一种抗肝癌的dna疫苗的制作方法

专利名称：一种抗肝癌的dna疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗肝癌的DNA疫苗。
背景技术：
原发性肝癌(Primary Hepatocellular Carcinoma, PHC)是一种常见的恶性肿瘤， 目前临床上仍沿用以手术切除为主，无水乙醇瘤体注射、经皮肝动脉化疗及栓塞治 疗等为辅的治疗方法，但疗效不佳，仅有20%的肿瘤可以被切除，不能切除肿瘤的 病人，5年生存率低于5%。
基因治疗有望成为有效治疗肝癌的新方法。由于肿瘤细胞表达低水平的组织相 容性抗原分子(MHC),缺乏有效激活淋巴细胞的信号分子，同时肿瘤细胞本身可 产生免疫抑制因子或某些细胞因子(如TGF-P )抑制淋巴细胞的激活从而逃避机体 免疫系统的免疫识别，机体免疫系统对肿瘤细胞表现为免疫耐受，不能激发正常的 免疫应答杀伤肿瘤细胞。因此结合免疫学原理和分子生物学技术的免疫基因治疗是 目前肝癌基因治疗中的研究热点。
多种多样的肝癌免疫基因治疗方法在体内、外实验中显示了良好的效果。肝癌 的免疫基因治疗策略主要包括
1、 增强肿瘤的免疫原性肿瘤细胞表面由于MHC I类抗原或共刺激因子的低 表达甚至丢失，不能被机体免疫系统识别而逃避免疫系统的免疫监视，MHC I类分 子和共同刺激因子(如B7. 1和B7.2)修饰后的肿瘤细胞，获得了激活机体免疫反 应所必需的第一和第二信号，使之免疫原性增强，激发机体的抗肿瘤免疫，导致肿 瘤消退(Melero B, Gene Ther, 1999;6:1779-1784.);干扰素调控因子1 (IRF-1)转染 肝癌细胞后，能诱导IFN-R的分泌，通过上调MHC I类抗原和MHC B类抗原分子表 达，增强免疫细胞对肿瘤细胞的有效识别来抑制肿瘤生长(KmgerA， Cancer Res,2001,61:260)。
2、 外源细胞因子增强机体的免疫
(l)白介素类应用重组白介素2和白细胞介素12激活淋巴因子活化杀伤细胞 (LAK细胞)从而改变宿主细胞肿瘤耐受状态；腺病毒和逆转录病毒转染的白介素12 (IL-12)均可在体内产生抗肿瘤活性(YamashitaY,Mol Cancer Ther. 2004; 3:1177-1182.)。
(2) 干扰素类肝癌的动物模型研究观察到，重组细胞因子干扰素可以抑制肝癌 细胞生长，增强机体的抗肿瘤免疫，导致肿瘤消退，延长荷瘤动物的生存期
(Aurisicchio L，Gene Ther.2001 ;8:1817-25; Santodonato L， Cancer Gen Ther，2001,8:63)。
(3) 肿瘤坏死因子类用逆转录病毒载体修饰肿瘤细胞以及肝癌的动物模型研究
观察到，肿瘤坏死因子a (TNFa)可以抑制癌细胞生长，增强机体的抗肿瘤免疫， 杀死肿瘤细胞或导致肿瘤消退，延长荷瘤动物的生存期(张群华等，中华医学杂志， 2000;8:313-315; Grimm C F， Gastroenterology, 2000; 119:110)。
3、 对抗原递呈细胞的修饰抗原递呈细胞(antigen present cell， APC)在产生 和调控肿瘤免疫中发挥着主要作用。树突状细胞(dendriticcell， DC)是最有效的专职 抗原递呈细胞，因此，研究DC在抗肿瘤免疫中的应用也是目前的热点。F113配体 (FL)能增加DC的数量和增强DC的功能，也有显著的抗肿瘤效应(Nishioka Y,Cancer Res,1999;59:4035-4041)。
4、 肿瘤抗原的核酸免疫用肿瘤相关抗原作为疫苗免疫动物，也能起到预防
肿瘤的作用。应用表达甲胎球蛋白(a-fetoprotein， AFP)的DC或AFP的核酸免疫， 以及用一个来自于AFP的9肽均能产生强大的T细胞反应，诱导排斥肿瘤的DNA疫 苗(ButerfeldL， Cancer Res. 1999, 59:31)。
5、 联合基因治疗细胞因子之间或细胞因子与自杀基因、抗血管生成基因或 抑癌基因等方法的联合应用，可以取得协同作用，明显增强其抗肿瘤效果，是目前 肿瘤免疫基因治疗的研究趋势(Tatsumi T, Hepatology, 1999; 30:422-429. Maninet O, Cancer Gem Ther, 1999,6:491)。
超过80%的原发性肝癌细胞可以合成分泌AFP，它是原发性肝癌重要的肿瘤标 记物，在正常细胞中AFP启动子不能活化，而分泌AFP的肝癌细胞中AFP启动子可 激活并转录翻译AFP (ButterfieldLH, Jlmmunol.2001;166:5300-8)。人类T细胞系 统可以通过MHC I类分子识别AFP来源的短肽而产生抗肝癌作用，已将AFP免疫T 细胞后获得的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)注入小鼠，并观察 到其在体内的抗癌的作用(VollmerCMJr， Cancer Res. 1999;59(13):3064-3067.)。但是 在体内，AFP作为"自身"肿瘤性抗原，机体对其表现为免疫耐受，免疫系统个体发
育时一些AFP特异性T细胞被清除，并且AFP是分子量较大的蛋白质，由于其空间 构型的影响，AFP分子中的抗原决定簇并不暴露在其分子表面，因而无法激发免疫 系统的免疫杀伤作用。
结合计算机分析和转基因小鼠实验，确定在AFP分子中hAFP542-550、 hAFP137-145、 hAFP158-166和hAFP325-331的氨基酸序列是其抗原决定簇，其中 hAFP542-550具备良好的免疫原性，通过抗原递呈激活机体MHC I类分子后，可被 CD8+T细胞系统识别，诱导其免疫杀伤作用(Butterfield LH, J Immunol. 2001 15; 166: 5300-8; Butterfield LH, Mol. Immunol.2000;37:943-950.)。
机体中最重要的抗癌效应细胞是T细胞，肿瘤的特异抗原可以有效激活特异T 细胞，在体内激活T细胞最佳条件是具备强免疫原性的抗原、有效的APC和适宜 的免疫刺激环境。尽管AFP抗原决定簇hAFP542-550具备良好的免疫原性，但其不 表达在肝癌细胞膜表面，肝癌细胞本身亦不能成为抗原颗粒，因此也就不能有效活 化T细胞系统，无法被效应T细胞识别杀伤。为实现上述目的必须具备以下两个条 件①良好抗原性的短肽能够通过肝癌细胞转录翻译；②转录翻译的短肽能够在肝
癌细胞膜上表达，并且能分泌在膜表面。
"锚定蛋白"是一种一端带有锚定信号膜蛋白的通称，其疏水端的分支信号序
列翻译后可以将其嵌入膜的脂质双分子层，S卩"锚定"在细胞膜上。共价连接糖基化 磷脂酰肌醇(glycosylphophatidylinositol， GPI)是细胞表面糖蛋白锚定细胞膜的重 要方式，因此也称这些糖蛋白是GPI锚定蛋白质。GPI锚定蛋白质广泛分布在真核 细胞中，理论上任何蛋白质都可以通过嵌合cDNA的办法将其3，末端的基因序列由 天然的GPI锚定蛋白质基因的3'端替换，从而转变为GPI锚定蛋白"派生"蛋白，即 "GPI再锚定蛋白"(GPI-reanchoredprotein)。当GPI再锚定蛋白表达后同样具备"锚 定"细胞的特性。这种技术称之为"蛋白质工程(protein engineering )"(Premkumar DR, J.CellBiochem.2001;82:234-45)。采用该技术不但可以修饰细胞表面，而且可以替 代传统的基因转染方式，有重要的应用价值。有报道将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)和GPI锚定蛋白-兔中性内肽酶(rabbit neutral end叩eptidase)的部分序列(包括锚定信号和分泌信号)结合形成融合蛋白PEP-GFP， 构建质粒pcPEP-GFP，将其转入C0S-l细胞中，结果在细胞膜上可检测到GFP的表 达(SimonovaM,Biochem.Biophys.Res.Commun. 1999;262:638-642.)。另有实验研 究GPI-膜锚定蛋白Yap3p的氨基酸序列与酿酒酵母细胞YPH499细胞壁的关系，确 定Yap3p蛋白的C末端对其锚定有重要作用(HamadaK, J. Biol. Chem.l998;273;(41):26946-53.)。近年来该技术逐步发展并应用于细胞肿瘤疫苗和 免疫基因治疗中，如GPI连接B7. l在小鼠中诱导保护性免疫并在体外诱导同源抗 肿瘤T细胞增殖(Brunschwig EB， J Immunother. 1999;22(5):390-400.);将白介素2 和白介素12锚定在肿瘤细胞膜上激发强的抗肿瘤免疫反应(Nagarajan S, Cancer Res.2002;62(10):2869-74.; Ji J， J Gene Med. 2004;6(7):777-85)。
Glypican3 (GPC3)是新近发现的一种新型原发性肝癌的肿瘤标记物，是一类 GPI锚定膜蛋白。它在肝癌细胞膜上过表达，属细胞膜表面硫酸乙酰肝素蛋白多糖 (heparan sulfate proteoglycans, HSPGs)家族的一员。它可以锚定在肝癌细胞膜表 面，且可以被分泌入血液，其氨基酸序列的N末端决定其分泌，而C末端则是其锚 定信号(T.Nakastura,Biochem.Biophys.Res.Commun.2003;306(3): 16-25.) ， GPC3 通过C末端与GPI共价连接后锚定于肝癌细胞膜上。

发明内容
本发明的目的是提供一种抗肝癌的DNA疫苗。
本发明所提供的抗肝癌的DNA疫苗，它的活性成分表达如下融合蛋白的重组真 核细胞表达载体；所述融合蛋白包括GPC3的N端分泌信号区、GPC3的C端锚定信 号区和至少一个甲胎蛋白抗原决定簇，所述至少一个甲胎蛋白抗原决定簇位于所述
GPC3的N端分泌信号区和所述GPC3的C端锚定信号区之间，所述GPC3的N端分泌 信号区位于所述融合蛋白的氨基端，所述C端锚定信号区位于所述融合蛋白的羧基 端。
所述GPC3的N端分泌信号区至少含有GenBank Accession Number NP—004475. 1 的自氨基末端第1至24位氨基酸残基；
所述GPC3的N端分泌信号区具体可为GenBank Accession Number NP—004475. 1 的自氨基末端第1至24位氨基酸残基、第1至25位氨基酸残基、第1至26位氨 基酸残基、第1至27位氨基酸残基、第1至28位氨基酸残基、第1至29位氨基 酸残基或第1至30位氨基酸残基；
所述GPC3的N端分泌信号具体区为GenBank Accession Number NP—004475. l的 自氨基末端第1至28位氨基酸残基。
所述GPC3的C端锚定信号区具体可为GenBank Accession Number NP—004475. 1 的自氨基末端第29至580位氨基酸残基。
所述GPC3的N端分泌信号区的编码序列可为GenBank Accession Number NM—004484的自5'末端第191一274位脱氧核糖核苷酸。
所述GPC3的C端锚定信号区的编码序列可为GenBank Accession Number 醒J)04484的自5'末端第275 — 1933位脱氧核糖核苷酸。
所述甲胎蛋白的抗原决定簇可为hAFP542-550、 hAFP137-145、 hAFP158-166 或hAFP325-331(Butterfield LH, J Immunol. 2001 15; 166: 5300-8; Butterfield LH， Mol. Immunol.2000;37:943-950.)，优选为hAFP542-550。
所述hAFP542-550的氨基酸序列为GVALQTMKQ (序列l)。
所述hAFP542-550的编码核苷酸序列为ggtgtagcgctgcaaacgatgaagcaa (序列2)。
所述融合蛋白中还包括报告蛋白，所述报告蛋白位于所述甲胎蛋白抗原决定簇 和所述GPC3的C端锚定信号区之间。
在上述融合蛋白中，当所述报告蛋白为EGFP，所述GPC3的N端分泌信号区为 GenBank Accession Number NP—004475. 1的自氨基末端第1至28位氨基酸残基，所述 GPC3的C端锚定信号区为GenBank Accession Number NP—004475. l的自氨基末端第 29至580位氨基酸残基，所述hAFP542-550的氨基酸序列为GVALQTMKQ (序列l) 时，所述融合蛋白的氨基酸序列如序列表中序列3所示，其名称为 GPC3-N-hAFP542—55。-GPC3-C 。
GPC3-N-hAFP542-55。-GPC3-C的编码基因可如序列表中序列4所示。
所述重组真核细胞表达载体的出发载体可为现有的能在哺乳动物细胞中表达 外源基因的载体，如腺病毒载体、逆转录病毒载体、质粒载体，如pcDNA3. 1 (+)。
本发明的抗肝癌DNA疫苗可以用于制备细胞因子IFN- y的诱生剂。
为了增加疫苗的靶向性，可以对出发质粒的CMV启动子进行改造替换，如加入 AFP启动子或者AFP启动子和增强子；或者进一步将融合蛋白的基因克隆入病毒载 体，如具亲肝性的腺病毒载体或者有成功应用经验的逆转录病毒载体等；甚至进一 步寻找更加合适的抗原决定簇基因，这些都将有助于优化改进该疫苗，从而能够有 效地实现对于原发性肝癌甚至更广谱意义上恶性肿瘤的基因治疗。
所述抗肝癌DNA疫苗中还可含有MHC I类分子或共同刺激因子(如B7. 1和B7. 2) 基因来修饰肿瘤细胞从而增强细胞的免疫原性。
本发明的抗肝癌DNA疫苗经过转录翻译后表达融合蛋白，使单个肝癌细胞本身 成为一种强免疫原性颗粒，放大其抗原性，使之成为具备"主动免疫"能力的疫苗，
增加免疫系统对癌细胞的识别，改变机体对其的免疫耐受状态，诱导T细胞活化实 现对肝癌细胞的杀伤。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。


图1为pcDNA3. 1 (+)/K0ZAK-GPC3-N-hAFP542-55。-EGFP-GPC3-C质粒构建示意图 图2为pcDNA3. 1 (+)/GPC3-C质粒酶切鉴定图
图3为pcDNA3. 1 (+)/K0ZAK-GPC3-N-hAFP542—55。-EGFP-GPC3-C质粒酶切鉴定图
图4为pcDNA3. 1 (+) /KOZAK-GPC3-N-hAFP542-55。-EGFP-GPC3-C质粒转染后RNA水 平上检测融合基因的表达
图5为pcDNA3. 1 (+) /KOZAK-GPC3-N-hAFP542_55。-EGFP-GPC3-C质粒转染后裂解细 胞内融合蛋白表达的检测(GFP—抗)
图6为pcDNA3. 1 (+)/K0ZAK-GPC3-N-hAFP542—55。-EGFP-GPC3-C质粒转染后裂解细 胞和培养上清内融合蛋白表达的检测(GPC3—抗)
图7为pcDNA3. 1 (+) /K0ZAK-GPC3-N-hAFP542—55。-EGFP-GPC3-C质粒和pEGFP-Nl 质粒转染后24小时和48小时荧光显微镜下绿色荧光蛋白表达细胞膜定位图
图8为pcDNA3. 1 (+)质粒和pcDNA3. 1 (+) /KOZAK-GPC3-N-hAFP542—55。-EGFP-GPC3-C 质粒分别转染肝癌细胞48小时后与淋巴细胞共培养各时段细胞上清中IFN— y的 ELISA检测结果
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见
《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 (Sambrook， J. ， Russell, David W.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001 ， NY， Cold Spring Harbor)。
所用引物及DNA序列均由上海基康生物公司合成。
实施例l、抗肝癌的DNA疫苗的活性成分制备
该抗肝癌的DNA疫苗的活性成分是 pcDNA3. 1 (+)/K0ZAK-GPC3-N-hAFP542—550-EGFP-GPC3-C。
pcDNA3. 1 (+)/KOZAK-GPC3-N-hAFP542—55。-EGFP-GPC3-C的构建流程如图1所示，方法 如下
1、用Trizol分别抽提离体的人胎肝、胎肾和胎盘组织的总RNA，按照Reverse Transcription System试剂盒(Promega公司)说明书，逆转录成cDNA备用。2、 以Genbank Accession number:NM—004484的序列为模板设计引物(上游引 物TF: 5，-ctgccactctcccgcgctctcc-3，禾口下游弓l物TR: 5， -gtggttccctttatcgaggaagac-3，) 从胎盘组织的cDNA中用pyrobest酶扩增含GPC3基因开放阅读框架的基因片段 L-GPC3(1.851kb)。上述PCR反应条件为预变性94。C 3min;然后94。C 50sec， 66 °C 45sec， 72°C 2min，共34个循环；再72'C延伸10min。琼脂糖凝胶电泳检测，结 果表明得到l. 851kb的L-GPC3基因片段。将L-GPC3基因片段与pGEM-T载体(Promega 公司)连接，构建pGEM-T/L-GPC3质粒，转化大肠杆菌感受态细胞，涂平板，蓝 白斑筛选，挑白色单克隆抽提质粒，通用引物测序鉴定，结果表明扩增得到的L-GPC3 基因片段的开放阅读框架序列与GenBank Accession Number NM—004484的自5'末端 第150位至2000位的核苷酸序列一致。
3、 以pGEM-T/L-GPC3质粒为模板，上游引物GPCC-f: 5 ， -aagaattcccgccgccggacgccacct-3 '与下游弓l物GPCC-r: 5，-tgcl^i^g^tcagtgcaccaggaagaagaa-3,(弓l物带相应酵切位点，上游 EcoRI，下游XbaI)扩增GPC3的C端片段(1659bp)。上述PCR反应条件为预变性 94°C 5min;然后94。C 50sec， 66°C 45sec， 72°C 2min，共32个循环；再72。C延伸 10min。将PCR产物测序，结果表明得到1659bp的GPC3的C端序列，其GPC3的C端序列 含有GenBank Accession Number NM—004484的自5'末端第275位至1933位的核苷酸 序列。
将带有氨卞青霉素和新霉素抗性基因的pcDNA3. 1 (+)质粒(Irwitrogen公司)和 上述GPC3的C端片段分别用EcoRI和XbaI双酶切，回收，将GPC3的C端片段连 入pcDNA3. 1 (+)的EcoRI和Xbal位点，得到重组表达载体pcDNA3. 1 (+) /GPC3-C质 粒，用SalI、 Scal、 SmaI和PstI分别进行单酶切鉴定，结果与酶切图谱分析结果 相符，具体的酶切情况如图2所示。其中M为500-12000bp的DNA分子量标准， "对照"为未被酶切的pcDNA3. 1 (+)/GPC3-C质粒。
4、 化学合成KOZAK-GPC3-N-hAFP,刷片段(序列5)，该片段两侧分别带有相应 的酶切位点(5，端为NheI， 3，端为EcoRI)，将该片段与pMD-18T载体(Taraka公 司，目录号D101A)连接，得到质粒pMD-18T/K0ZAK-GPC3-N-hAFP542_55。。以该质粒 为模板，用上游引物GPCN-F: 5'- ctagctagcgcaggatggccgggaccgt -3，与下游 引物GPCN-R:5， - gcggtaccttgcttcatcgtttgcagcg-3，(上游引物带NheI酶切位点， 下游引物带KpnI酶切位点，)进行PCR扩增。PCR反应条件为预变性94'C 3min; 然后94。C 30sec， 64°C 30sec， 72°C lmin，共32个循环；再72。C延伸10min。对PCR 产物进行凝胶电泳检测，结果表明得到得到116bp的K0ZAK-GPC3-N-hAFP542-55。-v^"/ 序列。将KOZAK-GPC3-N-hAFP542—55。-A^7游列与pGEM-T载体(Promega公司)连接，得到 pGEM-T/GPC-N-hAFP^-55。质粒，将该质粒测序，证实序列正确，无突变。
5、 以pEGFP-Nl质粒(Clotech公司)为模板，上游引物EGFP-f: 5, -aagg^^gtgagcaagggcgaggagc-3，禾口下游弓I物EGFP-r:
5， -gcgaattccttgtacagctcgtccatgcc-3，(上游引物带KpnI酶切位点，下游引物 带EcoRI酶切位点)PCR扩增EGFP (不含起始和终止密码子)的片段(726bp)。上 述PCR反应条件为预变性94。C 3min;然后94。C 30sec， 60°C 30sec， 72°C lmin， 共32个循环；再72i:延伸10min。 PCR产物纯化回收，与pGEM-T载体(Promega公司) 连接，构建pGEM-T/EGFP质粒，将该质粒测序，证实序列正确。
6、 EcoRI和Kpnl双酶切pcDNA3. 1 (+)/GPC3-C质粒和pGEM-T/EGFP质粒，酶切 产物纯化回收pcDNA3. 1 (+) /GPC3-C质粒的大片段和EGFP片段，将这两个片段进行 连接，得到重组质粒pcDNA3. 1 (+)/EGFP-GPC3-C;用Nhel和Kpnl双酶切 pGEM-T/GPC-N质粒，切下的片段K0ZAK-GPC3-N-hAFP542-55。-v^/2/与用同样酶切的 pcDNA3. 1 (+) /EGFP-GPC3-C质粒相连接，得到含有GPC3-N-hAFP542—55。-EGFP-GPC3-C 编码基因的重组质粒pcDNA3. 1 (+) /KOZAK-GPC3-N-hAFP542—55。-EGFP-GPC3-C质粒，该 质粒即为带有增强型绿色荧光蛋白报告基因的抗肝癌DNA疫苗。
对重组质粒pcDNA3. 1 (+) /KOZAK-GPC3-N-hAFP542—55。-EGFP-GPC3-C的测序结果表 明，GPC3-N-hAFP542-55。-EGFP-GPC3-C编码基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示， 其编码的融合蛋白GPC3-N-hAFPs42-55。-EGFP-GPC3-C的氨基酸序列如序列表中序列3所 示。
7、 pcDNA3. 1 (+)/K0ZAK-GPC3-N-hAFP542—55。-EGFP-GPC3-C质粒经过酶切图谱分 析，用Smal和Kpnl + EcoRI进行双酶切，具体酶切检测结果如图3所示。其中M 为500-12000bp的DNA分子量标准，"环质"为未被酶切的
pcDNA3. 1 (+) /KOZAK-GPC3-N-hAFP542—55。-EGFP-GPC3-C质粒。 实施例2、抗肝癌的DNA疫苗在体内表达和定位的检测 一、分别从RNA水平和蛋白质水平对融合基因的表达进行检测 1、对转染的细胞在RNA水平上检测融合基因的表达
用DMEM+10%FBS (胎牛血清)培养肝癌细胞株H印G2 [HLA-Au(+)](购于武汉大
学中国培养物储藏所动物细胞库(CCTCC)编号GDC024)，当细胞的汇合度大于 95%时，用0.25。/()的胰蛋白酶和EDTA消化传代，分别接种到6孔板(两次重复)和 25cm2培养瓶(两次重复)中，当细胞的汇合度达到80-90%时，将 pcDNA3. 1 (+) /K0ZAK-GPC3-N-hAFP542—55。-EGFP-GPC3-C质粒按照lipofectamine 2000
(Invitrogen公司)说明书的方法进行转染，在转染后24小时和48小时分别收获 细胞。以未转染任何质粒的肝癌细胞H印G2 [HLA-A^(+)]和加入pcDNA3.1(+)质粒 的肝癌细胞H印G2 [HLA-A2"+)]作为对照，转染后24小时和48小时分别收获细胞。 按照Trizol说明书提取细胞总RNA，以Promega公司的Reverse transcription system 逆转录为cDNA (具体步骤参见说明书)，选取特异引物(上游引物GPCN-F: 5'-ctagctagcgcagg3tggccgggaccgt -3，禾口下游弓l物EGFP-r: 5， -gcgaattccttgtacagctcgtccatgcc-3， ) PCR扩增片段 KOZAK-GPC3-N-hAFPM2—刷-EGFP-GPC3-C中的一段KOZAK-GPC3-N-hAFP542—刷-EGFP
(854bp) 。 PCR反应条件为预变性94。C 3rain;然后94°C 30sec， 60°C 30sec， 72°C lmin，共32个循环；再72。C延伸10min。对上述PCR扩增产物进行琼脂糖凝 胶电泳检测，结果如图4所示。其中A、 B分别代表两次重复的6孔板细胞PCR电 泳检测结果，空白表示未转染任何质粒的肝癌细胞HepG2[HLA-A^(+)]，单纯质粒 表示转染pcDNA3.1(+)质粒的肝癌细胞H印G2 [HLA-Au(+)]，右侧的六个泳道为转 染pcDNA3. 1 (+)/K0ZAK-GPC3-N-MFP542—55。-EGFP-GPC3-C质粒的肝癌细胞H印G2 [HLA-A2J(+)]0
2、对转染的细胞在蛋白水平上检测融合蛋白基因的表达 将pcDNA3. 1 (+)/K0ZAK-GPC3-N-hAFP542—55。-EGFP-GPC3-C质粒和pcDNA3.1(+)质 粒分别转染H印G2 [HLA-A2J(+)]，转染后24小时和48小时分别收获细胞和无细胞 的上清培养液，用细胞裂解液(RIPA裂解液中加入Cocktail蛋白酶抑制剂)裂解 细胞提取总蛋白。同时以未转染任何质粒的肝癌细胞H印G2 [HLA-Au(+)]作为空白 对照，培养48小时收获细胞，裂解细胞提取总蛋白。
以Rabbit anti-GFP IgG (Invitrogen公司)为一抗，服P标记的山羊抗兔IgG (深 圳晶美公司)为二抗，westemblot检测细胞内融合蛋白 GPC3-N-hAFP542—55。-EGFP-GPC3-C的表达。
以mouse anti-human GPC3 monoclonal antibody (R&D Systems公司)作为一 抗，HRP标记的羊抗小鼠IgG (深圳晶美公司)为二抗，western blot检测细胞和无
细胞的上清培养液内融合蛋白GPC3-N-hAFP542—55。-EGFP-GPC3-C。
检测结果如图5、 6所示。结果表明未转染任何质粒的肝癌细胞HepG2 [HLA-A2."+)]内未表达GPC3-N-hAFP542—55。-EGFP-GPC3-C，转染pcDNA3.1(+)质粒的 H印G2 [HLA-A2.!(+)]细胞内未表达GPC3-N-hAFP542—55。-EGFP-GPC3-C，转染 pcDNA3. 1 (+)/K0ZAK-GPC3-N-hAFP542—55。-EGFP-GPC3-C的H印G2 [HLA-A"(+)]细胞内 表达GPC3-N-hAFP5 -55。-EGFP-GPC3-C，但并未分泌到培养基中。
图5和6中，"空白组"或"空白组48h"表示未转染任何质粒的肝癌细胞H印G2 [HLA-Au(+)]在相同培养条件下培养48h;"单纯质粒组"或"单纯质粒组48h"表 示转染pcDNA3.1(+)的肝癌细胞H印G2 [HLA-Au(+)]在相同培养条件下培养48h;"转 染组"表示转染pcDNA3. 1 (+)/K0ZAK-GPC3-N-hAFP542—55。-EGFP-GPC3-C的H印G2 [HLA-A2. i (+)]细胞，后面的时间是转染时间。
二、荧光显微镜下对融合蛋白的细胞膜定位进行检测
用DMEM+10%FBS (胎牛血清)培养肝癌细胞H印G2 [HLA-A2.,(+)]，接种到6孔板 培养至汇合度为80-90%，按照lipofectamine 2000 (Invitrogen公司)说明分别转染 质粒pcDNA3. 1 (+)/K0ZAK-GPC3-N-MFP542—55。-EGFP-GPC3-C和pEGFP-Nl (阳性对照)。 每孔以5ul lipofectamine 2000转染4. 0 u g DNA;在转染后24小时和48小时，在 NIK0N TE2000-U荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，结果如图7所示。其中， A、 C为转染pcDNA3. l(+)/K0ZAK-GPC3-N-hAFP542—55。-EGFP-GPC3-C质粒的细胞；B、 D 为转染pEGFP-Nl的细胞；A、 B为转染后24小时绿色荧光蛋白的表达；C、 D为转 染后48小时绿色荧光蛋白的表达；放大倍数为40倍。结果表明，在各个时段内抗 肝癌的DNA疫苗的融合蛋白GPC3-N-hAFP542—55。-EGFP-GPC3-C均在细胞膜上表达，并 出现"帽"现象，胞浆内有散在的零星表达，可能为内质网和高尔基体上的表达； 而pEGFP-Nl质粒在整个细胞内均有表达，胞浆尤为明显，没有明确的胞膜分布。 实施例3、抗肝癌的DNA疫苗激活淋巴细胞免疫效应的初步检测 1、抽取健康人全血20ml加入到肝素抗凝管中，用生理盐水(0.9% Nacl)等 体积稀释，按照6ml稀释血液加入3ml淋巴细胞分离液Lymphoprep (挪威 AXIS-SHIELD公司)的比例，将二者混合，室温800g离心20min，吸取中间白色淋 巴细胞层，加入到25ci^培养瓶中用DMEM+l(mFBS(胎牛血清)培养，备用。
2、将肝癌细胞H印G2接种到6孔板培养板培养至汇合度为80-90%，按照 lipofectamine 2000 (Invitrogen公司)说明分别转染质粒pcDNA3. 1 (+)和质粒
pcDNA3. 1 (+)/K0ZAK-GPC3-N-hAFP542-55Q-EGFP-GPC3-C，每孔以5ul lipofectamine 2000 转染4.0ugDNA;在转染后48小时，分别加入分离培养的淋巴细胞，二者共培养， 分别共培养8h、 12h、 16h、 24h、 36h，取细胞培养上清用人Y干扰素ELISA试剂 盒(武汉博士德公司，货号EK0373)做IFN-Y的酶联免疫吸附试验。8h、 12h细 胞上清不稀释，将16h、 24h、 36h细胞上清稀释3倍作为样本。按照说明书稀释标 准品，并制定标准曲线。取标准品稀释液、每个稀释度的标准品及样本分别加入反 应板的反应孔中，胶纸封闭室温放置2小时；倒去孔中的标准品稀释液、标准品和 样本，每孔加入300u l洗涤液漂洗30-60sec后吸净弃去，重复4次；将酶与检测 抗体按1:250的体积比混匀15分钟后，力nlOOul到反应板的每个孔中，封盖，室 温下孵育l小时；继续洗涤7遍；每孔中加入100y l预先准备的底物溶液，在暗 处避光室温孵育30分钟后；每孔加入50 u 1终止液终止反应；TECAN GENios多功 能酶标仪中读数。
该实验设三次重复，图8显示的三次重复的平均值。图8表明转染质粒 pcDNA3. 1 (+)/K0ZAK-GPC3-N-hAFP542—55。-EGFP-GPC3-C的H印G2表达的蛋白诱生IFN-Y的能力远远高于转染质粒pcDNA3. 1 (+)的H印G2表达的蛋白。说明 pcDNA3. 1 (+)/K0ZAK-GPC3-N-hAFP542—55。-EGFP-GPC3-C可用于制备IFN- y的诱生剂。 图8中，pcDNA3. 1 (+)表示转染质粒pc丽A3. 1 (+)的H印G2与淋巴细胞共培养上清液 检测结果；pcDNA3. 1 (+) /KOZAK-GPC3-N-hAFP542—刷-EGFP-GPC3-C表示转染质粒 pcDNA3. 1 (+)/KOZAK-GPC3-N-hAFP542—55。-EGFP-GPC3-C的H印G2与淋巴细胞共培养上 清液检测结果。
序列表
<160〉 5
〈210〉 1 <211〉 9 <212〉 PRT 〈213〉人工序列
<400〉 1
Gly Val Ala Leu Gin Thr Met Lys Gin 1 5
〈210〉 2 <211> 27 <212〉 DNA <213>人工序列
<400〉 2
ggtgtagcgc tgcaaacgat gaagcaa 27
<210> 3 〈211〉 831 <212〉 PRT <213〉人工序列
<400> 3
Met Ala Gly Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu
15 10 15
Ser Leu Asp Phe Pro Gly Gin Ala Gin Pro Pro Pro Gly Val Ala Leu 20
Lys Gin Gly Thr
Gin Thr Met 35
Val Pro lie Leu
Gly Val 50
Lys Phe Ser Val Ser 65
Leu Thr Leu Lys
Val 55 Glu
Val
40
Glu
25 Ser
Lys Leu Asp Gly Glu Gly
Gly Gly
30
Glu Glu Leu Phe Thr 45
Val Asn Gly His
Gly 70
lie Cys Thr Thr
Asp 60
Ala Thr Tyr
Phe 85
Thr Thr Leu Thr
Asp 75
Lys Leu Pro Vsl
Pro Thr Leu Val 100
His Met Lys Gin
Gly 90
Gly Val Gin Cys
Tyr Pro Asp 115
Tyr Val Gin Glu
Glu Gly 130
Tyr Lys Thr Arg Ala 145
Arg lie Glu Leu
Gly His Ala Asp
Lys
Lys 195 Glu
Leu 180 Gin
Asn lie 210 Thr Pro 225
Ser Thr Gin Ser
lie
Asp Gly
Lys 165 Glu
Lys
Gly
Asp
Glu 150 Gly
Arg 135 Val
His 120 Thr
Tyr 105
Asp Phe Phe L>ys
Gly !>ys
80 Pro Trp 95
Ser Arg
Phe 110
Ala Met Pro
Ser 125
Asp Asp Gly Asn
Lys lie Asp Tyr Asn Tyr
lie Phe Phe Lys 140
Phe Glu Gly Asp Thr Leu 155
Glu Asp Gly Asn
Phe
Lys 170
Ser His Asn Val
Asn 185
Lys Val Asn Phe
Asn Gly lie 200
Gin Leu Ala Asp
Val Asn 160 lie Leu 175
Tyr lie Met 190
lie Arg His
Ser
Val 215
Pro Val Leu Leu
Lys 205
Tyr Gin Gin Asn
Gly 230
Leu Ser Lys Asp
His 220
Asp Asn His
Pro Asp Asn His Tyr Leu 235 240 Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His 245 250 255
Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly lie Thr Leu Gly Met
260
Tyr Lys Glu Phe
Asp Glu Leu 275
Ser Phe Phe Gin
265 Pro
Val Arg 290
Glu Thr Pro Val Pro 305
Pro Thr Cys Cys
Pro 280
Leu Gin Pro
Pro Asp Ala
Arg 295
Ser Asp Leu Gin
Asp Gly
270
Thr Cys His Gin 285
Lys Trp Val Pro
Gly 310
Arg Lys Met Glu
Leu 300
Cys Leu Pro
Ser 325
Glu Gin Leu Leu
Val 315
Lys Tyr Gin Leu
Arg Leu Asn Met 340
lie Gin Asn Ala
Glu 330
Ser Ala Ser Met
Phe Leu lie 355
Arg His Ala Lys
Gin 345
Val Phe Gin Glu
Lys Gly 320 Thr Ala 335
Leu Lys
Val Val 370
Tyr Pro Ser Leu Thr 385
Thr Asp Val Ser
Ala 360
Tyr Thr Asn Ala
Glu 350
Phe Glu lie
Asn 375
Gin Ala Phe Glu
Ala 365
Phe Lys Asn Asn
Pro 390
Tyr lie Leu Gly
Met 380
Val Gly Glu
Met Val Asn Glu 420 Pro
Leu 405
Leu Phe Asp Ser
Phe 395
Asp lie Asn Val
Ser 410
Phe Pro Val lie
Leu Met Asn 435 Gly
Leu Arg 450
Leu lie Met Thr Gin 465
Leu Gin Ala Leu
Gly Leu Pro Ala Arg Arg
Leu 425
Ser Ala Leu Asp
Asp 440
Leu Lys Val Phe
Asn 485 Lys
Val 470 Leu
Asp 455
Ser Lys Ser Leu
lie 445 Asn
Tyr 430 Asn
Phe
lie Phe 480
Asn Thr Thr Asp His 495
Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu Thr Arg Met Trp Tyr
Gly lie Glu Cys
Val 490 Met
Gin 475 lie
Gly 460
Val Thr Arg
Phe Phe 400 Asp Asp 415
Thr Gin Glu Cys Pro Lys500
Cys Gin Gly Leu
Cys Ser Tyr 515
Val Val Met Gin
Cys Asn 530 Lys Tyr 545
Met Tyr
505 Met Met Val 520
Cys Met Ala
Trp Arg Glu Arg
Gly 535
lie Leu Ser Leu
lie
Thr lie His Asp 580 lie
Tyr 565 Ser
Tyr 550
Asp Met Glu Asn
Lys
Gly
Glu 555 Leu
Pro
Cys 525 Val
510 Gly
Glu
Val 540
Glu Leu Val
Gly Tyr lie Asp
Val 570
Gin Lys Asn Ala
Thr Thr Thr 595 Ala
lie Gin Tyr Val 585
Ala His Ser Gin
Asn Gly 560
Leu Gly Leu Phe Ser 575
Lys Leu
Tyr Tyr Pro
Arg Ser 610
Lys Val Ala His Val 625
Glu Leu lie Gin
Gly Lys Leu Tyr
Cys 600
Asp Leu Phe lie
Glu 615
His Glu Glu Thr
Pro Gly Cys Trp
Tyr
Lys 645 Cys
Glu 630
Leu Lys Ser Phe
Leu 635 Ser
Asp 620
Ser
Gin 605 Lys
Ser
Gly 590
Arg Gin Tyr Lys Val Leu Arg
lie 660
Gly Gin Glu Leu
lie 650
Val Ala Glu Asn
Asn 675
Gly Met Lys Asn
Ser His Ser Pro 665
Glu Arg Tyr Ser
Arg Arg 640
Phe Tyr Ser Ala Leu 655
Thr Leu
Arg Asn 690
Gly Pro Glu Pro Val 705
Asn Gin Leu Leu
Val 680
Phe Asn Leu His
Gin 695
Ser Gin lie lie
Val 710
Arg Thr Met Ser Met 725
Lys Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly
Pro 730 Ser
Asp 715 Lys
Glu 700 Lys
Gly
Asp
Gin 685 Leu
Leu
Arg
Cys
Asp 670
Lys Ala Ala
Lys Met Lys
Lys His lie 720
Val Leu Asp
735 Gly Asp Asp740 745 750
Glu Asp Glu Cys lie Gly Gly Ser Gly Asp Gly Met lie Lys Val Lys
755 760 765
Asn Gin Leu Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr Asp Leu Asp Val Asp
770 775 780
Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gin Gin Ala Thr Pro Lys Asp Asn Glu lie 785 790 795 800
Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn Val His Ser Pro Leu Lys Leu匕eu
805 810 815
Thr Ser Met Ala lie Ser Val Val Cys Phe Phe Phe Leu Val His 820 825 830
〈210〉 4 〈211〉 2496 〈212〉 腿 <213>人工序列
<400> 4
atggccgggaccgtgcgcaccgcgtgcttggtggtggcgatgctgctcagcttggacttc60
ccgggacaggcgcagcccccgccgggtgtagcgctgcaaacgatgaagcaaggtaccgtg120
agca兆ggcg鄉agctgttC6LCCggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgac180
gtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcg鄉gCgElgggcgatgccacctacggcaag240
ctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtg300
accaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatg肌gcagcac360
gacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaag420
gacgacggcaccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaac■
cgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctg540
gagtacaactELC犯C2lgCC3caacgtctalatcatggccgacaagcagaagaacggcatc600
aaggtgaacttC33g3tCCggaggacggcagcgtgcagctcgccgaccac660
taccagcaga3caccccceitcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctg720 agcacccagtccgccctgagCB￡L3gaCCCCgcgatcacatggtcctgctg780
g3gttCgtg3ccgccgccgggatcactctcggc过tggscgagctgtacaagg33ttCCCg840
ccgccggacgccacctgtcaccaagtccgctccttcttccELgagactgcagcccggactc■
鄉tgggtgcC3g^3CtCCCgtgCC3gg3tC3gatttgcaagtatgtctcccta^gggc960
ccaacatgctgctcaagaa^gatgg肌g犯aaataccaact^cagc3cgattgaac3tg1020
ga3C3gCtgCttcagtctgcctcaagttctg组gctgcg1080
gttttccaagaggcctttgaaattgttg"ttcgccatgccaag犯ctac3ccaatgccatg1140
actacccaagcctgactccacaagcttttgsgtttgtgggtgaatttttc1200
acagatgtgtctctctaca1:cttgggttctgacatcaatgt3gatgaca1:ggtca^tgaa1260
ttgtttg3C3gcctgtttcc3gtC3tct3t3CCC3gCt犯tg33CCC3ggcctgcctgat1320
tcagccttgggtgcctccgaggagca卿cgtgacctgaaagtatttggg1380
aatttcccca3gCttdtt3tgacccaggtttccaagtcactgC犯gtC3Ctsggatcttc1440
cttcaggctctg8atc"ttggaattgaagtgatcaacacaactgatcacctgaagttcagt1500
^ggeictgtggccg^tgctcaccag^tgtggtactgctcttactgccaggg3Ctg3tg1560
3"tggtta^accctgtggcggttactgcaatgtggtxatgcaaggctgtatggcaggtgtg1620
gtgg卿ttg3cadgt3ctgga^gaatacattctgtcccttg犯g33Cttgtg^tggc1680
atgtacag肌tctatgacatctgcttggtctcttttcaacaatccatga"t1740
tctatccagtatgtccagaagaatgcaggaccactattggcaagttatgt1800
gcccattctcatat已gatctgcttattatcCtga^LgatCtctttattgac1860
ta^犯gttgctc3tgtagaaccttatccagccgs卿agg1920
gaactaattcagaagttgagtgtctttcatcagctlxtatag"tgctttgcctggctacatc1980
tgcagccatagccctgtggcgg￡iaaacgacaccctttgct8g33CtCgtg2040
g￡lgag3t3C￡Lgccaaa^ggcagcaaggaatacca^gttca^tctccatgag2100
娜gccctgagCC3gtggtCagtcaaattag^gcacatt2160
aaccagctcctgag肌ccatgt:ctatgcccttctggataaaaacctggat2220
gaggaagggtttgs卿tgg卿ctgcggtgstgatg卿tgg鄉ctct2280
ggtgatgga3gaag^"t cagctccgcttccttgcagaactggcc"tatga"t2340
ctggatgtggatgstgcgcctgg3犯cagtcagc叫gc肌ctccg^ggsi2400
agcacctttcacaacctcgggaacgttcattccccgctgaagcttctcaccagcatggcc2460
atctcggtggtgtgcttcttcttcctggtgcactga2496
〈210〉 5
<211〉 75 〈212〉 DNA 〈213>人工序列
<400〉 5
ctagctagcg caggatggcc gggaccgtgc gcaccgcgtg cttggtggtg gcgatgctgc 60 tcagcttgga cttcc 7权利要求
1、一种抗肝癌的DNA疫苗，它的活性成分表达如下融合蛋白的重组真核细胞表达载体；所述融合蛋白包括GPC3的N端分泌信号区、GPC3的C端锚定信号区和至少一个甲胎蛋白抗原决定簇；所述至少一个甲胎蛋白抗原决定簇位于所述GPC3的N端分泌信号区和所述GPC3的C端锚定信号区之间；所述GPC3的N端分泌信号区位于所述融合蛋白的氨基端，所述C端锚定信号区位于所述融合蛋白的羧基端。
2、 根据权利要求1所述的抗肝癌的DNA疫苗，其特征在于所述GPC3的N端分泌信号区至少含有GenBank Accession Number NP—004475. l的自氨基末端第1至24位 氨基酸残基。
3、 根据权利要求1或2所述的抗肝癌的DNA疫苗，其特征在于所述GPC3的 N端分泌信号区为GenBank Accession Number NP—004475. 1的自氨基末端第1至24 位氨基酸残基、第1至25位氨基酸残基、第1至26位氨基酸残基、第1至27位 氨基酸残基、第1至28位氨基酸残基、第1至29位氨基酸残基、或第1至30位 氨基酸残基；所述GPC3的N端分泌信号区优选为GenBank Accession Number NP—004475. l的 自氨基末端第1至28位氨基酸残基。
4、 根据权利要求3所述的抗肝癌的DNA疫苗，其特征在于所述GPC3的C端锚定信号区为GenBank Accession Number NP—004475.l的自氨基末端第29至580位氨基 酸残基。
5、 根据权利要求1所述的抗肝癌的DNA疫苗，其特征在于所述甲胎蛋白的抗原决定簇为hAFP542-550、 hAFP137-145、hAFP158-166或hAFP325-331，优选为hAFP542-550;所述hAFP542-550的氨基酸序列为序列表中的序列l 。
6、 根据权利要求1所述的抗肝癌的DNA疫苗，其特征在于所述融合蛋白中还包括报告蛋白。
7、 根据权利要求6所述的抗肝癌的DNA疫苗，其特征在于所述报告蛋白位于所述甲胎蛋白抗原决定簇和所述GPC3的C端锚定信号区之间；所述报告蛋白为增强型绿色荧光蛋白。
8、 根据权利要求7所述的抗肝癌的DNA疫苗，其特征在于所述融合蛋白的氨 基酸序列如序列表中序列3所示。
9、 根据权利要求8所述的抗肝癌的DNA疫苗，其特征在于所述融合蛋白的编 码基因如序列表中序列4所示。
10、 根据权利要求1所述的抗肝癌的DNA疫苗，其特征在于所述重组真核细胞表达载体的出发载体为腺病毒载体、逆转录病毒载体或质粒载体；优选为 pcDNA3. 1 (+)。
11、 权利要求1一10中任一所述的抗肝癌的DNA疫苗在制备IFN-Y诱生剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抗肝癌的DNA疫苗。本发明的抗肝癌的DNA疫苗是基于原发性肝癌高表达的癌胚抗原GPC3具有锚定细胞膜的特性，以机体自身的肿瘤性抗原甲胎蛋白AFP中一个抗原决定簇hAFP542-550作为免疫原构建DNA疫苗，表达融合蛋白，主动激发机体T细胞免疫应答作用，发挥对肝癌细胞的免疫杀伤作用。
文档编号A61K48/00GK101199861SQ20071017977
公开日2008年6月18日 申请日期2007年12月18日 优先权日2007年12月18日
发明者羊东晔, 方 蓝, 黄来强 申请人:清华大学深圳研究生院