一种改构的胰高血糖素样肽-1的类似物和修饰物及其应用的制作方法

专利名称：一种改构的胰高血糖素样肽-1的类似物和修饰物及其应用的制作方法
一种改构的胰高血麟样肽-1的类似物刺,物及其鹏
駄领域
本发明涉及一类新颖的胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)类似物及期斷布物。具体地，本发明涉及 GLP-1多肽的改造和修饰。这类多肽不fiM示出天然GLP-1的 生物学時性，并且与天然的 GLP-1相比，其对蛋白水解酶的稳定性和体内作用时间有明显的提高，可用于糖尿病的治疗和月巴 胖的辅助治疗。 ,絲
糖尿病(DiabetesMdlitusJDM)是严M:害人类健康的疾病，患病人数正随着生活水平的提高、 人口老龄化以及诊断技术的进步而ffl^增加。糖尿病患者分为两种，即胰岛素j繊型糖尿病(l型 糖尿病)和非胰岛素依赖型糖尿病(2型糖尿病)。其中，2型糖尿病占糖尿病患者的90%以上。 近年的研究表明2型糖尿病的主要病理彭见为胰岛素抵抗和由胰岛细胞功能失调所致的胰岛素分 泌相对不足，形成持久的高血糖，并可产生多种致命性并发症。目前的药理研究和治疗方法尚不 能涵盖该疾病所涉及的所有代谢性缺陷，因而许多新的药物作用靶点有待开发，如乙酰辅酶2 (ACC2) 、 IK#H (KK) P、 DPP-IV等，用以寻找肯鹏高胰岛^m感性，{ 4糖和脂质代谢或 增加葡萄糖f，1W岛素分泌的新药。GLP-1由于其具备的多种生理功育征是针对2型糖尿病患 者中普遍存在的异常，从而弓胞了许多糖尿病学家的极大兴趣，成为近年来在这"M域内较受关 注的研究热点。
胰高血糖素样肽-1 (glucagon-like peptide^, GLP-1)是1983年Bell等自胰高血糖素原 (proglucagon)基因进行序列分析时发现的。旭高血糖素样肽-1主要是由远端回肠、结肠和直 肠的L细胞分泌的一种31肽的多肽激素，肝量约为3,355KD。研究表明，GLP-1与同属肠肽激 素的GIP相互协同，对营,质的吸收和代谢皿重要的调节作用。GLP-1具有多种生理功能， 主要包括以下几个方面 1.与胰岛素分泌相关的作用
1) GLP-l的血糖1繊'鹏1」 岛素分泌作用是其 要的生理功倉^一。
2) GLP-1可以调控卩细胞内一^tf异基因的泰ii。
3) GLP-1可刺激卩细胞再生。
4) GLP-1能糊制细胞因子和脂肪酸诱导的卩细胞禾辨性死亡。
2. GLP-1會,血糖娜性的抑制胰高血糖素分泌。
3. 血浆GLP-1浓度生理性升高不仅^^5I太胃泌素介导的和饮食促发的胃酸分泌，而且抑制胃 排空和其W外分泌。
4. GLP-1育辦作用于中枢神乡孫统而抑制會欲。
5. GLP-1能增加胰岛素非依赖性的糖利用，增加外周组织^t胰岛素的鹏性。
6. 脂肪细胞存在GIJM的结合位点，可刺糊旨肪组织中脂肪酸的合成。Sil^胃肠的抑制作用 M^、食物中甘油三脂(TG)的吸收，还可增加脂肪组织中脂蛋白酶的活性而增加TG柳獬 作用，斷氐TG水平。
7. GLP-1能皿神经的增殖和分化，诱导神经突的，，并有增强神经生长因T(NGF)的作用。
8. GLP-1还可以齐糧和时间^#性,高胰岛素 岛素原与胰岛素瘤细胞和 细胞的结合 九M^餐后胰岛素原的分泌，从而避免了与胰岛素原水平升敲关的卩细胞损伤、月E^S、 2型糖尿病等鶴的发生。
目前，GLP-1妇型糖尿病治疗中的显著效果已^A们所公认。但是，^E体内很短的半衰期 限制了其直接用药的可能。研究表明GLP-l在体内酶解主要是^DPP-IV禾nNEP24.11的作用。其中， DPP-IV是使GLP-1失活的主要蛋白酶，其作用位点^Ala8和Glu9之间的肽键。NEP24.11在体内可以 水解芳香族氨基鰣^7K性竊酸的M^瑞的肽键，在GLP-1中存在MM立点Asp15-Val16， Ser18-Tyr19， Tyr^Leu^ Gh^-Phe^ Phe^Ile^tlTrpBi-Leuw因此，目前多数研究组织在要围绕 天然的人GLP-1肝进行改造，来设计长效GLP-1类似物。 ")7位组氨酸的麟
将7位的组氨^3ft行了N-甲對七、a-甲基化、脱錢、咪唑乳酸取代劐封布，发5见除了a-甲基 化GLP-1外，其它的肽在体外纟歡隹MDPP-IV降解。对RINm5F细胞中的GLP-lR亲和力最高的是咪 唑乳^GLP-1，其次是a-甲^4tGLP-l禾BN-甲^f七GLP-l，只有脱氨SGLP-1对GLP-1R的亲和力最
差，与天^GLP-1相比斷氐了15倍。所有这些模拟肽都育魂J、鹏胞内cAMP顿。另外，将酰基连 接到组氨酸的a-氨a^团也能使GLP-l体内的话性明显增加。
此外，Ms(7>glucitol-GLP-1是另一种合成的GLP-1类似物。N-pyroglutamyKJLP-l禾口 N-acetyKJLP-l是两种新的7位组氨酸麟的GLP-1类似物，虽然两者能与GLP-1R受体结合，但 亲和力比天然GLP-1低。
(2) 8位丙氨酸的,
N端的Xaa-Pro和Xaa-Ala是DPP-IV的识别位点，所以人们也尝试了对GLP-1N端第二个氨 基酸丙氨,行B^。用丝氨酸取代丙氨酸能明显增强GLP-l(7-36),安的稳定性，[Ser]GLP-l(7-36) 鹏具有强的体内鹏岛素活性，大鼠i微显示胰岛素的增加腿GLP-l(7-36)醐安组的2倍。用 甘氨^取代得到的GLP-1-Gly8对GLP-1R的亲和力有轻微斷氐。
分别用苏氨酸、甘氨酸、丝氨酸和a-氨基异丁^^取代8位的丙氨酸，所得到的4种肽都能 一定禾號 DPP-IV的,，并能与GLP-1R结合。但只有Aib8和Gly8类似物与GLP-l(7-36) 醐銪相似的亲和力。Jtt^卜，还有用EMJa来替换8位的L-Ala。 [D-Ala(8)]-GLP-1对受体的亲和 力和促cAMP产生的活性相对较低，不过体内的葡^W受实德示，它能明显M^、葡萄糖曲线。
(3) 9位谷氨酸的鹏 9位的谷氨,于DPP-IV的,也是輕的。用赖氨酸取f^位的谷氨酸得到的，它能明显J^DPP-IV作用，对受^^有亲和力，但丧失了GLP-1的那，咦岛素分 泌、cAMP产生^f乍用，所以它与已知的GLP-l拮抗齐0exendin(9-39)^似。在另一个石欣中，得到 了三种新的Glu9取代物[(Pro9)GLP-l,(Phe9》GLP-l,(Tyi9)GLP-l]，与^t然GLP-l相比，与受体结合 的能力及^SfeAMP产生的能力均稍有下降，不过鹏岛素产生的能力相同淑肖有增强。另外，在 严翻岛素抵抗棚朋半糖尿病动物中发现，(Pro9)"GLP-l能明显地改善血浆葡萄糖曲线并增加f械 循环中胰岛素的浓度。
(4) 其它位点,酸的g 以下几种魏其它位点的 ,行〈斷喊取代(Ala10), (Serl5), (Tyrl6), (Argl7), (Lysl8),(Gly21), (Lys27), (Asp31>GLP-1(7-36)，财卜还有GRF和(Glul5)OLP-l(8-36)StK(GLP隱l的拮抗齐0)。 这^l太的鹏岛素活性依次为GLP-l(7-36)mi^Tyr16 > Lysl8, Lys27 > Gly21 〉 Asp31》Serl5, Argl7 > AlalO》GRF > (Glul5)-GLP-l(8-36)繊。
然而，J^GLP-1的分子结构改变都没械得比天然GLP-1显著提高的,作用和稳定性，仍 然需要开发有效的GLP-1类似物，其不^M示对DPP-IV等蛋白/肽水解酶的抗,性，而m具有 更长的药理学作用时间。

发明内容
本发明的目的是解决现有技术中存在的战问题，麟一种新鹏高血糖素样肽-l(GLP-l诱 似物及其傲布物，使 有天然01^-1的 岛素分泌及降血糖作用，同时与天然的GLP-1相比 撤长的半衰期，可以用于糖尿病的治細巴胖的辅助治疗。
本发明的目的是Mil如下的技术方案来实现的
化学合成GLP-1的类似物(改构多肽)，ffiil转染有GLP-l受俠GLP-lR)基因和^fe荧光蛋 白报告基因的CHO/GLP-1R/EGFP细胞筛选与if^模型，评价改构多肽结合并活化GLP-1R的能 力，并在体外考察改构多B树DPP-IV酶的稳定性，然后采用^j树物实^i5^i正其離效果和促 胰岛素分浙效果，最终im本发明设计的GLP-l类似物的生物活性。
本发明ili共了一种辦勾的胰高血糖素样肽-l的對以物，其结构特征是皿高血糖素样肽-1的 N端前面添加一个赖氨酸，其中所述的胰高血糖素样肽-1包括天然的GLP-l(7-36)酰胺或 GLP-l(7-37)，及其部分氨基酸取代的衍生物。
优选的改构多肽是在天然的胰高血糖素样肽-1的N端前面添加一个赖氨酸，即SEQNO1-2所示。
部分氨基酸取代的衍生物是指皿第7位的组氨酸，第8位的丙氨酸，和第9位的谷氨酸不 变，而其它部分縫酸位点取代的GLP-l(7-36)鹏或GLP4 (7-37)，其中戶腿的部分取代的氨 基酸位点是指第16， 17， 19， 27， 29， 31位氨基酸中的至少一个位点。
本发明銜共的一种类似物多肽，其具有如下结构
Lys-HisT-Alas^Glug^Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-AspOCaais-Xaan-Ser-Xaaw-Leu-Glu^Gly-Gln-Ala-Ala-Lys
-Xaa27-Phe-Xaa29-Ala-Xaa3i-Leu-Val-LyS"Gly-Arg-y
其中，
y:馬或Gly;
Xaa16: Asp, GH Lys, Gln^ Arg Asn^ Gly, AK Pro, Leu^ He，或Phe;
Xaan: Thr,GlATyr,Asn^MetCys,Gln^或Tip;
Xaa19: Pro,Me^Ser,Cys,Asn^Thr,Trp，或Gln;
Xaa27: Thr,Pro,Asp,或Gln;
Xaa29: Phe, Leu^ Arg> Lys, Gly, Val,或Pro;
Xaa3i: Lys, Arg, Met^ Tyr, Ser, Cys, Asn^ Ghij或Thr 式中英文縮写表示Lys (縮写为K，以下相同。)赖氨酸、His (H)组氨酸、Ala (A)丙 氨酸、Glu (E)谷氨酸、Gly (G)甘氨酸、Thr (T)苏氨酸、Phe (F)苯丙氨酸、Ser (S)丝氨 酸、Asp (D)天冬氨酸、Leu (L)亮氨酸、Gln (Q)谷氨 、 Val (V)缬氨酸、Arg (R) 精氨酸、Asn (N)天冬繊、Pro (P)脯氨酸、He (I)异亮氨酸、Tyr (Y)酪氨酸、Met (M) 驗酸、Cys (C)半胱氨酸、Trp (W)色氨酸。
,的,多肽的 列如SEQNO 3-8所示
本发明还皿了一种胰高血^ 样肽-1的类似物的{,物，^1f，的胰高血糖素样肽-l的 类似物多月爐行化学銜布和/或生物斷布的衍生物。
戶腿的化對針布是指，对戶腿的胰高血糖素样肽-l的类似物采用PEG、月旨肪 :^^其它亲 脂性分子謝豫基劇,。
戶，的生劍,是指，采用分子生物学^S，将戶皿的胰高血糖素样肽-1的类似物与人血清 白蛋白HSA^A免疫球蛋白Fc片段IgG-Fc融合m制备胰高血糖素样肽-l类似物的融合蛋白。
以上戶，的胰高血糖素样肽-1的类似物、，高血糖素样肽-l的类似物的傲布物的应用，用 于制备治^^尿病绷巴f拖的药物。
阮逾的治疗糖尿病鄉巴胖症的药物是以单独的胰高血糖素样肽-1的类似物、，高血糖素样 肽-1的类似物的傲布物为原料制备成的顿U;職，将胰高ifilB素样肽-l的對以物、鹏高血糖 素样肽-1的类似物的i針布物与其他药学上可接受的糖剂、 剂或载体配賴喊的复方制剂。
本发明涉及的改构多肽，以天然GLP-1为对照，在体外，中利用CH0/GLP-1R/EGEP细胞 受Wi型，ifi^其活化GLP-lR的能力，以舰DPP-IV酶,的稳定性；在体内i微中，分别以 正常小鼠和糖尿病模型小鼠为试验模型，鉴定其降血糖和促胰岛素分泌的效果。^"体内外试验 结果，证明本发明^i共的GLP-l类似物及其斷布物能有效的抗DPP-IV,，并在持续地斷氐血 糖，iSW岛素分泌方面，能明显的优^e然的GLP-l。
本发明的优点和积极效果
本发明提供的新型GLP-1类似物及期針布物，不《fiM示出天然GLP-l优越的生物，性，促 胰岛素分泌及降血糖作用，而且与天然的GLP-1相比，其对二月力K解酶的稳定性和体内作用时间 有明显的提高，可用于糖尿病的治疗糊朋半的辅助治疗。


图1是实施例2， GLP-1类似物的体外活性测定的图示
图2是实施例3， GLP-1类似物的抗DPP-IV,性测定的图示
图3是实施例4， GLP-1类似t/^正常小鼠体内降JfilM作用的图示
图4是实施例5， GLP-1类似物在正常小鼠体内促胰岛素分泌作用的图示
图5是实施例6， GLP-1类似tF&糖尿病模型小鼠体内降血糖效果的图示
图6是实施例7， KGLP-1/HSA融合蛋白的SDS-PAGE及Western blot检测的图示
其中，条带M所示为低分子量蛋白质marker,条带1,4所示为GS115-pPIC9K发^Jt
清；条带2,5所示为GS115-pPIC9K/KGLP-l/HSA发酵液上清；条带3,6所示为纯化后的 KLP-1/HSA_
图7是实施例7， KGLP-1/HSA融合蛋白的HPLC (A)和MALDI-TOF-MS (B)检测的图
示
图8是实施例8， KGLP-1/HSA融合蛋白在小鼠体内的降血糖效果的图示。
鄉例i化学合鹏高ifiillt样肽-i类似物
本发明的类似物可皿常规的固相肽合成法来制备发明涉及的GLP-1类似物，具，作^e 上海吉尔生化公司^。
采用固相合成齢絲发明多肽之一，序列为
SEQN01: KHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2 其它多肽合成方法类似。
合虹艺細Fmoc合成汰选择Rink-Amide-MBHA Resin进行合成。合成步骤如下
(1) 16种带侧链保护基的Fmoc-氨基^J^料
(2) 固相合成
(3) 脱侧链微基
(4) HPLC纯化
(5) 冷冻千燥
(6) GLP-1类似物。
鄉例2 GLP-l类似物的体外^i定
微样品
SEQN01: KHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2 SEQN02: KHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG SEQ NO 3: KHAEGTFTS塌SSYLEGQAAKEFIAWLVKGR- NH2 SEQ NO 4: KHAEGTFTSDVgSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2
seq no 5: khaegtftsdvss|legqaakefiawlvkgr-nh2 seq no 6: khaegtftsdvssylegqaak|fiawlvkgr-nh2
SEQ NO 7: KHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEF@AWLVKGR-NH2
SEQ NO 8: KHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIA@LVKGR-NH2
GLP-1 (7-36) gy安为阳'i4^照HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2
微旅
将CHO/EGFP/GLP-1R细胞接种于96孑L板，密度为2xl04个/孔，用含100 mg^L Zeocin的 RPMI-1640完全培鎌培养48小时后移去培鎌，分别加入用RPM-1640基础培#^列稀释的 ±M GLP-1类似物(SEQ NO 1 ,SEQ NO 2, SEQ NO 3,SEQ NO 4, SEQ NO 5, SEQ NO 6, SEQ NO 7, 和SEQ NO 8)，以及GLP-l(7-36)酰胺对照品，每孔100^L。在37。C， 5。/。C02^f牛下培养8小时 后，用倒置荧舰微微行观察。荧光^^ffl Image Pro Plus 5.1软件进行分析，并用GraphPad Prism
5软件计算EQo值。 结果
如图1所示，各^^类似物都以剂量f繊的方式欵活GLP-1R，其EC50值分另伪GLP-1 (7-36) 鹏，0.8298nM; SEQNOl， 2.444nM; SEQN02， 2.554nM; SEQN03， 8.355nM， SEQNO 4， 8.756nM; SEQN05， 4.47nM; SEQN06， 13.11 nM; SEQN07， 22.30nM;和SEQN08， 30.27 nM;其中以类似物SEQ NO 1和SEQ NO 2的作用活性最优。
鄉例3 GLP國1类似物的体夕啦DPP-IV隨糊定
微样品
SEQNOl: KHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2
SEQ NO 2: KHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG
SEQ NO 3: KHAEGTFTSD@SSYLEGQAAKEFIAWLVKGR- NH2
SEQ NO 4: KHAEGTFTSDV@SYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2
SEQ NO 5: KHAEGTFTSDVSS@LEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2
SEQ NO 6: KHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKgFX29AX31LVKGR
SEQ NO 7: KHAEG1FTSDVSSYLEGQAAKEF§AWLVKGR-NH2
SEQNO8: KHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAgLVKGR-NH2
GLP-1 (7-36) ifc!安为阳'舰照HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2
取20g新鲜的猪肾脏^jl组织切碎，按20P/o(w/v)加入0.25mol/L的蔗糖溶液，用匀浆器进行 匀浆。匀桨液于8,000 rpm离心15 min，然后祉清液于15,000 ipm离心2小时。将沉淀溶于O.l mol/LTris/HCl缓冲液(pH7.4)中，即得到DPP-IV粗鹏，于國20。C保絲用。
取1 ranol ±3$ GLP-1类似物(SEQ NO 1 ， SEQ NO 2， SEQ NO 3, SEQ NO 4, SEQ NO 5, SEQ NO 6, SEQ NO 7,和SEQ NO 8)，以及GLP-1 (7-36)itJK对照品于100 0.1 mol/LTris/HCl缓冲液 (pH7.4)中，力口入l Ml DPP-IV粗提物(相当于5 mU的DPP-IV)，在37。C作用不同时间后，取 一定勤tl入3倍体积的乙腈终止反应。室繊置2小时后，12,000 rpm离心10 min，取上清液， 真空'M除去乙腈。经DPP-IV处理后的样品，参照实施例2用CH0/EGFP/GLP-1R细胞im体 系进行活性检测。 结果 如图2所示，与DPP-IV,乍用后，GLP-1 (7-36),的话性鹏下降。当作用12小时后，与 反应前的活性相比，GLP-1 (7-36)醐安刺歉HO/EGFP/GLP-l幽胞产独GFP的魏量,降至4.8%; 而四个GLP-1类似物，均显示了明显的抗DPP-IV酶,作用，当DPP-IV謝乍用12小时后仍會战I微 CHO/EGFP/GLP-l自胞产生较强的荧光，^EGFP的^ii^jg分别为原来的79.8n/。 (SEQ NO 1); 肌5o/o(SEQN02); 83.80/0(SEQNO3); 84.5%(SEQN04); 84.0%(SEQNO5); 81.0%(SEQNO6); 826%(SEQ NO 7);和85.0To(SEQ NO 8)。
^JI例4GLP-l类似物的体内降jfill&^用(正常小鼠)
SEQNOl: KHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2.
GLP-1 (7-36)鹏为对照HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2
微施
取7-8周龄雌性昆鹏中(KM)雌性小鼠(购自北京军事医学科学院实验动物中心)，随机分为 空白对照组、微组和GLP-1 (7-36) mi树照组，絲^^水16-18小时后，经^§激±^配 置的，药物(剂量10nmol/kg体重)，分别于给药后0h， lh， 2h和4h用灌胃针口腔灌注葡 萄糖(剂量1.5g/kg体重)，灌胃30min后^静脉lUf[L置于肝素处理的离心管中，6,000 rpm离 心10min后，用葡萄糖检测试剂盒(中生北控生物禾4SK份有限公司)检测血^ 。 结果
如附图3所示，SEQNOlW^f的降血糖作用。同天然GLP-1 (7-36) 相比，在相同的 给药剂量下，在给药2小时后仍具有明显的降血餘文^dx0.01)。
^SI例5 GLP-1类似物的体内，岛素分 用(正常小鼠)
i離样品
SEQN01: KHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2.
GLP國1 (7-36)鹂为对照HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2
微方法
按照实施例4戶腿的方法获得血浆，再用胰岛素H^免疫试剂盒(Linco Research^ Charles, USA)
须啶血浆中胰岛素的含量。 结果
如附图4所示，SEQNOlW^f的自疾岛素分泌作用。同天然GLP-1 (7-36) TO相比， 在相同的给药剂量下，在给药2小时后仍具有明显的促胰岛素分泌的效％<0.01)。
鄉例6 GLP國1类似物的体内降血,用(糖尿病輕小鼠)
微样品
SEQN01: KHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2,
GLP-1 (7-36)鹏为对照HAEGITTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2
i離施
糖尿病小鼠模型的制备选取体重20-25g的雌性KM小鼠，禁食16-18小时;f^ISB 10m^mL 的四氧嘧啶水溶液，腹腔^lt给药(给药量200mg/kg体重)； 鼠粮，以及100mg/mL的葡 萄糖溶液作自由糊水，给药48小时后改为t畑自齡JC;给药72小时后，雜5小时以上，测 定空mifiL糖；进一^^择空miflL糖您11.0mmol/L者入围实验。
血齢量的测定取糖尿病模型小鼠，随机分为3组空白对照组、微组和GLP-1 (7-36) ^K对照组，難^ 水16-18小时后，进行葡萄M受实验。纟彌腔激给药(剂量10nmol/kg 体重)，l小时后，用灌胃针口腔灌注葡萄糖(剂量1.5 ^kg体重)，并分别于不同时间M^静 脉取血置于肝素处理的离心管中，6,000 ipm离心10 min后，用葡萄糖检测试剂盒(中生北控生物 禾4SM有限公司)检测血齢量。 结果
如附图5所示，SEQNO 1对糖尿病小鼠有，的降血糖作用，同天然GLP-1 (7-36)翻安相 比，在相同的给药剂量下，體药1小时后仍具有明显的降血糖效駒<0.01)。
^Sfi例7GLP-l类似物的与AlfiL清白蛋白(SA)的融^&
采用分泌型毕赤酵母表达系统表达人胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)的类似物与人血清白蛋白
(HSA)的融合蛋白。本实施例中选取SEQNO1，以其MS,应基因序列为基础，构建SEQNO 1和Aj6L清白蛋白(HSA)的融^ii载体，pPIC9K/KGLP-l/HSA，并在毕赤酵母GS115菌株中发 酵^iiM4合蛋白KGLP-1/HS入其中KGLP-1 SEQ NO 1多肽。其它GLP-1类似物与Aifc清
白蛋白的融^ii方法类似。 具〈^作如下；
1. 融合^ii载体pPIC9K/KGLP-l/HSA的构建
以pPIC9K/GLP-l/HSA为模板，MilPCR扩增得到KGLP-1与HSA的融合基因，所用的弓| 物如下
Pl: 5， (AC GAA TTC GAG AAA AGA GAG GCT AAA CAT GCT GAA GGG ACC- 3， P2: 5， -TAT GCG GCC GCT TAT AAG CCT AAG GC- 3，
pcr方法如下:25m1的反应体系中加入l(Vmol/L的pi和P2弓l物各1.5 ^1， 2mmol/l的dNTP 1 pi, lOxpfU Buffer 2.5 pi, 5 U/m1的pfo DNA聚合酶1 pl，质粒pPIC9K/GLP-l/HSA 1吗，加双蒸水 补齐25^1， PCR^(牛为；94。C变性50秒，55。C退火50秒，72。C延伸90秒，循环30次。
ffia^Iim皿电泳分析反e^物，在加#^31出1见目标条带，用PCR片a^回收试剂盒纯 化出目标片段；经EcoRI和NotI双酶切后，琼月l^繊电泳纯化，用PCR片鹏回收试剂盒回 收，用T4连^^擬U经同样双酶切的pPIC9K;连接产物转化鄉杆菌DH5a感受态细胞，转 化物凃布矜100 ng/ml氨节青霉素的LB培养基中37°C培养过夜，提^M粒;MilPCR，及EcoR I和NotI双酶切，琼月^^繊电泳鉴定阳性克隆，雖进行测序^i正。阳'MS子保存在含有400/。 甘油的LB中，冻于-7(TC;重组质粒命名为pPIC9K/KGLP-l/HSAj日性重组子命名为 DH5a/pPIC9K/KGLP-l/HSA。
2. 毕赤酵母的转化ffl组菌株的筛选
提取DH5a/pPIC9K/KGLP-l/HSA中的质粒，用限制性内切酶Sal I酶切后，电转化毕赤酵母 GS115感受态细胞，涂布于MDS组氨,微陷型固体培养基上，选取阳ttm子进行PCR鉴 定。歸，在含不同浓度G418的YPD平feJ^4行多拷贝筛选，得至,性克隆。提取阳性转化子 的基因组DNA进行PCR鉴定。阳I4S组T^名为GS115/pPIC9K/KGLP-l/HSA。
3. 融合蛋白的诱导^i和纯化
将GS115/pPIC9K/KGLP-l/HSA接种至装有25 ml BMGY生长培养基的250 ml三角瓶中，250 rprn^ 30°C培养至A600 nm为2 6，离心收集酵母细胞，重;i^有100 ml BMMY培养基的500ml 三角瓶中，250rp叫30。C诱导毅，每隔12小时补加甲醇，使其终浓度维持在0.5% (V/V)。诱导 72小时后，离心得至U上清液。采用SDS-PAGE及Western blot对融合蛋白进行鉴定。{顿亲和层 析方法分离纯化融合蛋白KGLP-1/HSA。用HPLC和MALDI-TOF-MS鉴定纯化的融合蛋白。 结果
如附图6所示，融合蛋白KGLP-1/HSA在酵母^ii体系中得到良好的彭i， SDS-PAGE及 Western blot中可以清BKfitk检测到融合蛋白的条带。如附图7戶标，经亲和层析分离纯化的融合蛋 白KGLP-1/HSA用HPLC检测纯度为92.0%， MALDI-TOF-MS鉴定分子量为70,297.8 Da^同预测 结果相一致，证明融合蛋白KGLP-1/HSA得到良好的表达和纯化。
^M例8融合蛋白KGLP-l/HSA在小鼠体内的降jfilll皿
i^^材料为i^实施例7获得的融合蛋白KGLP-l/HSA， 方法参见实施例4,不同之处在 于此实施例中给药量为100画l/kg体重。
结果如附图8所示，i纖融合蛋白具有一定的降血糖作用，同空白组，GLP-1 (7-36) ifcK对 照组以及SEQ NOl对照组相比，KGLP-1/HSA试验组在给药8小时后仍具有明显的降血糖 ， (p<0.05)。
序列表
〈110〉南开大学
〈120〉 一种改构的胰高血糖素样肽-1的类似物和斷嫩及其卿 <160〉 10
<210〉 1
〈211〉 31
<212> PRT
〈213〉 AX序列 〈220〉
〈221> MOD—RES
<222> (31).. (31) 〈223〉,化
〈400〉 1
Lys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu
15 10 15
Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30
<210> 2 <211〉 32 <212> PRT 〈213〉 AX序列 〈400〉 2
Lys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu 15 10 15Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30
〈210〉 3 <211〉 31 <212〉 PRT 〈213〉 AI序列 〈220〉
〈221〉 MOD—RES
〈222> (31)., (31) 〈223〉鹏化
〈400> 3
Lys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Asn Ser Ser Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30
<210〉 4 〈211〉 31 〈212〉 PRT <213> AX序列 <220>
〈221〉 MOD—RES
<222> (31).. (31) 〈223〉,化
<400> 4
Lys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Asn Ser Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Tip Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30
<210> 5 〈211〉 31 〈212〉 PRT 〈213〉 AX序列
〈220>
<221〉 MOD— RES
〈222〉 (31).. (31) 〈223〉醐安化
<400> 5
Lys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Pro Leu Glu
15 10 15
Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30
〈210> 6 〈211〉 31 <212> PRT <213〉 AX序列
<220〉
<221〉 MDD—RES
<222> (31).. (31) <223〉鹏化
〈400> 6
Lys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu
15 10 15
Gly Gin Ala Ala Lys Pro Phe He Ala Tip Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30
〈210〉 7 〈211> 31 <212> PRT <213> AX序列 〈220〉
<221> MDD一RES
〈222〉 加..加 〈223〉,安化
〈400〉 7
Lys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu
15 10 15
Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Arg Ala Tip Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30
<210> 8
〈211〉 31
〈212〉 PRT
<213〉 AX序列 〈220〉
<221> MDD一RES
〈222> (31).. (31) 〈223〉鹏化
<■> 8
Lys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu
15 10 15
Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Arg Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30
〈210〉 9 <211〉 31 〈212〉 PRT <213〉人工序列
〈220〉
<221> MOD—RES
<222> (31).. (31) <223〉醐姚
<220>
<221> MISC—FEATURE 〈222〉 (11) ..(12)
〈223> Xll = D， E， K, R， Q， G， A, P, L， I,或F
X12 = T， Y， E， M， C， Q,或W
<220>
〈221〉 MISC—FEATURE
〈222〉 (14) .. (14)
〈223> X14 = W S, C， N, T， W,或Q
〈220>
〈221〉 MISC—FEATURE
〈222> (22) .. (22) <223> X22 = T, D，或Q
<220>
<221〉 MISC—FEATURE
〈222> (24) .. (24)
〈223> X24 = F, L， K， G， A, V，或P
〈220〉
<221> MISC—FEATURE
〈222〉 (26) .. (26)
〈223> X26 = K， ^ Y， S, C, N, Q，或T
〈400> 9
Lys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Xaa Ser Xaa Leu Glu
1 5 10 15
Gly Gin Ala Ala Lys Xaa Phe Xaa Ala Xaa Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30
<210〉 10 〈211〉 32 〈212〉 PRT 〈213〉 AI序列 〈220〉
〈221〉 MISC一FEATURE <222> (11). .(12)
<223> Xll = N， D， E, K， R, Q, G, A， P， L， I,或F X12 = N， T， Y， E， M> C， Q，或W
〈220>
〈221〉 MISC一FEATURE <222> (14) .. (14)
<223> X14 = P, M> S， C， N， T， W,或Q 〈220〉
<221〉 MISC—FEATURE
<222> 咖..(22)
<223> X22 = P， T, D,或Q
<220〉
〈221〉 MISC—FEATURE 〈222> (24) .. (24)
<223> X24 = R， F, L， K， G， A， V，或P <220>
〈221〉 MISC—FEATURE 〈222> (26) .. (26)
〈223> X26 = R, K， ^ Y， S， C， N, Q,或T 〈400> 10
Lys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Xaa Ser Xaa Leu Glu
1 5 10 15
Gly Gin Ala Ala Lys Xaa Phe Xaa Ala Xaa Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30
权利要求
1.一种改构的胰高血糖素样肽-1的类似物，其结构特征是在胰高血糖素样肽-1的N端前面添加一个赖氨酸，所述的胰高血糖素样肽-1包括天然的GLP-1(7-36)酰胺或GLP-1(7-37)，及其部分氨基酸取代的衍生物。
2、 根据权利要求1B^的改构的胰高血糖素样肽-1的类似物，其中优选的是在天然的胰高血 糖素样肽-l的N端前面添加一个赖氨酸，即SEQN01-2所示。
3、 根据权利要求l所述的辦勾的胰高血糖素样肽-l的类似物，，征是在保g然的胰高血 糖素样肽-1的第7位的组氨酸，第8位的丙氨酸，和第9位的谷氨酸不变，而其它部分氨基 !^立点取代的衍生物的N端前面添加一个赖氨酸。
4、 根据权利要求3所述的改构的胰高血M^样肽-1的类似物，其特征^0M的部分取代的氨 基酸位点是指第16， 17， 19， 27， 29， 31位氨基酸中的至少一个位点，其具有如下结构 Lys-His7-Ala8-Glu9"Gly-Thr隱Phe誦Thr-Ser-Asp"Xaai6-Xaan-Ser-Xaai9"Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys -Xaa27-Phe-Xaa29-Ala-Xaa31 -Leu-Val-LyS"Gly誦Arg-y ，其中，y: NH2或Gly;Xaai6: Asp, GH Lys, Gli% Arg^ Asn^ Gly， Pro, Le4 He或Phe;Xaai7: Thr， GH Tyr, Asn^ Met^ Cys, Gln或Tip;Xaa19: Pro,Me^Ser,Cys,Asn^Thr,Tip或Gln;Xaa27: Thr,Pro,Asp或Gln;Xaa29: Phe,Leu^Arg^Lys, Gly,AKVal或Pro;Xaa31: Lys, Arg, Met, Tyr, Ser, Cys， Asn^ Gln或Thr 0
5、 根据权利要求4所述的改构的胰高血糖素样肽-l的类似物，其中优选的多月幼口SEQN03-8 所示。
6、 一种权利要求l-5fi^项戶，的,的胰高血糖素样肽-l的类似物的斷布物，，戶，的 胰高血糖素样肽-1的类似物多月爐行化学斷柳/或生物銜布的衍生物。
7、 根据权利要求6所述的麟血糖素样肽-l的类似物的斷嫩，其特征在于臓的化学斷布 是指，对胰高血歸样肽-l的类似物多月媒用PEG、月旨肪敝舰其它亲脂性分T^豫基 ,,。
8、 根据权利要求6所述的胰高血糖素样肽-l的类似物的傲布物，辦征在于戶腿的生物斷布 是指，采用好生物学手段，将胰高血糖素样肽-l的类似物与人血清白蛋白HSA^A免疫球 蛋白Fc片段IgG-Fc融^ii制备融合蛋白质。
9、 一种权利要求1-5任一项所述的胰高血糖素样肽-1的类似物或权利要求6>8《i^项戶M的 胰高血糖素样肽-1的类似物的斷布物的細，用刊恪治^^尿病鋤EH粮的药物。
10、 根据权利要求9所述的应用，，征在于所述的治疔糖尿病鄉EH粮的药物是以，的 胰高血糖素样S太-1的类似物、 高血糖素样肽-1的^i以物的^t^物为原f斗制备成的药剂； 或者，将胰高血糖素样肽-1的类似物、鹏高血糖素样肽-1的类似物的銜布物与其他药学上 可接受的繊剂、,剂或载体配餺喊的复方制剂。
全文摘要
本发明涉及一类胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的改构多肽及其修饰物，具体的，该改构多肽是在胰高血糖素样肽-1的N端前面添加一个赖氨酸，所述的胰高血糖素样肽-1包括天然的GLP-1(7-36)酰胺或GLP-1(7-37)，及其部分氨基酸取代的衍生物。本发明提供的GLP-1改构多肽及其修饰物不但显示了促胰岛素分泌和降血糖作用，而且与天然的GLP-1相比，其对蛋白水解酶的稳定性和体内作用时间有明显的提高，可用于制备治疗糖尿病或肥胖症的药物。
文档编号A61P3/04GK101367873SQ20081015214
公开日2009年2月18日 申请日期2008年10月8日 优先权日2008年10月8日
发明者奇 张, 芳 白, 钢 白, 陈家琪, 高智慧 申请人:南开大学