奥曲肽变构肽分子及其药物的制作方法

专利名称：奥曲肽变构肽分子及其药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类具有抗肿瘤活性的奥曲肽变构肽分子及其药物
背景技术：
自Brazeau等从羊下丘脑中分离出Somatostatin(SMS)以来，科学家们对生长抑素的产生、分布及生物活性作了大量研究。实验证明，生长抑素族激素在体内分布很广泛，如中枢神经系统、下丘脑、周围神经系统、胰岛D细胞、胃肠道上皮、腺上皮细胞和轴突细胞，它们的生理活性也是多样的，在垂体前叶，生长抑素抑制生长激素和促甲状腺激素的释放；在胰腺，生长抑素抑制胰岛素和胰高血糖的分泌；SMS对胃肠道系统也有广泛的影响，它能抑制胃泌素、胰泌素、血管活性肠肽和其他激素的释放，抑制胃酸、胃蛋白酶的分泌，降低内脏血流量和肠活动，降低碳水化合物吸收，增加大肠对水和电解质的吸收，生长抑素同时还具有细胞保护作用。
由于生长抑素具有广谱的生理作用，在临床上可改善许多疾病的症状，它能调节胃肠道多种内、外分泌功能，降低内脏尤其是肝脏的血流量，而因被认为能够用于治疗某些胃肠道及外科疾病。但SMS的体内半衰期非常短(1-7分钟)，且无器官特异性，停药后易引起生长激素(GH)等分泌过度，长期应用生长抑素可导致肠道吸收不良和葡萄糖耐受性降低，因此SMS的临床作用一直受到限制。
Sandoz药厂Bauer等在生长抑素结构改造的基础上，合成了新一代生长抑素类似物-奥曲肽(Octreotide，OCT)商品名为Sandostatin(善得定)，为人工合成的生长抑素八肽衍生物。奥曲肽的药效类似于生长抑素，但没有生长抑素临床上的一些缺点，奥曲肽除去了生长抑素中的6个氨基酸，其中4个氨基酸在排列上与天然内源性生长抑素相同，1，4位为D型氨基酸，8位为L-氨基醇，药理作用和天然内源性生长抑素一样，具有多种生理活性。实验证明在奥曲肽的结构中，其N端的D-苯丙氨酸(D-Phe)为奥曲肽的生物活性所必须。而D型取代L型形成的D-Trp-Lys肽链则不易为蛋白酶迅速水解，半衰期较天然生长抑素延长了30倍，使用时不需要连续静注，减少了临床使用的麻烦，同时也为病人减少了皮肉之苦。奥曲肽能抑制生长激素、促甲状腺素、胃肠道和胰内分泌激素的病理性分泌过多，对胃酸、胰酶、胰高血糖素和胰岛素的分泌具有抑制作用，且比天然产物作用更强，它对生长激素(GH)、胰高血糖素和胰岛素抑制特异性高[16]，动物实验证明，奥曲肽对生长激素(GH)释放抑制作用比生长抑素(SMS)强约70倍，对胰高血糖素为23倍，对胰岛素为3倍。醋酸奥曲肽也能降低胃运动和胆囊排空，抑制缩胆囊素-胰酶泌素的分泌，减少胰腺分泌，对胰腺实质细胞膜有直接保护作用。对经手术、放射治疗或多巴胺受体激动剂治疗失败的肢端肥大症，食道胃底静脉曲张破裂出血、急性胰腺炎、胃肠胰等消化系统内分泌肿瘤以及生长激素释放因子瘤均具有很好的疗效。进一步研究发现奥曲肽除了对绝大多数具有神经内分泌功能的肿瘤具有抑制作用外，对普通的实体肿瘤也同样具有抑制作用，如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、黑色素瘤等。1987年美国FDA已批准奥曲肽用于转移性类癌和血管活性肠肽瘤的治疗。也正是由于奥曲肽具有多种生物活性，所以引起了人们广泛的研究兴趣。
在细胞生物学及临床药学等研究领域，许多亲水性蛋白、多肽及寡聚核苷酸因其独特、高效的生物学活性而被看作是研究活细胞生命行为的理想工具。多年来，生物学家们致力于探索将这些工具分子导入活细胞中的有效方法。近年来研究发现有许多多肽可不需要任何膜蛋白受体的协助而穿过细胞质膜(见1991，Proc Natl Acad Sci USA，88(5)1864-1868)；另有一类多肽可携带亲水性大分子穿过血脑屏障，使得“亲水性大分子难以通过血脑屏障”这一长期以来困扰着科学家们的难题有了重大突破(见Science，1999，2851569-1572)。这些重要发现为将来亲水性蛋白、寡肽及寡核苷酸应用于药学、基因治疗、细胞生物学等研究领域开辟了一条新的途径。现在，这类具有细胞生物膜穿透功能的肽被称为穿膜肽(cell-penetrating peptides)。它们是一类多肽分子，长度为几个至几十个氨基酸不等，目前正不断受到人们的关注。
技术内容Tat49-57片段对于实现细胞内转运是最有效的最小片段；迄今为止，有十多种来源于Tat的短肽显示出可穿过不同细胞质膜的功能。而奥曲肽这样具有亲水性的多肽一般不具备穿透细胞膜的能力，因此，我们设想通过穿膜肽和奥曲肽的连接，增加其自由穿透细胞膜的能力并结合其他化学修饰方法来变构奥曲肽衍生物，以设计和筛选出具有更强生物活性的多肽分子。
基于此，我们选取奥曲肽(OCT)作为母体分子，对其碳端(C-terminal，C-端)、氮端(N-terminal，N-端)进行化学修饰，并采用多肽固相合成、液相合成方法以及这两种方法的组合，合成具有下列通式的一系列多肽衍生物。
为了提高奥曲肽抗肿瘤的生物活性，本发明提供奥曲肽变构肽衍生物分子，其特征在于具有下列结构通式， 其中R1是p-CH3C6H4SO2或R2CO。
R2是C1-C17烷基或环烷烃基或芳香基或芳杂环。例如R2为Fluorenylmethoxycarbonyl(芴甲氧羰基)；Benzyloxycarbonyl(苄氧羰基)；硬脂酰基等，实验证明本发明的结构比奥曲肽本身具有更强的抗肿瘤活性。
选取具有穿膜效应(cell-penetrating effect)的尽可能短的穿膜肽(CMT)RKKRRQRRR or RQIKIWFQNRRMKWKK作为另一活性部位，OCT与CMT这两种活性部位通过共价键键合直接相联，共同组成母体，并对其C-端、N-端进行化学修饰，得到具有下列通式的系列衍生物 其中CMT的肽序为RKKRRQRRR或RQIKIWFQNRRMKWKK。
在结构中引入CMT的作用是增强奥曲肽变构肽分子进入细胞的能力。
其中Z是H2N(CH2)nCO，n可以是5-11。
在R1和CMT之间可以用Z来连接。
将CMT偶联在肽的C端也同样起到增强奥曲肽变构肽分子进入细胞的能力的作用。
其中X是能水解的羧基保护基。
X的作用是封闭其C端，增强分子的稳定性。
或 中的R1可以是H。
当R1是H时，由于其肽序中引入了穿膜肽CMT，该变构肽分子的活性也较奥曲肽强。上述这些变构肽的特点是既具有奥曲肽的基本特性，又有修饰肽的新特点，特别是通过穿膜肽CMT的修饰，可以有效地将变构肽衍生物通过无受体介导、无能耗的方式导入多种哺乳动物细胞并定位于胞质及细胞核(穿膜肽CMT的特性)，从而尽早发挥OCT的生物效应。一种上述的任一奥曲肽变构肽分子的药物，其特征在于表现为多肽的药学上有效的盐。一般多肽类药物在临床都需要转为盐的形式，这样有利于药物的稳定和人体的吸收。例如醋酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐等。
实施方案本发明的奥曲肽变构肽分子的制法如下1.母体肽树脂的合成通法称取适量Fmoc-AA-Wang树脂或其它多肽合成氨基酸树脂倒入合成柱中，加入溶剂(DCM，DMF，or DCM/DMF)溶胀，以20％-50％六氢吡啶的DMF溶液脱除氨基酸树脂的Fmoc保护基团，用DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤，除尽六氢吡啶。按照本发明的奥曲肽变构肽的氨基酸序列依次称取适量的Fmoc-氨基酸于适宜的容器中，加入适量DMF溶解，然后加入偶联剂(如TBTU/HOBt，HATU/HOBt，etc)和适量氮甲基吗啉或二异丙基乙胺的DMF溶液。偶联完成后，除去反应液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤肽树脂；加入20％-50％六氢吡啶的DMF溶液脱除氨基酸树脂的Fmoc保护基团，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤，除尽六氢吡啶。按照多肽固相化学合成方法依照本发明的奥曲肽变构肽母体的氨基酸序列从C端开始依次进行后续偶联，如此循环完成整个奥曲肽变构肽的肽链，得到母体线性肽肽树脂；充分洗涤，抽干，加入适量I2的DMF溶液进行氧化成环，然后充分洗涤，MeOH收缩，抽干备用。
2.变构肽衍生物的制备依据修饰基团的不同，采用不同的合成方法，制备得到全保护的奥曲肽模拟多肽衍生物，得到的粗肽经过高效液相色谱(HPLC)纯化得精肽，精肽成盐，质谱鉴定和HPLC检查纯度，进行生物活性实验。
2.1氮端酰基化将奥曲肽变构肽母体肽树脂倒入合成柱中，加入溶剂(DCM，DMF，or DCM/DMF)溶胀，抽干，加入20％-50％六氢吡啶的DMF溶液脱除肽树脂的Fmoc保护基团，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤，除尽六氢吡啶。加入酰基化试剂的DMF溶液，搅拌或通氮气或振荡，控温。偶联完成后，除去反应液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤，MeOH收缩，抽干。加入适量裂解液，搅拌，反应2-5小时，无水乙醚沉降，离心；加入无水乙醚，搅匀，离心分离。加水或50％醋酸水溶液，冻干。HPLC纯化，成盐或冻干，质谱仪检测分子量，HPLC检查纯度、离子色谱仪检测离子含量。
2.2碳端酰胺化将奥曲肽变构肽母体肽树脂倒入合成柱中，加入溶剂(DCM，DMF，DCM/DMF，THF，THF/DMF)溶胀，抽干。加入胺基化试剂的DMF溶液，搅拌或通氮气，控温。酰胺化完成后，抽滤，除去反应液，以DMF、MeOH、THF、Et2O依次洗涤，滤液合并，旋蒸至干或置冻干机中冻干。加入适量裂解液，搅拌，反应2-5小时，无水乙醚沉降，离心；加入无水乙醚，搅匀，离心分离。加水或50％醋酸水溶液，冻干。HPLC纯化，成盐或冻干，质谱仪测分子量，HPLC检查纯度、离子色谱仪检测离子含量。
本发明设计的奥曲肽变构肽的生物活性研究本发明还通过测定本发明设计的奥曲肽变构肽对人肝癌细胞的抗肿瘤活性研究，以期筛选出具有抗肿瘤活性的新药物。
体外试验表明，本发明的奥曲肽变构肽在体外对人肝癌细胞BEL-7402均有不同程度的抗肿瘤活性。
本发明的奥曲肽变构肽可以辅以药用稀释剂、佐剂及载体制成药用组合物，如片剂、粉剂、丸剂、溶液或悬浮剂，通过口服、注射或其他方式给药，用于肝癌的防治。
至少两个相同或不同的本发明的奥曲肽变构肽相连成一个肽，用于肝癌的防治。
实施例1本实施例涉及CMT(I)-OCT的合成，用以说明本发明的奥曲肽变构肽的合成与纯化方法。
1.苏氨醇与DHP-HM Resin树脂反应合成氨基酸树脂将DHP-HM Resin 5.25g(3.9mmol，sub0.74mmol/g)在39ml CH2Cl2中溶涨15分钟，然后加入Fmoc-Thr(tBu)-ol 7.48g(19.5mmol)。反应体系冷至0℃再加入p-TsOH 670mg(3.9mmol)，继续在60℃反应搅拌反应16h，然后依次用CH2Cl2(2×25mml)、的DMF/H2O(1∶1)(4×25mml)、DMF(3×25mml)和CH2Cl2(3×25mml)洗涤，最后真空干燥。按照Meienhofer方法检测其替代度为0.408mmol/g。
2.线性肽肽树脂的合成称取Fmoc-Thr(tBu)-O-DHP-HM Resin树脂2.964g(1.5mmol)置于合成柱中，加入40mlDMF/DCM(1∶1)溶胀30min后抽干。加入20ml 30％六氢吡啶的DMF溶液反应30min脱除氨基酸树脂的Fmoc保护基团，然后用DMF(6×30ml)、DCM(2×30ml)MeOH(2×30ml)、DCM(2×30ml)依次洗涤以除尽六氢吡啶。称取Fmoc-Cys(Trt)-OH(3.515g，6mmol)，用适量DMF溶解然后加入偶联剂HOBt(0.978g，7.2mmol)、TBTU(2.316g，7.2mmol)和1M的二异丙基乙胺(7.2ml，7.2mmol)，偶联2h左右直到茚三酮检测呈阴性，除去反应液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤肽树脂；加入20％-40％六氢吡啶的DMF溶液脱除半胱氨酸的Fmoc保护基团，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤，除尽六氢吡啶。然后依照本发明的奥曲肽变构肽母体肽的氨基酸序列依次进行后续偶联，如此循环完成整个奥曲肽变构肽肽链的偶联，充分洗涤，MeOH收缩，抽干，得到线性肽树脂4.564g。
3.氧化成环和裂解称取按上述方法合成的线性奥曲肽变构肽肽树脂3.07g(1.0mmol)，于反应器中用30mlDMF溶胀30min，在搅拌下滴加0.3M的I2/DMF溶液30ml，避光、室温氧化3h，将树脂抽干、依次用DMF、DCM、MeOH洗涤至树脂无色。再将树脂抽干，然后加入30ml裂解液(TFA27ml、Anisole0.6ml、Thioanisole1.5ml、EDT0.9ml)，反应3.0h后，滤去树脂，液相浓缩至10ml左右，倒入60ml冰冻的无水乙醚中，析出大量白色沉淀，经离心得到白色固体即为奥曲肽(粗肽)2434.3mg，收率104％，MALDI-TOF-MS 2340.7。
4.CMT(I)-OCT粗肽纯化取上述合成的粗肽，加少量无热原纯水使粗肽充分溶解，得到1.0mg/mL浓度的样品溶液，经针式滤器过滤(0.45μm有机滤膜)，收集滤液，按下述色谱条件纯化。
仪器Varian320；制备柱Varian反相C18 201SP1022(22mm/250mm)纯化方法流动相AH2O+0.2％TFA；BACN+0.1％TFA流速19ml/min检测波长230nm梯度B相24％→28％ACN 30min经HPLC纯化后得到精肽938.2mg，收率40.08％。
修饰后其肽序为 实施例2本实施例涉及本发明的奥曲肽变构肽OCT-CMT(I)的合成，称取Fmoc-Arg(Pbf)-Wang Resin树脂4.351g(1.5mmol)置于合成柱中，加入120mlDMF/DCM(1∶1)溶胀30min后抽干。加入60ml 30％六氢吡啶的DMF溶液反应30min脱除氨基酸树脂的Fmoc保护基团，然后用DMF(6×50ml)、DCM(2×50ml)MeOH(2×50ml)、DCM(2×50ml)依次洗涤以除尽六氢吡啶。称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH(2.598g，4mmol)，用适量DMF溶解然后加入偶联剂HOBt0.651g(4.8mmol)、TBTU1.543g(4.8mmol)和1M的二异丙基乙胺4.8ml(4.8mmol)，偶联2h左右直到茚三酮检测呈阴性，除去反应液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤肽树脂；加入20％-40％六氢吡啶的DMF溶液脱除精氨酸的Fmoc保护基团，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤，除尽六氢吡啶。然后依照本发明的奥曲肽变构肽母体肽的氨基酸序列依次进行后续偶联，如此循环完成整个奥曲肽变构肽肽链的偶联，充分洗涤，MeOH收缩，抽干，经氧化成环后得肽树脂9.825克。
从中取出6.550g(1.0mmol)肽树脂，然后加入30ml裂解液(TFA27ml、Anisole0.6ml、Thioani sole1.5ml、EDT0.9ml)，进行裂解去保护，反应3.0h后，滤去树脂，液相浓缩至10ml左右，倒入60ml冰冻的无水乙醚中，析出大量白色沉淀，经离心得到白色固体即为粗肽，粗肽经高效液相色谱(HPLC)纯化、得精肽626.4mg，纯度98.5％，合成总收率为26.6％。MALDI-TOF-MS 2355.7。
其肽序为

实施例3本实施例涉及本发明的奥曲肽变构肽的6-氨基己酰化合成6-氨基己酰化通法按照固相合成常规方法进行合成，先制备相应的Fmoc-peptideresin，以适量DMF溶胀肽树脂，加入6-(N-芴甲酰)氨基己酸(Fmoc-Ahx-OH)、TBTU/HOBt的DMF溶液，通入氮气，滴入TEA/DMF溶液，室温反应。茚三酮监测，反应完成后抽滤、常规洗涤、再以30％左右的哌啶脱去Fmoc保护基，DMF、DCM、MeOH等充分洗涤，固相氧化成环。选定方法裂解，以无水乙醚沉降得粗肽；HPLC法纯化，冻干，得纯的6-氨基己酰化化合物。
1.Ahx-CMt(I)-OCT的合成其肽序为

按照6-氨基己酰化通法，偶联完线性肽后加入0.64g碘，12.5ml DMF氧化成环，氧化时间为2h；裂解均是在Reagent R中添加TES 2.5mL，裂解时间为3h。Ahx-CMT(I)-OCT的实验条件见下表。
Table 1 Synthetic conditions and experimental results ofAhx-CMT(I)-OCT


裂解后得粗肽1221.5mg；经HPLC纯化得精肽322.9mg收率26.5％，纯度95.2％。
2.Ahx-CMt(II)-OCT的合成其肽序为

按照6-氨基己酰化通法，偶联完线性肽后加入7.5.ml 0.5M I2的DMF溶液进行氧化成环，氧化时间为2h；裂解均是在Reagent R中添加TES 2.8mL，裂解时间为3h。Ahx-CMt(II)-OCT的实验条件见下表。
Table 2 Synthetic conditions and experimental results ofAhx-CMt(II)-OCT

裂解后得粗肽1567.5mg；经HPLC纯化得精肽349.9mg，纯度90.2％，收率21.6％。
实施例4本实施例涉及本发明的奥曲肽变构肽的乙酰化合成。
1.Ac-OCT-CMT(I)的合成其肽序为

取OCT-CMT(I)-Pr肽树脂(替代度0.345mmol/g)进行乙酰化修饰，以30％左右哌啶脱去Fmoc保护基后，取出2.620g(0.40mmol)-OCT-CMT(I)-Pr肽树脂，加入乙酸酐(Ac2O)1.08mL(40eq.)、0.914mL(40eq.)Pyridine对N-端进行乙酰化，通入氮气，室温反应3.5h，茚三酮检测已透明，反应完成后抽滤，收样，抽干得乙酰化肽树脂。经固相氧化成环后加入25mLReagent R，常规裂解。冷冻干燥得Ac-OCT-CMT(I)828.02mg，收率90.5％HPLC纯度71.2％，MALDI-TOF-MS 2396.9；经HPLC纯化，得精肽336.5mg，纯度为97.9％，收率为35.1％。
化方法，2.Ac-Ahx-CMt(I)-OCT的合成其肽序为

按照上述乙酰化方法，线性肽偶联完后加入7.5.ml 0.5M I2的DMF溶液进行氧化成环，氧化时间为2h；裂解采用Reagent R，裂解时间为3h。Ac-Ahx-CMt(I)-OCT的实验条件见下表。
Table 3 Synthetic conditions of Ac-Ahx-CMt(I)-OCT and experimental results

裂解后所得粗肽经HPLC纯化得精肽259.6mg，纯度95.2％，收率20.8％。
3.Ac-Ahx-OCT-CMT(I)的合成其肽序为

按照上述乙酰化方法，线性肽偶联完后加入0.84g碘20.5ml DMF氧化成环，氧化时间为2h；裂解采用Reagent R，裂解时间为3h。Ac-Ahx-OCT-CMT(I)的实验条件见下表。
Table 4 Synthetic conditions of Ac-Ahx-OCT-CMt(I)and experimental results

裂解后所得粗肽经HPLC纯化得精肽295.5mg，纯度97.1％，收率23.5％。
实施例5本实施例涉及本发明的奥曲肽变构肽的丁二酸单酰化合成丁二酸单酰化合成通法肽树脂以30％左右哌啶脱去Fmoc保护基后，以DMF、DCM、MeOH等充分洗涤。以适量DMF溶胀树脂，慢慢滴加丁二酸酐(Suc2O)或丁二酸酐/吡啶的DCM溶液，通入氮气，室温反应。茚三酮监测，反应完成后抽滤、常规洗涤、真空干燥。经固相氧化后，选定方法裂解，得粗肽；HPLC法纯化，冻干，得纯品。
1.Suc-OCT-CMt(I)的合成其肽序为

按照丁二酸单酰化通法，线性肽偶联完后加入7.5.ml 0.5M I2的DMF溶液进行氧化成环，氧化时间为2h；裂解采用Reagent R，裂解时间为3h。Suc-OCT-CMt(I)的实验条件见下表。
Table 5 Synthetic conditions of Suc-OCT-CMt(I)

裂解后所得粗肽经HPLC纯化得精肽337.5mg，纯度96.3％，收率27.5％。MS2454.7。
2.Suc-CMT(I)-OCT的合成其肽序为

按照丁二酸单酰化通法，线性肽偶联完后加入7.5.ml 0.5M I2的DMF溶液进行氧化成环，氧化时间为2h；裂解采用Reagent R，裂解时间为3h。Suc-CMt(I)-OCT的实验条件见下表。
Table 6 Synthetic conditions of Suc-CMT(I)-OCT

裂解后所得粗肽经HPLC纯化得精肽276.3mg，纯度95.7％，收率28.3％。MS2440.7。
实施例6本实施例涉及本发明的奥曲肽变构肽的硬脂酰化合成硬脂酰化通法肽树脂以15％左右哌啶脱去Fmoc保护基后，以DMF、DCM、MeOH等充分洗涤。以适量DMF溶胀树脂，加入硬脂酸(stearic acid)、TBTU/HOBt的DMF溶液，通入氮气，滴入TEA/DMF溶液，室温反应。茚三酮监测，反应完成后抽滤、固相氧化、经洗涤后真空干燥。选定方法裂解，得粗肽；HPLC法纯化，冻干，得纯品。
1.C17H35CO-OCT的合成其肽序为

按照硬脂酰化通法，取线性肽树脂OCT-Pr 2.6g(0.4mmol)对其N端用硬脂酸进行修饰。线性肽偶联完后加入6.5.ml 0.5M I2的DMF溶液进行氧化成环，氧化时间为2h；肽树脂裂解是在Reagent R中添加TES 1.5mL，裂解时间为3h。C17H35CO-OCT的实验条件见下表。
Table 7 Synthetic conditions of C17H35CO-OCT

裂解后得粗肽539.5mg；经HPLC纯化得精肽162.5mg，纯度98.2％，收率31.6％。MALDI-TOF-MS 1286.7。
2.C17H35CO-CMT(I)-OCT的合成其肽序为

按照硬脂酰化通法，取线性肽树脂CMt(I)-OCT-Pr 3.215g(0.5mmol)对其N端用硬脂酸进行修饰。线性肽偶联完后加入7.5.ml 0.5M I2的DMF溶液进行氧化成环，氧化时间为2h；肽树脂裂解是在Reagent R中添加TES 2.5mL，裂解时间为3h。
C17H35CO-CMt(I)-OCT的实验条件见下表。
Table 8 Synthetic conditions of C17H35CO-CMT(I)-OCT

裂解后得粗肽1433.9mg；经HPLC纯化得精肽294.5mg，纯度97.3％，收率22.6％。MALDI-TOF-MS 2607.1。
3.C17H35CO-OCT-CMT(I)的合成其肽序为

按照硬脂酰化通法，取线性肽树脂OCT-CMt(I)-Pr 3.255g(0.5mmol)对其N端用硬脂酸进行修饰。线性肽偶联完后加入7.5.ml 0.5M I2的DMF溶液进行氧化成环，氧化时间为2h；肽树脂裂解是在Reagent R中添加TES 2.5mL，裂解时间为3h。
C17H35CO-OCT-CMt(I)的实验条件见下表。
Table 9 Synthetic conditions of C17H35CO-OCT-CMT(I)


裂解后得粗肽1376.4mg；经HPLC纯化得精肽338.2mg，纯度97.8％，收率25.8％。MALDI-TOF-MS2621.7实施例7本实施例涉及本发明的奥曲肽变构肽的对甲苯磺酰化合成1.Ts-OCT的合成其肽序为

取OCT-Pr肽树脂进行对甲苯磺酰化修饰，DBLK后取出2.787(0.5mmol)OCT-Pr肽树脂，加入对甲苯磺酰氯7.6g(40mmol)、Pyridine 3.48g(44.0mmol)对N-端进行对甲苯磺酰化修饰，12h检测已透明，洗涤、抽干称重得3.031g对甲苯磺酰化肽树脂。加入7.5.ml 0.5M I2的DMF溶液进行氧化成环，以DMF、DCM、MeOH等充分洗涤。抽干后加入20mL Reagent R，常规裂解。冷冻干燥得Tos-OCT粗肽651.7mg，收率111.0％HPLC纯度62.6％，MALDI-TOF-MS1174.3；经HPLC纯化得精肽164.4mg，纯度为93.9％，收率28.0％。
2.Ts-CMT(I)-OCT的合成其肽序为

按照上述对甲苯磺酰化方法，取线性肽树脂CMt(I)-OCT-Pr 2.952g(0.5mmol)对其N端用对甲苯磺酰氯进行修饰。线性肽偶联完后加入7.5.ml 0.5M I2的DMF溶液进行氧化成环，氧化时间为2h；肽树脂裂解是在Reagent R中添加TES 2.5mL，裂解时间为3h。Ts-CMt(I)-OCT的实验条件见下表。
Table 10 Synthetic conditiohs of Ts-CMT(I)-OCT


裂解后得粗肽1235.4mg；经HPLC纯化得精肽222.1mg，纯度97.8％，收率17.8％。MALDI-TOF-MS2495.7。
3.Ts-CMT(II)-OCT的合成其肽序为

按照上述对甲苯磺酰化方法，取线性肽树脂CMt(II)-OCT-Pr 3.198g(0.3mmol)对其N端用对甲苯磺酰氯进行修饰。线性肽偶联完后加入4.5.ml 0.5M I2的DMF溶液进行氧化成环，氧化时间为2h；肽树脂裂解是在Reagent R中添加TES 2.5mL，裂解时间为3h。Ts-CMt(II)-OCT的实验条件见下表。
Table 11 Synthetic conditions of Ts-CMT(II)-OCT

裂解后得粗肽1030.9mg；经HPLC纯化得精肽186.8mg，纯度90.8％，收率18.3％。MALDI-TOF-MS3403.24.Ts-OCT-CMT(I)的合成其肽序为

按照上述对甲苯磺酰化方法，取线性肽树脂OCT-CMt(I)-Pr 2.987g(0.45mmol)对其N端用对甲苯磺酰氯进行修饰。线性肽偶联完后加入7.5.ml 0.3M I2的DMF溶液进行氧化成环，氧化时间为2h；肽树脂裂解是在Reagent R中添加TES 2.5mL，裂解时间为3h。
Ts-OCT-CMt(I)的实验条件见下表。
Table 12 Synthetic conditions of Ts-OCT-CMT(I)


裂解后得粗肽1298mg，纯度42.6％，MALDI-TOF-MS 2508.9；经HPLC纯化得精肽124mg，纯度为89.9％，总收率11.0％。
实施例8本实施例涉及本发明的奥曲肽变构肽的N-芴甲酰化合成1.Fmoc-CMT(I)-OCT-01线性肽的合成其肽序为Fmoc-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-(D)-Phe-Cys-Phe-(D)-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol称取Fmoc-Thr(tBu)-O-DHP-HM Resin树脂1.976g(1.0mmol)置于合成柱中，加入27mlDMF/DCM(1∶1)溶胀30min后抽干。加入15ml 30％六氢吡啶的DMF溶液反应30min脱除氨基酸树脂的Fmoc保护基团，然后用DMF、DCM、MeOH、DCM依次洗涤以除尽六氢吡啶。称取Fmoc-Cys(Trt)-OH(2.345g，4mmol)，用适量DMF溶解然后加入偶联剂HOBt(0.543g，4mmol)、TBTU(1.287g，4mmol)和1M的二异丙基乙胺(4ml，4mmol)，偶联2h左右直到茚三酮检测呈阴性，除去反应液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤肽树脂；加入20％-40％六氢吡啶的DMF溶液脱除半胱氨酸的Fmoc保护基团，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤，除尽六氢吡啶。然后依照本发明的奥曲肽变构肽母体肽的氨基酸序列依次进行后续偶联，如此循环完成整个奥曲肽变构肽肽链的偶联，当偶联完最后一个氨基酸(Fmoc-Arg(Pbf)-OH)时，不用去Fmoc保护基。充分洗涤，MeOH收缩，抽干，得到Fmoc保护的线性肽树脂6.280g。
从中取出3.140g(0.5mmol)线性肽肽树脂，然后加入22.6ml裂解液(TFA20.3ml、Anisole0.45ml、Thioanisole1.2ml、EDT0.7ml)，进行裂解去保护，反应3.0h后，滤去树脂，液相浓缩至10ml左右，倒入60ml冰冻的无水乙醚中，析出大量白色沉淀，粗肽经高效液相色谱(HPLC)纯化、得精肽378.2mg，纯度97.6％，合成总收率为29.5％。MALDI-TOF-MS 2565.0。
2.Fmoc-CMT(I)-OCT-02环肽的合成其肽序为

称取按上述方法合成的线性奥曲肽变构肽肽树脂3.140g(0.5mmol)，于反应器中用20mlDMF溶胀30min，在搅拌下滴加0.3M的I2/DMF溶液20ml，避光、室温氧化3h，将树脂抽干、依次用DMF、DCM、MeOH洗涤至树脂无色。再将树脂抽干，然后加入30ml裂解液(TFA27ml、Anisole0.6ml、Thioanisole1.5ml、EDT0.9ml)，反应3.0h后，滤去树脂，液相浓缩至10ml左右，倒入60ml冰冻的无水乙醚中，析出大量白色沉淀，粗肽经高效液相色谱(HPLC)纯化、得精肽288.2mg，纯度96.6％，合成总收率为22.5％。MALDI-TOF-MS 2563.0。
实施例9本实施例涉及本发明的奥曲肽变构肽的C-端酰氨化合成1.CMT(I)-OCT-NH2-01线性肽的合成其肽序为Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-(D)-Phe-Cys-Phe-(D)-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2称取Rink氨基酸树脂Fmoc-Thr(tBu)-Rink Amide Resin-040508 4.321g(1.5mmol)置于合成柱中，加入120ml DMF/DCM(1∶1)溶胀30min后抽干。加入60ml 30％六氢吡啶的DMF溶液反应30min脱除氨基酸树脂的Fmoc保护基团，然后用DMF、DCM、MeOH、DCM依次洗涤以除尽六氢吡啶。称取Fmoc-Cys(Trt)-OH(2.343g，4mmol)，用适量DMF溶解然后加入偶联剂HOBt(0.651g，4.8mmol)、TBTU(1.543g，4.8mmol)和0.5M的二异丙基乙胺(9.6ml，4.8mmol)，偶联2h左右直到茚三酮检测呈阴性，除去反应液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤肽树脂；加入20％-40％六氢吡啶的DMF溶液脱除半胱氨酸的Fmoc保护基团，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤，除尽六氢吡啶。然后依照本发明的奥曲肽变构肽母体肽的氨基酸序列依次进行后续偶联，如此循环完成整个奥曲肽变构肽肽链的偶联，充分洗涤，MeOH收缩，抽干，得其线性肽肽树脂9.320克。
从中取出4.660g(0.75mmol)线性肽肽树脂，然后加入23ml裂解液(TFA20.3ml、Anisole0.45ml、Thioanisole1.2ml、EDT0.7ml)，进行裂解去保护，反应3.0h后，滤去树脂，液相浓缩至10ml左右，倒入60ml冰冻的无水乙醚中，析出大量白色沉淀，粗肽经高效液相色谱(HPLC)纯化、得精肽459.2mg，纯度98.1％，合成总收率为26.0％。MALDI-TOF-MS 2354.7。
2.CMT(I)-OCT-NH2-02环肽的合成其肽序为 取上述合成的线性肽肽树脂4.660g(0.75mmol)于反应瓶中，加入7.5.ml 0.5M I2的DMF溶液进行氧化成环，反应3h后，滤去树脂，液相浓缩至10ml左右，倒入60ml冰冻的无水乙醚中，析出大量白色沉淀，粗肽经高效液相色谱(HPLC)纯化、得精肽384.7mg，纯度98.7％，合成总收率为21.8％。MALDI-TOF-MS 2352.7。
实施例10本实施例涉及本发明的奥曲肽变构肽的C-端乙氨化合成乙胺解通法以DMF溶涨一定量已经氧化的肽树脂，加入足量乙胺水溶液(70％EtNH2.H2O)，震摇一定的时间，室温放置。TLC监测反应进程。抽滤，DMF洗涤，滤液合并。控温旋蒸近干，适宜溶剂溶解，再旋蒸浓缩，加入无水乙醚，沉降完全后冷藏，倒出上清液，沉淀用溶剂溶解，再次沉降、冷藏，过滤，干燥。如此得到的乙胺解全保护肽，选定方法裂解，得粗肽；HPLC法纯化，冻干，得纯品。
1.OCT-NHEt的合成其肽序为 按照乙胺解通法，取2.180g(0.50mmol)OCT-Wang-Resin(简写为OCT-WR)，加入25mLDMF，摇匀后滴加15mL 70％EtNH2.H2O，室温震摇35小时后，抽滤，DMF洗涤树脂4次，滤液合并。减压旋蒸浓缩至干，DCM溶解，再旋蒸至干，真空干燥得乙胺解全保护肽。加入20mL经典裂解试剂(Reagent RTFA/thioanisole/anisole/EDT，90∶5∶3∶2，v/v)，室温搅拌反应3h，乙醚沉降抽干得粗肽；HPLC法纯化，冻干，得精肽112.4mg，纯度87.8％，合成总收率为21.2％，MALDI-TOF-MS 1060.3。
2.CMT(I)-OCT-NHEt的合成其肽序为 按照乙胺解通法，2.476g(0.50mmol)CMt(I)-OCT-Wang-Resin(简写为OCT-WR)，加入27mLDMF，摇匀后滴加18mL 70％EtNH2.H2O，室温震摇42小时后，抽滤，DMF洗涤树脂4次，滤液合并。减压旋蒸浓缩至干，DCM溶解，再旋蒸至干，真空干燥得乙胺解全保护肽。加入25mL经典裂解试剂(Reagent R:TFA/thioanisole/anisole/EDT，90∶5∶3∶2，v/v)，室温搅拌反应3h，乙醚沉降抽干得粗肽；HPLC法纯化，冻干，得精肽223.9mg，纯度85.2％，合成总收率为18.8％，MALDI-TOF-MS 2381.7。
3.OCT-CMT(I)-NHEt的合成其肽序为 按照乙胺解通法，2.456g(0.50mmol)CMT(I)-OCT-Wang-Resin(简写为OCT-WR)，加入27mLDMF，摇匀后滴加18mL 70％EtNH2.H2O，室温震摇40小时后，抽滤，DMF洗涤树脂4次，滤液合并。减压旋蒸浓缩至干，DCM溶解，再旋蒸至干，真空干燥得乙胺解全保护肽。加入25mL经典裂解试剂(Reagent R:TFA/thioanisole/anisole/EDT，90∶5∶3∶2，v/v)，室温搅拌反应3h，乙醚沉降抽干得粗肽；HPLC法纯化，冻干，得精肽213.7mg，纯度86.7％，合成总收率为17.9％。MALDI-TOF-MS 2382.3。
实施例11本实施例涉及本发明的奥曲肽变构肽对人肝癌细胞的抗肿瘤活性试验采用MTT法进行体外细胞毒活性实验1.主要试剂与仪器1.1主要试剂RPMI-1640培养基和胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司，噻唑蓝(MTT)购自SIGMA公司，人肝癌细胞BEL-7402购自中国科学院上海生命科学研究院。
1.2仪器FACScalibur型流式细胞仪(Becton Dickinson)；酶标仪(Bio-Rad Model 680)；SanyoCO2培养箱(MCO-18AIC)。
2.方法(1).取单层培养的人肝癌细胞BEL-7402，用全培养基(含有10％FBS的DMEM)将细胞数调整到105/ml，接种于96孔板中(90μl/孔)；置于37℃、5％CO2及饱和湿度的条件下静置24小时待细胞贴壁；(2).24小时后，从-20℃条件下取出各待测物，用灭菌的PBS液溶解，立即加入到各孔，设8个浓度，8个平行，并使其中的有效成分的终浓度在500，250，125，62.5，31.25，15.625，7.8125，3.90625μM，并设空白组与对照组，放入培养箱中继续培养24小时；(3).复步骤2，继续培养24小时；(4).当各待测物累计作用了48小时后，每孔加入10μl MTT(5μg/mL)作用4小时后，加入DMSO溶解形成的蓝紫色结晶，并于590nm波长测定各孔细胞吸光度值，按照公式(1)计算抑制率，并计算IC50值，结果见表13。
Table 13奥曲肽变构肽衍生物对人肝癌细胞BEL-7402的抑制实验结果

权利要求
1.奥曲肽变构肽分子，其特征在于具有下列结构通式， 其中R1是p-CH3C6H4SO2或R2CO。R2是C1-C17烷基或环烷烃基或芳香基或芳杂环。
2.根据权利要求1所述的奥曲肽变构肽分子，其特征在于具有下列结构通式， 其中CMT的肽序为RKKRRQRRR或RQIKIWFQNRRMKWKK。
3.根据权利要求2所述的奥曲肽变构肽分子，其特征在于具有下列结构通式， 其中Z是H2N(CH2)nCO，n可以是5-11。
4.根据权利要求2所述的奥曲肽变构肽分子，其特征在于具有下列结构通式，
5.根据权利要求2所述的奥曲肽变构肽分子，其特征在于具有下列结构通式， 其中X是能水解的羧基保护基。
6.一种含有权利要求1至5中所述的任一奥曲肽变构肽分子的药物，其特征在于表现为多肽的药学上有效的盐。
7.根据权利要求1至5中所述的任一变构肽分子，其特征在于表现为线性多肽。
8.一种含有权利要求7中所述的任一奥曲肽变构肽分子的药物，其特征在于表现为多肽的药学上有效的盐。
9.根据权利要求2或4所述的变构肽分子，其特征在于 或 其中R1可以是H。
全文摘要
本发明涉及一类具有抗肿瘤活性的奥曲肽变构肽分子及其药物，其特征在于具有下列结构通式，
文档编号A61K38/12GK1900110SQ20051003599
公开日2007年1月24日 申请日期2005年7月22日 优先权日2005年7月22日
发明者谢文林, 徐安龙, 袁建成, 姚志勇, 杨大成, 曾少贵, 彭文烈, 王宇恩, 刘建, 刘剑, 刘艳红 申请人:深圳市翰宇生物工程有限公司, 中山大学