治疗骨关节炎的组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学和生物医学工程领域，具体涉及一种治疗骨关节炎的生物制品及 其制备方法。
【背景技术】
[0002] 骨性关节炎是一种以关节软骨的变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节病，发 病率高，在老年人口中十分常见，60岁以上的人群中患病率可达50%，75岁以上的人群中则 达80%。骨关节炎患者的关节疼痛常使患者难以忍受，患者发病后致残率高。现有的治疗 骨关节炎的药物能在一定程度上延缓病程、改善患者症状，缓解患者疼痛，但不能逆转病理 过程，不能根治骨关节炎，且大部分药物副作用明显。而外科手术治疗主要通过关节镜（窥 镜）、开放手术或人工关节置换，虽然能暂时缓解疼痛，但长远效果（10年左右）并不理想。 干细胞等细胞治疗法是目前最有希望彻底解决骨关节炎治疗的新方法。
[0003] 骨关节炎常发生软骨缺损，但软骨的自身修复能力有限，通常可以将软骨修复作 为骨关节炎治疗的最重要评价指标。近十年来，干细胞移植治疗骨关节炎已有大量研究报 道。干细胞注入骨关节炎关节后，能发挥免疫调节作用，炎症反应调节作用，减少疼痛；分泌 抗凋亡因子和抗纤维化因子抑制病情进展；分泌TGF-β、BMP_4等因子，促进内源性干细胞 软骨修复；还能分化为软骨细胞帮助修复软骨。
[0004] 除人类以外，多数动物也容易罹患骨关节炎，特别是常见的动物如犬科动物、马科 动物等，由于运动量大、主人饲育不当等原因，发病率较人类甚至更高。如，部分大型犬的成 犬中，骨关节炎的发病率可达到20% ;而10岁以上的成犬的发病率可高达95%。对于动物骨 关节炎的临床治疗中，大多仅仅使用抗炎药，治疗效果十分有限。
[0005] 目前骨关节炎的干细胞治疗研究大多采用骨髓来源的间充质干细胞，脂肪多能细 胞治疗骨关节炎也已有大量文献报道，临床前研究和临床研究显示骨髓间充质干细胞和脂 肪多能干细胞都有可能改善病情，并有增加软骨含量的报道。骨髓间充质干细胞获取需穿 刺骨髓，对供体造成较大伤害，相比而言从脂肪获取多能细胞更具优势，1)取材对肌体损伤 小；2)脂肪中具CFU-F形成能力的多能细胞含量高于1%，而骨髓中小于0. 001% ;3)脂肪来 源丰富，多能细胞的含量多；4)脂肪来源细胞增殖能力较骨髓间充质干细胞强。因此脂肪 多能干细胞治疗骨关节炎更具优势。
[0006] 脂肪基质血管成分(称为"Stromal vascular fraction"，或SVF)含有脂肪多能 细胞，并含有多种其他类型细胞，可以采用酶消化方法从脂肪组织获得，可经过提取纯化分 离出出脂肪多能干细胞。基质血管成分对骨关节炎治疗也具有治疗效果，并且基质血管成 分从分离到移植1-3小时，成本低，还能减少细胞培养中的风险，但是含有的脂肪多能细胞 含量少。同时基质血管成分中含有⑶34+⑶31-和⑶34+⑶31+的多能细胞，具有较强的促 进血管再生能力，而经培养后的脂肪多能细胞CD34+表达减少或消失。目前尚未见基质血 管成分或纯化的CD34+CD31-和CD34+CD31+的多能细胞联合脂肪多能细胞用于治疗骨关节 炎的研究，而将这两者联用有可能提高血管再生能力，产生明显的改善治理的效果。
[0007] 富含血小板的血浆（PRP)能分泌多种促进软骨恢复细胞因子，但在治疗骨关节炎 领域，PRP的作用存在争议，有研究报道其对软骨修复产生负面效果。另外，由于PRP的主 要成分为血小板和有核细胞，它们在关节腔或病变部位所停留和存活的时间关系到治疗效 果。
[0008] 高分子材料，譬如玻尿酸钠和胶原蛋白等不但可以作为支架和润滑剂减缓疼痛， 也可作为支架保留水分、细胞、以及其它有效成分，还可以起到延长这些有效成分在病变部 位存留的时间，增强治疗效果。
[0009] 综上所述，本领域尚缺乏一种成分优化，杂质含量少，有效成分含量高的的治疗骨 关节炎的液态制剂。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是提供一种成分优化，杂质含量少，有效成分含量高的治疗骨关节 炎的液态组合物。
[0011] 本发明的第一方面，提供了一种治疗动物骨关节炎的组合物，所述组合物包括以 下组分：
[0012] a.任选的富含血小板的血浆（PRP);和/或
[0013] 脂肪干细胞培养上清液；
[0014] b.支架材料；
[0015] c.维生素 B12;
[0016] d.抗炎药物；和
[0017] e.药学上可接受的载体。
[0018] 在另一优选例中，所述的富含血小板的血浆是现制的或预制的。
[0019] 在另一优选例中，所述的富含血小板的血浆是自体的或异体的。
[0020] 在另一优选例中，所述的脂肪干细胞培养上清液是现制的或预制的。
[0021] 在另一优选例中，所述的脂肪干细胞培养上清液是自体的或异体的。
[0022] 在另一优选例中，所述组合物为液态组合物。
[0023] 在另一优选例中，所述的组合物是注射剂。
[0024] 在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体是注射用载体。
[0025] 在另一优选例中，所述的骨关节炎选自下组：膝骨关节炎、髋骨关节炎、踝骨关节 炎。
[0026] 在另一优选例中，所述的富含血小板的血浆（PRP)选自下组：活化后的PRP，未活 化PRP液体、PRP凝胶，或其组合。
[0027] 在另一优选例中，所述富含血小板的血浆中，血小板浓度范围为 0. 5 X IO6-L 5 X IOltVmL,且所述血浆中白细胞和红细胞的总浓度为彡IX 106/mL。
[0028] 在另一优选例中，所述富含血小板的血浆中，血小板浓度范围为5X 107-5XlO8/ HlLo
[0029] 在另一优选例中，所述的脂肪干细胞培养上清液中含有细胞因子。
[0030] 在另一优选例中，所述的脂肪干细胞培养上清液中含有选自下组的细胞因子： TGF- β、HGF、TGF-I、PDGF、VEGF、EGF、IGF、BFGF，或其组合。
[0031] 在另一优选例中，所述的脂肪干细胞培养上清液是灭活的脂肪干细胞培养上清 液。
[0032] 在另一优选例中，所述的脂肪干细胞培养上清液中不含细胞。
[0033] 在另一优选例中，所述的组合物还包括选自下组的一种或多种成分：
[0034] 脂肪多能细胞组分；和/或
[0035] 软骨前体细胞组分；和/或
[0036] 维生素 C。
[0037] 在另一优选例中，所述的脂肪多能细胞组分是现制的或预制的。
[0038] 在另一优选例中，所述的脂肪多能细胞组分是自体脂肪多能细胞组分或异体脂肪 多能细胞组分。
[0039] 在另一优选例中，所述的脂肪多能细胞组分选自下组：从基质血管成分中纯化的 脂肪多能细胞、经培养扩增的脂肪多能细胞，或其组合。
[0040] 在另一优选例中，所述的经培养扩增的脂肪多能细胞是在无血清培养基或含血清 的培养基中进行扩增的。
[0041] 在另一优选例中，所述的脂肪多能细胞组分是即时制备或冻存复苏的。
[0042] 在另一优选例中，除脂肪多能细胞外，所述的脂肪多能细胞组分还可含有选自下 组的细胞：脂肪细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、周细胞、成纤维细胞、肥大细胞、神经细胞、月旨 肪前体细胞、淋巴细胞、血液细胞、基质细胞、巨噬细胞，或其组合。
[0043] 在另一优选例中，在所述脂肪多能细胞组分中，脂肪多能细胞数量占总细胞数量 的0· 5~100%，较佳地为1~100%，更佳地为10~100%。
[0044] 在另一优选例中，所述的脂肪多能细胞组分是自体的或同种异体的。
[0045] 在另一优选例中，所述的脂肪多能细胞组分具有软骨分化潜能。
[0046] 在另一优选例中，所述的脂肪多能细胞组分中还含有细胞因子。
[0047] 在另一优选例中，所述的软骨前体细胞组分是自体的或同种异体的。
[0048] 在另一优选例中，所述的软骨前体细胞组分具有软骨分化潜能。
[0049] 在另一优选例中，所述的软骨前体细胞组分中还含有细胞因子。
[0050] 在另一优选例中，所述的细胞因子选自下组：TGF-P、PDGF、VEGF、IL-1、IL-6、TNF、 IRAP、CTGF、EGF、IGF、BFGF，或其组合。
[0051] 在另一优选例中，所述脂肪多能细胞和/或软骨前体细胞在所述组合物中的总浓 度为 I X 103-5 X 108/mL，较佳地为 I X IO4-I X 108/mL，更佳地为 I X IO5-I X 107/mL。
[0052] 在另一优选例中，所述的脂肪多能细胞组分是⑶45-⑶235a-⑶31-⑶34+细胞，和 /或⑶45-⑶13+⑶36+⑶73+细胞富集的脂肪多能细胞组分。
[0053]