专利名称：(e)-1-(2,4-二羟基-5-(3-甲基-丁基-2-烯基)苯基)-3-(4-羟基苯基)丙烯-2-酮-1在药 ...的制作方法
技术领域：
本发明属医药领域，涉及天然化合物在制备抗肿瘤药，骨质疏松，老年痴呆药物方面的应用。
背景技术：
雌激素是一种由内分泌系统产生的类固醇类激素，它在生殖系统、骨组织、心血管、免 疫系统及中枢神经系统中都发挥着重要的作用[J Cell Sci, 2003; 116 (4): 585-586]。雌激素信 号传递系统在调节细胞生长、分化和凋亡过程中都起到很大的作用。雌激素依赖型肿瘤，如 乳腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌等的发生和发展都与雌激素有着密切的关系[J Steroid Biochem. Mol. Biol" 2002, 81 (1): 1-24, J Mammary Gland Biol. Neoplasia, 1998, 3(1): 49-61, Curr. Drug Targets Immune Endocr. Metabol. Disord; 2001, 1 (1): 1-12, Cancer Res., 1998， 58(23): 5367-5373, J Psychiatry Neurosci, 2002;27(1): 1-27]，因此对雌激素受体的研究具有指导抗雌激素和雌激素 受体拮抗剂等药物的开发和应用和指导对雌激素依赖型肿瘤等疾病的治疗的重要意义[Nat. Rev. Drug Discov., 2004, 3 (11): 950-964]。
目前已知的雌激素受体分为a 、e两种亚型。雌激素受体a在1958年被Toft和Gorski 等人[Proc. Natl. Acad. Sci. 1966, 55 (6): 1574-1581]率先从老鼠子宫细胞中分离得到，
1986年Green [Nature, 1986, 320 (6058): 134-139]和Greene [Science,1986, 231 (4742): 1150-1154]等人克隆得到第一个分子量为66kDa的人雌激素受体ERa ; 1996年，Kuiper等 [Proc. Natl. Acad. Sci. 1996, 93 (12): 5925-5930]从大鼠前列腺中克隆得到另一种雌激素 受体ERP 。此后，Mosselman等人[FEBS Lett. 1996, 392 (1): 49-53]从人睾丸组织中克隆得到 不完整的人ER e ; Ogawa[Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998, 243 (1): 122-126]和Moore等 人[Biochem. Biophys. Res. Commun., 1998, 247 (1):乃-78]相继克隆得到完整的人ER P 。雌激 素受体ERa与ERP亚型具有类似的序列组成[FEBS Lett. 2003, 546: 17-24, Biochem. Soc. Trans. 2003, 31: 56-59];它们都由三个独立但又相互作用的功能区组成位于N端的A/B区， 中间的C区，以及C端的D/E/F区。N端的A/B区是一个不依赖于配体的转录活化区(AF-1)， 负责与共活化因子的结合以及转录激活相关的靶基因(图1)。 C区是DNA结合区，含有两个锌 指结构，对于分子的二聚化以及和特定DNA序列的结合至关重要。C端的D/E/F区是一个配 体结合区，由它介导配体的结合，受体的二聚化，核定位，以及配体依赖的转录活化功能 (AF-2)。
根据传统理论，雌激素通过与细胞浆或核内的雌激素受体(ER)结合并通过调节基因转 录而发挥生物功能。近十年来对雌激素信号通路又有了许多新的认识雌激素信号转导途径 包括细胞核途径(经典途径)和细胞膜途径(非经典途径)。因此雌激素的生物效应，并不完 全依赖于配体-受体的细胞核激活途径，还可通过其他信号通路发挥作用。非经典雌激素信号 通路在不同细胞产生的效应各异，例如17 {3雌二醇(E2 e )可通过膜信号通路及P38激酶和 PI3K激酶调节心肌细胞调亡，从而对心血管系统具有保护作用[Curr. Treat. Options Cardiovasc. Med. 2001, 3 (1): 67-79];此外，细胞内几个重要的信号传导通路如G-蛋白信号通路、磷脂酶 C，腺苷酸环化酶及MAPK等信号传导通路都和非经典的雌激素膜信号通路有相互作用[Trends in Endocrinol. Metabol., 2002, 13, 349-354]。人们广泛认为血清中的高水平雌激素通过经典及 非经典雌激素信号传导途径刺激腺管上皮细胞的持续增生，从而参与雌激素依赖型肿瘤，如 乳腺肿瘤、子宫内膜癌及卵巢癌的发生和发展。然而非经典雌激素膜信号通路的作用目前尚 不清楚。
Flouriot等[EMBO, 2001, 19: 4688-4700]的研究发现除了全长的ER-a 66外还有一个 缺失了第一个外显子所编码的173个氨基酸的ER-a同源异构体。这个新发现的分子量为 46kDa的ER-a 同源异构体被称为ER-a 46 ，而较早发现的分子量为66kDa的 ER-a [Nature, 1986, 320 (6058): 134-139; Science,1986, 231 (4742): 1150-1154]就被称为 ER-a 66。该异构体缺失了 AF1功能区，但保持了其他功能区的完整性。进一步研究发现 ER- a 46能竞争性抑制ER- a 66的AF1的功能，而对AF2的作用没有影响。
2005年另一个分子量为36kDa的全新的ER-a的同源异构体被发现并克隆了，并将其命 名为ER- a 36 [Biochem. Biophy. Res. Commu. 2005, 336: 1023 - 1027; Proc. Natl. Acad. Sci. 2006, 103 (24):卯63-9068]。该异构体从存在于ER-a 66基因的第一个内含子中的启动子开 始转录，经一小段外显子后，利用ER-a66的外显子2-6进行编码。因此，ER-a 36缺失两 个转录功能区AF1和AF2，但保留了 DNA结合功能区和二聚化功能区。重要的是ER- a 36激 素配体结合区(ligand binding domain)缺失了 8-12螺旋区(helix),从而完全改变了其与激 素配体结合的专一性和亲和力(图l)。因此，ER-a 36具有和ER-a 66及ER-e完全不同的 激素配体结合能力，为筛选针对ER- a 36的特异性配体提供了结构基础。
因ER- a 36缺失AF1和AF2功能区，ER- a 36本身缺失任何转录调节功能，但可以有效 地抑制ER-a 66介导的经典的雌激素核信号通路。ER-a 36主要分布在细胞膜和细胞衆中， 少量分布于细胞核中。ER-a 36从而可通过非经典的雌激素膜信号传导通路并经过MAPK/ERK
信号传递途径刺激细胞分裂[Proc. Natl. Acad. Sci. t/&4， 2006, 103 (24): 9063-9068] 。 ER- a 36
在不同的雌激素依赖型肿瘤，如乳腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌中皆有高表达。因此ER-a36
介导的信号途径可能参与了多种雌激素依赖型肿瘤的形成和发展。
发明内容
本发明的目的是通过对天然有效成分的研究，提供新的可以调节ER-a和-P生物传导系 统的化合物，可以用于抗肿瘤，心脏疾病，骨质疏松和老年痴呆的作用. 式(I)化合物或式(I)化合物的药学上可接受的盐或溶剂合物
(I)
在制备治疗因雌激素受体ER- a亚型ER- a 36， ER- a 46以及ER- a 66和ER- e亚型 引起的疾病的药物中的应用。
所述式(I)化合物或式(I)化合物的药学上可接受的盐或溶剂合物是作为雌激素受体 ER-a和ER-e亚型的调节剂。
所述药物包括片剂，口嚼剂，胶囊剂，悬浮液剂，溶液剂。
所述疾病包括肿瘤，骨质疏松，哮喘，心脏疾病或老年痴呆。
所述肿瘤为乳腺癌，卵巢癌，子宫内膜癌，胃癌，结肠癌，前列腺癌，血癌和肺癌。
所述肿瘤为乳腺癌，前列腺癌。
所述肿瘤为乳腺癌。
式(I)化合物可从豆科植物补骨脂果实中提取分离得到(Yao Xue Xue Bao. 2006,41(1)， 76-9; Biol Phann Bull. 2005, 28 (12), 2253-7)。其对ER受体的生物活性，尤 其对ER亚型ER- a 36的受体的生物活性以及由此产生的药效未见报导。
实验表明正常乳腺上皮细胞表达少量ER-a36，而在700例乳腺癌的检査中发现大约 39. 9%乳腺癌样品高表达ER- a 36，且40%雌激素受体阴性的乳腺癌样品虽不表达ER- a 66， 但可表达ER-a36。 ER- a 36也表达在100% ER-， PR- and HER-2+乳腺癌样品.上述结果表 明ER-a36不仅参与ER阳性的乳腺癌的形成和发展，而且可能参与过去被认为是ER阴性 的乳腺癌的形成和发展。迸一步研究表明，表达ER-a36的乳腺肿瘤预后极差，并对抗雌激 素药物，如他莫昔芬的治疗反应不强。
雌激素受体阴性的乳腺癌细胞系MDA-MB-231不表达ER-a 66，但高表达ER-a 36，而且 雌激素可促进MDA-MB-231细胞快速增殖。因此ER- a 36启动的促细胞生长信号转导可导致细
胞增殖。同时表达ER- a 66和ER- a 36的ER-阳性MCF7细胞，对雌激素刺激可产生更强增殖 反应，并对抗雌激素药物如他莫昔酚有抵抗作用。
此外，研究表明，心脏疾病，骨质疏松和老年痴呆等疾病同ER-a36的生物功能有着直 接的关系.因此以ER- a 36为耙点筛选药物将提供一种新的筛选抗肿瘤，心脏疾病，骨质疏松 和老年痴呆药物的途径。
通过实验证明，式(I)化合物，在低浓度条件下，不改变ERa66， ERa46禾tl ER a 36 的表达。然而高浓度的化合物(I)能同时抑制三者的表达；同时化合物(I)能杀死表达ER a 66， ERa46和ERa36的乳腺癌细胞MCF7细胞。而式(I)化合物也可作为雌激素受体ER a 36的调节剂，用于治疗因雌激素受体ERa36的异常表达而引起的疾病，如肿瘤，骨质疏 松，哮喘，心脏疾病或老年痴呆等病症。
图1雌激素受体的结构分区
图2 ERa 66， ERa46和ERa36在6个不同患者的乳腺癌组织中的表达。
1、正常乳腺组织2、浸润性导管癌组织，3、浸润性导管癌组织，4、浸润性导管癌组织，
5、浸润性小叶癌，6、浸润性小叶癌，7、非浸润性导管癌
图3 在乳腺癌细胞MDA- MB-231中，抗ER a 36特异性抗体显色情况
aER-a36，阳性结果显示为绿色，DAPI，阳性结果显示为蓝色，联合显色者标注为"Merge"。 图4 MCF7细胞经化合物(I)处理后，Western blot检测ER a 66， ER a 46和ER a 36表达的 情况。
图5 MCF7细胞经化合物(I)处理后，存活细胞数量变化情况。
图6式(I)化合物对仅表达ER a -36或ER a -66的HEK293细胞的ERK的活化情况。 具体实施方法
技术领域：
本发明中的化合物(I)问-1-(2,4-二羟基-5-(3-甲基-丁基-2-烯基)苯基)-3-(4-羟基苯基)丙烯-2-酮-1从上海友思生物技术有限公司购买。
实施例1 式(I)化合物的体外生物试验 试验1-1
试验方法含有不同患者乳腺癌组织蛋白的pre-blot滤膜片购至ProSci公司(Poway， CA)。 使用ER a 36特异性的抗ER a 36抗体[ER-a36特异抗体(针对ER-a36 C-端的20个氨基酸)
是由Alpha Diagnostic International (San Antonio, TX)制备，可参阅Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 2006, 103 (24): 9063-9068]， HRP标记的二抗以及增强化学发光试剂(ECL， AmerShair Pharmacia Biotech)检测滤膜片并显色。该膜洗脱后，使用能同时检测ER三种亚型(ERa 66， ERa 46和ERa 36)的抗ERa抗体H222 (Novocastra Laboratories Ltd, UK)检测膜片。 (见图2)
试验结果ERa 66， ERa 46和ER a 36在浸润性导管癌(泳道2)、浸润性小叶癌(泳道5) 和非浸润性导管癌(泳道7)中表达。此外，ERa36在浸润性导管癌(泳道4)和浸润性小 叶癌(泳道6)中表达。泳道2和泳道3是来源于两位不同患者的浸润性导管癌。泳道5和 泳道6是来源于两位不同患者的浸润性小叶癌。该结果显示ER a 36可以在ER a 66和ER a 46 表达阴性的乳腺癌中表达，而在正常乳腺组织中无表达(泳道l)。 试验1-2:
试验方法:MDA-MB-231细胞系是公认的缺乏ERa 66和ER a 46表达的乳腺癌细胞系[Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumors: an update. iSresst C朋cer AfesearcA a刀c/ 7>eatoe 7f 2004， 83: 249-289] MDA-MB-231细胞(购至ATCC细胞库)传代 置于8孔BI0C0AT玻片(BD Science Discovery Labware)，培养于含10%胎牛血清的DMEM 培养基，并在37°C， 5%C02的条件下培养12小时。使用无菌PBS冲洗两遍，4X多聚甲醛(PBS 配制，PH7.4)在室温固定30分钟；然后用PBS洗，和0.5% (v/v) Triton X-100破膜10 分钟；PBS洗，3%血清在室温封闭l小时；抗ERa36特异性抗体在室温孵育1小时，含0. 5 % TritonX-100的PBS (PBST)洗三次；异硫氰酸荧光素(FITC)标记的荧光二抗孵育1小 时；PBST洗三次，PBS洗一次；防淬灭封片剂(Molecular Probes, Eugene, OR)封片。于 Nikon E600显微镜下观察，使用MRC-1024激光共聚焦显微镜(Bio-Rad)拍摄图像。(见图3) 试验结果在ER a 66和ER a 46表达阴性的的乳腺癌细胞MDA-MB-231中，抗ER a 36特异性 抗体显色阳性(标注为aER-a36，阳性结果显示为绿色)，并可以被用作免疫的多肽所阻断。 细胞核使用4, 6-联咪_2-苯基-lH-吲哚染色(标注为DAPI，阳性结果显示为蓝色)。联合显 色者标注为"Merge"。(图中的+P印tide表明在实验中加免疫源多肽来阻断抗体) 试验1-3:
MCF7细胞经浓度为0ym至25iim的化合物(I)处理后，免疫印迹法(Western blot)检测ER a 66， ERa46和ERa36表达的情况。(见图4)。
试验结果如图所示，随着化合物(I)浓度的上升，ERa66和ERa46的表达下降。然而高浓 度的化合物(I)能抑制三者的表达。 试验1-4:
试验方法'.MCF7细胞系是高表达ERa66， ER a 46和ER a 36的乳腺癌细胞系(Relevance of
breast cancer cell lines as models for breast tumors: an update. Marc Lacroix， Guy Leclercq, Area" rreat廳t ，《83; 249-289。) MCF7细胞(购
至ATCC细胞库)培养于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基(Invitrogen)，在37。C和5% C02 的条件中培养12小时。化合物(I)(购至上海有思生物技术公司)，通过DMS0溶解稀释。MCF7 细胞按IX 105的密度接种于100mm直径的培养皿中，由浓度为0 u m至25 u m的化合物(I) 处理两周后，使用血球计数器在显微镜下对存活的细胞进行计数。按照浓度进行分组，5个 培养皿为一组。(见图5)图示的是MCF7细胞经浓度分别为0um， 5 y m， 10 ym, 15 um， 20 和25um的化合物(I)处理两周后，细胞数目变化的表现。细胞计数的单位为1X104个。
试验结果如图所示，MCF7细胞经浓度为5um的化合物(I)处理后活细胞数量明显下降。 试验1-5:式(I)化合物对仅表达ER a -36或ER a -66的HEK293细胞的ERK的活化(见图 6)
试验方法HEK293, HEK 293/ERa-36 (HEK293细胞用ER-a36表达质粒转染并高表达ER-a36 的细胞株)；HEK 293/ERa-66 cells (HEK293细胞用ER-a66表达质粒转染并高表达ER-a66的 细胞株)在10%胚胎牛血清(FBS)和无酚红的DMEM中，禾B 5%C02， 37。C培养箱中培养。 细胞在含5%活性碳处理的FBS的DMEM中培养24小时后，以2X10"培养皿的密度接种在 (D100 mm培养皿中。细胞在经过24小时后，加到无血清的DMEM介质中培养18小时。细 胞然后DMSO和化合物(I)在10—15, 10-1G禾n 1(T6M (图六中标为0, -15, -10, -6)处理10 分钟。细胞用PBS洗两次，收获和裂解细胞，用针对磷酸化或非磷酸化ERK的抗体做Western blotting分析。
试验结果式(I)化合物可活化表达ER-a36的293细胞中的MAPK/ERK磷酸化，但不活 化表达ER-a66的293细胞中的ERK磷酸化。这一结果表明式(I)化合物可和ER-a36特异 性结合并活化下游ERK信号通道。
权利要求
1.式(I)化合物或式(I)化合物(E)-1-(2，4-二羟基-5-(3-甲基-丁基-2-烯基)苯基)-3-(4-羟基苯基)丙烯-2-酮-1的药学上可接受的盐或溶剂合物id="icf0001" file="S2007101796719C00011.gif" wi="114" he="25" top="5" left = "5" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>在制备治疗与所有雌激素受体ER-α亚型和ER-β亚型相关疾病的药物中的应用，所述ER-α亚型包括ER-α36，ER-α46以及ER-α66。
2. 根据权利要求1所述的应用，所述式(I)化合物或式(I)化合物的药学上可接受的 盐或溶剂合物是作为雌激素受体ER-a的调节剂。
3. 根据权利要求1所述的应用，所述药物包括片剂，口嚼剂，胶囊剂，悬浮液剂，溶液剂。
4. 根据权利要求l所述的应用，所述疾病为肿瘤，骨质疏松，哮喘，心脏疾病或老年痴 呆。
5. 根据权利要求4所述的应用，所述肿瘤为乳腺癌，卵巢癌，子宫内膜癌，胃癌，结肠 癌，前列腺癌，血癌或肺癌。
6. 根据权利要求5所述的应用，所述肿瘤为乳腺癌，前列腺癌。
7. 根据权利要求6所述的应用，所述肿瘤为乳腺癌。
全文摘要
本发明涉及化合物(E)-1-(2，4-二羟基-5-(3-甲基-丁基-2-烯基)苯基)-3-(4-羟基苯基)丙烯-2-酮-1及其药学上可接受的盐或溶剂合物在制备治疗与雌激素受体ER-α亚型和ER-β亚型相关疾病的药物中的应用，属医药领域。该化合物在低浓度条件下，不改变ERα66，ERα46和ERα36的表达，而高浓度下能同时抑制三者的表达；同时该化合物能杀死表达ERα66，ERα46和ERα36的乳腺癌细胞MCF7细胞；因此该化合物也可作为雌激素受体ERα36的调节剂，用于治疗因雌激素受体ERα36的异常表达而引起的疾病，如肿瘤，骨质疏松，哮喘，心脏疾病或老年痴呆等病症。
文档编号A61K31/122GK101185643SQ20071017967
公开日2008年5月28日 申请日期2007年12月17日 优先权日2007年12月17日
发明者坤 孟, 靖 李 申请人:北京珅奥基医药科技有限公司