所述的连接序列为含4-10个氨基酸的接头肽。
更佳的，所述的融合蛋白包括SEQ ID NO.6中所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的DNA分子，它编码本发明上述的融合蛋白。较佳地，所述的DNA分子编码包括SEQ ID NO.6中所示的氨基酸序列的融合蛋白。更佳的，所述的DNA分子包括SEQ ID NO.5中所示的核苷酸序列。
在本发明的第三方面，提供了含有上述DNA分子的载体和含有上述载体的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了一种产生本发明融合蛋白的方法，它包括步骤在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达出所述的融合蛋白；和分离所述的融合蛋白。
在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，它包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效量的本发明的融合蛋白。
在本发明的第六方面，提供了本发明融合蛋白的用途，它被用于制备治疗肿瘤的药物。
图1显示了不同长度的Kininogen D5、氨基酸连接臂和TRAIL的不同拼接方式。其中 表示TRAIL氨基酸序列； 表示Kininogen D5氨基酸序列； 表示氨基酸连接臂序列； 表示缺失部分氨基酸。
图2显示了一种特征性的KininogenD5-TRAIL融合蛋白重组表达及纯化过程的电泳分析(SDS-PAGE)。其中A蛋白质分子量标记；B原核重组热诱导表达的Kininogen D5-TRAIL工程菌破碎上清；C金属亲和纯化的重组KininogenD5-TRAIL融合蛋白质活性峰；D金属亲和洗出液；E进一步纯化的kininogenD5-TRAIL；F硫酸铵盐析表达上清的活性组分；G诱导表达Kininogen D5-TRAIL前的细菌破碎上清。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，将Kininogen D5基因和TRAIL基因融合在一起，产生由合适的氨基酸连接臂连接的Kininogen D5-TRAIL的融合蛋白。所述融合蛋白质具有两者的生物学功能，既可通过Kininogen D5 N-端抑制肿瘤新生血管内皮细胞生长而抗肿瘤，还可以通过TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡而抑制肿瘤。因此，本发明所得到的Kininogen D5-TRAIL融合蛋白质可以在两者的协同下增强抗肿瘤的效果，还可减少两者分别给药给患者所带来的麻烦和痛苦，为抗肿瘤等治疗提供新的化合物。在此基础上完成了本发明。
定义如本文所用，术语“激肽原第五结构域和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的融合蛋白”、“Kininogen D5-TRAIL融合蛋白”等可互换使用，都指由激肽原第五结构域元件的氨基酸序列和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体元件的氨基酸序列融合而成的蛋白，其中在两者之间可以有或者没有连接肽序列。此外，所述融合蛋白可以具有或没有起始的甲硫氨酸或信号肽。
如本文所用，术语融合蛋白中“激肽原第五结构域元件”指在所述融合蛋白中的一部分氨基酸序列，该序列与天然的或变异的全长激肽原第五结构域或其活性片段具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有与天然激肽原第五结构域基本上相同的生物活性。优选的激肽原第五结构域元件是人激肽原第五结构域，更佳的是全长的人激肽原第五结构域或其活性片段，如SEQ ID NO.2中第1-266位、24-153位、或60-148位的氨基酸序列。
如本文所用，术语融合蛋白中“肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体元件”或“TRAIL元件”可互换使用，指在所述融合蛋白中的一部分氨基酸序列，该序列与天然的或变异的全长肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体或其活性片段具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有与天然肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基本上相同的生物活性。优选的TRAIL元件是人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，更佳的是全长的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体或其活性片段，如SEQ ID NO.4中第1-281位、95-281位、114-281位的氨基酸序列。
激肽原第五结构域和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的序列可以源自人，也可以源自非人的动物。然而，优选的是人的天然序列。
如本文所用，术语“连接肽”或“氨基酸连接臂”可互换使用，指位于激肽原第五结构域元件的氨基酸序列和TRAIL元件的氨基酸序列之间的、起连接作用的短肽或氨基酸。连接肽的长度通常为1-20个氨基酸，较佳地为3-10个氨基酸，最佳地为4-6个氨基酸。技术人员可按照本领域常规方法[如参见PNAS 1998；955929-5934；Protein Eng，2000；13(5)309-312；Protein Eng，2003；15(11)871-879等文献]设计连接肽。通常，连接肽不影响或严重影响激肽原第五结构域元件的氨基酸序列和TRAIL元件的氨基酸序列形成正确的折叠和空间构象。
优选的连接肽例子包括(但并不限于)为了有利于蛋白折叠成相互独立的结构域，用SGGGGSGGGG等序列作为连接臂是合适的(SEQ ID NO.6中第170-181位)；为了有利于蛋白酶把Kininogen D5-TRAIL切割成两个独立的蛋白分子，可用活性X因子的酶切位点(IEGR)作连接臂，相似的，chymotrypsin 1，papain，plasmin，thrombin，trypsin等的酶切位点也可设计作为氨基酸连接臂；为了有利于纯化，可把6His作为连接臂，以用金属亲和层析纯化Clareticulin-TRAIL融合蛋白；上述三种方案的结合也可设计成新的氨基酸连接臂，如NVVVHQAHHHHHHEFTYK连接臂就是融合了蛋白酶切位点(NIa蛋白酶)和金属亲和层析位点6His。
编码本发明融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。也可用PCR扩增或合成的方法获得激肽原第五结构域和或肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的编码DNA序列，然后将其拼接在一起，形成编码本发明融合蛋白的DNA序列。
在获得了编码本发明新融合蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的融合蛋白。
如本文所用，术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。代表性的状态包括(但并不限于)能在真核细胞如CHO、COS系列等真核细胞中表达的载体，能在酿酒酵母或毕氏酵母中表达的载体，能在家蚕等昆虫细胞中表达的载体以及原核表达载体。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳的，该宿主细胞是真核细胞，更佳的是家蚕细胞。
在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明融合蛋白的条件下培养该细胞，从而表达出融合蛋白。可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括(但并不限于)常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的Kininogen D5-TRAIL融合蛋白既具有Kininogen D5的抑制肿瘤新生血管内皮细胞生长的功能，又具有TRAIL的诱导肿瘤细胞凋亡的作用。
在本发明的另一方面，还提供了一种药物组合物。本发明的药物组合物包括有效量的本发明的新型Kininogen D5-TRAIL融合蛋白，以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。
组合物可制成单元或多元剂型。各剂型包含为了产生所期望的治疗效应而计算出预定量的活性物质，以及合适的药剂学赋形剂。
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、口服或局部给药。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明融合蛋白或其抗体施用于人，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳的该剂量是约1微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
此外，本发明的融合蛋白还可与其他治疗药物联用，其中包括(但并不限于)各种细胞因子，如IFN、TNF、IL-2等；各种肿瘤化疗药物，如5-Fu、氨甲蝶呤等影响核酸生物合成的药物，氮芥、环磷酰胺等烷化剂类，阿霉素、放线菌素D等干扰转录过程阻止RNA合成的药物，长春新碱、喜树碱类影响蛋白质合成的药物及某些激素等各类药物。
综上所述，本发明的主要优点如下(1)Kininogen D5-TRAIL融合蛋白，既具有Kininogen D5的抑制肿瘤新生血管内皮细胞生长的功能，又具有TRAIL的诱导肿瘤细胞凋亡的作用，是一种治疗肿瘤的新型药物。
(2)给药方便。由于两者的有效作用剂量在大多数情况下接近，所以用融合蛋白同时给予，方便了单药的配比，同时受试者也减少了痛苦。
(3)具有靶向性。Kininogen D5在抑制肿瘤新生血管的同时可以把TRAIL运抵肿瘤局部发挥作用；同样的，TRAIL作用于肿瘤细胞时，把Kininogen D5运抵肿瘤组织的新生血管发挥其抑制作用。
(4)增强蛋白的稳定性。两者融合表达后，体外半衰期明显变长，在水溶液中的稳定性由两者各约一周变为融合后的一至两个月(皆在4℃下)；相信在体内的半衰期也会适当的延长。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1建立cDNA文库，筛选得到TRAIL和Kininogen D5基因1.制备人外周血单个核细胞总RNA按常规用淋巴细胞分离液分离人外周血淋巴细胞，用RPMI-1640培养基(GIBCO公司)，加10％新生小牛血清(杭州四季青生物公司)及青霉素和链霉素培养至贴壁，得单个核细胞，然后用10μg/L的大肠杆菌R595的内毒素刺激2h，以激活单个核细胞，收集107细胞，用总RNA抽提试剂盒(Qiagen公司)抽提总RNA，得人外周血单个核细胞总RNA。
2.建立cDNA文库，筛选TRAIL基因上述所得的总RNA，用Oligo-dT柱(Qiagen公司)纯化得总mRNA，用cDNA合成试剂盒(Clontch公司)按说明书进行cDNA第一链和第二链的合成，加上EcoR I接头后连接到λgt10载体中，并用λ噬菌体包装试剂盒(Clontech公司)包装成λ噬菌体文库，建成λgt10 cDNA文库，文库的滴度为6×106。
此λgt10 cDNA文库以1×105菌落/LB平板上铺板，在20×20cm的硝酸纤维素滤膜上制做重复的印模。用TRAIL理论序列设计随机引物，制备基因探针，杂交筛选文库。含有菌落的重复印膜在含10％硫酸葡聚糖、100μg/ml tRNA和6×105cpm/ml探针的平板筛选缓冲液(50mmol/L Tris-HCl pH7.5，1mol/L NaCl，0.1％焦磷酸钠，0.2％聚乙烯吡咯烷酮和0.2％Ficoll)中65℃杂交过夜。65℃平板筛选，2×SSC(0.3mol/L NaCl，30mmol/L柠檬酸钠，pH7.0)、0.1％SDS缓冲液洗两次。然后在-40℃与胶片紧密接触，筛选40小时。
双份阳性的样品从主平板上挑出对应菌落，转到添加了明胶的缓冲液(100mmol/L NaCl、10mmol/L MgSO4、50mmol/L Tris-HCl，pH7.5)的LB平板上，得到12个阳性噬菌斑。12个纯化的λDNA用Not I消化，1％琼脂糖凝胶电泳，Southern印迹确认与探针杂交。挑选与上述探针杂交时，放射性强度最大的克隆(约1.7kp)进行DNA纯化。这些克隆的插入部分被亚克隆到pSPORT1(GIBCO公司)的Not I位点。测定质粒中插入部分的DNA序列。从序列分析的结果中得到，其中一个质粒中的插入序列为1769bp，包含87bp的5′非翻译区，843bp开放阅读框和3′非翻译区(含多聚腺苷酸化信号或称polyA尾)，此片段即TRAIL基因，其中的编码序列如SEQ ID NO.3。根据Kozak定义的翻译起始位点要求，第88-90位核苷酸(ATG，编码蛋氨酸)为翻译起始位点，由此得到的最大开放阅读框所编码的281个氨基酸序列如SEQ ID NO.4。
3.筛选Kininogen D5基因用步骤1和2类似的方法，从人心肌细胞cDNA文库中筛选得到Kininogen D5基因的编码序列如SEQ ID NO.1，推断的所编码的266个氨基酸序列如SEQ IDNO.2。
实施例2逆转录-聚合酶链反应法(即RT-PCR)得到Kininogen D5的编码序列1.RT获得Kininogen D5 cDNA第一链以从Clontech公司(美国)购买的人心肌细胞总RNA为模板，以P1为引物，逆转录酶催化合成Kininogen D5 cDNA第一链。
2.聚合酶链反应(PCR)扩增获得Kininogen D5编码序列以上述cDNA第一链为模板，P1、P2为引物，Tag DNA聚合酶催化合成和扩增Kininogen D5编码序列。经序列分析，所得DNA序列与GenBank登记的序列(GenBank No.AH005302)所显示的Kininogen D5编码序列一致，即得到了Kininogen D5编码核苷酸序列。引物P1CTG TTTA GAT CTC ACT GAT G(SEQ ID NO.30)P2AGA AAT ACC CAT AGC CAC(SEQ ID NO.31)实施例3RT-PCR得到TRAIL的编码序列1.制备人外周血单个核细胞总RNA(1)按常规方法从人外周血中分离淋巴细胞，进而用贴壁法获得单个核细胞；(2)用细菌内毒素激活单个核细胞以刺激细胞表达更多的基因和提高RNA的丰度，用RNA抽提试剂盒(Qiagen公司)抽提总RNA。
2.逆转录(RT)获得TRAIL cDNA第一链以上述总RNA为模板，以P3为引物，逆转录酶催化合成TRAIL cDNA第一链。
3.聚合酶链反应(PCR)扩增获得TRAIL编码序列以上述cDNA第一链为模板，P3、P4为引物，Tag DNA聚合酶催化合成和扩增TRAIL编码序列。经序列分析，所得DNA序列与GenBank登记的序列(NM_003810)所显示的TRAIL编码序列一致，即得到了TRAIL编码核苷酸序列P3GAC TTA CAG CAG TCA GAC TCT GAC(SEQ ID NO.32)P4TAT TGC TTT TTC TTT CCA GGT CAG(SEQ ID NO.33)实施例4构建表达Kininogen D5-TRAIL融合蛋白质表达载体以改建的pBV220为载体(原始质粒由中国预防医学科学院病毒研究所惠赠)，构建表达TRAIL第114-281位氨基酸的重组质粒，所构建的表达TRAIL第114-281位氨基酸的原核表达载体，命名为pBV-TRAIL。本发明相应的融合蛋白的重组表达以同样的方法实施。具体实施步骤如下1.设计并合成引物和寡聚核苷酸双链设计扩增编码TRAIL第114-281位氨基酸的引物P5、P6，其序列为P55′-ACG AAT TCA CAA TGG TGA GAG AAA GAG GTC-3′(SEQ ID NO.34)；
P65′-ACG GAT CCT TAG CCA ACT AAA AAG-3′(SEQ ID NO.35)P5优化了SD序列与外源基因之间的距离为8个核苷酸(斜体部分)，引入蛋白合成起始密码子ATG及EcoR I酶切位点GAATTC；P6引入BamH I酶切位点GGATCC。
合成寡聚核苷酸双链，序列如下(未给出互补链的序列)P75′-AAA GAT CTC TCA CCT ACC AAA CAA TGC CCC CCT GCA AAA AATAAA TTC ATA TAA AAA ACA TAC AGA TAA CCA TCT GCG GTG ATA AAT TATCTC TGG CGG TGT TGA CAT AAA C TGA GCA CAT CAGCAG GAC GCA CTG ACC ACC ATG AAG GTG ACG CTC TTA AAA ATT AAG CCCTGA AGA AGG GCA GCA TTC AAA GCA GAA GGC TTT GGG GTG TGT GAT ACG AAACGA AGC ATT GGT TAA AAA TTA AGG AGG AAT TCA CA-3′(SEQ ID NO.36)其中，P7序列的斜体部分为λPLPR串联启动子序列，阴影部分为cI抑制蛋白结合位点，黑体部分为优化的SD序列，5′端引入BglII酶切位点AGATCT，3′端引入EcoR I酶切位点GAATTC；P85′-AAG GAT CCG TCG ACC TGC AGC CAA GCT TGG CTG TTT TGG CGGATG AGAGAA GAT TTT CAG-3′(SEQ ID NO.37)其中，P8序列的5′端引入了BamH I酶切位点GGATCC，3′引入Xmn I酶切位点GAANNNNTTC。
2.构建表达载体pBV-TRAIL，具体如下以P5、P6为引物，以实施例3的TRAIL基因为模板，PCR扩增TRAIL基因编码序列，产物以EcoR I和BamH I酶切(工具酶皆购自美国NEB公司)。以Bgl II和EcoR I酶切P3，BamH I和Xmn I酶切P4。以Bgl II和Xmn I双酶切pBV220质粒。
上述各酶切片段琼脂糖凝胶回收相应大小的片段，用T4 DNA连接酶连接各片段，所得到的重组质粒即肿瘤凋亡素的表达载体，命名为pBV-TRAIL。
pBV-TRAIL相比pBV220具有以下特征TRAIL编码基因受上游λ噬菌体PLPR串联启动子控制，优化的核糖体结合序列(SD序列)，插入EcoR I酶切位点及翻译起始密码子ATG，同时优化了与SD序列之间的距离为8个核苷酸；在肿瘤凋亡素编码基因下游插入BamH I酶切位点等。该质粒与pBV220同样，在启动子序列中含有cIts857结合序列；带有氨苄青霉素抗性基因；转录终止序列rrnB；质粒上含有编码温度敏感蛋白因子cIts857基因，在42℃时该编码产物失活，从而失去对启动子的抑制，启动子控制的下游外源基因被表达。上游调控序列、优化的SD序列、TRAIL编码序列及翻译终止序列等特征核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示。
用上述同样的方法，以表1所列序列为引物(所列引物只部分列举了扩增图1中所列18种融合蛋白质)，以上述所得的相应基因为模板，扩增相应编码DNA片段，限制性内切酶酶切，T4 DNA连接酶连接入已同样酶切的载体上，转化感受态细胞，筛选含重组质粒的克隆，测序鉴定证实。
表1 引物核苷酸序列表第一组扩增所编码融合蛋白质中的Kininogen D5在N端，如图1所示的A-I(p表示引物，K表示Kininogen D5，T表示TRAIL，中间数字表示所编码的氨基酸的起始或终止位置，f表示正向引物，r表示反向引物)
第二组扩增所编码融合蛋白质中的TRAIL在N端，如图1所示的a-i(为区别第一组引物，在所示引物名称后加1)
第三组氨基酸连接臂的编码序列，经过简单的变性与复性即可形成双链DNA
由此得到了一系列分别表达不同长度Kininogen D5-TRAIL融合蛋白质的重组质粒。特别的，用所列举的引物制备得到的如图1所示的18种KininogenD5-TRAIL重组融合蛋白质可直接表现出在体外杀伤肿瘤细胞，在体内抑制移植的肿瘤生长的生物学作用。
一种优选的表达Kininogen D5-TRAIL融合蛋白质的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，所推断的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
实施例5转化大肠杆菌，建立工程菌按常规将实施例4中获得的pBV-TRAIL等一系列重组表达质粒转化大肠杆菌BL21[基因型hsdS gal(λcIts857ind1 Sam7 nin5 lacUV5-T7)](可购自上海生工生物工程公司)，从氨苄抗性菌落中分离质粒DNA，酶切鉴定，测序确认，所得的阳性克隆即为表达相应蛋白质的工程菌。
实施例6制备Kininogen D5-TRAIL融合蛋白质各种培养基如下LB培养基用作试管种子培养，2×YT培养基用作二级种子培养，半合成培养基用于发酵，补料分批加入培养。
LB培养基配方(g/L)蛋白胨∶酵母粉∶NaCl＝10∶5∶5；2×YT培养基配方(g/L)蛋白胨∶酵母粉∶NaCl＝16∶10∶5；半合成发酵培养基中配方(g/L)蛋白胨∶酵母粉∶KH2PO4∶K2HPO4∶Na2HPO4.12H2O∶(NH4)2SO4∶NH4Cl＝5∶5∶2∶4∶7∶1.2∶0.2；各种微量元素溶液，浓度为(g/L)MnSO4.5H2O∶CaCl2.6H2O∶Na2MoO4.2H2O∶ZnCl2∶CuSO4.5H2O∶H3BO4∶FeSO4.7H2O∶CaCl2.2H2O∶MgSO4.7H2O＝0.001∶0.004∶0.002∶0.002∶0.001∶0.0005∶0.02∶0.02∶0.3；发酵补料配方(g/L)葡萄糖∶酵母粉∶蛋白胨∶MgSO4.7H2O＝200∶70∶70∶5.7。
培养基的pH值全部调为7.0。各种培养基高温灭菌后加入氨苄青霉素终浓度至100μg/ml。
一级种子培养过夜后，以1∶50的比例转接至二级种子，发酵罐按工作体积的5％接种入培养过夜的二级种子。培养分两个阶段进行，32℃培养5-7小时；升温至42℃培养4-5小时。恒流泵添加补料，溶解氧控制在30-50％之间。得到约20-30克/升发酵液的湿菌体。
超声破碎发酵菌体，离心取上清过0.22μm的滤膜；用NTA Supperflow(Qiagen公司)或TALON Metal Affinity Rsins(Clontech公司)行金属亲和层析，10mmol/L咪唑，pH7.0洗脱杂蛋白，再以100mmol/L咪唑，pH7.0，洗脱重组蛋白质；洗脱液过CM纤维素，收集活性组分；再过Sephacryl S-200进一步纯化，即可得到高纯度的重组融合蛋白。
结果以图1-i所示的一种融合蛋白(即TRAIL114-281-Kininogen D560-148)进行原核重组表达为例，所构建的工程菌经热诱导表达，超声破碎后，离心所分离的上清行SDS-PAGE，可见所表达的融合蛋白占上清总蛋白的10％以上，进一步纯化后达电泳纯，结果见图2。计算分子量为30.6kD，与理论值一致。推断的理论等电点为10.2。其余单独的TRAIL、Kininogen D5或两者融合诱导表达后可取得类似结果，得到相应分子量大小的重组蛋白。
实施例7融合蛋白质的生物学活性确定在本实施例中，测定融合蛋白所具有的TRAIL活性和Kininogen D5活性。
TRAIL的活性在体外可以人胰腺导管上皮细胞癌1990株细胞、人大细胞肺癌NCI-460、小鼠黑色素瘤B16等为靶细胞，确定TRAIL的生物学活性，体内以抑制裸鼠的人结肠癌HCT-8移植瘤等在体外对TRAIL敏感、在体内能成瘤的小鼠移植瘤为模型，验证TRAIL的生物学功能。
Kininogen D5的活性在体外观察Kininogen D5对在碱性上皮细胞生长因子(bFGF)存在下培养的新生内皮细胞(人脐静脉、牛主动脉、大鼠肺源毛细血管等)的抑制作用，在体内观察Kininogen D5对鸡胚鸟囊膜新生血管生长、家兔眼角膜新生血管生长、裸鼠的人结肠癌HCT-8移植瘤等为模型，验证Kininogen D5的生物学功能。
具体测试操作如下1、TRAIL活性分析杀伤各种肿瘤细胞各种靶细胞来源于中国科学院细胞研究所或上海长海医院。主要有人胰导管上皮细胞癌1990、8898株，人大细胞肺癌NCI-460，人结肠癌HCT-8，人胃癌M85株、人神经母细胞瘤SK-N-SH株、人喉癌Hep-2株、人鼻咽癌CNE-2株、人内皮细胞CEV304株、人成纤维细胞株、人结肠癌AT-29、人卵巢癌3AO、鼠成纤维L929株、人神经胶质瘤U251、人乳癌、人肝癌HepG-2、SMMU7721、人血液学肿瘤(U937、Jukart、HL60等)、黑色素瘤B16-MB、Ehrlich腹水瘤、Lewis肉瘤等。
以1990细胞为例，将培养细胞以2×108细胞/L种入96孔细胞培养板，37℃5％CO2孵箱中孵育4-6小时，弃上清；用完全培养基将样品做梯度稀释后加入细胞板；同时观察加入1.5μg/ml放线菌素D后对各种因子杀伤细胞的影响；活性单位定义使培养板孔中的细胞50％死亡为一个单位，效价即达到50％杀伤时样品稀释度的倒数。以结晶紫法作定量分析贴壁细胞弃上清，以结晶紫固定液(5g/L结晶紫，80mL/L甲醛，1g/L NaCl，200mL/L乙醇)染色15分钟，蒸馏水洗去结晶紫，晾干，被染色者为活细胞。每孔再加入200μL 330mL/L的乙酸，摇床旋转使结晶紫溶解，置酶联仪于波长595nm读出A值，以未加细胞的空白孔为A本底。悬浮细胞以MTT法确定活细胞数。其活性效价以样品稀释度的对数与A595nm的均数作直线回归，得到常数A、B，以(A对照-A本底)/2为50％杀伤终点(Y)。按Y＝A+BlgX算出样品的活性单位，即X值。同时，该细胞在TRAIL作用下呈典型的凋亡形态，在10mg/L肿瘤凋亡素作用下，2小时即观察到细胞发生典型变化。
2、新生牛主动脉内皮细胞的培养无菌条件下剪取新生牛主动脉段约10cm长共两根；在无菌层流室内，将主动脉修剪整齐，动脉分枝处以线绳结扎；以pH7.2的0.1mol/L PBS将主动脉腔冲洗，彻底去除残存的血细胞；线绳结扎主动脉一端后灌入约10ml消化液(0.2％II型胶原酶，以DMEM培养基为溶剂)，室温静置消化20分钟；取出消化液，以0.1mol/L PBS冲洗主动脉管内壁，收集冲洗液与消化液混合，放入无菌50ml离心管；500×g离心10分钟，弃上清；0.1mol/L PBS悬浮沉淀(含细胞)，500×g离心10分钟，重复一次；以含20％FBS、200μg/ml ECGF的DMEM培养液悬浮后，加入塑料细胞培养瓶，置37℃，5％CO2细胞培养箱培养；镜检有大量细胞贴壁生存后(约需3天)换液，以后每2天换液一次，待细胞生长呈单层汇合后常规传代培养。
3、大鼠肺源毛细血管内皮细胞的培养术前处理取150g左右重的SD大鼠，腹腔注射0.5％肝素钠溶液3ml，密封缸内以乙醚熏蒸麻醉动物，浸于75％酒精消毒3分钟；手术取肺开胸，剪开左心室，右心室注射PBS液10ml，冲洗肺血管至左心室流出液无色为止，剪下肺叶边缘，置PBS液中冲洗，将剪下的肺组织剪成2×2mm左右的小块，于含20％小牛血清的DMEM培养液中浸泡5分钟；将小块肺组织置于无菌、干燥的塑料细胞培养瓶中，于37℃，5％CO2孵箱中培养1.5小时，使肺组织块贴壁；正置培养小心加入含20％FBS、200μg/ml ECGF的DMEM 10ml，将组织块冲离瓶壁，置37℃，5％CO2培养箱培养；小心移去组织块并换液，以后2天换液一次，细胞生长至单层汇合后传代培养。
4.融合蛋白质抑制各种细胞增殖试验各种细胞(小鼠源肺毛细血管内皮细胞、新生牛主动脉内皮细胞、B16黑色素瘤细胞)生长汇合后(培养瓶中)，以0.125％胰酶消化，含20％FBS的DMEM悬浮并调节细胞浓度至5×104/ml，以100μl/孔接种到96孔细胞培养板，置37℃，5％CO2培养箱培养。倒置相差显微镜观察细胞贴壁后(约需4～5小时)给样品蛋白质起始浓度为2μg/孔，作2倍梯度稀释。置37℃，5％CO2培养箱中培养。48h后加入MTT溶液15μl/孔，37℃，5％CO2培养4小时；加入100μl/孔MTT法反应终止液，37℃置1h。将各孔充分混匀并去除气泡后置酶联仪检测595/630nm吸收值。
5.融合蛋白质抑制内皮细胞增殖试验以前述方法制备新生牛主动脉内皮细胞、小鼠肺源毛细血管内皮细胞悬液，调节浓度至6×104/ml，以50μl/孔接种到96孔细胞培养板中，置37℃ 5％CO2孵箱培养。待细胞贴壁后(约4～5小时)给样品设每孔0、2.5、5.0、10、20、40μl/ml六个浓度梯度，每个浓度梯度设10个平行孔。48小时后加入15μl/孔MTT溶液，37℃，5％CO2孵箱培养4小时。加入100μl/孔终止液，37℃温浴1小时。将各孔充分混匀并去除气泡后置酶联仪检测595nm/630nm双波吸收值。计算融合蛋白质50％抑制浓度。
6.融合蛋白质对家兔眼角膜诱生的新生血管的抑制试验将样品包被在一种缓释物(EVA，即ELvax40，是一种乙烯与乙烯乙酸盐的共聚物)内，植入家兔眼角膜，观察其抑制诱生血管生长的情况。样品以0.1～1μg/d的速度释放，可持续释放100天。
将50mg EVA浸泡于75％酒精10分钟，消毒后置于2ml二氯甲烷溶液中，搅拌使其溶解，加入细菌内毒素8mg和实验样品，充分搅拌使其混匀于EVA溶液中静置1小时，形成EVA胶膜，剪成小块，每块重1mg，紫外线照射30分钟，灭菌备用。家兔经静脉麻醉(3％戊巴比妥钠，40μg/kg体重)后，在眼角膜外1/3处作放射状切口(长2～3mm，深0.3～0.5mm)，用板层分离器分离角膜板层，使角膜形成3×3mm腔隙，填入一块经处理的EVA。每天观察家兔角膜生长情况，术后第10天拍照记录分析结果。
7.融合蛋白质对鸡胚尿囊膜新生血管的抑制试验样品包埋于EVA同前，但不加入内毒素。取9日龄鸡胚，无菌dH2O洗净，1/4000甲醛擦拭后，晾干，置37℃温箱孵育。次日，将鸡胚置检卵灯下寻找胚头，在距胚头前1cm，两条前卵黄静脉之间的卵壳投影部位，用蜡笔画出1×1.5cm长方形区。在鸡胚气室端钻约1.0～2.0mm的小孔并穿透气室壳膜。在蛋壳开窗位置，用75％酒精消毒后，用小锉刀沿长方形区的边线磨切透卵壳(切勿伤及下方的卵壳膜)，用眼科镊夹住长方形卵壳缘，平行向上提起，暴露出下方的卵壳膜，倾去卵壳粉尘。用注射针头循壳膜纤维方向划破直径1mm小孔，不可伤及下方的尿囊膜(CAM)。在壳膜窗上滴加无菌生理盐水少许，然后用眼科镊轻轻拨起小孔边缘的卵壳膜，让液体浸入卵壳膜与CAM之间，待CAM下沉后，剪除长方框内卵壳膜。将EVA包埋块直接放置CAM上无血管区。用灭菌透明胶带封住卵窗，用石蜡封住气室小孔，37℃孵育。三天后用眼科镊去掉CAM平面以上的卵壳及卵壳膜，注意勿伤及CAM血管。在CAM平面上滴加适量甲醇、丙酮等量混合固定液，在室温下固定15分钟。待CAM上的血管内血液凝固后，将测试区域的CAM剪下，置于盛有dH2O的碟皿中，用弯头吸管展开后，倾去皿中的dH2O，在皿底摊平CAM，翻转贴于滤纸上，拍照记录结果，分析结果。
8.融合蛋白质抑制小鼠移植瘤各种肿瘤细胞的体内外的扩增液氮冻存的肿瘤细胞复苏后培养或接种入昆明种小鼠腹腔(107细胞/小鼠)。10天后处死小鼠，无菌条件下吸取小鼠腹水，用PBS调节细胞浓度为108/ml。以该细胞悬液0.2ml接种子实验小鼠皮下。随机分组，每组6只小鼠，皮下接种的小鼠分别给予0(PBS，对照组)、10、100、1000μg(样品)/kg(小鼠体重)，隔天给药，2周。停药1周后，处死小鼠，剥离肿瘤称重，计算每组平均瘤重和抑瘤率，分析结果。抑瘤率以下式计算
结果人结肠癌细胞HCT-8移植瘤的结果如表2。
表2 HCT-8测试结果表
*这六组没有测定，是因为重组表达时融合蛋白的表达量较低，无法得到大量的纯化蛋白由表2可见，重组表达的融合蛋白对结肠癌细胞有较好的抑制作用。对其他移植瘤，如人大细胞肺癌NCI-H460，人胰腺癌SW1990，8898株，人胃癌M85，人喉癌Hep-2，人鼻咽癌CNE-2，人结肠癌AT-29，人神经胶质瘤U251，人肝癌HepG-2，黑色素瘤B16-MB，Ehrlich腹水瘤，Lewis肉瘤等模型上可取得相似的结果。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国人民解放军第二军医大学<120>激肽原第五结构域-肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的融合蛋白及其制法和用途<130>
<160>37<170>Patent In version 3.1<210>1<211>801<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1atgaaaaggc ctccaggttt ttcacctttc cgatcatcac gaatagggga aataaaagaa 60gaaacaactg taagtccacc ccacacttcc atggcacctg cacaagatga agagcgggat120tcaggaaaag aacaagggca tactcgtaga catgactggg gccatgaaaa acaaagaaaa180cataatcttg gccatggcca taaacatgaa cgtgaccaag ggcatgggca ccaaagagga240catggccttg gccatggaca cgaacaacag catggtcttg gtcatggaca taagttcaaa300cttgatgatg atcttgaaca ccaagggggc catgtccttg accatggaca taagcataag360catggtcatg gccacggaaa acataaaaat aaaggcaaaa agaatggaaa gcacaatggt420tggaaaacag agcatttggc aagctcttct gaagacagta ctacaccttc tgcacagaca480caagagaaga cagaagggcc aacacccatc ccttccctag ccaagccagg tgtaacagtt540accttttctg actttcagga ctctgatctc attgcaacta tgatgcctcc tatatcacca600gctcccatac agagtgatga cgattggatc cctgatatcc agatagaccc aaatggcctt660tcatttaacc caatatcaga ttttccagac acgacctccc caaaatgtcc tggacgcccc720tggaagtcag ttagtgaaat taatccaacc acacaaatga aagaatctta ttatttcgat780ctcactgatg gcctttctta a 801<210>2<211>417<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg Ser Ser Arg Ile Gly1 5 10 15Glu Ile Lys Glu Glu Thr Thr Val Ser Pro Pro His Thr Ser Met Ala20 25 30
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<221>MISC_FEATURE<223>融合蛋白<400>6Met Lys His Asn Leu Gly His Gly His Lys His Glu Arg Asp Gln Gly1 5 10 15His Gly His Gln Arg Gly His Gly Leu Gly His Gly His Glu Gln Gln20 25 30
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<221>misc_feature<222>(1)..(1288)<223>pBV-TRAIL的特征核苷酸序列<400>7aaattcttca acgctaactt tgagaatttt tgtaagcaat gcggcgttat aagcatttaa 60tgcattgatg ccattaaata aagcaccaac gcctgactgc cccatcccca tcttgtctgc 120acgtgcgtcc tcaagctgct cttgtgttaa tggtttcttt tttgtgctca tacgttaaat 180ctatcaccgc aagggataaa tatctaacac cgtgcgtgtt gactatttta cctctggcgg 240tgataatggt tgcatgtact aaggaggttg tatggaacaa cgcataaccc tgaaagatta 300tgcaatgcgc tttgggcaaa ccaagacagc taaagatctc tcacctacca aacaatgccc 360ccctgcaaaa aataaattca tataaaaaac atacagataa ccatctgcgg tgataaatta 420tctctggcgg tgttgacata aataccactg gcggtgatac tgagcacatc agcaggacgc 480actgaccacc atgaaggtga cgctcttaaa aattaagccc tgaagaaggg cagcattcaa 540agcagaaggc tttggggtgt gtgatacgaa acgaagcatt ggttaaaaat taaggaggaa 600ttcacaatgg tgagagaaag aggtcctcag agagtagcag ctcacataac tgggaccaga 660ggaagaagca acacattgtc ttctccaaac tccaagaatg aaaaggctct gggccgcaaa 720ataaactcct gggaatcatc aaggagtggg cattcattcc tgagcaactt gcacttgagg 780aatggtgaac tggtcatcca tgaaaaaggg ttttactaca tctattccca aacatacttt 840cgatttcagg aggaaataaa agaaaacaca aagaacgaca aacaaatggt ccaatatatt 900tacaaataca caagttatcc tgaccctata ttgttgatga aaagtgctag aaatagttgt 960tggtctaaag atgcagaata tggactctat tccatctatc aagggggaat atttgagctt1020aaggaaaatg acagaatttt tgtttctgta acaaatgagc acttgataga catggaccat1080gaagccagtt tttttggggc ctttttagtt ggctaaggat ccgtcgacct gcagccaagc1140ttggctgttt tggcggatga gagaagattt tcagcctgat acagattaaa tcagaacgca1200gaagcggtct gataaaacag aatttgcctg gcggcagtag cgcgggtggt cccacctgac1260cccatgccga actcagaagt gaaacccc 1288
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<213>人工序列<400>34acgaattcac aatggtgaga gaaagaggtc 30<210>35<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>35acggatcctt agccaactaa aaag 24<210>36<211>274<212>DNA<213>人工序列<400>36aaagatctct cacctaccaa acaatgcccc cctgcaaaaa ataaattcat ataaaaaaca 60tacagataac catctgcggt gataaattat ctctggcggt gttgacataa ataccactgg 120cggtgatact gagcacatca gcaggacgca ctgaccacca tgaaggtgac gctcttaaaa 180attaagccct gaagaagggc agcattcaaa gcagaaggct ttggggtgtg tgatacgaaa 240cgaagcattg gttaaaaatt aaggaggaat tcaca274<210>37<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>37aaggatccgt cgacctgcag ccaagcttgg ctgttttggc ggatgagaga agattttcag 60
权利要求
1.一种融合蛋白质，其特征在于，它包括(a)激肽原第五结构域元件，该元件具有人激肽原第五结构域或其活性片段的氨基酸序列；(b)肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体元件，该元件具有人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体或其活性片段的氨基酸序列；以及(c)位于激肽原第五结构域元件和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体元件之间的1-20个氨基酸的连接序列。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的激肽原第五结构域元件具有SEQ ID NO.2中第1-266位、24-153位、或60-148位的氨基酸序列；所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体元件具有SEQ ID NO.4中第1-281位、95-281位、114-281位的氨基酸序列；而且，所述的接头肽序列含4-10个氨基酸。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白包括SEQ IDNO.6中所示的氨基酸序列。
4.一种分离的DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的融合蛋白质。
5.如权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，它包括SEQ ID NO.5中所示的核苷酸序列。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求4所述的DNA分子。
7.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。
8.一种产生权利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，它包括步骤在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞，从而表达出所述的融合蛋白；和分离所述的融合蛋白。
9.一种药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效量的权利要求1所述的融合蛋白。
10.权利要求1所述的融合蛋白的用途，其特征在于，用于制备治疗肿瘤的药物。
全文摘要
本发明提供了人激肽原第五结构域与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的融合蛋白(Kininogen D5－TRAIL融合蛋白)，编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该融合蛋白的方法，以及含该融合蛋白的药物组合物。本发明的Kininogen D5－TRAIL融合蛋白既具有Kininogen D5抑制肿瘤新生血管内皮细胞生长的功能，又具有TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的作用，可以用于制备治疗如肿瘤等疾病的药物。序列表编号说明SEQ ID NO.1Kininogen D5编码核苷酸序列；SEQ ID NO.2Kininogen D5蛋白质氨基酸序列；SEQ ID NO.3TRAIL编码核苷酸序列；SEQ ID NO.4TRAIL蛋白质氨基酸序列；SEQ ID NO.5融合蛋白核苷酸序列；SEQ ID NO.6融合蛋白氨基酸序列；SEQ ID NO.7pBV－TRAIL的特征核苷酸序列；SEQ ID NO.8－37各种引物和接头的核苷酸序列。
文档编号C12N15/63GK1546528SQ20031010926
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月10日 优先权日2003年12月10日
发明者王梁华 申请人:中国人民解放军第二军医大学