专利名称：治疗脱髓壳紊乱的方法
技术领域：
本发明涉及治疗多发性硬化症的领域，具体为通过抑制CNS和周围神经胶质细胞(少突胶质细胞和施旺细胞)及这些谱系内的祖细胞的EphB1介导的细胞排斥而治疗多发性硬化症的领域。
背景技术：
引用的所有文件在此以其整体引入作为参考。
生促红细胞生成素肝细胞(“Eph”)受体(erythropoietin-producinghepatocellular(“Eph”)receptor)是含有细胞外区域以及细胞内酪氨酸激酶结构域的受体酪氨酸激酶家族，所述细胞外区域具有独特的富含半胱氨酸的基序以及两个纤连蛋白III型基序(Connor RJ和Pasquale EB(1995)Oncogene 112429-381995)，所述细胞内酪氨酸激酶结构域涉及信号转导(Vindis等人，J Cell Biol.2003 Aug 18；162(4)661-71)。Eph受体涉及神经发育和生理学，并在发育的及成人神经系统中表达(Tuzi NL和Gullick WJ.(1994) Br.J.Cancer 69417-21)。Eph受体的配体被称为肝配蛋白。所有已知的肝配蛋白配体都是膜结合的。肝配蛋白A亚类通过糖基化磷脂酰(“GPI”)基团与膜结合。肝配蛋白B亚类通过跨膜结构域结合(Flanagan和Vanderhaeghen，Annu.Rev.Neurosci.1998.21309-45)。肝配蛋白配体通过直接的细胞-细胞接触与其Eph受体相互作用(Davis，S.等人，(1994)Science 266，816-819；Drescher，U.等人，(1997)Curr.Opin.Neurobiol.7，75-80；Flanagan，J.G.和Vanderhaeghen，P.(1998)Annu.Rev.Neurosci.21，309-345；Frisen，J.等人，(1999)EMBO J.18，5159-5165；Mellitzer，G.等人，(1999)Nature 400，77-81)。
已显示肝配蛋白配体起排斥性轴突导向信号的作用，Eph受体系正确的体内轴突定位(axonal navigation)所必需(Holland，S.J.等人，(1998)Curr.Opin.Neurobiol 8，117-127)。EphB1受体酪氨酸激酶(“EphB1”)(也被称为Elk、Cek6、Net和Hek6)通过建立适当的空间分布型而在中枢和周围神经系统发育中担当重要角色。已显示EphB1受体与肝配蛋白B配体的相互作用在神经发育中发挥作用(Smith等人，Curr Biol.1997 Aug1；7(8)561-70)。例如，EphB1和肝配蛋白B2以互补的模式表达于中脑多巴胺能神经元及其靶标中，这提示其相互作用可能在建立不同的神经通路中起作用(Yue等人，J Neurosci.1999 Mar15；19(6)2090-101)。已显示EphB在突触形成(Dalva等人，(2000)Cell 103945)及细胞迁移和增殖(Conover等人，(2000)Nature Neurosci 31091)中发挥作用。已发现Eph受体和肝配蛋白配体与细胞运动性相关信号传导通路有关，确证了它们在细胞迁移和排斥中的作用(Schmucker和Zipursky(2001)Cell 105701)。肝配蛋白B1表达于与新生皮质神经发生相关的神经上皮细胞(Stuckmann等人，(2001)JNS 212726)。除神经元发育之外，已显示Eph和肝配蛋白在成人CNS中起作用。例如，已显示EphB1和肝配蛋白B相互作用在脊髓中调节突触效率和的疼痛加工(Battaglia等人，(2003)Nature Neurosci 6339)。
因为Eph家族和肝配蛋白家族都是膜结合的，并且通过直接的细胞-细胞相互作用彼此交流，指定Eph家族为“受体”而肝配蛋白为“配体”有些武断。事实上，已显示Eph和肝配蛋白之间的信号转导可以是双向的。与Eph受体的相互作用导致肝配蛋白B配体成为酪氨酸磷酸化的并且转导细胞内信号，所述细胞内信号导致表达肝配蛋白B的细胞的细胞骨架重组(Xu等人，J.Biol.Chem.，2003，278卷，27期，24767-24775)。已显示肝配蛋白B转导使用Grb4蛋白质的反转的信号通路，所述Grb4蛋白质是已知的SH2/SH3结构域衔接蛋白质(adaptor protein)(Cowan CA及Henkemeyer M.，Nature.2001 Sep13；413(6852)174-9)。
肝配蛋白配体高度表达于中枢神经系统(CNS)生发区(germinalregion)(Conover等人，2000，Nature Neurosci.，卷3，第11期，1091-1097；Stuckmann等人，2001，J.Neurosci.，卷21，第8期，2726-2737)，提示其可能涉及调节神经胶质祖细胞迁移进周围的软脑膜中及跨越中线的轴突导向。
申请人已显示Eph通过调节细胞迁移在神经发育中发挥作用。通过使用抗Eph抗体和PCR，显示EphB1表达于培养的未成熟或成熟啮齿目少突胶质细胞，且EphB1表达水平随细胞成熟而降低。这些研究也证实少突胶质细胞迁移可受肝配蛋白B配体影响。
使用被称为条纹测定法(stripe assay)(修改自Bonhoeffer等人，Development.1987 Dec；101(4)685-96)的细胞迁移测定法测量肝配蛋白B配体对少突胶质细胞迁移的作用。在典型的条纹测定中，将推定的引诱剂或排斥物以称为条纹的线形固定在平板上。然后将细胞悬液置于平板上并使其平衡。随后，测量细胞迁移相对于条纹的速度和方向。如果条纹含有化学排斥物，皿中的细胞将不会迁移到条纹区中或从条纹迁移到远处。因此，如果观察到细胞远离条纹或从条纹迁移到远处，则将该条纹的内容物鉴定为所述类型细胞在细胞培养中的化学排斥物。
尽管Ephs和肝配蛋白在体内通过直接细胞-细胞相互作用而相互作用，经显示，Eph或肝配蛋白的细胞外结构域与IgG Fc连接可以产生能够活化其各自肝配蛋白或Eph的可溶性融合蛋白(Kaneko M和Nighorn A，J Neurosci.2003 Dec17；23(37)11523-38)。
使用肝配蛋白B-Fc融合蛋白进行条纹测定，所述肝配蛋白B-Fc融合蛋白能够活化EphB1受体而不需要细胞-细胞相互作用。将肝配蛋白B-Fc融合蛋白以称为条纹的线形区域黏着于平板上。然后将少突胶质细胞悬液置于平板上，并测量培养的少突胶质细胞相对于肝配蛋白B-Fc条纹迁移的速度和方向。经显示肝配蛋白B-Fc条纹在体外排斥培养的少突胶质细胞的迁移。
在CNS中，轴突周围的髓壳作为增加信号沿轴突传播的速度的绝缘体。髓壳由少突胶质细胞产生，并由环绕轴突的多层少突胶质细胞膜组成。在例如多发性硬化症(MS)的脱髓壳疾病中，神经学症状由脱髓壳轴突中受损的传导引起。其他脱髓壳紊乱包括脑桥中央髓壳溶解症、脑白质营养不良、急性播散性脑脊髓炎、进行性多发性脑白质病和亚急性硬化性全脑炎。脱髓壳MS病灶的神经病理学检查显示少突胶质细胞数量的明显减少。在急性和慢性MS损伤中均发现少突胶质细胞的损失。这提示MS病灶中少突胶质细胞的减少是少突胶质细胞死亡的结果(Bruck，W.等人，(1994)Ann Neurol 35，65-73)。
经显示，肝配蛋白配体直接抑制少突胶质细胞和神经元迁移。此外，EphB1受体和相应的肝配蛋白配体在病理条件下上调，提示这些受体涉及限制疾病组织中的细胞迁移，所述病理条件包括多发性硬化损伤、脊髓损伤、以及肺和乳腺肿瘤(Bundesen等人，2003，J.Neurosci.，23(21)，7789-7800)。
在MS损伤中及周围存在新形成的少突胶质细胞，提示自我修复的可能性，如果这些细胞能够迁移到损伤中。最近的研究提示这些少突胶质细胞祖细胞的迁移可能受EphB1介导的抑制性信号表达的影响。另外提示干扰EphB1信号转导途径可能允许少突胶质细胞祖细胞向损伤的脑组织区域中迁移并积极影响修复过程。
因此，需要鉴定干扰EphB1介导的细胞排斥的化合物。通过提出EphB1受体活性调节子的筛选测定法，本发明提供鉴定干扰EphB1信号转导通路的化合物的方法。另外想要使用这些鉴定的化合物治疗遭受诸如MS之类脱髓壳紊乱的患者。
发明简述一方面，本发明涉及鉴定能够抑制EphB1活性的化合物的方法，包括步骤于不存在候选化合物时测量EphB1活性；并于存在候选化合物时测量EphB1活性，如果于存在候选化合物时测量的活性低于不存在候选化合物时测量的活性，则将其中所述候选化合物鉴定为能够抑制EphB1活性。本发明另一方面，可以通过下列三个测定法之一测量EphB1活性细胞排斥测定法、酪氨酸激酶测定法、以及体内测定法。
可以通过将肝配蛋白B配体固定到平板上的特定区域，向平板加入表达EphB1的细胞的悬液，并测量细胞相对于特定区域的迁移速率、程度和方向而测量细胞排斥。可以将肝配蛋白B配体以肝配蛋白B-Fc融合蛋白、以细胞表面表达的蛋白质(其中细胞固定于平板上)、或以整合质膜中的蛋白质(其中质膜固定于平板上)固定于平板上。
通过测量EphB1细胞内酪氨酸激酶结构域的磷酸化活性而确定EphB1酪氨酸激酶活性。可以在完整细胞中测量酪氨酸激酶活性。
可以通过测量脱髓壳动物模型中修复的进程或速率而体内确定EphB1活性。动物模型可以是啮齿动物EAE或EtBr诱导的损伤。
另一方面，本发明涉及通过在需要这类治疗的人宿主中施用抑制EphB1基因产物活性的化合物而在人宿主中抑制EphB1活性，其中通过在不存在候选化合物时测量所述EphB1基因产物活性及在存在候选化合物时测量所述EphB1基因产物活性而鉴定该化合物抑制EphB1基因产物活性的能力，如果在存在候选化合物时测量的活性低于不存在候选化合物时测量的活性，则将其中所述候选化合物鉴定为能够抑制EphB1活性。另一方面，将该化合物作为含有该化合物及可药用附加物的药物组合物施用。
附图简述
图1是描述EphB1 mRNA在大鼠少突胶质细胞祖细胞(OLP)、成熟少突胶质细胞(OL)、星形胶质细胞和小胶质细胞中相对水平的柱状图。
图2是描述EphB1 mRNA在选自全身的多种人组织类型中相对水平的图表。
图3是描述EphB1 mRNA在成人脑不同亚区中相对水平的图表。
图4是描述EphB1 mRNA在人病理组织中相对水平的图表。
图5是描述EphB1 mRNA在正常和MS脑的脑白质中相对水平的柱状图。MS组织样品代表基于组织病理学评价的不同严重程度的损伤(“MS-PVC”，为含有血管周尖瓣(perivascular cusp)的组织；“50％斑块”，为含有少于或约等于50％斑块的组织；“＞50％斑块”，为含有多于50％斑块的组织；“100％斑块”，为含有100％斑块的组织；“MS-NAWM””，为含有正常“外观”白质的组织；“C-WM”，为正常成年脑组织)。
图6是描述EphB1在包括不同严重程度MS损伤的多种组织类型中相对表达水平的柱状图。
发明详述对多种细胞类型分析一系列的EphB1 mRNA表达谱，以确定其中表1达EphB1 mRNA的组织及相对表达水平。
发现EphB1 mRNA水平在少突胶质细胞中富集。图1是描述EphB1mRNA在四种细胞类型中相对表达水平的柱状图成熟少突胶质细胞(“OL”)、少突胶质细胞祖细胞(“OLP”)、星形胶质细胞和小胶质细胞。使用实时逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)测定法进行EphB1表达的测量。RT-PCR是本领域中充分确定的基于荧光的稳态mRNA水平定量测定法。在所述RT-PCR测定法中，将EphB1 mRNA逆转录并使用PCR扩增。使用经过特别设计的含有荧光团和猝灭剂的探针进行PCR，以便荧光团在各轮扩增中与其猝灭剂分离，从而荧光水平与扩增的EphB1的量成比例增加。测量达到预定阈值的荧光水平所需的扩增周期数。将达到预定阈值的荧光水平所需的扩增周期数定义为Ct。进行许多扩增反应并测量若干Ct值。然后计算这些Ct值的平均值。将平均Ct值定义为dCt。达到该阈的循环数大指示低转录起始数量。反之，达到该阈所需的循环数越少，转录起始数量越高。因此，mRNA表达与dCt成反比。除非另外指出，通过将测量的mRNA表达水平相对于一个或多个管家基因(例如18S RNA或β2微珠蛋白)的表达水平标准化而计算此处图表中描述的表达水平。如图1所示，与星形胶质细胞和小胶质细胞相比，EphB1 mRNA水平在大鼠少突胶质细胞祖细胞(“OPL”)和成熟少突胶质细胞(“OL”)中显著富集。
发现EphB1 mRNA水平在人中枢神经系统(“CNS”)中富集。图2是描述EphB1 mRNA在选自全身的多种组织类型中相对表达水平的图表。使用RT-PCR测量该水平。如图2所示，EphB1 mRNA在胎儿和成人脑组织中具有相对高的表达水平。
在成人CNS内，EphB1 mRNA以较低水平表达于人成人白质。图3是描述EphB1 mRNA在成人脑不同亚区中相对表达水平的图表。如图3所示，EphB1 mRNA在成人白质中相对低。
经显示，EphB1 mRNA表达水平在某些人疾病中升高。如图4所示，EphB1 mRNA水平在人肺和乳腺肿瘤中升高。这些组织类型中的表达提示EphB1涉及调节疾病组织中的细胞迁移。
图5是描述EphB1 mRNA在不同严重性的MS损伤中的表达水平。如图5所示，EphB1 mRNA水平随斑块物质量的增加而增加，提示其在MS损伤的灰质中最高。类似地，图6是描述EphB1 mRNA在不同严重性的MS损伤中相对于正常白质的表达柱状图。如图6所示，EphB1 mRNA表达水平在最严重的MS损伤中最高。
这些结果表明，在MS斑块中及周围，在其细胞表面表达EphB1的神经胶质祖细胞受到增加的肝配蛋白B介导的细胞排斥，其向炎症及脱髓壳区域中迁移的能力从而被显著削弱或阻止。如果封闭肝配蛋白B介导的细胞排斥，则预计迁移到MS损伤中的少突胶质细胞祖细胞将数量增加，它们在所述损伤中与轴突相互作用、分化并重新形成髓壳。
干扰表达EphB1细胞(例如少突胶质细胞)的肝配蛋白B介导的细胞排斥的一种方法包括鉴定能够干扰EphB1受体和肝配蛋白B配体之间相互作用或EphB1功能，特别是EphB1信号通路的化合物。然后可以将这类鉴定的化合物施用于遭受脱髓壳紊乱(例如多发性硬化症)的患者。其他脱髓壳紊乱包括脑桥中央髓壳溶解症、脑白质营养不良、急性播散性脑脊髓炎、进行性多发性脑白质病和亚急性硬化性全脑炎。
在本发明的一个实施方案中，通过于存在或不存在候选化合物时测量肝配蛋白B介导的细胞排斥速率，将化合物鉴定为能够干扰这种排斥。
一种用于测量细胞排斥速率的测定法称为条纹测定法(Bonhoeffer等人，Development.1987 Dec；101(4)685-96)。对于本发明，“条纹测定法”是体外进行的细胞迁移测定法，其中将推定的引诱剂或排斥物固定在平板上的一个或多个被称为条纹的线形区域中，并且将细胞培养物置于平板上，并测量细胞相对于条纹的迁移速率和方向。
典型的条纹测定法采用一个线形区域(称为条纹)，其含有黏附在平板上的推定的排斥物分子，以及在条纹附近放有细胞悬液，所述线形区域。然后使用实时照片成像技术(real time photoimaging technique)测量细胞迁移的程度、速率和/或方向。如果条纹含有化学排斥物，细胞将远离条纹或从条纹迁移。条纹测定法的另一个变体采用一系列平行的含有推定排斥物分子的线形区域(称为条纹)，所述平行线形区域相隔已知距离，称为间隙。在该变体中，如果条纹含有排斥物，细胞培养物中的细胞将远离条纹或从条纹迁移到条纹之间的间隙中。
在一个条纹测定法实施方案中，采用含有黏附的肝配蛋白B-Fc融合蛋白的条纹。尽管Eph和肝配蛋白在体内通过直接的细胞-细胞相互作用而相互作用，已显示将Eph或肝配蛋白的细胞外结构域与IgG Fc连接可以产生可溶性融合蛋白，所述融合蛋白能够活化其各自的肝配蛋白或Eph(Kaneko M，及Nighorn A，J Neurosci.2003 Dec 17；23(37)11523-38)。肝配蛋白B-Fc融合蛋白包含与IgG免疫球蛋白Fc区有效连接的肝配蛋白B受体的功能部分。在Beckmann，M.P.等人，EMBO J.133757-3762(1994)和Davis，S.等人，Science 266，816-819(1994)中描述了合适的肝配蛋白B-Fc融合蛋白的构建。在备选的实施方案中，条纹包含固定的细胞膜，所述细胞膜包含肝配蛋白B配体。在另一个实施方案中，条纹包含在其表面表达肝配蛋白B配体的黏附的细胞。
在上面引用的测定法的改良中，实施两组条纹测定，测量表达EphB1的细胞相对于条纹的细胞迁移程度、速率和方向。在第一组测定中，于不存在候选化合物时测量迁移。在第二组中，加入化合物，并于候选化合物存在下测量迁移。然后比较两组测定之间迁移的程度、速率和方向。如果当候选化合物存在时所测量的向条纹上迁移的程度增加，或细胞远离条纹迁移的程度或速率低于其不存在时，则鉴定其为能够干扰肝配蛋白B介导的细胞排斥的化合物。类似地，如果当候选化合物存在时所测量的细胞向条纹中的迁移程度或方向更高，或细胞远离条文迁移的程度或方向更低，则鉴定其为能够干扰肝配蛋白B介导的细胞排斥的化合物。在备选的实施方案中，细胞迁移测定法使用以不同于线形的形状固定于平板上的排斥物分子。例如，可以将排斥物固定于平板上的一个特定点。
降低表达EphB1细胞的肝配蛋白B介导的细胞排斥的另一条途径是通过调节EphB1信号通路而干扰其功能。EphB1蛋白含有涉及信号转导的细胞内酪氨酸激酶结构域(Vindis等人，J Cell Biol.2003 Aug 18；162(4)661-71)。EphB1的细胞内酪氨酸激酶结构域位于SEQ ID NO1的第613至881位。干扰该酪氨酸激酶结构域的功能将阻止沿EphB1通路的信号转导，从而削弱肝配蛋白B介导的细胞排斥。
因此，在本发明的另一个实施方案中，通过于存在和不存在候选化合物时测量EphB1介导的酪氨酸激酶活性将化合物鉴定为能够干扰EphB1细胞内酪氨酸激酶结构域的酪氨酸激酶活性。在本实施方案中，实施两组酪氨酸激酶测定。于不存在候选化合物时实施第一组。在第二组中，加入化合物，并在该化合物存在下测量活性。然后比较两组测定之间的酪氨酸激酶活性。如果候选化合物存在时测定的酪氨酸激酶活性显著低于其不存在时，则鉴定其为能够干扰EphB1细胞内酪氨酸激酶结构域酪氨酸激酶活性的化合物。
本领域充分确定了测量酪氨酸激酶活性的方法。例如，可以通过商业途径从Roche Molecular Biosystems、Calbiochem、Chemicon、Perkin-Elmer Life Sciences、Upstate Biotechnologies和Applied Biosystems获得酪氨酸激酶测定试剂盒。酪氨酸激酶测定法可以采用包含荧光标签的底物肽、以及固定于例如珠子或孔这类表面的磷酸化酪氨酸特异性抗体。由于底物肽是磷酸化的，它与抗体接合，其荧光标签由此局限于附有抗体之处。如果底物没有成为磷酸化的，则底物及其荧光标签保持弥散。可以通过在附有抗体的位置确定荧光水平而测量酪氨酸激酶活性水平。
也可以在完整的表达EphB1的细胞中或在表面包含EphB1蛋白的小的质膜囊泡中测量酪氨酸激酶活性。可以通过超声处理完整的表达EphB1的细胞产生这些囊泡。也可以使用表达EphB1细胞的细胞裂解液或使用分离的包含其细胞内结构域的EphB1片段测量酪氨酸激酶活性。重组产生的EphB1细胞内酪氨酸激酶结构域也可以用于实施上述发明。在该实施方案中，将EphB1酪氨酸激酶结构域的DNA序列(SEQ ID NO2第2051至2857的核苷酸)克隆到表达载体(例如可从New England Biolabs获得的pMAL载体)中，然后在大肠杆菌(E.coli)细胞中表达所述表达载体，并根据pMAL系统方案纯化(New England Biolabs pMAL Protein Fusionand Purification System Manual，可从New England Biolabs获得)。
可以通过测量EphB1信号通路上其他元件的活性而测量EphB1活性。已知的EphB1下游元件包括Cdc42和Rac(Murai及Pasquale，Journal ofCell Science 116，2823-2832(2003))。Cdc42和Rac是GTP酶，其活性可以通过测量从标记的GTP底物释放的标记量或通过测量荧光共振能量转移(“FRET”)测定法(Kraynov，V.S.等人，Science 290333-337(2000)所述)而测量。典型的FRET测定法测量从底物释放的荧光团，所述底物经显微注射到完整细胞中。在该实施方案中，在两组测定中测量下游元件的活性。于不存在候选化合物时实施第一组。在第二组中，加入化合物，并在该化合物存在下测量活性。然后比较两组测定之间的下游元件活性。如果候选化合物存在时测量的酪氨酸激酶活性显著低于其不存在时，鉴定其为能够干扰EphB1细胞内酪氨酸激酶结构域酪氨酸激酶活性的化合物。
在本发明的另一个实施方案中，在脱髓壳和髓壳再形成动物模型(包括大鼠、小鼠及绒猴中的哺乳动物溴化乙锭(“EtBr”)和实验性自身免疫脑脊髓炎(“EAE”)模型)中体内测量候选化合物对肝配蛋白B介导的细胞排斥的作用。在本实施方案中，在动物中诱导“MS”样症状和病理生理学。然后以候选化合物处理动物。监测MS在动物中的进展。一般将MS在动物模型中的进展量化为称为“临床评分”的数值，基于动物中MS症状的严重性，所述临床评分一般在零(健康)到5(垂危或死亡)范围内。在特定的时间点，将动物处死并通过勒克司坚牢蓝(LUXOL FAST BLUE，“LFB”)和髓鞘碱性蛋白(“MBP”)染色证实髓壳再形成而评价髓壳再形成。如果经过处理的动物比未经处理的动物显示显著改善的临床评分或髓壳再形成，将候选化合物鉴定为能够干扰肝配蛋白B介导的细胞排斥。另外，化合物功效可以是与未经处理的动物相比，增加髓壳再形成的速率和/或程度。
候选化合物的实例包括但是不限于小分子(通过例如组合的化学方法产生)或大分子(例如蛋白质、核酸、碳水化合物、脂类、糖蛋白、脂蛋白、多糖、上述分子的任何修饰衍生物、以及包含一个或多个上述分子的任何复合物)。候选化合物的一个实例是用于RNA干涉(“RNAi”)的双链RNA。RNAi是在例如美国专利No.6,506,559中详细描述的抑制目的基因表达的方法。在美国专利申请公开No.20020086356和20030108923中进一步描述了RNAi方法及材料，Tuschl，Chembiochem.2；2(4)239-45(April，2001)中提供了RNAi综述。
可以将通过前述方法鉴定的化合物以单独或者与可药用载体或赋形剂组合的药物组合物的形式施用。可以以使鉴定的化合物可生物利用有效量的任何形式或模式施用化合物。可以经口、皮下、肌肉内、静脉内、经皮、鼻内、经直肠、经眼等施用鉴定的化合物。优选口服。可以使鉴定的化合物的药物组合物适于施用途径。如果施用途径是经口、胃肠外或局部的，鉴定的化合物的药物组合物的实例包括片剂、锭剂、胶囊、酏剂、糖浆、干胶片、口香糖、栓剂、溶液或悬液剂。优选的鉴定化合物的口服药物组合物包含该化合物和惰性稀释剂或可食用载体。通过确定化合物的具体特征、受治疾病、疾病阶段、其他患者的反应及其他相关情况，制备药物制剂的技术人员可易于确定所鉴定化合物的适宜形式。
可能需要将鉴定的化合物施用于脑。将鉴定的化合物施用于脑的方法的实例包括但是不限于手术期间局部输注、注射、使用导管、使用栓剂或使用植入物。植入物可以包含多孔的、非多孔的或凝胶状材料，包括膜(例如唾液酸膜或纤维)。当需要将药物导向中枢神经系统时，可以使用能够条件性开放血脑屏障的技术，开放的时间足以递送药物通过。例如，可以使用5％的甘露糖和水的组合物。
预期在疾病活跃阶段和好转期间将单独或与一种或多种抗炎剂组合周期性施用本发明的药物组合物。当施用恰当时，预期本发明的药物组合物将使表达EphB1的细胞(例如少突胶质细胞祖细胞)迁移到表达细胞排斥效应子(例如肝配蛋白B配体)的患病部位。另外预期本发明的材料和方法可以用于治疗其他能够通过减轻细胞排斥而改善的病状，包括脱髓壳相关病状。
权利要求
1.鉴定化合物的方法，所述化合物能够抑制肝配蛋白B介导的EphB1活性，所述方法包括步骤(a)在不存在候选化合物时测量所述EphB1的活性；和(b)在存在候选化合物时测量所述EphB1的活性，其中如果在步骤(b)中测量的活性低于步骤(a)中测量的活性，将所述候选化合物鉴定为能够抑制肝配蛋白B介导的EphB1活性。
2.权利要求1的方法，其中所述测量步骤(a)包括在不存在候选化合物时测量肝配蛋白B介导的表达EphB1的细胞的排斥，且所述测量步骤(b)包括于存在所述候选化合物时测量肝配蛋白B介导的所述细胞的排斥。
3.权利要求2的方法，其中所述肝配蛋白B介导的细胞排斥的测量包括步骤(i)将肝配蛋白B配体固定于平板上至少一个特定区域；(ii)向所述平板加入表达EphB1的细胞培养物；并(iii)测量所述细胞培养物相对于所述至少一个特定区域的迁移程度、速率和方向。
4.权利要求3的方法，其中所述肝配蛋白B配体是肝配蛋白B-Fc融合蛋白。
5.权利要求3的方法，其中所述肝配蛋白B配体通过表达肝配蛋白B的细胞固定于所述平板。
6.权利要求3的方法，其中所述肝配蛋白B配体通过质膜固定于所述平板。
7.权利要求1的方法，其中所述测量步骤(a)包括在不存在所述候选化合物时测量EphB1细胞内酪氨酸激酶结构域的激酶活性，且所述测量步骤(b)包括在存在所述候选化合物时测量EphB1细胞内酪氨酸激酶结构域的激酶活性。
8.权利要求7的方法，其中所述EphB1细胞内酪氨酸激酶结构域的活性测量中测量的是完整细胞的酪氨酸激酶活性。
9.权利要求1的方法，其中所述测量步骤(a)包括在不存在所述候选化合物时在动物中测量脱髓壳紊乱的进程，且所述测量步骤(b)包括在存在所述候选化合物时在动物中测量脱髓壳紊乱的进程或修复的速率/程度。
10.权利要求9的方法，其中所述动物选自实验性自身免疫脑脊髓炎(“EAE”)及溴化乙锭(“EtBr”)模型。
11.在人宿主中抑制EphB1活性的方法，包括向需要这类治疗的人宿主施用抑制EphB1基因产物活性的化合物，其中如下鉴定抑制EphB1基因产物活性的化合物的能力(a)在不存在候选化合物时测量所述EphB1基因产物的活性；和(b)在存在所述候选化合物时测量所述EphB1基因产物的活性，其中如果在步骤(b)中测量的活性低于步骤(a)中测量的活性，将所述候选化合物鉴定为能够抑制EphB1活性。
12.权利要求11的方法，其中将所述化合物以包含所述化合物和可药用佐剂的药物组合物施用。
13.权利要求11的方法，其中所述测量步骤(a)包括在不存在候选化合物时测量肝配蛋白B介导的表达EphB1的细胞的排斥，并(b)在存在候选化合物时测量肝配蛋白B介导的所述细胞的排斥。
14.权利要求13的方法，其中所述测量肝配蛋白B介导的细胞排斥包括步骤(i)将肝配蛋白B配体固定于平板上至少一个特定区域；(ii)向所述平板加入表达EphB1的细胞培养物；并(iii)测量所述细胞培养物相对所述至少一个特定区域的迁移程度、速率和方向。
15.权利要求14的方法，其中所述肝配蛋白B配体是肝配蛋白B-Fc融合蛋白。
16.权利要求14的方法，其中所述肝配蛋白B配体通过表达肝配蛋白B的细胞固定于所述平板。
17权利要求14的方法，其中所述肝配蛋白B配体通过质膜固定于所述平板。
18.权利要求11的方法，其中所述测量步骤(a)包括在不存在所述候选化合物时测量EphB1细胞内酪氨酸激酶结构域的激酶活性，且所述测量步骤(b)包括在存在所述候选化合物时测量EphB1细胞内酪氨酸激酶结构域的激酶活性。
19.权利要求18的方法，其中EphB1细胞内酪氨酸激酶结构域的活性测量中测量的是完整细胞的酪氨酸激酶活性。
20.权利要求11的方法，其中所述测量步骤(a)包括在不存在所述候选化合物时在动物中测量脱髓壳紊乱的进程，且所述测量步骤(b)包括在存在所述候选化合物时在动物中测量脱髓壳紊乱的进程或修复的程度/速率。
21.权利要求20的方法，其中所述动物选自实验性自身免疫脑脊髓炎(“EAE”)及溴化乙锭(“EtBr”)模型。
全文摘要
鉴定并使用能够治疗脱髓壳紊乱(例如多发性硬化症)的化合物的方法，所述化合物抑制EphB1介导的中枢神经系统(CNS)和周围神经系统(PNS)神经胶质细胞(少突胶质细胞和施旺细胞及这些谱系内的祖细胞)的细胞排斥。
文档编号G01N33/68GK101019029SQ200580016192
公开日2007年8月15日 申请日期2005年5月4日 优先权日2004年5月6日
发明者K·尚德罗斯, J·梅里尔, S·纳特森 申请人:安万特药物公司