一种用于抗肝癌的聚乙二醇改性甘草次酸和姜黄素复合物及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医药领域，具体涉及一种用于抗肝癌的聚乙二醇改性甘草次酸和姜黄素复合物及其制备方法。
技术背景
[0002]肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，其致死率极高。根据最新统计，全世界每年新发肝癌约六十万，居恶性肿瘤的第五位。严重威胁人们的健康和生命。临床上，化疗是较为常用的癌症治疗手段，抗肿瘤药物的联合应用必不可少，但极易产生耐药性及严重的毒副作用。为尽可能减少化疗给患者身体上和精神上造成的伤害，现代科学技术逐渐要求药物及其制剂的“给药精密化”，肝靶向给药系统可将药物有效地输送至肝脏病变部位，减少对其它脏器的损伤。这就促使新型肝靶向抗癌药物的研宄开发以及新的肝靶向载体一直被寻找和探索。
[0003]甘草(Glycyrrhiza)为豆科甘草属植物，其性味甘平，归心、肺、脾、胃经，具有缓急、润肺、解毒、调和中药的作用。作为常用中药，从古至今为药用。《神农本草经》就将其列为药之上乘。南朝医学家陶弘景将甘草尊为“国老”，并言“此草最为众药之王，经方少有不用者。”在传统医药学的的药物方剂组成中，甘草多属于“使药”，引导药物直达病变部位，具有调和猪药的作用。在我国，甘草位列“药食同源”的品种之中，这说明甘草除在医药领域外，还能发挥食品和保健品的作用，甚至被用作化妆品原料。现代医学研宄表明，甘草酸(Glycyrrhizin，GL)和甘草次酸(Glycyrrhetinic acid，GA)为其主要有效成分，而GL在人体内经胃酸水解为GA ο GA具有抗炎、抗溃疡、抗病毒、降血脂、防治肿瘤、促进胰岛素吸收等多方面药理效应，在Caco-2细胞模型上的双向转运结果表明其为吸收良好的化合物且主要为被动扩散。自从1991年Negishi等发现鼠肝实质细胞表面存在大量高度特异性的GA结合位点之后，GA的抗病毒及抗肿瘤作用愈来愈被国内外医学界关注。随后的一些研宄也将甘草从中药的传统范围向现代应用方向进行扩展，而如何有效利用日益减少的甘草资源，发挥GA预防肿瘤的发生以及高度肝靶向性称为热点研宄内容。GA本身具有抗炎保肝解毒作用，加之肝细胞表面具有丰富的GA结合位点，对肝细胞具有明显的生物膜效，因此它越来越多地被用作一种高效、特异的肝靶向配体，提高抗肿瘤药物的肝靶向递送效率，可将抗肝癌药物定向转运至肝病变细胞组织，在必要时间内持续高度富集，发挥缓释作用，并减少对正常肝组织细胞的毒性。
[0004]姜黄素(Curcumin，⑶R)是从姜科植物姜黄中提取的一种二酮化合物，其味苦辛，性温，归脾，肝经。具有破血行气、通经止痛的功效、抗癌是其主要药理活性之一，可抑制胃癌、皮肤癌、结肠癌等癌症的发生，还可作为天然色素广泛用于食品工业。但存在水溶性差和稳定性差的问题，生物利用度极低。GA是五环三萜类齐墩果烷型皂甙元，水溶性差，大量使用时常伴有类醛固酮增多症，高浓度时对正常细胞产生毒性，制约了其在临床上的应用。
[0005]为了克服GA和CUR的溶解性及有关问题，有利于支撑合适的剂型，改善体内吸收和提高生物利用度，国内外学者对其结构进行修饰和改造，其中在分子中通过引入亲水基团可提高生物利用度从而提高疗效。聚乙二醇(Polyethylene Glycol，PEG)具有很好的水溶性和生物相容性，无毒，无免疫源性、生物可降解性良好，被广泛应用于食品、制药、化学等行业。它可改善水中不易溶解药物的溶解度，提高药物的稳定性，还利用结构自身具有的羟基或其衍生物，通过化学合成修饰许多化合物，扩大了应用范围。
[0006]本项目利用GA本身就具有一定的抗癌药理活性和保肝解毒作用，并具有肝细胞靶向性，不仅可作为药物载体，也可与药物产生协同作用。鉴于GA和CUR的抗肿瘤活性，以及GA分子结构中存在的羧基，设想将GA引到氨基PEG的高分子链上，再与难溶性小分子的药物⑶R(Nw=368.32)结合，制成PEG改性水溶性GA和⑶R复合物，加之GA的高度趋肝性，共同提高抗肿瘤效果。采用红外光谱，核磁共振等对PEG改性GA进行结构确证和表征，并对复合物进行小鼠体内组织分布及靶向性评价，考察其在肝脏的主动摄取和靶向效率。并以此为依据，深入某些中药抗肿瘤有效成分的结构修饰，进一步寻找高效、低毒、毒副作用小的新药成分，以充分发挥中药的药用价值，使癌症疾病的治疗得到突破性进展。
[0007]Negishi等在证实了离体大鼠肝细胞均浆的细胞膜组分中含有多量甘草次酸(Glycyrrhetinic acid，GA)特异结合为点，在所有脏器组织中，肝脏的GA结合位点活性最高。GA与该结合位点的结合可成饱和性、高度特异性，且该结合位点具有蛋白质性质。国内也有学者用投射电镜进行观察，证实了肝细胞表面确实存在大量GA受体。随后国内外一些学者纷纷报道了以甘草酸和甘草次酸修饰的脂质体或血清蛋白可以在肝脏组织中富集。
[0008]如毛声俊在肝细胞靶向甘草次酸表面修饰脂质体的制备[中国中药杂志，2003年 4 月第 28 卷第 4 期，323-331]以毛声俊在 2007 年 Preparat1n , characterizat1nand updtake by primary cultured rat hepatocytes of liposomes sufer-modofiedwith glycyrrhetinic acid.Pharmazie，[ORIGINAL，ARTICLES，2007 年，62 卷第 8 期；614-619]中公开了一种甘草次酸表面修饰脂质体，它是将GA与硬脂醇、琥珀酸酐偶联，合成一新型两亲性导向分子，将其掺入脂质体中，介导该修饰脂质体与肝细胞表面的GA受体特异结合，以期达到肝细胞主动靶向作用。该甘草次酸表面修饰脂质体简称LP-SM-GA。制得的甘草次酸修饰的脂质体平均粒径在65?79nm之间，甘草次酸修饰脂质体的摩尔含量最高位10%。又如，中国专利申请CN101006983A公开了甘草酸修饰壳聚糖和羧化壳聚糖复合载药纳米粒的制备方法，甘草酸修饰组可进入鼠肝实质细胞的细胞核中，相同时间内荧光标记的甘草酸盐修饰的纳米粒在肝实质细胞的荧光强度对照组强于对照组，具体是将甘草酸盐为靶向基团，通过静电相互作用制备成载药纳米粒而并未涉及甘草次酸的相关内容(文献报道肝细胞膜上甘草次酸的结合位点多余甘草酸);中国专利申请CN1743008A公开了甘草次酸修饰的壳聚糖纳米粒子并表现出明显的靶向性，但是甘草次酸直接修饰壳聚糖的制备条件较为意义重大；中国专利CN101254308B制备了甘草次酸-氨基聚乙二醇和壳聚糖或壳聚糖衍生物肝靶向复合纳米粒，体外细胞实验显示对肝细胞有很强的结合能力，可提高给药载体的肝靶向能力，能实现对肝脏的靶向定位。对甘草次酸的改性研宄很多，华东理工大学的洪伟等从甘草次酸的羧基修饰聚乙二醇作为一种抗肿瘤药物，而并未提及作为肝靶向配基的可能(洪伟，何明磊，魏东芝，18-β甘草次酸-聚乙二醇轭合物的合成及体外抗肿瘤活性，华东理工大学学报，2006，32 ;415)。周京辉等在姜黄素与甘草次酸联合用药的体外抗肿瘤作用[北方药学，2011年第8卷第4期，7-8]中公开了一种采用MTT法，研宄姜黄素、甘草次酸以及姜黄素和甘草次酸联合用药分别对人肝癌细胞株IfepG-2、人乳腺癌细胞株MCF-7、人肺癌细胞株A549的细胞增殖抑制率，可以得到姜黄素、甘草次酸以及姜黄素和甘草次酸联合用药对三种肿瘤细胞株的抑制率IC50值分别为:姜黄素(16.3?19.3 μ g.mL—1);甘草次酸(11.6?36.1 μ g.mL—1);姜黄素和甘草次酸联合用药(10.5?16.2 yg-πιΓ1)。甘草次酸可以显著加强姜黄素对！fepG-2、MCF-7、A549癌细胞增殖的抑制作用，而且两者在癌细胞的增殖抑制方面表现出协同作用。其中，姜黄素对IfepG-2、MCF-7, A549癌细胞均具有较强的抑制作用；而甘草次酸由于具有很强的肝靶向性，因此，对肝癌H印G-2细胞具有较强的抑制作用，但对MCF-7和A549癌细胞抑制作用较弱。姜黄素、甘草次酸以及姜黄素和甘草次酸联合用药对三种肿瘤细胞株的抑制率IC50值分别为:姜黄素(16.3?19.3 μ g.ml/1);甘草次酸(11.6?36.1 μ g.ml/1);姜黄素和甘草次酸联合用药(10.5?16.2yg.mL—1)。有研宄表明，联合用药的药物如果存在协同效应，则可以在控制药物副作用的同时，增强药物的疗效，或减少药物用量而不改变药物疗效。结果表明，当姜黄素和甘草次酸联合用药时，可以显著提高药物对H印G-2、MCF-7、A549癌细胞的抑制作用，而且随着药物浓度的提高，其效果越明显。这表明姜黄素和甘草次酸联合用药可以显著加强姜黄素对H印G-2、MCF-7、A549癌细胞增殖的抑制作用，而且两者在癌细胞的增殖抑制方面表现出了协同作用。
[0009]但现有技术一般以吡啶作为缚酸剂，中和反应中生成的盐酸，但吡啶毒性大，易损害实验人员健康，且成本高，回收困难，反应收率低，反应产物纯度不高，并且水溶解性低，肝靶向能力不足，疗效不高。
【发明内容】
[0010]本发明的目的是提供一种用于抗肝癌的聚乙二醇改性甘草次酸和姜黄素复合物，具有水溶解性高、肝靶向能力高、纯度高、毒副作用小和疗效好的优点；
本发明的另一个目的是提供一种用于抗肝癌的聚乙二醇改性甘草次酸和姜黄素复合物的制备方法，具有收率高，毒性小，成本低和回收简单的优点。
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