专利名称：：Ⅱ型胶原变构肽鼻粘膜给药治疗类风湿关节炎的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及n型胶原变构肽鼻粘膜给药治疗类风湿关节炎的应用。一、
背景技术：
类风湿关节炎(RA)是一种以慢性侵袭性关节病变为主要表现的全身性自身免疫病。在中国的患病率为0.34%,全国有近500万患者，致残率高达93%。该病的发病过程是一种受抗原驱动的"激发一连锁免疫反应"的过程。感染因子及自身免疫反应介导的免疫损伤是类风湿关节炎发病及病情演变的基础。抗原多肽通过体内的抗原提呈细胞表达，并激活T淋巴细胞，导致细胞因子的释放、免疫球蛋白、趋化因子及自由基等炎性介质产生增多，进而引起血管炎，滑膜增生，软骨及骨破坏等类风湿关节炎的特征性病理变化。目前，尚无从根本上控制类风湿关节炎的药物。临床上主要通过非甾体抗炎药如布洛芬及双氯芬酸等暂时缓解症状。而慢作用抗风湿药如甲氨喋呤及来氟米特等则是通过抑制DNA合成广泛抑制免疫反应，进而抑制关节炎症。因此，这些药物在类风湿关节炎治疗中并非作用于发病的最初环节，难以针对性的控制病变，致使全身及关节病变不断进展，最终致残。而且，由于这些药物的广泛免疫抑制作用，骨髓抑制，肝功能异常等不良反应较多，致使很多患者不能接受这些药物治疗。本发明人经过多年研究发现了可以用以治疗类风湿关节炎的n型胶原(CII)变构肽。研究证明，CII变构肽能够抑制HLA-DRJ31分子以及T细胞对抗原的识别和由此而致的自身免疫反应，从类风湿关节炎发病的中心环节遏止本病的发生和发展。本申请中将CII变构肽进行鼻粘膜给药治疗类风湿关节炎。二、发明概述本发明的目的是提供CII变构肽治疗类风湿关节炎的鼻粘膜给药途径。本发明所用术语"CII变构肽"指CII263-272多肽中任意一个或多个氨基酸进行修饰后仍能够与HLA-DR(31结合的多肽。用于修饰氨基酸的方法是本领域技术人员熟知的。本发明中所应用的Cn变构肽主要是以短侧链的丙氨酸(A)连续替换CII263-272多肽中T细胞受体(TCR)识别位点及与HLA-DRpi亲和力相关的特定氨基酸，设计合成多条CII263-272变构肽，变构肽与HLA-DRP1分子有亲和力，但不被T细胞受体识别。HLA-DR(31、抗原多肽及TCR三分子之间的相互识别和结合是类风湿关节炎异常免疫反应的中心环节。CII变构肽可以竞争性抑制致病抗原的作用及T细胞对抗原的识别，遏止类风湿关节炎患者体内的异常免疫反应，从而控制发病及病变的进展，达到从根本上治疗类风湿关节炎的目的。已经证明，HLA-DRP1中的第70—74位氨基酸含有一段共同序列QK/RRAA(即Gln-Lys/Arg-Arg-Ala-Ala，谷氨酰胺-赖氨酸/精氨酸-精氨酸-丙氨酸-丙氨酸)(1)，该段共同序列与HLA-DR(31抗原结合槽的形成有关，是其结合抗原的功能氨基酸。本发明人和Wucherfennig等的大量研究证明该序列中带正电荷的第71位氨基酸(Lys或Arg)是抗原结合的关键部位P—7)。通过X线衍射技术对HLA-DRP1—抗原二聚体结晶结构的研究发现，与类风湿关节炎相关的HLA-DR(31(DR4/DR1)分子相结合的多种抗原肽在构型上均极其相似，其中包括变性II型胶原(Cn)及热休克蛋白等^叫。从这些肽的立体结构(图l)可见，Phe263(Pl)、Ghi266(P4)和Gly271(P9)的侧链伸向左侧的HLA-DRpi分子，全部或部分嵌入抗原结合槽内。而其它氨基酸的侧链则伸向一侧或与HLA-DR(31相反的(T细胞受体)方向，刺激T细胞活化。由图2可见CII多肽的P1、P4、P9侧链嵌入HLA-D邓1结合抗原的"口袋"中。带负电荷的P4(Glu)与HLA-DRpi上带正电荷的第71位氨基酸(Lys71)相邻，形成高亲和力的极性结合。因此，Glu266可能是CII多肽结合DR|31的关键氨基酸。之后的研究进一步证明，CII主要靠Gln267、Gly268、Pro269和Lys270与T细胞受体结合，导致T细胞激活。由此可见，CII多肽中主要与HLA-DRpl结合的氨基酸为Phe263,Gly265，Glu266及Gly271、Glu272,而主要与T细胞受体结合的氨基酸为Gln267,Gly268,Pro269,Lys270(表1)。表1.CII中与T细胞受体(TCR)和HLA-DRp1结合的氨基酸<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>*F-Phe(苯丙氨酸),K-Lys(赖氨酸),G-Gly(甘氨酸),E-Glu(谷氨酸),(^Gln(谷氨酰胺),P-Pro(脯氨酸),R-Arg(精氨酸)，A:Ala(丙氨酸)基于以上的研究基础，本发明人以丙氨酸(A)或者甘氨酸(G)替换CII多肽中与TCR结合及与HLA-DRpi亲和力相关的特定氨基酸，合成了多条cn变构肽。这些cn变构肽可特异性结合HLA-DRP1，并且亲和力增高，竞争性抑制自身抗原与HLA-DR(31的结合。从而抑制由HLA-DRP1介导的自身免疫反应及由此引起的炎症介质释放等病理过程。我们前期的动物实验发现CII变构肽皮下注射和静脉注射均可以抑制实验性关节炎的关节炎症，减轻其放射学及病理学损伤。但注射给药在临床应用中不方便也不经济。经鼻腔给药具有吸收起效快、生物利用度高、使用方便等优点。因此，在本发明的实施方案中，我们优选体外抑制作用最强的多肽序列FKGEAGPAAE。应用鼻粘膜给药途径治疗实验性关节炎大鼠模型，并且得到很好的治疗效果，提示CII变构肽可以通过鼻粘膜给药，从而使T细胞的激活受到抑制，达到治疗类风湿关节炎目的。图1.CII多肽与HLA-DR(31结合的晶体结构。CII多肽的Pl、P4和P9的侧链嵌入HLA-DRj31的抗原结合"口袋"中。P4(Glu，带负电荷)与HLA-DRJ31上的Lys71(带正电荷)形成高亲和力的极性结合点(Immunity7:473-81,1997)。图2.Cn变构肽鼻粘膜给药对CIA大鼠关节炎的抑制作用。CII变构肽治疗组关节炎评分明显低于PBS组(*P<0.05)，而CII原型肽治疗组关节炎评分与PBS组比较无明显统计学差异(P>0.05)。图3.CII变构肽鼻粘膜给药对CIA大鼠体重变化的影响。变构肽治疗组大鼠体重增加幅度要高于PBS治疗组和原型肽治疗组(P<0.05)。图4.CII变构肽治疗对CIA病理学损伤的影响。原型肽治疗组(b)和PBS治疗组(c)可见明显的关节软骨和骨侵蚀以及关节间隙变窄，而变构肽治疗组(a)仅见炎性细胞浸润。图5.CII变构肽对CIA大鼠抗CII抗体IgG及其亚型的影响。变构肽可以降低抗CIIIgG2a型抗体滴度(P0.05)，而对抗CIIIgG和IgGl型抗体滴度无显著影响(PX).05)。以下通过实施例进一步说明本发明，但下列实施例不以任何方式限制本发明的范围。具体实施方式实施例l:多肽的设计及合成前述的研究工作(4—7)己经证明，CII多肽中267-270位氨基酸主要与T细胞受体结合，并激活T细胞。本发明的试验中首先固相法合成了CII263-272原型肽和应用丙氨酸替换相应氨基酸的CII变构肽(表2)。为提高多肽的吸收率、利用度及增强疗效，合成中将每条肽的氨基端与十四烷酸基因相连，以利多肽向细胞内转运。本研究中所用十肽均含有4个以上亲水残基，如赖氨酸(K)及谷氨酸(E)，易于溶解和吸收。这些肽不含易降解的甲硫氨酸(M)、色氨酸(W)、或易脱氨、脱羧基的天门冬氨酸(N)等。因此，肽的稳定性好，并且易于进入细胞内发挥其干扰T细胞识别的作用。表2.非T细胞结合肽的设计_<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>F-苯丙氨酸，K-赖氨酸，。=甘氨酸，E二谷氨酸，(^=谷氨酰胺，八=丙氨酸，P-脯氨酸研究表明，上述CII263-272变构肽与HLA-DR(31的结合能力增强，而对T细胞的激活能力显著低于CII263-272原型肽，并可抑制CII263-272刺激的T细胞免疫反应。实施例2:本发明CII变构肽鼻粘膜给药对实验性关节炎的抑制作用在导致关节炎的免疫反应中，抗原呈递细胞是通过抗原诱导T细胞激活，并促使T细胞的增殖，弓l起动物体内的CII抗体和细胞因子(例如IFN-力水平增高，进而导致类风湿关节炎的特征性病理变化。所以，通过检测实验动物体内的细胞因子的水平可了解非T细胞结合肽对关节炎的抑制作用。同时，通过病理切片也能从组织学的角度对药物疗效作出全面的评判。在本发明的动物实验方案中，以牛CII诱导Lewis大鼠的胶原性关节炎(CIA)，然后用CII变构肽对关节炎大鼠进行治疗，发现变构肽可明显抑制大鼠关节炎，使关节肿胀程度减轻，(见结果部分)。(1)实验性关节炎动物模型的建立本发明中的实验性关节炎模型采用了国际公认的胶原性关节炎(CIA)模型。实验动物为近交系Lewis大鼠。本实验用大鼠均在北京大学人民医院动物实验中心(SPF级)饲养，大鼠被关闭在垫有木刨花的聚苯乙烯笼中，保持12小时白天/黑夜循环，使之可自由饮水和摄取食物。用于试验的大鼠均为6-8周龄的雌性大鼠，体重120士10g。实验中涉及动物的全部程序均按我国实验动物管理条理进行。从Sigma公司购得牛II型胶原(批号:C1188)，用无水冰醋酸溶解配成4mg/ml的溶液，再用等体积的完全福氏佐剂(Sigma,美国)乳化，在每只Lewis大鼠的尾根部注射150|al乳化物，注射剂量为300iLil/只。本实验成功建立了Lewis大鼠的关节炎模型。(2)对关节炎的评估-在用CII诱导后12—14天，70%大鼠出现踝关节和趾间关节肿胀。用0-16的记分等级评估关节炎，对四只脚爪的每只按0-4记分，其中0分=关节无红肿；1分=关节轻度红肿；2分=关节中度红肿；3分=关节重度红肿；4分=关节重度肿胀且不能负重，或出现关节畸形。发病关节的关节评分相加，最高分为16分。(3)CII变构肽鼻粘膜给药对CIA大鼠的治疗-Lewis大鼠在初次免疫后12-14天出现关节炎表现，共有21只大鼠发病。将发病的大鼠随机分为3组，每组7只。于发病当天开始分别给予变构肽、原型肽和PBS鼻滴入治疗。变构肽和原型肽剂量为100jug/次(多肽溶于PBS，浓度为2.5mg/ml),每天1次，连续给药5天后改为隔日给药，共给药12次。对照组每次给予鼻滴入PBS40(il。每天观察大鼠体重的变化，并用前述的关节炎评估方法对发生关节炎的关节数目作关节炎评分。初次免疫38天后处死动物，留取外周血，ELISA方法检测抗CII-IgG抗体及其亚型的变化，用IFN-y和IL-IOELISA试剂盒(Bender公司，奥地利)检测其血清中的相应细胞因子的浓度；同时，取后足关节，固定，脱钙，切片做HE染色。(4)应用SPSS软件包做统计分析。(5)结果本发明CII变构肽鼻粘膜给药对实验性关节炎的抑制作用用CII对30只雌性Lewis大鼠进行关节炎的诱导，结果21只大鼠于第12天至第14天时出现不同程度的关节肿胀。在出现关节炎的当天，将大鼠随机的分为3组，分别给予变构肽、原型肽和PBS鼻滴入治疗，并用前述的关节炎评估方法对发生关节炎的关节数目评分。结果显示，治疗前各组间关节炎评分无显著差异。变构肽治疗组于治疗后的2周内大鼠关节肿胀逐渐减轻，而原型肽治疗组和PBS对照组的关节肿胀逐渐加重。实验结束后行后踝关节病理学检查，结果显示，原型肽和PBS治疗组大鼠踝关节存在明显的滑膜增生和血管翳形成，关节软骨及软骨下骨质破坏明显，严重者关节腔消失，出现关节强直。而变构肽治疗组大鼠踝关节只见轻度的炎性细胞浸润和滑膜增生，关节软骨和软骨下骨质破坏不明显。变构肽显著降低CIA大鼠体内抗CII抗体IgG2a亚型的滴度，并降低血清中Y-干扰素(IFN-y)水平。这些结果证明，CII变构肽鼻粘膜给药治疗可减轻CIA大鼠的自身免疫性炎症，抑制关节炎的程度及病程，该多肽鼻粘膜给药可能对类风湿关节炎有治疗作用。表3.各组大鼠治疗后血清中细胞因子的变化<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*与对照组相比，CII变构肽可以降低CIA大鼠血清中IFN-Y水平(PO.05)，而对IL-10水平没有明显影响(P>0.05)。序列表<110>北京大学人民医院<120>II型胶原变构肽鼻粘膜给药治疗类风湿关节炎的应用<140><141>2007-11-14<160>2<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>10(氨基酸)<212>肽<213〉人工序列<223>合成<400>1PheLysGlyGluGinGlyProLysGlyGlu<210>2<211〉10(氨基酸)<212>肽<213>人工序列<223>合成<400>2PheLysGlyGluAlaGlyProAlaAlaGlu权利要求1.以丙氨酸(A)或者甘氨酸(G)替换CII263-272多肽序列中与TCR结合及与HLA-DRβ1亲和力相关的特定氨基酸而合成的CII变构肽。2、权利要求1的CII变构肽在制备治疗类风湿关节炎的鼻粘膜给药剂型中的应用。3、权利要求1的CII变构肽鼻粘膜给药在治疗类风湿关节炎的应用。全文摘要本发明提供II型胶原变构肽治疗类风湿关节炎的鼻粘膜给药方式。这种II型胶原变构肽鼻粘膜给药可特异性抑制类风湿关节炎的异常免疫反应，针对发病的起始环节，从根本上控制本病的发展。文档编号A61K38/16GK101244257SQ20071017983公开日2008年8月20日申请日期2007年12月19日优先权日2007年12月19日发明者栗占国申请人:北京大学人民医院