治疗骨关节炎的组合物和方法

专利名称：治疗骨关节炎的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及用于在动物中治疗异常关节病症的组合物和方法，其中所述异常关节病症包括动物的肌骨骼关节。特别是，本发明涉及治疗包括骨关节炎、类风湿性关节炎和局部关节炎症在内的异常肌骨骼关节病症，并减轻所述异常肌骨骼关节病症的相关症状。本申请也包括通过给予本发明的组合物来调节在动物中差异表达的基因(例如与未患关节炎的动物相比在患有关节炎的动物中差异表达的基因)。本发明也涉及在包括狗和猫在内的伴侣动物中对新生物标记的鉴定，诊断方法、组合物及其相关试剂盒。
背景技术：
科学界公认基因在动物发育中起作用，而且基因表达的调节在影响动物健康和良好状态的某些疾病或病症的发展中起作用。同样，基因的差异表达在这类疾病和病症的发展中是一个因素，而且对基因表达模式的评价已被广泛认为是在分子水平上理解这类疾病和病症的发展和控制的关键。为了增加对基因及其与疾病的关系的理解，已经开发了各种方法用于研究差异的基因表达，例如DNA微阵列、表达序列标签(expressed tag sequencing, EST)、基因表达系列分析(SAGE)、消减杂交、消减克隆和mRNA差异显示(DD)、 RNA随机引导PCR(RAP-PCR)、代表性差异分析(RDA)、二维凝胶电泳、质谱和用于蛋白质的基于抗体结合的蛋白质微阵列。事实上，哺乳动物体的所有关节都有软骨。软骨是身体的支持结构，由密集的纤维状蛋白(胶原)束组成，其交织而形成关节面。蛋白多糖填充未被胶原占据的细胞外空间。 这样的蛋白多糖包括蛋白质和糖的组合。每个蛋白多糖亚基都含有由被称为葡糖胺聚糖 (GAG)的修饰糖长链而组成的蛋白质核心。葡糖胺是GAG的单一最重要组分和前体。机体的胶原合成取决于GAG合成。软骨中的软骨细胞利用葡糖胺产生N-乙酰葡糖胺(NAG)和葡糖醛酸，它们可被身体利用而产生透明质酸(hyaluron)。透明质酸使动物体的关节具有润滑性。软骨在动物体内是重要的，能提供柔软性、压力下的可压缩性、缓冲、拉伸强度、运动范围和关节内运动的平滑性。具有软骨的关节实例包括指头和脚趾、颈、膝、臀、肩等。动物可罹患因软骨被降解而导致的关节柔软性、可压缩性降低的多种病症，并经常导致关节和/或关节周围组织的全身炎症，而且在某些情况下导致骨关节炎和类风湿性关节炎等病症的发展。这样的动物关节功能就会明显缺失并感到疼痛。关节炎是一种肌骨骼障碍。骨关节炎是动物和人的最常见的关节炎类型。骨关节炎是通常发生在人和伴侣动物中的退行性关节病，该病的特征在于关节软骨的退行性改变，伴有关节边缘的蛋白多糖和胶原的丢失和新骨的增殖。这些改变伴随着滑膜内的各种炎性反应。在关节的关节面上的透明软骨的主要缺陷是葡糖胺聚糖与基质胶原纤维含量比例的变化。关节内软骨下面的骨骼被称为软骨下骨。这些软骨下骨滋养上面的软骨，这些软骨本身没有血管、神经或淋巴组织。软骨的天然侵蚀是随年龄而发生的，但也可由关节过量负荷而导致，肥胖症、遗传、创伤、循环减少、不良骨骼排列和反复压迫可加剧关节病症。推测自由基损伤可能促进骨关节炎的发展。被称为软骨细胞的透明软骨细胞产生并维持周围细胞外基质。软骨基质稳态的维持取决于基质蛋白例如II型胶原和聚蛋白多糖(aggrecan)的分解代谢。这些蛋白质被消化并被软骨细胞所合成的新蛋白质取代。分解代谢部分地由蛋白水解酶例如基质金属蛋白酶(MMP)和聚蛋白多糖酶(aggrecanase)蛋白进行。在正常动物中，合成与降解之间达到平衡，因而维持健康的软骨。当平衡向降解偏移时，就会发病并导致关节炎症和骨关节炎。软骨的稳定状态取决于通过软骨细胞间的胞间信号转导的调节。因此，软骨细胞产生并响应信号转导分子。这类信号转导分子可包括可直接影响细胞新陈代谢的细胞因子和生长因子。胞间信号转导是复杂的，尚未被完全表征。生长因子分子例如TGF-β涉及并据信促进II型胶原的产生并且还能抑制胶原裂解。细胞因子例如TNF-α和IL-I β也起作用。据信这些细胞因子促进可降解软骨的蛋白酶的产生。据信各种其它复杂的相互作用是作为胞间信号转导的结果而发生。因为胞间信号转导过程的复杂性，高度希望在遗传学水平上理解所发生的相互作用。对前关节炎或关节炎病症中的异常调节的基因的检测有助于理解异常肌骨骼关节障碍的生物学，尤其是在基因组范围的基础上。对涉及基因表达谱的生物途径的更详细理解将会有助于开发在疾病途径中有益的药物、营养补充食物(nutraceutical)和营养(食物) 干预。这些方法能预防、早期检测和治疗潜在的异常肌骨骼关节病症以及监测这类异常肌骨骼关节障碍(尤其是骨关节炎)的预后。涉及这类障碍的病理学的异常调节的基因可作为重要的生物标记，以优化对合适的药物、营养补充食物和营养(食物)干预的选择。鉴定了能逆转骨关节炎进程的药物。目前可用的治疗药用于减少炎症和/或减轻疼痛。目前的治疗采用一类称为非留体抗炎药(NSAID)的药物来治疗肌骨骼关节障碍例如骨关节炎，但是这些治疗有多种缺陷(尤其包括胃肠阻碍)，并且它们也抑制软骨形成。大狗在老年时也会得关节炎。大狗品种因其体重增加和/或遗传配置而对关节炎更易感。大狗并非是处于关节炎和其它软骨病症危险中的唯一动物。已经公认关节炎和其它退行性关节病在狗中是常见的，而且已经证明这类病症在猫中流行。猫骨关节炎是主要侵袭10岁以上老年猫的疾病。处于发展累及软骨的异常肌骨骼关节障碍危险的动物包括但不限于哺乳动物(例如犬(canine)、猫(feline)、马、山羊、绵羊、猪、牛、人和非人类灵长类)以及鸟类(包括火鸡和鸡)。食物在疾病病因和进程中起到重要作用，因为它从根本上说参与新陈代谢。疾病调节基因在某种程度上受到营养因子的调节。因此，食物中存在的作为营养的食物成分在转录和翻译水平上、以及在某些翻译后修饰水平上可调节基因表达。它们同样也涉及降解和酶活性。营养水平可影响代谢途径的平衡。代谢途径通常是复杂的并可包括不同代谢途径的多个重复多余和相互干扰。一种酶、生长因子、细胞因子或代谢产物的浓度改变都可影响涉及疾病相关生理学的多个代谢途径。已经充分理解激素和其它细胞信号转导分子受到食物的调节，并且也已经知道激素和其它细胞信号转导分子参与疾病的发展和进程。相同的疾病表型可由不同代谢途径障碍和每种动物的不同遗传组成而导致，因而导致对相同因素(包括营养和环境因素)响应的差异。遗传、营养和环境因素的相互影响对于理解动物疾病的病因学、预防、治疗和疾病进程是至关重要的。发现基因表达对营养的反应与多种疾病和障碍相关，这一发现允许为易感疾病例如异常肌骨骼关节障碍的动物配制食物，并且进一步允许诊断、治疗和监测潜在疾病的预后。营养成分影响基因表达，包括mRNA的产生(转录)、mRNA加工、蛋白质的产生(翻译)和翻译后修饰，因而影响动物总体代谢状态。结果，生物标记在疾病进程的早期检测和监测和/或基于基因型的食物中的使用，能预防或治疗疾病并开发用于动物、尤其是伴侣动物的新疗法。食物经证明是影响动物表型包括对疾病的易感性的最重要的环境因素。可通过由基因功能的激活物和阻遏物控制的不稳定过程来调节基因表达。营养状态可导致基因转录速率的极大改变。常量营养物(例如葡萄糖、脂肪酸和氨基酸)以及微量营养物(例如铁、锌和维生素)可调节基因表达。各种生物活性食物成分例如类胡萝卜素、类黄酮、单萜类和酚酸类可起到转录因子的作用而影响基因表达。这些物质倾向于直接影响基因表达。在其它情况下，膳食纤维等物质在肠道被细菌发酵，可导致营养物例如短链脂肪酸的产生。这类物质可起到基因表达的间接激活物或阻遏物的作用。在本说明书所述的实验类型中可检测营养相关改变对转录和翻译的鉴定。考虑到本说明书实施例中给出的广泛的基因阵列，通过本说明书的方法可容易地检测基因表达的变化和定量检测。因此，可采用本说明书实施例所述的技术，容易地确定食物的和代谢的基因表达信号。本发明的生物标记是在动物中差异表达的蛋白质和/或核酸。可使用技术人员已知的各种方法，在蛋白质或核酸水平上评价生物标记的表达。迄今为止，在犬和猫中筛选用于响应这些伴侣动物食物中的营养成分的基因表达谱的基因组中仅仅进行了非常有限的工作。在癌症领域中已经使用犬基因微阵列进行肿瘤 CG 分析的工作。ThomasR.等.A canine cancer gene microarray for CGH analysis tumors (用于CGH分析肿瘤的犬的癌基因微阵列)，Cyrogenet. Genome Res.，2003 ；102 254-2600在扩张型心肌病领域方面已经进行了进一步的工作。Oyayma，Μ. Α.等，Genomic expression patterns of cardiac tissue fromdogs with dilated rdiomyopathy (,患有扩张型心肌病的狗的心脏组织的基因组表达模式)，Am. J. Vet. Res. 2005 ；66 :1140_1155。 迄今为止，有关骨关节炎的犬基因组的研究依然非常有限。在一个研究中，已经发现MIG-6 基因在高度危险的骨关节炎组的狗中增加，并且假设该基因可能涉及狗的软骨降解并涉及软骨的产生° Mateescu,R. G.等，Increased MIG-6 mRNA transcipts in osteoarthritic cartilage (在骨关节炎软骨中的增加的MIG_6mRNA转录物)· Biochem. Biophy. Res. Commun. 2005 ；332 :482-486。对健康动物群体和患病(例如本说明书所述异常肌骨骼关节障碍)群体的研究尚未深入进行。几乎没有有关犬基因组的数据可用，更没有有关猫基因组的数据可用。本说明书所包含的基因表达数据鉴定了狗和猫中的软骨降解相关的基因。这类基因表达数据能鉴定以有利方式调节所述基因表达的营养组合物。这也是有关通常涉及炎症的基因的例子。 在本说明书、本说明书的附图和实施例中还给出了猫的类似数据。本说明书和实施例中包含的基因表达数据使各种各样的有希望的发明成为可能， 根据本文所述的基因表达谱。所述数据允许鉴定和定量测定基因表达产物，作为营养的生物标记以及潜在异常肌骨骼关节障碍的疾病预防、鉴定和治疗的生物标记。作为本发明方法的实践结果而得到的基因表达数据也允许监测这类异常肌骨骼关节障碍的进程。这些发明进一步包括遗传测定，以鉴定可能罹患这类异常肌骨骼关节障碍的易感动物亚群，以鉴定用于预防或治疗所述阻碍的最佳食物，以鉴定药物、营养补充食物和营养(食物)干预， 根据本说明书所给出的发现，以治疗潜在疾病和炎症。本发明也包括用于早期疾病检测的生物标记、靶向治疗药、用于分析来自易感动物或患有所述异常肌骨骼关节障碍的动物的组织和血液样品的诊断试剂和试剂盒。在动物(例如猫和狗等伴侣动物)的食物设计中，通过良好营养达到最佳动物健康或良好状态是重要目标。然而，甚至最富营养的动物食物也价值不大，如果动物抵制或拒绝进食，或者如果因动物认为食物味道差而限制动物的食物摄取的话。因此，在本说明书中给出的本发明进一步包括能促进易感动物或患有所述异常肌骨骼关节障碍的动物的健康和良好状态的营养组合物。本发明因此包括伴侣动物可食的食物组合物，所述组合物具有治疗性和预防性功效并且比现有市售伴侣动物食品具有增加的可口性。
发明概述本发明涉及一种包含以下成分的组合物至少一种ω-3脂肪酸、至少一种葡糖胺聚糖、至少一种氨基糖、至少一种抗氧化剂、以及肉毒碱或乙酰肉毒碱。本发明包括但不限于用于给予动物、尤其是伴侣动物的营养组合物、膳食补充剂、营养补充食物和治疗物 (treats)0本发明也涉及治疗患有异常肌骨骼关节病症的动物的方法，所述方法包括给予所述受试者至少一种本发明的组合物。本发明还涉及在动物中延迟发作或减少患有异常肌骨骼关节病症的动物的疼痛的方法，所述方法包括给予所述受试者至少一种本发明的组合物。在一个实施方案中，本发明包含犬宠物食物组合物，所述组合物包含至少一种 ω-3脂肪酸、至少一种葡糖胺聚糖、至少一种氨基糖、至少一种抗氧化剂、以及肉毒碱或乙酰肉毒碱。在另一个实施方案中，本发明包含猫宠物食物组合物，所述组合物包含至少一种 ω-3脂肪酸、至少一种葡糖胺聚糖、至少一种氨基糖、至少一种抗氧化剂、以及肉毒碱或乙酰肉毒碱。另一个实施方案包括在有需要的动物中用本发明的组合物治疗或预防异常肌骨骼关节障碍的方法。还一个实施方案包括在有需要的动物中用本发明的组合物治疗或预防选自骨关节炎、类风湿性关节炎和局部关节炎症的异常肌骨骼关节障碍的方法。本发明的再一个实施方案包括在有需要的伴侣动物中用本发明的组合物治疗或预防选自骨关节炎、类风湿性关节炎和局部关节炎症的肌骨骼关节障碍的方法。本发明的另一个实施方案包括在有需要的犬中用本发明的组合物治疗或预防选自骨关节炎、类风湿性关节炎和局部关节炎症的肌骨骼关节障碍的方法。本发明的另一个实施方案包括在有需要的猫中用本发明的组合物治疗或预防选自骨关节炎、类风湿性关节炎和局部关节炎症的肌骨骼关节障碍的方法。本发明的另一个实施方案包括用本发明组合物在有需要的犬中治疗或预防骨关节炎的方法。本发明的另一个实施方案包括用本发明组合物在有需要的猫中治疗或预防骨关节炎的方法。本发明的另一个实施方案包括用本发明组合物在有需要的犬中治疗或预防类风湿性关节炎的方法。本发明的另一个实施方案包括用本发明组合物在有需要的猫中治疗或预防类风湿性关节炎的方法。本发明的另一个实施方案包括用本发明组合物在有需要的犬中治疗或预防关节炎症的方法。本发明的另一个实施方案包括用本发明组合物在有需要的猫中治疗或预防关节炎症的方法。本发明的另一个实施方案包括与未患此类异常肌骨骼关节障碍的动物相比，在患有异常肌骨骼关节障碍的动物中差异表达的一个或多个基因或基因区段，所述关节障碍可包括例如骨关节炎、类风湿性关节炎或局部关节炎症。本发明的另一个实施方案包括与未患此类异常肌骨骼关节障碍的动物相比，在患有异常肌骨骼关节障碍的动物中差异表达的两个或更多个多核苷酸或多肽的组合，所述关节障碍可包括例如骨关节炎、类风湿性关节炎或局部关节炎症。本发明的另一个实施方案包括两个或更多个多核苷酸或多肽探针的组合物，所述组合物适用于检测与未患异常肌骨骼关节障碍的动物相比，在患有所述异常肌骨骼关节障碍的动物中差异表达的基因的表达，所述关节障碍可包括例如骨关节炎、类风湿性关节炎或局部关节炎症。本发明的另一个实施方案包括方法和组合物，所述方法和组合物用于检测与未患肌骨骼障碍的动物相比，在患有所述异常肌骨骼关节障碍的动物中差异表达的一个或多个基因的差异表达，所述关节障碍可包括例如骨关节炎、类风湿性关节炎或局部关节炎症。本发明的另一个实施方案包括测定试验物对与未患异常肌骨骼障碍的动物相比， 在患有所述异常肌骨骼关节障碍的动物中差异表达的一个或多个基因的表达谱的作用的方法，所述方法用于筛选试验物，以测定它是否可用于在所述动物中调节所述障碍，所述关节障碍可包括例如骨关节炎、类风湿性关节炎或局部关节炎症。本发明的另一个实施方案包括这样的方法所述方法用于确定动物可能发展异常肌骨骼关节障碍(可包括例如骨关节炎、类风湿性关节炎或局部关节炎症)的预测或开发对动物患有所述肌骨骼关节障碍的诊断。本发明的又一方面涉及动物、尤其是伴侣动物的异常肌骨骼关节障碍尤其是骨关节炎的新生物标记的鉴定，以及根据所述生物标记在体内的特征性基因表达模式在所述动物中检测异常肌骨骼关节障碍的方法。特别是，本发明的方法包括在机体样品、优选血液样品中检测与对照表达水平相比的至少一种生物标记的差异表达，其中对所述生物标记差异表达的检测特异性鉴定患有异常肌骨骼关节障碍、尤其是骨关节炎的动物。因此，所述方法取决于对与正常或对照动物细胞相比在异常肌骨骼关节障碍中差异表达的至少一种生物标记的检测。通过将调节生物标记有效量的本发明组合物给予有需要的动物，来调节涉及异常肌骨骼关节障碍，尤其是骨关节炎、类风湿性关节炎或局部关节炎性病症的各种犬生物标记，也是本发明的实施方案。可被调节的涉及异常肌骨骼关节障碍的生物标记的实例包括但不限于膜联蛋白Al、组织蛋白酶D、组织蛋白酶F、组织蛋白酶S、RELA、HMGBl、IL-I β、 TNFa、TNF^、TLR—2、TLR-4、p38MAPK、TIMP-U TIMP—2、MMP-U MMP—2、MMP—13、IL-15 禾口 IL-17 受体、C0L2A1、C0L1A2、C0L3A1、C0L4A1、MMP-13、TIMP-2、MMP-2、C2C、C1，2C、FLAP、 PLA2、MAPKl、MAPK2和聚蛋白多糖。本发明的生物标记是在患有或可能发展异常肌骨骼关节障碍、尤其是骨关节炎、 类风湿性关节炎或局部关节炎性病症的动物中差异表达的蛋白质和/或核酸。本文还考虑本发明方法可与能检测退行性肌骨骼关节疾病的物理学和形态学特征的传统诊断技术组合使用。因此，例如，在得自动物血液样品的细胞中对作为骨关节炎生物标记的基因的差异表达的表征可以与常规诊断(例如放射)技术组合，以确证骨关节炎的诊断。又一方面，本发明涉及组合物，所述组合物包含与编码本发明生物标记的核酸或其片段特异性杂交的一种或多种核酸探针。在另一方面，本发明涉及组合物，所述组合物包含与表达本发明生物标记的基因所编码的多肽特异性结合的抗体。本发明还涉及在动物中诊断异常肌骨骼关节障碍的试剂盒，所述试剂盒包含可用于检测本发明生物标记表达的成分，包括但不限于本文所述的组合物和微阵列。另一方面，本文也考虑本发明涉及生物活性食物成分或其它天然化合物(在下文中称为“食物成分”或“成分”)的鉴定方法，即可测定所述成分治疗或改善动物的异常肌骨骼关节病症的能力，所述方法包括(a)使能表达表2和/或表3中公开的一种或多种生物标记的RNA或蛋白质产物的细胞与试验成分接触；(b)测定与所述试验成分接触的细胞中所产生的所述RNA和/或产物的量；和(c)将与所述试验成分接触的细胞中的所述RNA和 /或蛋白质产物的量与未接触所述试验成分的相应对照细胞中存在的同样的所述RNA或蛋白质产物的量进行比较；其中与对照中的量相比，如果所述RNA或蛋白质产物的量改变，那么所述成分就鉴定为经测定能治疗或改善异常肌骨骼关节障碍、尤其是骨关节炎、类风湿性关节炎或局部关节炎性病症的成分。本发明的又一方面是用于在动物中诊断和/或预测骨关节炎的方法，其中所述方法包括以下步骤从所述动物中获取至少一个组织样品或体液标本；在得自所述动物的所述至少一个样品或标本中测定选自表2和/或表3的一种或多种生物标记的量，其中所述生物标记是多肽、蛋白质、RNA、DNA、多核苷酸或其代谢产物。再一个实施方案是这样的方法其中所述一种或多种生物标记选自膜联蛋白Al、组织蛋白酶D、组织蛋白酶F、组织蛋白酶 S、RELA、HMGB1、IL-I β,TNFa、TNF3、TLR-2、TLR-4、p38 MAPK、TIMP-1、TIMP_2、MMP_1、 MMP-2、MMP-13、IL-15 和 IL-17 受体。本发明的还一个实施方案是用于在动物中诊断和/或预测骨关节炎的试剂盒，尤其是用于在动物中进行诊断和/或预测骨关节炎的方法，其中所述方法包括以下步骤从所述动物中获取至少一个组织样品或体液标本；在得自所述动物的所述至少一个样品或标本中测定选自表2和/或表3的一种或多种生物标记的量，其中所述生物标记是多肽、蛋白质、RNA、DNA、多核苷酸或其代谢产物，并且任选进一步包括与所述生物标记偶联的可检测试齐LU本发明的再一个实施方案是用于在动物中诊断和/或预测骨关节炎的试剂，尤其是用于在动物中进行诊断和/或预测骨关节炎的方法，其中所述方法包括以下步骤从所述动物中获取至少一个组织样品或体液标本；在得自所述动物的所述至少一个样品或标本中测定选自表2和/或表3的一种或多种生物标记的量，其中所述生物标记是多肽、蛋白质、RNA、DNA、多核苷酸或其代谢产物，并且任选进一步包括与所述生物标记偶联的可检测试齐LU本发明的另一个实施方案是表2和/或表3中鉴定的一种或多种多肽、蛋白质、 RNA、DNA、多核苷酸或其代谢产物，作为用于诊断和/或预测异常肌骨骼关节障碍的生物标记的用途，尤其是用于构成诊断或预测异常肌骨骼关节障碍的试剂盒。再一个实施方案是这样的试剂盒其中所述一种或多种生物标记选自膜联蛋白Al、组织蛋白酶D、组织蛋白 Bl F^liRSSSI S, RELA, HMGBU IL-I β、TNF α、TNF^、TLR—2、TLR—4、p38 MAPK、TIMP_1、 TIMP-2、MMP-I、MMP-2、MMP-13、IL-15和IL-17受体。还一个实施方案是这样的试剂盒其中所述试剂和设备包括DNA微阵列分析材料，其包括寡核苷酸微阵列、cDNA微阵列和聚焦基因芯片或其组合。本发明的另一个实施方案是在动物中检测骨关节炎的方法，所述方法包括提供来自动物的样品，包括组织样品或体液标本；检测表2和/或表3中鉴定的生物标记的水平， 所述生物标记是所述样品或标本中的多肽、蛋白质、RNA、DNA、多核苷酸或其代谢产物；然后将所述样品或标本中的所述生物标记水平与对照样品中的所述生物标记水平进行比较；其中与对照动物细胞中的表达相比，所述生物标记的表达具有至少1倍或以上的基因表达差
已本发明的再一个实施方案是在动物中检测骨关节炎的方法，所述方法包括使上述方法的样品或标本与包含与所述生物标记选择性杂交的多核苷酸序列的第一引物和包含与所述生物标记多核苷酸杂交的多核苷酸序列的第二引物接触，进行扩增反应，然后定量测定所述样品或标本中的所述生物标记多核苷酸的扩增产物。本发明的另一个实施方案是评价患有骨关节炎的动物的治疗或营养管理过程有效性的方法，所述方法包括(a)在所述治疗过程期间的第一时间点，在所述动物的组织样品或体液标本中测定表2和/或表3中鉴定的生物标记多肽、蛋白质、RNA、DNA、多核苷酸或其代谢产物的第一水平，(b)在治疗过程期间的第二时间点，在所述动物的样品或标本中测定所述生物标记的第二水平，和(c)比较所述第一点和所述第二点的所述生物标记的测定值；其中与对照动物细胞中的表达相比，所述生物标记的表达具有至少1倍或以上的基因表达差异。本发明的另一个实施方案是评价患有骨关节炎的动物的治疗或营养管理过程的进程的方法，所述方法包括(a)在所述治疗过程期间的第一时间点，在所述动物的组织样品或体液标本中测定表2和/或表3中鉴定的生物标记多肽、蛋白质、RNA、DNA、多核苷酸或其代谢产物的第一水平，(b)在治疗过程期间的第二时间点，在所述动物的所述样品或标本中测定所述生物标记的第二水平，和(c)比较所述第一点和所述第二点的所述生物标记的测定值；其中与对照动物细胞中的表达相比，所述生物标记的表达具有至少1倍或以上的基因表达差异。本发明的又一实施方案是鉴定用于在动物中诊断骨关节炎的分子的方法，所述方法包括(1)提供来自所述动物的包含表2和/或表3中鉴定的生物标记的组织样品或体液标本的样品，所述生物标记是多肽、蛋白质、RNA、DNA、多核苷酸或其代谢产物；( 将所述样品或标本与试验分子接触；C3)测定所述试验分子是否结合所述生物标记或被所述生物标记结合；其中与对照动物中所述生物标记的表达相比，所述生物标记的表达具有至少 1倍或以上的表达差异。 本发明的再一个实施方案是用于在动物中筛选骨关节炎的方法，所述方法包括以下步骤i)从所述动物中获取组织样品或体液标本并检测所述样品中一种或多种生物标记多肽、蛋白质、RNA、DNA、多核苷酸或代谢产物的基因表达谱；和ii)将所述样品中的所述一种或多种生物标记的基因表达谱与在来自表现出骨关节炎症状的动物的多个参考样品中包含所述一种或多种生物标记的平均基因表达水平的阳性对照进行比较，以测定所述样品与阳性对照之间的差异的基因表达，其中如果所述样品和阳性对照的一种或多种生物标记的基因表达谱的基因表达之间没有统计学显著差异，就表明存在骨关节炎，其中所述生物标记包括表2和/或表3中的一个或多个基因。 本发明的还一个实施方案是用于在动物中筛选骨关节炎的方法，所述方法包括以下步骤i)从所述动物中获取组织样品或体液标本并检测所述样品中一种或多种生物标记多肽、蛋白质、RNA、DNA、多核苷酸或代谢产物的基因表达谱；和ii)将所述样品中的所述一种或多种生物标记的基因表达谱与在来自不表现出骨关节炎症状的对照动物的多个参考样品中包含所述一种或多种生物标记的平均基因表达水平的阳性对照进行比较，以测定所述样品与所述对照动物的参考样品之间的差异的基因表达，其中如果所述样品和阳性对照的一种或多种生物标记的基因表达谱的基因表达之间有1倍差异，就表明存在骨关节炎，其中所述生物标记包括表2和/或表3中的一个或多个基因。本发明的另一个实施方案是用于筛选具有治疗或预防骨关节炎的一种或多种症状的能力的试剂的测定方法，所述方法包括以下步骤i)从产生代表骨关节炎的差异的基因表达谱的所述动物的组织样品中分离核酸对照样品并测定所述对照样品的基因表达水平；ii)使所述组织样品接触所述试剂；iii)在步骤(ii)的所述组织样品接触所述试剂之后，从所述组织样品中分离核酸测试样品并测定所述测试样品中的基因表达水平；iv)比较所述对照样品与所述测试样品之间基因表达的产生、稳定性、降解和/或活化，以找到所述测试样品和所述对照样品之间的差异的基因表达谱；其中所述测试样品与所述对照样品之间的差异的基因表达谱表明所述试剂具有预防或治疗骨关节炎的一种或多种症状的能力。本发明的再一个实施方案是用于信息阵列(informativearray)的、用于鉴定在组织样品间差异表达的多个基因的方法，包括提供来自第一组织样品的第一组异源核酸探针；提供来自第二组织样品的第二组异源核酸探针；将包含来自生物过程的基因的多个序列的核酸阵列与第一组探针杂交并测定所述阵列序列的第一表达水平；将所述阵列与所述第二组探针杂交并测定所述阵列序列的第二表达水平；通过将杂交序列的第一表达水平与所述第二表达水平进行比较，鉴定在所述生物过程中差异表达的多个基因；和通过选自以下的步骤，确定所鉴定基因的排序测定第一表达水平和第二表达水平之间差异的绝对值，然后与具有更低差异的基因相比，将具有更高差异的基因排序；并测定第一表达水平和第二表达水平之间差异的标准差，然后相对于具有更低标准差的基因，将具有更高标准差的基因排序，其中所述基因包括表2和/或表3中的一个或多个基因。
本发明的另一个实施方案是将核酸阵列转化成信息阵列的方法，包括提供来自第一组织样品的第一组异源核酸探针；提供来自第二组织样品的不同的第二组异源核酸探针；将包含不同序列的核酸阵列与第一组探针杂交并测定所述阵列序列的第一表达水平； 将所述阵列与所述第二组探针杂交并测定所述阵列序列的第二表达水平；通过选自以下的步骤，根据所鉴定基因的第一表达水平和第二表达水平之间的差异，鉴定在所述生物过程中差异表达的多个基因测定第一表达水平和第二表达水平之间差异的绝对值，然后相对于具有更低差异的基因，将将具有更高差异的基因排序；并测定第一表达水平和第二表达水平之间差异的标准差，然后相对于具有更低标准差的基因将具有更高标准差的基因排序；然后从多个已鉴定的差异表达的基因中选择基因用于包含在信息阵列中，其中所述基因选自表2和/或表3中所列举的基因。本发明的还一个实施方案是用于分析基因表达、以筛选骨关节炎的计算机执行的方法，所述方法包括以下步骤i)编辑包含来自组织样品的选自以下的核酸微阵列分析的多个所测基因表达信号的数据寡核苷酸微阵列、c-DNA微阵列和聚焦基因芯片分析或其组合，形成适用于基于计算机分析的形式；和ii)分析所编辑的数据，其中所述分析包括鉴定来自大量的上调生物标记基因和下调生物标记基因的基因网络，其中所述生物标记基因是已被鉴定与骨关节炎的存在或严重程度相关的基因，所述基因包括表2和/或表3中所列举的基因。本发明的另一个实施方案是在体外筛选药物候选者的方法，所述方法包括测定候选者调节所选基因表达或所选基因表达产物的活性的能力，其中所选基因或基因表达产物是选自表2和/或表3中所列举的基因或基因产物的骨关节炎生物标记或基因表达产物。本发明的另一个实施方案是在体外筛选营养食物、膳食补充剂、营养补充食物或治疗的方法，所述方法包括测定候选者调节所选基因表达或所选基因表达产物的活性的能力，其中所选基因或基因表达产物是选自表2和/或表3中所列举的基因或基因产物的骨关节炎生物标记或基因表达产物。本发明的另一个实施方案是在体外筛选药物候选者的方法，所述方法包括a)采集至少两个生物样品；其中第一样品模拟骨关节炎而第二样品模拟健康状态；b)使至少一个样品或样品混合物与待测的一种或多种药物候选者接触；c)在b)中所获取的所述生物样品或混合物中测定表2和/或表3中所列举的基因表达或基因表达产物水平或基因活性或活性；和d)选择能调节在b)中所获取的所述样品或混合物中所测定的基因表达或基因表达产物水平或活性的药物候选者并与不与所述药物候选者混合的样品的水平进行比较。本发明的另一个实施方案是在体外筛选营养食物、膳食补充剂、营养补充食物或治疗的方法，所述方法包括a)采集至少两个生物样品；其中第一样品模拟骨关节炎而第二样品模拟健康状态；b)使至少一个样品或样品混合物与待测的一种或多种营养食物、膳食补充剂、营养补充食物或治疗接触；c)在b)中所获取的所述生物样品或混合物中测定表2 和/或表3中所列举的基因表达或基因表达产物水平或基因活性或活性；和d)选择能调节在b)中所获取的所述样品或混合物中所测定的基因表达或基因表达产物水平或活性的营养食物、膳食补充剂、营养补充食物或治疗并与不与所述营养食物、膳食补充剂、营养补充食物或治疗混合的样品的水平进行比较。本发明的另一个实施方案是在体外测定动物骨关节炎的严重程度的方法，所述方
11法包括比较选自表2和/或表3中所列举的基因和基因产物的生物标记的基因表达或基因表达产物水平或活性。本发明的另一个实施方案是用于治疗骨关节炎的组合物的制备方法，所述方法包括制备这样的组合物所述组合物包含选自表2和/或表3中所列举的基因和基因产物的骨关节炎生物标记的调节剂。本发明的另一个实施方案是测定骨关节炎治疗功效的方法，所述方法包括以下步骤(a)提供来自患有骨关节炎的动物的生物样品，所述动物已经接受所述治疗，(b)在所述样品中测定骨关节炎的一种或多种生物标记的水平，以产生所述动物的表达谱，和(C) 将所述表达谱与以下表达谱进行比较i)在开始所述治疗之前得自所述试验动物的相应表达谱，和/或ii)在所述治疗的较早时期得自所述试验动物的相应表达谱，和/或iii)未患骨关节炎的受试者的相应表达谱特征，其中骨关节炎的一种或多种生物标记包括表2和 /或表3所示的一个或多个基因的表达产物。本发明的另一个实施方案是选择在动物中能治疗或预防骨关节炎的一种或多种症状的食物组合物的方法，所述方法包括以下步骤i)访问至少一个数据库，所述数据库包含涉及患有骨关节炎的动物的组织样品或组织样品的生物流体标本的基因表达谱的第一数据集； )访问至少一个数据库，所述数据库包含涉及生物活性食物成分对所述基因表达谱的作用的第二数据集；和iii)通过使用第一算法，使用所述第一和所述第二数据集，处理所述第一数据集和所述第二数据集，得到营养配方，用于选择和制备食物组合物， 用于所述动物；和iv)以用户可读形式存储或使用所述营养配方。本发明的其它和进一步的目的、特征和优势将会是本领域技术人员显而易见的。
附图简述

图1描述了在饲喂至少一种本发明组合物(称为犬组合物j/d)之后，与狗软骨降解相关的多个基因的基因表达降低。图2描述了在饲喂至少一种本发明组合物(称为犬组合物j/d)之后，与狗软骨降解相关的多个基因的基因表达降低。图3描述了与未患关节炎的猫相比，在患有关节炎的猫中与炎症相关的多个基因的基因表达增加。图4描述了称为组合物j/d的本发明组合物的一个实施方案。图5描述了与正常狗相比，在患有关节炎的狗中基因C2C上调。图6描述了与未患关节炎的狗相比，在患有关节炎的狗中基因C1，2C上调。图7描述了与未患关节炎的狗的软骨相比，在患有关节炎狗的软骨中表达关节炎相关蛋白的某些基因。图8描述了与未患关节炎的狗的软骨相比，在患有关节炎狗的软骨中表达关节炎相关蛋白的某些基因图9描述了给狗饲喂犬食物组合物j/d分别达14天和18天之后的EPA和DHA的
血清水平。图10描述了给狗饲喂犬组合物j/d 14天之后基因C2C表达的调节。图11描述了给狗饲喂犬组合物j/d 14天之后，基因C1，2C表达的调节。
图12描述了给狗饲喂组合物j/d 14天之后，基因CTX-II表达的调节。图13描述了与未患关节炎的猫相比，在患有关节炎的猫中基因C2C上调。图14描述了与未患关节炎的猫相比，在患有关节炎的猫中基因CTX-II上调。图15描述了与未患关节炎的猫相比，在患有关节炎的猫中软骨修复相关的多个基因上调。图16描述了在接受猫组合物j/d之后，猫的运动性增加。图17描述了狗的夜间活动性减少，表明在给予犬食物组合物j/d的狗中舒适性有所改善。
发明详述本发明涉及治疗动物异常病症的组合物和方法，其中所述异常病症影响动物的肌骨骼关节。所述组合物可配制成供口服给予用，包括但不限于动物饲料。所述动物饲料可给予任何类型的动物，其中所述组合物已经配制好。例如，饲料可为伴侣动物包括但不限于狗或猫而配制。本文所用的异常动物是经诊断患有或明显具有累及动物肌骨骼关节的病症的动物，或者本文所含有的基因表达数据表明对所述病症具有易感性的动物。例如，经诊断患有或明显具有骨关节炎的狗或猫就可认为是异常动物。本发明的组合物包含至少一种ω-3脂肪酸。ω-3脂肪酸是本领域众所周知的。 ω-3脂肪酸是动物健康的必需营养素，动物不能制造所述脂肪酸或者不能制造出足够数量。所述脂肪酸用作本文所述的本发明的组合物和方法的一种或多种食物成分。本文所含有的营养组合物的配制部分是基于所述营养组合物对患有本文所述类型的肌骨骼关节障碍的动物的基因表达的影响。ω-3脂肪酸的实例包括但不限于α-亚油酸(ALA)、二十二碳六烯酸(docosahexanoic acid) (DHA)和二十碳五烯酸(EPA)。在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含ALA、DHA或EPA中的一种。在另一个实施方案中，所述组合物包含ALA、 DHA或EPA中的至少两种。在本发明的还一个实施方案中，所述组合物包含所有三种ALA、 DHA 禾口 EPA0所述组合物还包含至少一种葡糖胺聚糖(GAG)。GAG是本领域众所周知的并且认为是由重复二糖单元组成的无支链多糖。如果多糖是无支链的并由重复二糖单元组成，就认为所述分子或聚合物是GAG。GAG的实例包括但不限于硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素和乙酰透明质酸(hyaluronan)。在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素或乙酰透明质酸中的至少1种。在本发明的另一个实施方案中，所述组合物包含硫酸软骨素、硫酸皮肤素、 硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素或乙酰透明质酸中的至少2种。在本发明的还一个实施方案中，所述组合物包含硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素或乙酰透明质酸中的至少3种。在本发明的再一个实施方案中，所述组合物包含硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素和/或乙酰透明质酸中的至少4种、5种或全部。所述组合物还包含至少一种氨基糖。氨基糖是本领域众所周知的并且仅指糖部分，其中胺基取代或发生加成在羟基上。氨基糖的实例包括但不限于半乳糖胺、葡糖胺、唾液酸和N-乙酰葡糖胺。在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含半乳糖胺、葡糖胺、唾液酸或N-乙酰葡糖胺中的至少1种。在本发明的另一个实施方案中，所述组合物包含半乳糖胺、葡糖胺、唾液酸或N-乙酰葡糖胺中的至少2种。在本发明的还一个实施方案中，所述组合物包含半乳糖胺、葡糖胺、唾液酸或N-乙酰葡糖胺中的至少3种。在本发明的再一个实施方案中，所述组合物包含所有4种半乳糖胺、葡糖胺、唾液酸或N-乙酰葡糖胺。所述组合物还包含至少一种抗氧化剂。抗氧化剂是本领域众所周知的。抗氧化剂的实例包括但不限于维生素C、维生素E (生育酚和/或生育三烯酚)、谷胱甘肽、硫辛酸、褪黑激素、肉毒碱和胡萝卜素。在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含维生素C、 维生素E (生育酚和/或生育三烯酚)、谷胱甘肽、硫辛酸、褪黑激素或β -胡萝卜素中的至少1种。在本发明的另一个实施方案中，所述组合物包含维生素C、维生素E(生育酚和/或生育三烯酚)、谷胱甘肽、硫辛酸、褪黑激素或胡萝卜素中的至少2种。在本发明的还一个实施方案中，所述组合物包含维生素C、维生素E (生育酚和/或生育三烯酚)、谷胱甘肽、硫辛酸、褪黑激素或胡萝卜素中的至少3种。在本发明的再一个实施方案中，所述组合物包含维生素C、维生素E (生育酚和/或生育三烯酚)、谷胱甘肽、硫辛酸、褪黑激素或 β-胡萝卜素中的至少4种。在本发明的再一个实施方案中，所述组合物包含维生素C、维生素E (生育酚和/或生育三烯酚)、谷胱甘肽、硫辛酸、褪黑激素和/或β -胡萝卜素中的至少5种或以上。本发明的组合物还包含肉毒碱或乙酰肉毒碱，其是具有抗氧化剂作用的季铵化合物。在选择实施方案中，所述组合物还包含至少一种膳食矿物质和/或至少一种天然氨基酸。膳食矿物质和天然氨基酸的实例是众所周知的。膳食矿物质的实例包括但不限于钙、氯化物、镁、磷、钾、钠、钴、铜、氟、碘、铁、锰、钼、镍、硒、硫、锌和钒。在一个实施方案中， 所述组合物包含钙、氯化物、镁、磷、钾、钠、钴、铜、氟、碘、铁、锰、钼、镍、硒、硫、锌或钒中的至少1种。在另一个实施方案中，所述组合物包含钙、氯化物、镁、磷、钾、钠、钴、铜、氟、碘、 铁、锰、钼、镍、硒、硫、锌或钒中的至少2种。在还一个实施方案中，所述组合物包含钙、氯化物、镁、磷、钾、钠、钴、铜、氟、碘、铁、锰、钼、镍、硒、硫、锌或钒中的至少3种。在再一个实施方案中，所述组合物包含钙、氯化物、镁、磷、钾、钠、钴、铜、氟、碘、铁、锰、钼、镍、硒、硫、锌或钒中的至少4种。在再一个实施方案中，所述组合物包含钙、氯化物、镁、磷、钾、钠、钴、铜、 氟、碘、铁、锰、钼、镍、硒、硫、锌或钒中的至少5种或以上。天然氨基酸是本领域众所周知的，是在蛋白质中存在的氨基酸。在一个具体的实施方案中，所述组合物包含必需氨基酸，其中术语必需氨基酸与受试者的种类有关。例如， 狗和猫的必需氨基酸包括精氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、亮氨酸、 色氨酸、赖氨酸和缬氨酸。牛磺酸也认为是猫的必需氨基酸。在一个实施方案中，犬食物组合物j/d包含图4中一般性描述的组合物，并包含硫酸软骨素形式的葡糖胺聚糖和葡糖胺盐酸盐形式的氨基糖以及肉毒碱和至少一种抗氧化剂。所述组合物也可含有额外的营养来源，例如碾碎的整粒玉米(Ground Whole Grain Corn)、鸡副产品粉(Chicken By-Product Meal)、亚麻籽、豆粕(Soybean MillRun)、酿造用米(Brewers Rice)、豆粉(Soybean Meal)、猪脂(Pork Fat)(用混合生育酚和柠檬酸保存)、鸡肝调味料(Chicken Liver Flavor)、粉状纤维素、鱼油、氯化钾、L-赖氨酸、碳酸钙、 氯化胆碱、加碘盐、DL-甲硫氨酸、维生素E补充剂、维生素(L-抗坏血酸基-2-多磷酸酯(维生素C来源)、维生素E补充剂、烟酸、硝酸硫胺、维生素A补充剂、泛酸钙、生物素、维生素B12补充剂、盐酸吡哆醇、核黄素、叶酸、维生素D3补充剂)、L_苏氨酸、牛磺酸、大豆卵磷脂、盐酸葡糖胺、矿物质(硫酸亚铁、氧化锌、硫酸铜、一氧化锰、碘酸钙、亚硒酸钠)、L_色氨酸、L-肉毒碱(用混合生育酚和柠檬酸保存)、硫酸软骨素、胡萝卜素、迷迭香提取物。用于实施例的本发明的猫的j/k食物组合物含有ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸并也含有α-亚麻酸。所述组合物含有硫酸软骨素形式的葡糖胺聚糖和盐酸葡糖胺形式的氨基糖。另外，所述组合物含有肉毒碱和至少一种抗氧化剂，例如维生素C和胡萝卜素。术语“动物”是指人类或非人类动物，包括鸟、牛、犬、马、猫、hicrine、鼠、牛、灵长类动物和猪的动物。术语“抗体”是指与特异性抗原结合的任何免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgA、 IgD和IgE抗体。该术语包括多克隆抗体、单克隆抗体、一价抗体、人源化抗体、杂缀合物 (heteroconjugate)、具有多表位特异性的抗体组合物、嵌合抗体、双特异性抗体、双链抗体、单链抗体和抗体片段(例如Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv)或其它抗原结合片段。术语“阵列”是指至少2个探针在基片上有序排列。至少1个探针是对照或标准， 至少1个探针是诊断探针。约2个至约40，000个探针在基片上的排列确保探针与样品多核苷酸或多肽之间所形成的各标记复合物的大小和信号强度是可单独区分的。术语“差异表达”或“差异表达的”是指增加或上调的基因表达或者是指降低或下调的基因表达，当通过在样品中转录的信使RNA或翻译的蛋白质的数量上不存在、存在、或具有至少2倍、或至少1. 5,1. 4,1. 3,1. 2、1. 1或1倍变化而测定时。术语“倍”当用作差异基因表达的度量时，是指动物中的基因表达量与比较动物的基因表达量相比的基因表达倍数或是分数，例如患有关节炎的动物与未患关节炎的动物相比。例如，在某动物中基因表达是比较动物的3倍，就具有3倍的差异基因表达，而在某动物中基因表达是比较动物的1/3，也具有3倍的差异基因表达。术语“片段”是指(1)寡核苷酸或多核苷酸序列，其是完整序列的一部分并且对于特定用途而言具有与完整多核苷酸序列相同或相似的活性，或( 肽或多肽序列，其是完整序列的一部分并且对于特定用途而言具有与完整多肽序列相同或相似的活性。所述片段可包含被认为是适于特定用途的任何数量的核苷酸或氨基酸。通常，寡核苷酸或多核苷酸片段含有至少约10、50、100或1000个核苷酸，多肽片段含有完整序列的至少约4、10,20或 50个连续氨基酸。该术语包括多核苷酸和片段的多肽变体。术语“基因”或多个“基因”是指参与产生多肽的DNA的完整或部分区段，包括前导区和随后的编码区(前导区和拖曳区)和介于单个编码区段(外显子)的插入序列(内含子)。该术语包含与互补基因编码序列杂交的任何DNA序列。术语“同源物”是指(1)多核苷酸，包括来自相同或不同动物物种的多核苷酸，其与多核苷酸具有大于30^^50%,70%或90%序列相似性并具有与完整多核苷酸相同或基本相同的性质并表现出相同或基本相同的功能，或者具有在严格性条件下与多核苷酸特异性杂交的能力，或⑵多肽，包括来自相同或不同动物物种的多肽，其与通过多核苷酸表达而鉴定的多肽具有大于30^^50^^70%或90%序列相似性并具有与完整多肽相同或基本相同的性质并表现出相同或基本相同的功能，或者具有与通过多核苷酸表达而鉴定的多肽特异性结合的能力。使用技术人员已知的方法，可确定2个多肽序列或2个多核苷酸序列的序列相似性，所述方法例如Karlin和Altschul的算法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 2264-2268(1990))。将所述算法结合到 Altschul 等(J. MoI. Biol. 215 :403-410(1990))的 NBLAST和XBLAST程序中。为了得到空位比对用于比较的目的，可使用Altschul等(Nucl. Acids Res. 25 :3389-3402(1997))所述的 Gapped Blast。当使用 BLAST 和 Gapped BLAST 程序时，使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http://WW. ncbi. nlm. nih. gov. 0术语“杂交复合物”是指样品多核苷酸之间形成的复合物，当一个多核苷酸的嘌呤与互补多核苷酸的嘧啶通过氢键结合时，例如5' -A-G-T-C-3 ‘碱基对与 3' -T-C-A-G-5'。互补程度和核苷酸类似物的使用影响杂交反应的效率和严格性。术语“联合”是指将药物、食物或其它物质(1)与组合物、尤其是食物组合物一起给予动物，或( 使用相同或不同给予途径，在大致相同的时间或周期，以相同或不同频率分别给予动物。“周期”是指按照特定物质可接受的给予方案给予物质。“大致相同的时间” 通常是指在同时或在彼此相隔约72小时之内给予物质(食物或药物)。“联合”明确包括在指定周期内给予物质例如药物的给予方案并且无限期地给予本发明的组合物。术语“多核苷酸”或“寡核苷酸”是指核苷酸的聚合物。该术语包括DNA和RNA(包括cDNA和mRNA)分子，无论是单链还是双链，而且如果单链的话，其互补序列呈线状或环状形式。该术语也包括片段、变体、同源物和等位基因，适当时所述序列具有与原始序列相同或基本相同的特性并表现出相同或基本相同的功能。序列可以是完全互补的(没有错配) 当比对时或者可具有至多约30%序列错配。优选地，对于多核苷酸，其链含有约50-10，000 个核苷酸，更优选约150-3，500个核苷酸。优选地，对于寡核苷酸，其链含有约2-100个核苷酸，更优选约6-30个核苷酸。多核苷酸或寡核苷酸的准确大小将取决于各种因素和多核苷酸或寡核苷酸的具体应用和用途。该术语包括合成的和从天然来源分离并纯化的核苷酸聚合物。术语“多核苷酸”包括“寡核苷酸”。术语“多肽”、“肽”或“蛋白质”是指氨基酸聚合物。该术语包括天然存在的和非天然存在的(合成)聚合物以及用人工化学模拟物取代一个或多个氨基酸的聚合物。该术语也包括具有与原始序列相同或基本相同的特性并表现出相同或基本相同的功能的片段、 变体和同源物。该术语包括任何长度的聚合物，优选聚合物含有约2-1000个氨基酸，更优选约5-500个氨基酸。该术语包括合成的和从天然来源分离并纯化的氨基酸聚合物。术语“探针”是指(1)寡核苷酸或多核苷酸，无论是RNA还是DNA，无论是在纯化的限制酶水解物中天然存在的还是合成产生的，其能够与具有与所述探针互补的序列的多核苷酸退火或特异性杂交，或( 肽或多肽，其能特异性结合特定蛋白质或蛋白质片段，而基本上不与其它蛋白质或蛋白质片段结合。寡核苷酸或多核苷酸探针可以是单链或双链。 探针的准确长度将取决于许多因素，包括温度、来源和用途。例如，对于诊断应用，根据靶序列的复杂性，寡核苷酸探针通常含有约10-100、15-50或15-25个核苷酸。在某些诊断应用中，多核苷酸探针含有约100-1000、300-600个核苷酸，优选约300个核苷酸。本文的探针经选择与特定靶序列的不同链“基本”互补。这表明探针必须与其相应靶序列足够互补，从而与之在一系列预定条件下特异性杂交或退火。因此，探针序列不一定反映准确的互补靶序列。例如，非互补核苷酸片段可连接到探针的5'或3'端，探针序列的剩余部分与靶序列互补。或者，非互补的碱基或更长序列可插入到探针中，只要探针序列与靶多核苷酸序列具有足够的互补性，从而与靶多核苷酸特异性退火。肽或多肽探针可以是蛋白质或肽与之特异性结合的任何分子，包括DNA(对于DNA结合蛋白)、抗体、细胞膜受体、肽、辅因子、凝集素、糖、多糖、细胞、细胞膜、细胞器和细胞器膜。术语“样品”是指含有例如多核苷酸、多肽、抗体、代谢产物等的任何动物组织或流体，包括含有DNA和RNA的细胞和其它组织。实例包括血液、软骨、结缔组织、上皮、淋巴、肌肉、神经、痰液等。样品可以是固体或液体并且可以是DNA、RNA、cDNA、体液例如血或尿、细胞、细胞制备物或可溶性部分或其培养基等分试样、染色体、细胞器等。术语“单独包装”是指与一个或多个容器物理缔合的试剂盒的成分并作为一个单位进行制造、配送、销售或使用。容器包括但不限于袋、盒、瓶、热缩包装、钉牢的或其它方式固定的成分、或其组合。一个单独包装可以是物理缔合的单一食物组合物的容器，使得它们作为一个单位进行制造、配送、销售或使用。术语“有用的变异”是指(1)对于多核苷酸，多核苷酸的互补物；多核苷酸同源物及其互补物；多核苷酸变体、其互补物及其同源物；和多核苷酸片段、其互补物、其同源物及其变体，和⑵对于多肽，多肽的同源物；多肽的变体及其同源物；和多核苷酸片段、其同源物及其变体。术语“实际包装”是指试剂盒的成分附加有对一种或多种物理的或实际的试剂盒成分的说明书，指导用户怎样获取其它成分，例如在含有一种成分的袋中，并具有指导用户上网、接触记录信息、察看可视信息或接触顾问或指导者以获取怎样使用试剂盒的说明书。术语“标准”是指(1)对照样品，所述样品含有来自正常动物的组织，如果例如要测试患有关节炎的动物的话，或者所述样品含有来自例如患有关节炎的动物的组织，如果要测试正常动物的话，或(2)对照样品，所述样品含有来自正常动物或例如患有关节炎的动物的组织，其尚未在相应的正常或例如患有关节炎的动物中暴露给所测试验物，以检测所述试验物是否引起差异的基因表达，在适于其用途的情况下。术语“严格性条件”是指(1)在50% (vol/vol)甲酰胺和0.1%牛血清白蛋白、 0. 1% FicolUO. 聚乙烯吡咯烷酮、50mM磷酸钠缓冲液(pH 6. 5)和750mM NaCl、75mM柠檬酸钠中，在42°C杂交，⑵在50%甲酰胺、5x SSC(0. 75M NaCl、0. 075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6. 8)、0. 焦磷酸钠、5x Denhardt溶液、超声降解的鲑鱼精子DNA(50 μ g/ml)、 0. 1 % SDS和10%硫酸葡聚糖中，在42°C杂交；在42°C，用0. 2x SSC和0. 1 % SDS洗涤或者用0. 015M NaCUO. 0015M柠檬酸钠、0. 1% Na2SO4在50°C洗涤或者用类似的低离子强度和高温洗涤剂和类似的变性剂，用类似的方法。术语“物质”是指可潜在用于诊断、预测或调节动物的异常关节病症的发作和严重程度的元素、化合物、分子或其混合物或任何其它材料，包括任何药物、化学实体或生物实体。术语“siRNA”是指形成能降低或抑制基因表达的双链RNA的多核苷酸，当siRNA 在同一细胞作为基因表达时。该术语包括由互补链形成的双链RNA。杂交形成双链分子的 siRNA互补部分通常具有基本或完全的同一性。通常，siRNA含有至少约15-50个核苷酸， 而双链siRNA含有约15-50个碱基对，优选约20-30个核苷酸和碱基对。术语“特异性结合”是指两个分子间特异而精确的相互作用，这取决于其结构，尤其是其分子侧基。例如，调节蛋白插入到DNA分子的大沟中，两个单链核酸之间的氢键沿主链排列，或者蛋白质表位与激动剂、拮抗剂或抗体之间的结合。术语“特异性杂交”是指足够互补的序列的两条单链多核苷酸之间的缔合，以允许所述杂交在通常用于本领域的预定条件下进行(有时称为“基本互补”)。例如，该术语可指多核苷酸探针与本发明方面的单链DNA或RNA分子内含有的基本互补的序列杂交，而基本上排除了所述多核苷酸探针与非互补序列的单链多核苷酸的杂交。术语“变体”是指(1)多核苷酸序列，其含有从多核苷酸序列中或向多核苷酸序列上的一个或多个核苷酸的任何取代、变异、修饰、置换、缺失或添加并且具有与原始序列相同或基本相同的特性并表现出相同或基本相同的功能，和(2)多肽序列，其含有从多肽序列中或向多肽序列上的一个或多个氨基酸的任何取代、变异、修饰、置换、缺失或添加并且具有与原始序列相同或基本相同的特性并表现出相同或基本相同的功能。因此该术语包括单核苷酸多态性(SNP)和等位变体并包括多肽中的保守和非保守氨基酸取代。该术语也包括多核苷酸或多肽的化学衍生和用并非天然发生的核苷酸或氨基酸取代核苷酸或氨基酸， 如果合适的话。本发明不限于本文所述的具体的方法学、方案和试剂，因为它们是可以改变的。此外，本文所用的术语仅为了描述具体的实施方案，不得视为对本发明范围的限制。本文所用的和所附权利要求书中的单数形式“一”和“该”包括复数形式，除非另有明确说明，否则例如“一个变体”包括多个变体。此外，定义的术语包括用于适当语法范围的术语的变异体， 例如术语“特异性结合”包括“特异性结合”和该术语的其它形式。同样，术语“包含”、“含” 和“包括”解释为包含在内而非排除。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语以及任何简称均具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。虽然与本文所述的任何组合物、方法、制造物品或其它工具或材料相似或等同的任何组合物、方法、制造物品或其它工具或材料都可用于本发明的实践，但是本文中描述优选的组合物、方法、制造物品或其它工具或材料。本文所引用或提到的所有专利、专利申请、出版物和其它参考文献都通过引用结合到本文中，其程度是在法律的允许下。这些参考文献的讨论仅用于概括其中作出的声明。 但并不是承认任何所述专利、专利申请、出版物或参考文献或其任何部分是本发明相关的现有技术并且明确保留对所述专利、专利申请、出版物和其它参考文献的准确性和针对性进行质询的权利。在一个实施方案中，本发明包括与正常动物相比在异常动物中差异表达的一个或多个基因或基因区段(“基因”如本文中定义)。本发明是基于对与正常动物相比在异常动物中差异表达的多核苷酸的发现。通过使用Affymetrix GeneChip 技术，比较经诊断为异常动物的淋巴细胞的基因表达与经诊断为正常动物的淋巴细胞的基因表达，来鉴定基因。通过测定经诊断为异常犬的淋巴细胞的基因表达与经诊断为正常犬的淋巴细胞的基因表达的差异，来鉴定多核苷酸和基因。可通过技术人员已知的任何方法来测定基因表达的改变。通常，通过测定转录(测定基因所产生的mRNA的量)或测定翻译(测定基因所产生的蛋白质的量)来测定基因表达的改变。可用技术人员已知的定量测定多核苷酸和蛋白质的任何方法来测定基因所产生的RNA或蛋白质的量。通常，采用聚合酶链式反应 (PCR)(包括但不限于逆转录-PCR(RT-PCR)和定量实时PCR(qPCR))、RNase保护、RNA印迹和其它杂交方法来测定RNA表达。所测RNA通常呈mRNA的形式或反转录mRNA的形式。采用各种比色测定和光谱测定以及例如Iowry测定、双缩脲测定、荧光测定、比浊法、二辛可宁酸测定、蛋白质芯片技术、红外吸收、茚三酮、bradford测定和紫外吸收的方法，测定蛋白质或多肽的表达。在一个优选的方法中，使用购自Affymetrix公司的Affymetrix犬-1和犬-2基因芯片和使用所述芯片的说明书来测定基因表达，以测定基因表达的改变。通常，通过测定至少一个基因的表达，测定异常动物与正常动物相比的差异的基因表达。优选地，测定两个或更多个差异表达的基因的表达，以提供基因表达模式或基因表达谱。更优选地，测定多个差异表达的基因的表达，以提供额外信息，用于更重要的基因表达模式或表达谱。另一方面，本发明提供适用于检测与正常动物相比在异常动物中差异表达的多个基因的表达的装置。所述装置包括基片，所述基片在已知位置上固定有本发明的多个寡核苷酸或多核苷酸探针。所述装置基本上是本文所述的寡核苷酸或多核苷酸探针的固定化形式。所述装置可用于快速而特异性检测基因和多核苷酸及其表达模式和表达谱。通常，将所述探针连接到基片或类似固体支持物上，再将含有一个或多个多核苷酸(例如基因、PCR 产物、连接酶链式反应(LCR)产物、已用扩增技术合成的DNA序列或其混合物)的样品暴露给所述探针，使样品多核苷酸可与探针杂交。所述探针、样品多核苷酸或这两者都带有标记，通常用荧光团或其它标签例如链霉抗生物素来标记，然后用技术人员已知的方法来测定。如果样品多核苷酸带有标记，就可通过检测结合的荧光来测定杂交。如果探针带有标记，通常就可通过标记猝灭而检测杂交。如果探针和样品多核苷酸都带有标记，就可通过监测这两个结合标记接近而导致的颜色变化来检测杂交。各种各样的标记策略和标记是技术人员已知的，尤其是荧光标记。优选地，将探针固定在适合形成阵列(已知有若干名称，包括DNA微阵列、基因芯片、生物芯片、DNA芯片和基因阵列)的基片上，其与本领域已知的那些相当。可按照常规方法来制备多肽探针，所述方法例如采用为本发明多核苷酸提供的核苷酸序列数据和本领域已知的方法。所述方法包括但不限于直接从细胞中分离多肽，分离或合成编码所述多肽的DNA或RNA并使用DNA或RNA产生重组产物，从单个氨基酸经化学方法合成多肽，以及通过现有多肽的化学裂解而产生多肽片段。另一方面，本发明提供适用于检测与正常动物相比在异常动物中差异表达的多个基因的表达的装置。所述装置包括基片，所述基片在已知位置上固定有本发明的多个肽或多肽探针。所述装置基本上是本文所述的肽或多肽探针的固定化形式。所述装置可用于快速而特异性检测蛋白质及其表达模式。通常，将所述探针连接到基片上，再将含有一种或多种蛋白质的样品暴露给所述探针，使样品蛋白质可与探针杂交。在某些实施方案中，所述探针、样品蛋白质或这两者都带有标记并且通常可用技术人员已知的荧光团或其它试剂来检测。通常，用于阅读多核苷酸微阵列的同样的方法和仪器可用于蛋白质阵列。优选地，将探针固定在适合形成阵列的基片上。样品中蛋白质含量或浓度的测定方法是技术人员已知的。所述方法包括放射性免疫测定、竞争性结合测定、蛋白质印迹分析和ELISA测定。对于使用抗体的方法而言，多克隆抗体和单克隆抗体都是合适的。所述抗体可以是对蛋白质、蛋白质表位或蛋白质片段具有免疫特异性。
本发明的某些实施方案使用抗体用于检测和定量检测由本发明多核苷酸表达而产生的蛋白质。尽管可通过免疫沉淀、亲和分离、蛋白质印迹分析、蛋白质阵列等来检测蛋白质，但优选的方法利用ELISA技术，其中将抗体固定在固体支持物上，并将靶蛋白或肽暴露给固定的抗体。探针或靶标或这两者都可用已知方法来标记。在某些实施方案中，用探针阵列来观察与正常动物相比在异常动物中差异表达的多个基因的表达模式或表达谱，用于测定多核苷酸或多肽。在一个实施方案中，可使用寡核苷酸或多核苷酸探针阵列，而另一个实施方案可使用能与差异表达的本发明的基因产物特异性结合的抗体或其它蛋白质阵列。所述阵列可以是市售的或者它们可以是采用技术人员已知的方法常规制备的，所述方法例如在固体支持物上原位合成或通过显微印刷 (micro-printing)技术将预先合成的探针连接在固体支持物上。在不同的实施方案中，多核苷酸或多肽探针阵列是常规制备的，以专一性检测由差异表达的本发明基因所产生的转录物或蛋白质。在一个实施方案中，多核苷酸或多肽探针阵列是常规制备的，以专一性检测由表2 和/或表3中所鉴定的两个或更多个多核苷酸或基因所产生的转录物或蛋白质。这些探针经设计用于检测与动物的脂质和葡萄糖代谢途径相关的基因。在另一个实施方案中，多核苷酸或多肽探针阵列是常规制备的，以专一性检测由表3中所鉴定的两个或更多个多核苷酸或基因所产生的转录物或蛋白质。这些探针经设计用于检测与正常动物相比为异常动物所特有的基因。又一方面，本发明提供在样品中检测与正常动物相比在异常动物中差异表达的一个或多个基因的差异表达的方法。所述方法包括(a)将包含与正常动物相比在异常动物中差异表达的多个多核苷酸探针的组合与样品中的多核苷酸杂交，形成一种或多种杂交复合物；(b)任选，将包含与正常动物相比在异常动物中差异表达的多个多核苷酸探针的组合与标准品中的多核苷酸杂交，以形成一种或多种杂交复合物；(c)检测来自样品和任选来自步骤(b)的标准的杂交复合物；和(d)将来自样品的杂交复合物与来自标准的杂交复合物进行比较，其中标准与样品之间杂交复合物的量的差异就表明在样品中与正常动物相比在异常动物中差异表达的基因的差异表达。步骤(b)和部分步骤(C)是任选的并可使用，如果进行两个或更多个试验系统的相对同时的比较。然而，在一个优选的实施方案中，用于比较的标准是基于在先前用所述方法而获取的数据。将这些探针暴露给样品，以形成杂交复合物，其可检测并与标准的杂交复合物进行比较。来自样品和标准的杂交复合物之间的差异就表明多核苷酸的差异表达，并因此表明在样品中与正常动物相比基因在异常动物中差异表达。在一个优选的实施方案中，制备探针，以特异性检测由本发明所鉴定的一个或多个基因或基因片段所产生的多核苷酸或其片段。检测杂交复合物的方法是技术人员已知的。在一个实施方案中，所述方法还包括在杂交之前将动物或样品暴露给试验物。然后，比较表明所述试验物是否改变了样品中与正常动物相比在异常动物中差异表达的基因 (尤其是异常相关基因)的表达。另一方面，本发明提供在样品中检测与正常动物相比在异常动物中差异表达的基因的差异表达的方法。所述方法包括(a)在允许探针和蛋白质之间发生特异性结合的条件下，使包含多个多肽探针的组合与样品中的蛋白质反应，其中与探针结合的蛋白质与正常动物相比在异常动物中差异表达；(b)任选，在允许探针和蛋白质之间发生特异性结合的条件下，使包含多个多肽探针的组合与标准中的蛋白质反应，其中与探针结合的蛋白质与正常动物相比在异常动物中差异表达；(C)检测样品和任选来自步骤(b)的标准中的特异性结合；和(d)将样品中的特异性结合与标准中的特异性结合进行比较，其中标准与样品的特异性结合之间的差异就表明在样品中与正常动物相比在异常动物中差异表达的基因的差异表达。将这些探针暴露给样品，以形成特异性结合，其可检测并与标准进行比较。来自样品和标准的特异性结合之间的差异就表明蛋白质的差异表达，并因此表明在样品中与正常动物相比基因(尤其是异常相关基因)在异常动物中差异表达。在一个优选的实施方案中， 制备探针，以特异性检测由本发明鉴定的一个或多个基因或基因片段所产生的蛋白质或其片段。在一个实施方案中，所述方法还包括在将多肽与蛋白质反应之前将动物或样品暴露给试验物。然后，比较表明所述试验物是否改变了样品中与正常动物相比在异常动物中差异表达的基因(尤其是异常相关基因)的表达。另一方面，在样品中检测与正常动物相比在异常动物中差异表达的基因表达的方法用于监测动物进程，当在响应软骨组织调节程序时试图调节动物的例如关节炎组织的量。在调节程序期间，按照间隔、优选设定间隔，进行所述方法并且通过比较在调节程序期间的两个或更多个点的方法结果来监测动物进程。由比较产生的、与正常动物相比在异常动物中差异表达的一个或多个基因(尤其是异常相关基因)的表达的改变，或基因表达模式的改变，或缺少任何改变，都表明调节程序的有效性。试验物可以是对与正常动物相比在异常动物中差异表达的多核苷酸或基因(尤其是异常相关基因)具有作用的任何物质。试验物包括但不限于氨基酸；蛋白质、肽、多肽、核酸、寡核苷酸、多核苷酸、小分子、大分子、维生素、矿物质、单糖；复杂糖；多糖；碳水化合物；中链甘油三酯(MCT)；甘油三酯(TAG) ；η-3(ω-3)脂肪酸，包括DHA、EPA、ALA ； η-6(ω-6)脂肪酸，包括LA、Y -亚麻酸(GLA)和ARA ;SA、共轭亚油酸(CLA)；胆碱来源，例如卵磷脂；脂溶性维生素，包括维生素A及其前体例如类胡萝卜素(例如β-胡萝卜素)、维生素D来源例如维生素D2 (麦角骨化醇)和维生素D3 (胆钙化醇)、维生素E来源例如生育酚(例如α -生育酚)和生育三烯酚，以及维生素K来源例如维生素Kl (叶绿醌)和维生素Κ2(甲萘醌)；水溶性维生素，包括B族维生素例如核黄素、烟酸(包括烟酰胺和烟酸)、 吡哆醇、泛酸、叶酸、生物素和钴胺素；和维生素C(抗坏血酸)；抗氧化剂，包括某些上述维生素，尤其是维生素E和维生素C ；还有生物类黄酮例如儿茶素、槲皮素和茶黄素；醌类例如泛醌；类胡萝卜素例如番茄红素和番茄黄素；白藜芦醇；和α -硫辛酸；L-肉毒碱；D-柠檬烯；葡糖胺；S-腺苷甲硫氨酸；和脱乙酰壳多糖。在一个优选的实施方案中，试验物质是可加入到食物中或作为补充剂而消耗的营养物。实例包括但不限于脂肪酸例如ω-3脂肪酸 (例如DHA和EPA)和ω -6脂肪酸(例如ARA)、肉毒碱、甲硫氨酸、维生素C、维生素E和维生素D。在优选的实施方案中，可以使用于2005年3月2日提交的同时待审的美国临时专利申请号60/657980和要求其优先权的任何后续美国或美国之外的专利申请中公开的方法，来鉴定用于影响与正常动物相比在异常动物中差异表达的基因(尤其是异常相关基因)的表达的物质。用于比较的正常动物的表达谱可得自一个或多个正常动物，所述动物同时具有来自正常动物表达谱数据库测定的动物的表达谱。优选地，随时间积累的正常动物表达谱数据库可用作参考。可通过用技术人员已知的方法(其中的一些在本文中描述)测定多核苷酸或多肽，来进行多核苷酸或多肽是否是差异表达的测定。另一方面，本发明提供适用于操纵动物基因组的组合物。所述组合物包含能干扰与正常动物相比在异常动物中差异表达的一个或多个基因(尤其是异常相关基因)的表达的一种或多种物质。在另一个实施方案中，本发明包括能调节与正常动物相比在患有异常肌骨骼关节障碍的动物中差异表达的一个或多个基因(尤其是异常肌骨骼关节障碍相关基因)的表达的方法。在优选的实施方案中，所述组合物包含以每天每千克体重的毫克数(mg/kg/天) 计的以下物质DHA含量为约1至约30，优选约3至约15 ；EPA含量为约1至约30，优选约 3至约15 ；EPA/DHA Combo (比例为1. 5 1)含量为约V2至约30/45，优选约9/6至约 18/12 ；ALA含量为约10至约100，优选约30至约60 ；LA含量为约30至约600，优选约60 至约300 ；ARA含量为约5至约50，优选约15至约30 ； SA含量为约3至约60，优选约6至约 30 ；和CLA(作为对照)含量为约6至约120，优选约12至约60。可以按照适于所述组合物的任何方式或形式将所述组合物给予动物。优选将所述组合物以食物组合物或补充剂的形式经口服给予动物。所述食物组合物可以是任何形式，例如本领域已知的营养平衡的食物组合物例如用于动物(尤其是伴侣动物，例如猫科动物和犬科动物)的干燥食物、半干食物和湿食物。补充剂包括例如片剂、胶囊剂和类似形式的剂型。又一方面，将所述组合物与一种或多种药物或能调节动物软骨组织量的其它物质联合给予。另一方面，本发明提供适于调节与正常动物相比在患有异常肌骨骼关节障碍的动物中差异表达的一个或多个基因(尤其是异常肌骨骼关节障碍相关基因)的表达的组合物，或适于调节动物软骨组织量的组合物。所述组合物包含基因表达或组织调节量的DHA、 EPA、EPA和DHA、ALA、LA、ARA和SA中的一种或多种。在不同实施方案中，所述组合物包含以mg/kg/天计的以下物质足以给予动物的DHA含量为约1至约30 ；足以给予动物的EPA 含量为约1至约30 ；足以给予动物的EPA/DHA Combo (比例为1. 5 1)含量为约V2至约 30/45 ；足以给予动物的ALA含量为约10至约100 ；足以给予动物的LA含量为约30至约 600 ；足以给予动物的ARA含量为约5至约50 ；足以给予动物的SA含量为约3至约60 ；和足以给予动物的CLA (作为对照)含量为约6至约120。所述物质可用于在动物中调节软骨组织的量。优选地，所述物质影响多个所述基因的表达。在一个实施方案中，所述组合物还包含一种或多种药物或能调节动物软骨组织量的其它物质。又一方面，本发明提供适于在测试系统中测定与正常动物相比在患有异常肌骨骼关节障碍的动物中差异表达的一个或多个基因(尤其是异常肌骨骼关节障碍相关基因)的差异表达的试剂盒。实施例1 测定多种物质或成分对犬细胞系中基因表达的作用Affymetrix犬基因芯片犬基因组-1和犬基因组_2用于测定例如以下多种试验物或成分对4种犬细胞系和合适对照的基因表达的作用MCT ；TAG ；ALA ；EPA ；DHA ；亚油酸； 硬脂酸(SA)、共轭亚油酸(CLA)、GLA ；花生四烯酸；卵磷脂；维生素A、维生素D、维生素E、维生素K、核黄素、烟酸、吡哆醇、泛酸、叶酸、生物素、维生素C、儿茶素、槲皮素、茶黄素；泛醌； 番茄红素、番茄黄素；白藜芦醇；α -硫辛酸；L-肉毒碱；D-柠檬烯；葡糖胺；S-腺苷甲硫氨酸；脱乙酰壳多糖，多种材料含有一种或多种这些化合物及其不同组合。按照表1所示的所选样品成分的说明，对每种成分测试两个浓度。两个浓度中更高的溶剂用作对照。使用 4种犬细胞系CCL34(肾)、CRL 1430(胸腺)、CCL 183 (骨)(得自美国组织培养物保藏中心)和 CTAC(甲状腺)(参见 Measurement of NK Activity in Effector CellsPurified from Canine Peripheral Lymphocytes (在从犬外周淋巴细胞纯化的效应细胞中测定NK活性)，Veterinary Immunology andlmmunopathology，35 (1993) 239-251)。用特定浓度的成分处理的细胞系称为“处理”，未处理样品称为“对照”。术语“基因”和“探针”在该方法中用作同义词。对于处理细胞系和对照，使用随Affymetrix芯片一起提供的说明书，测定基因表达。各独特探针识别号的详细序列信息可得自制造商。对于任何指定处理，测定基因表达数据，看它是“上调”还是“下调”。对于基因是否是“上调”还是“下调”的判定是根据倍数变化，对于每个单独探针，这是按处理强度/对照强度而计算出。如果其值< 1/1.5(对于跨越所有4种细胞系的分析)或< 1/2(对于细胞系内分析)，就认为倍数变化下调，而如果它> 1.5(对于跨越所有4种细胞系的分析)或 >2(对于细胞系内分析)，就认为倍数变化上调。同样，如果仅在所比较的一个条件(处理或对照)中存在，而在其它条件中“不存在”或“处于边缘(marginal)”并且按照所用软件而言其倍数变化是显著的，就认为探针对进一步研究是有意义的。将在两次处理中表现出相反方向调节的探针排除在进一步分析之外。用GeneSpring 7. 0 版(GS)软件(Agilent Corporation)分析原始数据并用 R-Bioconductor(RB)免费软件证实。这两个软件包都用于从由Affymetrix仪器所产生的 CEL文件计算探针强度。分别使用R-Bioconductor和GeneSpring软件，计算每个探针的存在/不存在/边缘信号(calls)和P-值。有两种方案用于数据分析。第一；“跨越细胞系”和“单个细胞系内”。在第一方案中，选择基因进行打分，只要发现它们是显著的并共同跨越所有细胞系。“跨越细胞系”得到具有最小噪声的最高置信度数据并可提供可能达到最好的线索，因为基因受到单个成分的影响。在第二方案中，按照这两个软件包，在单个细胞系内仅有在两次处理中表现出显著倍数变化的那些基因才被打分。得自这些实验的数据样品见表2。表2显示处理物(第1 栏)、探针(数据链路(data link))(第2栏)、方向(第3栏)、最佳BLAST注释(统计学测定)(第4栏)和人类检索号(第5栏)之间的关系。所有所测成分的信息都存储在数据库中供参考用。根据犬的生理条件(诊断为异常)和来自表1-2信息的比较，也就是说，记录受到试验物或成分的影响并与正常犬相比在异常犬中差异表达的基因，用于选择和制备异常犬的食物组合物的营养配方据信将含有以下量的一种或多种以下成分(以每天每千克体重的毫克数(mg/kg/天)计的体内量是根据体外用量外推而来)，例如DHA-约1至约30 ； EPA-约 1 至约 30 ；EPA/DHA Combo (比例为 1.5 1)-约 4/2 至约 30/45 ；ALA-约 10 至约 100 ；LA-约30至约600 ；ARA-约5至约50 ；和SA-约3至约60。根据这些数据，可以制备含有一种或多种这些成分的食物组合物和相关膳食并用于调节与正常动物相比在异常动物中差异表达的基因。所述调节将会导致对动物的异常肌骨骼关节障碍的调节，并且，因此， 在一个实施方案中，可促进向想要的或正常状态转变并促进动物更好的健康和良好状态。实施例2 =RNA分离方法材料和方法。以下通用方法可用于从狗和猫组织样品中分离RNA，用于利用本说明书的实施例中进一步描述的基因芯片进行基因表达谱分析。本领域技术人员显而易见的是这些方法或本领域内公知的其改进方法可用于从组织或体液样品中分离RNA，用于使用本领域普通技术人员可用的各种分析方法、尤其是微阵列技术，进行进一步的基因表达分析。 从组织中分离核糖核酸(RNA)可采集组织样品，在液氮中冷冻，融化并勻浆，再使用TRIzol RNA提取方法来处理，得到良好质量的RNA，然后用于进一步基因组分析。材料冰、液氮、冷冻犬或猫组织、TRIzol 裂解试剂、氯仿最少99%、异丙醇、 70%乙醇(用无水乙醇和无RNA酶的去离子水制备)、RNase Zap 、去离子水、RNA贮存液 ，来自 Ambion。设备Ultra-Turrax T25 Power 勻菜器、Beckman CoulterAllegra 25R 离心机、 Eppendorf离心机、镊子、解剖刀、硬质切割用表面即切割砧板、1. 5mL无DNA酶和RNA酶的无菌微量离心管、50mL无DNA酶和RNA酶/无菌一次性聚丙烯管，P1000.P200.P20,PlO和 P2 Rainin Pipetman移液管，用于P1000、P200、P20、P10和P2移液管的过滤移液管头(无 DNA酶和RNA酶/无菌)和无棉抹布(lintfree wipe)。制备用4mLTRIzol 制备50mL聚丙烯管(每个选择用于RNA分离的组织一管)。组织勻浆将3-4铲液氮装入能装液氮的容器内。立即向上述容器中放入一片冷冻组织(该组织的大小应大致为豌豆大)并将该组织放入适当标记的50mL聚丙烯管(其中已经装有4mL TRIzol )中。用Ultra-Turrax T25 Power勻浆器立即开始勻浆。以最高设置(6)勻浆10-15秒钟。在冰上将样品再冷却10-15秒钟，然后重复。直到组织被充分勻浆，溶液呈浑浊状。完成勻浆后，盖好该50mL管并放回冰中。将勻浆组织在室温下孵育5分钟，然后进行分离步骤。实施例3:RNA制备方法RNA分离通常按照与TRIzol 试剂一起提供的hvitrogen说明书中给出的方法。将均质样品分为装在4个1.5mL微量离心管中的4个ImL等份试样。将200 μ L氯仿加入到每个ImL等份试样中。盖上各管，涡旋振荡15秒钟，然后上下摇勻。结果应当是粉红色乳浊液。将各管在室温下孵育2-3分钟。将各管以14，OOOrpm在4°C离心15分钟。将水相 (上层)移入无菌的1. 5mL微量离心管。应移入新管的水相体积通常为约500 μ L。确信未移入任何中间相或下相。通过将500 μ L异丙醇加入到含水层的各微量离心管，从溶液中沉淀RNA。上下摇勻各管至少20秒钟。在室温下将样品孵育10分钟。将样品在14，OOOrpm 在4°C离心10分钟。通过吸出液体小心除去上清液，确保没有损失沉淀。加入ImL 70%乙醇，洗涤沉淀。轻弹离心管，移动沉淀(或在工作台上轻敲管子)并振摇混合。在8，200rpm 在4°C离心5分钟。通过吸出液体小心除去上清液，确保没有损失沉淀。用无棉抹布小心吸去过量乙醇，以确保沉淀干燥。将各沉淀重悬于30 μ LRNA贮存液。通过吹吸而轻轻混合， 直到RNA回到溶液中并贮存于-80°C。可能需要以低速涡旋振荡样品几秒钟，以促进RNA重悬浮。如果有必要，用微量离心机离心样品，然后冷冻。RNA清洗按照RNeasy 袖珍型手册中给出的方法。用RNeasy袖珍型试剂盒，从在OptiCell室中培养的细胞中分离RNA。由哺乳动物细胞系培养而来的细胞用于分离高质量的RNA，其再用于以后的下游基因组分析。涉及细胞培养的所有工作都在严格无菌条件下进行。试剂10X PBS、去离子水、无水乙醇、RNA贮存液、β -巯基乙醇、RNase Zap 、缓
冲液RLT、以及缓冲液RWl和缓冲液RPE (在RNeasy袖珍型试剂盒内提供)。设备/材料RNeasy袖珍型试剂盒、QIAshredder离心柱、OptiCell刀、20mL无菌注射器、OptiCell tips、细胞刮刀、PlOOOPipetman 移液管(Rainin)、P200 Pipetman 移液管(Rainin)、100-100 μ L过滤移液管头、1_200 μ L过滤移液管头、无菌转移移液管、55mL无菌溶液池、1. 5mL无菌微量离心管和Eppendorf微量离心机。溶液缓冲液RLT(在RNeasy袖珍型试剂盒内提供贮液)；-在开始方案之前，在每 IOmL缓冲液RLT中加入100 μ L β -巯基乙醇。70%乙醇将35mL无水乙醇加入到15mL无 RNA酶的去离子水中，制备50mL 70%乙醇。IX PBS:无RNA酶的水。用0. 22um滤器过滤溶液。方法从OptiCell室中取出细胞(一次处理一个OptiCell)。在显微镜下检查细胞，确保细胞是活的，然后分离RNA。移出并弃去细胞培养基。用OptiCell刀，将下膜上暴露给细胞的上膜切掉。用IXPBS 3次洗涤吸附细胞的膜。将600 μ L缓冲液RLT溶液(含 β-巯基乙醇)移至吸附细胞的膜的中心。用细胞刮刀，将缓冲液RLT轻柔涂布到整个膜表面上，然后将液体收集到一个角落。吸取全部体积的缓冲液RLT并放入QIAshredder离心柱。RNA分离将QIAshredder离心柱在14，OOOrpm离心2分钟。弃去离心柱，但保留收集管及其内容物。将600yL 70%乙醇加入到收集管中，通过吹吸而充分混合(此时的总体积=1. 2mL)。将600 μ L细胞裂解物移入foieasy小柱并在14，OOOrpm离心15秒钟。 弃去流通，但保留收集管和离心柱。将剩余体积的细胞裂解物( 600 μ L)移至离心柱并重复离心。弃去流通，但保留收集管和离心柱。将700 μ L缓冲液RWl加入到离心柱。在 14，OOOrpm离心15秒钟以洗涤离心柱。弃去流通和收集管。将离心柱移至新的2mL收集管并将500 μ L缓冲液RPE加入到离心柱。在14，OOOrpm离心15秒钟。弃去流通，保留收集管/离心柱。再加入另一份500 μ L缓冲液RPE到离心柱中。在14，OOOrpm离心2分钟。 将离心柱移至1. 5mL收集管。将30 μ L RNA贮存液直接加入到硅胶膜并在14，OOOrpm离心 1分钟，以洗脱RNA。将最终RNA贮存于-70°C。RNA 6000 Nano测定使用Agilent 2100生物分析仪和RNA 6000Nano测定，分析分离自培养哺乳动物细胞、淋巴细胞或组织的RNA的质量。试剂RNA6000Nano 凝胶基质、RNA 6000Nano 染料浓缩物、RNA 6000Nano 标记 (以上所有试剂都包括在Agilent公司的RNA 6000Nano Assay试剂盒内)、RNA 6000梯、 RNase Zap和无RNA酶的水，来自Ambion。设备/ 其它材料Agilent Chip Priming Station, Agilent, RNA 6000 芯片， Agilent,电极清洗剂，P2、ΡΙΟ、P200 和 Ρ1000 RaininPipetman 移液管(无菌)、无 DNA 酶 /RNA酶的过滤移液管头、1.5mL微量离心管(无菌，涡旋)、IKA涡旋混合器、微量离心机和
25加热块。方法方法在Agilent Technologies公司的试剂盒指南(RNA 6000 Nano测定， 2003年11月出版)中给出。按照指南给出的方法进行，并采用以下修改制备凝胶，第17 页-而不是将过滤凝胶分为各65 μ L的等份试样，将贮液过滤凝胶保存在原始微量离心管中并如必要的话等分65 μ L。加载RNA 6000 Nano标记，第22页-将1 μ L无RNA酶的水 (代替RNA 6000 Nano标记)加入到将不含样品的各样品孔。这不仅将保留所用的标记量， 而且也可用作阴性对照，以检查试剂都未受污染，包括无RNA酶的水。加载梯(Ladder)和样品，第23页-在71°C加热变性样品和RNA 6000梯达额外的30秒钟(总共2. 5分钟)。 开始芯片运行，第沈页-从测定菜单中选择“Eukaryote Total RNANano”选项。实施例4 Affymetrix基因芯片表达分析使用Affymetrix犬1和犬2 GeneChip 来分析基因表达。市售阵列可得自 Affymetrix公司，Santa Clara, CA 95051。将总RNA逆转录为cDNA。该cDNA用于产生打断的并用作基因芯片杂交探针的cRNA。洗涤基因芯片并用Affymetrix激光扫描仪测定杂交信号。杂交数据再经证实和归一化后，用于进一步分析。材料=Affymetrix提供大部分试剂和试剂盒。Affymetrix手册中列出的、但在试剂盒内未提供的其它试剂可分别获取(详见GeneChip Expression Analysis Technical Manual (基因芯片表达分析技术手册)(701021Rev. 4))，RNase Zap 和去离子水。设备Eppendorf微量离心机、1. 5mL无DNA酶和RNA酶/无菌微量离心管、50mL 无 DNA 酶和 RNA 酶 / 无菌一次性聚丙烯管、P1000、P200、P20、PlO 和 P2 Rainin Pipetman 移液管、用于P1000、P200、P20、P10和P2移液管的过滤移液管头(无DNA酶和RNA酶/无菌)和珀耳帖热循环器PTC-200。方法以下所有方法都完全按照GeneChip ExpressionAnalysis Technical Manual (基因芯片表达分析技术手册)(Affymetrix版权所有1999-2003)所述来进行。使用5微克总RNA进行第一链cDNA合成。使用珀耳帖热循环器PTC-200或加热块进行反应和探针变性的温度控制。使用RNA NanoDrop芯片和BioAnalyer 2100进行总量控制。使用100 Format (Midi阵列)，用于犬基因芯片。实施例5 在猫中的测定方法在本文所提供的研究中，用PAXgene RNA管从猫中获取全血，按照以下详述的方法，用PAXgene RNA分离试剂盒从全血样品中分离总RNA。PAXgene 血 RNA 分离如下所述，PAXgene 血 RNA 管和 PAXgene 血 RNA 试剂盒Oliagen) —起用于从来自猫的全血中分离和纯化胞内RNA(另见PAXgene Blood RNA Kit他11(113001^，1^64皿17^1，2005年6月)。简而言之，用Vacutainer 针将血直接采集到 PAXgene 血RNA管，然后进行几轮离心，洗涤和纯化步骤，最终得到高质量的RNA。该RNA 再经过质量控制步骤，然后用于将来的定量实时PCR和/或微阵列分析，使用在Affymetrix 平台上生产的按常规制备的专有的猫基因芯片。测定准备在开始测定之前，将PAXgene 管(装有血液)在室温下孵育至少2小时。如果这些管是冷冻的，并且不允许在冷冻之前孵育2小时，则它们就需要在室温下多放置2小时至融化。在第一次离心之前，将各PAXgene 管上下颠倒8-10次。如果初次使用缓冲液BR4 (缓冲液包括在PAXgene 血RNA试剂盒内)，将4倍体积的96-100 %乙醇加入到浓缩缓冲液中，得到工作液。在开始测定之前预热两个加热块至65°C和55°C。制备DNA 酶I贮液(无RNA酶的DNA酶组包括在PAXgene 血RNA试剂盒内)。将固体DNA酶I酶熔于随试剂盒一起提供的550 μ L无RNA酶的水中。确保在揭开盖时，没有损失任何DNA酶 I。颠倒管子而轻轻混合。不要涡旋或离心。制备DNA酶I酶和缓冲液RDD(试剂盒成分) 的混合物(对待处理的每批样品数而言具有足够体积)。各样品需要70 μ L缓冲液RDD和 10 μ LDNA酶I (即20份样品应需要1. 4mL缓冲液RDD和200 μ L DNA酶I混合物)。混合物应当贮存于2-8°C直到需要时。重配的酶在2-8°C可存放至多6周。样品贮存在处理之前，PAXgene 管(其中装有血液)可在室温下贮存至多3天。 按照随PAXgene 血RNA管一起提供的产品说明书，细胞RNA特性在这些条件下至多稳定3 天。然而，这可因种类不同而异。PAXgene 管也可于4°C贮存至多5天。如果需要长期贮存，可将PAXgene 管于_20°C或_70°C贮存至多6个月。各管应当在宽松的试管架中以直立位冷冻。如果各管要贮存于_70°C的话，推荐先在-20°C冷冻，然后移至-70°C。一旦将各管从冷冻器中移出，应当让它们在室温(温度不超过22°C )下融化。在进行测定之前，将各管上下颠倒10次。从全血中分离RNA 将PAXgene 血RNA管在4000xg离心10分钟。倾析上清液并弃去。吸干残留在PAXgene 管边缘的剩余上清液。将4mL无RNA酶的水加入到沉淀中，盖上新的Hemogard盖。通过涡旋振荡而重悬沉淀物，然后在4000xg离心10分钟。倾析上清液并弃去。吸干残留在PAXgene 管边缘的剩余上清液。将360 μ L缓冲液BRl (试剂盒成分)加入到沉淀中，轻柔吹吸直至沉淀物完全重悬。将样品移入无菌1.5mL微量离心管并加入300 μ L缓冲液BR2 (试剂盒成分)和40 μ L蛋白酶K (在加入样品之前先不要混合缓冲液BR2和蛋白酶K)。通过涡旋振荡而充分混合各管并放入预热至55°C的热混合器。在 1400rpm孵育/摇动各管达10分钟。将裂解物移液至放入2mL收集管中的QIAshredder离心柱。在14，OOOrpm离心3分钟。将流通部分的上清液移入无菌1. 5mL微量离心管中。加入350yL 96-100%乙醇并通过吹吸而轻轻混合。将700 μ L样品加入到放入2mL收集管中的PAXgene 离心柱并在14，OOOrpm离心1分钟。将PAXgene 离心柱移入新的2mL收集管并弃去流通和老收集管。将剩余体积的样品加入到PAXgene 离心柱。在14，OOOrpm离心 1分钟。从上述离心柱离心中弃去老收集管和流通。将PAXgene 离心柱放入新的2mL收集管。将350 μ L缓冲液BR3 (试剂盒成分)加入到PAXgene 离心柱并在14，OOOrpm离心 1分钟。弃去流通和收集管。将离心柱放入新的2mL收集管并将80 μ L DNA酶I/缓冲液 RDD混合物(参见“测定准备”)直接加入到离心柱膜并在室温下孵育15分钟。将另一份 350 μ L缓冲液BR3加入至Ij PAXgene 离心柱。在14，OOOrpm离心1分钟。将PAXgene 离心柱移入新的2mL收集管并弃去老收集管和流通。将500 μ L缓冲液BR4(试剂盒成分)加入到PAXgene 离心柱。在14，OOOrpm离心 1分钟。将PAXgene 离心柱放入新的2mL收集管并弃去老收集管和流通。将另一份500yL 缓冲液BR4加入到PAXgene 离心柱。在14，OOOrpm离心3分钟以干燥离心柱膜。弃去收集管和流通并将离心柱放入另一 2mL收集管。将样品在14，OOOrpm再离心1分钟，进一步干燥离心柱膜。弃去流通和收集管。将PAXgene 离心柱移入1.5mL洗脱管。将40 μ L缓冲液BR5 (试剂盒成分)直接加入到PAXgene 离心柱膜。在14，OOOrpm离心1分钟。取出 PAXgene 离心柱并将洗脱液移液至1. 5mL管中的同一 PAXgene 离心柱上。将PAXgene 离心柱放回同一 1. 5mL洗脱管并在14，OOOrpm离心1分钟。将最终洗脱液在65°C孵育5分钟并且立即在冰上冷藏。将最终RNA样品贮存于-80°C，用于以后使用。实施例6:与对照猫相比在患有骨关节炎的猫中的基因表达按照实施例5，使用未患关节炎的猫和患有骨关节炎的猫进行研究，以确定未患关节炎的猫与患有骨关节炎的猫之间潜在的基因表达差异。在初次研究中，在这两组猫之间进行基线比较，以确定未患关节炎的猫与患有骨关节炎的猫之间潜在的基因表达差异。在本说明书实施例中一般性描述的方法可用于制备组织样品和体液样品。对于本文所提供的研究，按照先前已公布的方法对患有骨关节炎的猫进行分级， 即所有未患关节炎的猫为“0级”，表示关节表现正常，患有骨关节炎的猫的级别可为1级 (存在小骨刺或小骨赘)或2级(更明显的骨刺和骨赘)。患有严重骨关节炎(3级)的猫不包括在本研究中。使用一种专有的常规制备猫基因芯片(Affymetrix)来评价患有和未患骨关节炎的猫(10只正常，10只患关节炎)的基线基因表达。如上所述，使用常规方法并按照制造商说明书进行基因芯片分析，以获取这两组之间的基线比较，测定未患关节炎的猫与患有骨关节炎的猫之间潜在的基因表达差异。^ M Robust Multiarray Average (RMA) β — U 胃夕去(Irizarry 等’ Biostatistics 2003第4卷，第249-264页)使原始基因芯片数据标准化，然后使用 Support Vector Machine (SVM)算法(PartekGenomic Suite，第 6版)对其进行统计分析， 以测定可以区分患有和未患关节炎的动物之间的基因表达差异。根据P值截止和倍数变化 (FC)，来选择鉴定OA生物标记的基因。在患有和未患关节炎的猫中测定基因表达谱，结果见图3和图15。发现在患有关节炎的猫中上调超过1倍的基因如下=IL-I β、TNF、HMGBl、p38、TLR2和TLR4。这些基因及其基因产物涉及炎性过程并且被认为是异常肌骨骼障碍、尤其是骨关节炎的标记。另外，发现以下基因在患有关节炎的猫中上调超过1倍C0L2A1、COLlAl、C0L3A1、C0L4A1和聚蛋白多糖。这些基因及其基因产物涉及软骨降解并且被认为是异常肌骨骼障碍、尤其是骨关节炎的标记。从按照实施例6进行的研究中得到的结果表明，基因表达可用于区分正常猫和患有骨关节炎的猫。在患有关节炎的猫中与炎症相关的差异表达的基因见图3和图15。因此， 鉴定的基因可作为猫的生物标记用于本文所述的本发明并且包括以下基因IL-li3、TNF、 HMGBl、p38、TLR2、TLR4、C0L2A1、COLlAl、C0L3A1、C0L4A1 和聚蛋白多糖。实施例7 患有关节炎的猫在给予猫食物组合物j/d之后的平均活动性。来自涉及实施例6所述的患有和未患关节炎的猫的营养研究的临床数据表明，食物干预可影响并增强患有关节炎的猫的运动性。与饲喂对照食物的猫相比，饲喂本发明猫食物组合物j/d的猫在活动性上表现出统计学显著性增加。临床研究结果见图16。根据观察数据，饲喂本发明食物组合物j/d的猫在运动上表现出超过30%的增加，表明通过给予本发明的试验食物，骨关节炎潜在症状有所改善。技术人员根据图16所示数据可以推断， 给予试验食物组合物j/d的结果就是猫具有更大运动性，更少疼痛和炎症。
实施例8 在给予组合物j/d之后狗的夜间活动性。在狗中进行了给予本发明犬食物组合物j/d的临床试验。与饲喂对照食物的狗和未接受药物处理的狗相比，对患有关节炎的狗饲喂食物组合物j/d后进行了夜间活动性观察并记录。用ACTTWATCH 装置进行测定。这些装置是基于活动变化记录的数据记录仪，其记录总运动活动性的数字化综合测量值。各装置采用活动变化记录原理，以提供睡眠方案变异性、睡眠数量和质量统计以及日间活动模式。所述装置采集动物动态环境相关的客观数据。该临床试验结果证明患有关节炎的狗的夜间活动性显著降低，因此证明饲喂食物组合物j/d的狗消除潜在关节炎症状包括关节僵硬和疼痛，而享受更大的安慰和舒适。 该临床试验的数据见图17。实施例9 狗在接受犬食物组合物j/d之后的蛋白质标记水平在患有和未患关节炎的狗中，得到与狗的软骨降解相关的两种蛋白质标记C2C和 C1，C2的基线水平。提取动物的血液样品并按照本说明书所述的常规方法进行测试。测试结果证明在患有关节炎的狗中这些标记的基因产物升高并可用作标记，以测定食物成分对基因表达的有效性。基线数据见图5和图6。临床数据得自对患有和未患关节炎的狗的营养研究。给本实施例中所述的试验狗饲喂本发明的食物，所述食物在图4中称为食物组合物j/d。对C2C和C1，C2关节炎标记水平和已知与异常肌骨骼关节障碍相关的另一种蛋白质标记(即胶原CTX-II)的水平进行评价。图10、图11和图12所示的数据代表在试验动物和对照动物的血液中所测的蛋白质标记水平。按照图4所示的饲喂犬食物组合物j/d的狗的血浆C2C、Cl，C2和CTX-II水平表现出统计学显著降低，如图10、图11和图12所示。技术人员将会知道，该生物标记数据支持如本实施例所证明的饲喂本发明食物组合物、尤其是食物组合物j/d的狗的临床观察结果，表现出潜在疾病过程(在本例中是骨关节炎)的临床症状的改善，其与软骨降解和局部关节炎性病症(包括骨关节炎)相关的某些基因的下调和某些基因产物表达的减少有关。实施例10 在患有和未患关节炎的犬中上调和下调的犬基因的基因芯片分析。按照本领域已知的标准临床诊断标准所测，使用市售犬基因芯片(Affymetrix基因芯片2)来评价患有和未患关节炎的两组狗的基线基因表达。使用常规方法并按照制造商的说明书来进行基因芯片分析。使用实施例1的通用表达谱分析方法和本说明书给出的其它实施例所概述的分析技术，进行基因表达谱分析，得到这两组之间的基线比较，测定患有和未患关节炎的狗之间潜在的基因表达差异。按照本领域普通技术人员已知的标准动物营养测试方法，给患有关节炎的狗和正常狗饲喂包含称为j/d的食物组合物的试验食物，然后用qRT-PCR分析动物中基因表达的变化。使用 Robust Multiarray Average (RMA) 归一化算法(Irizarry 等’ Biostatistics 2003第4卷，第M9464页)使原始基因芯片数据标准化，然后使用 Support Vector Machine (SVM)算法(PartekGenomic Suite，第 6版)对其进行统计分析， 以测定可以区分患有和未患关节炎的动物之间的基因表达差异。根据P值截止和倍数变化 (FC)，来选择鉴定关节炎生物标记的基因。使用 Robust Multiarray Average (RMA) 归一化算法(Irizarry 等’ Biostatistics 2003第4卷，第M9464页)使原始基因芯片数据标准化，然后使用Support Vector Machine (SVM)算法(PartekGenomic Suite，第 6 版)对其进行统计分析， 以测定可以区分患有和未患关节炎的动物之间的基因表达差异。根据P值截止和倍数变化 (FC)，来选择鉴定OA生物标记的基因。这些研究的结果表明基因表达可用于在正常狗和患有关节炎的狗之间进行区分。 在患有关节炎的狗中与炎症相关的差异表达的基因见图1、2、7和8。不限于本说明书给出的公开内容的概述，图1、2、7和8所示的基因可以作为本文所述的本发明的生物标记并且包括膜联蛋白Al、组织蛋白酶D、组织蛋白酶F、组织蛋白酶S、RELA、HMGB1 JL_15、1L_17受体、TLR4、C0L2AU COLlAUC0L4A1、MMP-13、TIMP-2、MMP-2、FLAP、PLA2、MAPK1、MAPK2。实施例11 在饲喂食物组合物j/d的食物的患有和未患关节炎的犬中上调和下调的犬基因的基因芯片分析使用市售犬基因芯片(Affymetrix基因芯片2)来评价患有和未患骨关节炎的两组狗的基因表达。对总共30只患有关节炎的狗和31只未患关节炎的狗进行研究。使用常规方法并按照制造商的说明书来进行基因芯片分析。使用实施例1的通用表达谱分析方法和本说明书给出的其它实施例所概述的分析技术，进行基因表达谱分析。按照本领域众所周知的临床诊断方法，确定第一组的30只测试动物患有关节炎。按照同样的临床诊断标准，认为第二组犬未患关节炎。按照本领域普通技术人员已知的标准动物营养测试方法，给患有关节炎的狗和正常狗饲喂包含称为j/d的食物组合物的试验食物，然后用qRT-PCR分析动物中基因表达的变化。按照本领域技术人员已知的标准动物营养测试方法，给患有关节炎的狗和正常狗饲喂称为j/d的试验食物，然后用qRT-PCR分析动物中基因表达的变化。对于qRT-PCR，使用Taqman探针技术，所有分析都用Applied Biosystems 7500实时PCR仪来进行。使用制造商提供的序列检测软件包1. 2. 2版来分析数据。使用按照实施例所述而制备的组织样品，使用市售犬基因芯片(Affymetrix基因芯片2)来评价患有或未患关节炎的狗的基因表达。使用Robust Multiarray Average (RMA) 归一化算法(Irizarry等，Biostatistics 2003第4卷，第M9-264页)使原始基因芯片数据标准化，然后使用 Support Vector Machine (SVM)算法(Partek Genomic Suite，第 6版) 对其进行统计分析，以测定可以区分患有和未患关节炎的动物之间的基因表达差异。根据 P值截止和倍数变化(FC)，来选择鉴定关节炎和炎症的生物标记的基因。本实施例的数据见表3。数据包括2383个记录，当使用倍数变化截止为1. l，p-值截止为0. 05和Q-值截止为0. 3时。使用这些分析标准，倍数变化大于1表明在采集自关节炎狗组的样品中探针被上调。表3所示的数据在第1栏中表示独特的Affymetrix探针识别号，随后分别是P-值、q_值、倍数变化、1/倍数变化的值、Top BLAST注释、匹配百分率、 人类检索号、top命中检索号、基因符号和基因描述。技术人员根据该数据，仅使用普通实验分析，就可推断以下信息倍数变化截止标准、上调或下调的目标基因以及通过BLAST注释对所述基因的鉴定、相关人类检索号和所述各鉴定基因的序列以及相应的基因产物和所述基因产物的序列，根据得自制造商的信息以及得自技术人员可容易得到的基因序列数据库的信息。另外，用于AfTymetrix阵列的独特探针的序列是来自制造商的公开来源中的公共可得的。同样，公开的序列信息和用于AfTymetrix芯片第1和2版的相应探针的鉴定是容易的并且可公开得自制造商以及探针组彼此之间的比较。根据这些数据，在制备和使用本发明的组合物和制造品的实践中以及在制备和使用本说明书所述的发明的方法的实践中， 技术人员可以鉴定和利用所述基因表达数据、经鉴定为异常调节的基因及其相应的基因产物。并不限制本说明书所公幵和要求保护的本发明的程度，可以鉴定与狗和猫的关节炎病症高度相关的某些目标基因和基因产物。可以推断，表3所提供数据给出的这些和其他基因和基因产物对狗和猫的潜在异常肌骨骼关节障碍、尤其是关节炎病症具有有益作用，当给这些动物饲喂可调节表3给出的目标基因的本发明组合物、尤其是称为j/d的食物组合物时。 表1 在犬细胞系中测试的成分
权利要求
1.一种包含以下成分的组合物a)至少一种ω-3脂肪酸，b)至少一种葡糖胺聚糖，c)至少一种氨基糖，d)至少一种抗氧化剂和e)肉毒碱或乙酰肉毒碱。
2.权利要求1的组合物，其中所述ω-3脂肪酸选自α-亚油酸(ALA)、二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)。
3.权利要求1的组合物，其中所述葡糖胺聚糖选自硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素和乙酰透明质酸。
4.权利要求1的组合物，其中所述氨基糖选自半乳糖胺、葡糖胺、唾液酸和N-乙酰葡糖胺。
5.权利要求1的组合物，其中所述抗氧化剂选自维生素C、生育酚、生育三烯酚、谷胱甘肽、硫辛酸、褪黑激素和胡萝卜素。
6.权利要求1-5中任一项的组合物，所述组合物还包含至少一种膳食矿物质。
7.权利要求6的组合物，其中所述膳食矿物质选自钙、氯化物、镁、磷、钾、钠、钴、铜、 氟、碘、铁、锰、钼、镍、硒、硫、锌和钒。
8.权利要求7的组合物，所述组合物还包含至少一种必需氨基酸。
9.一种在受试者中治疗异常关节病症的方法，所述方法包括给予有需要的受试者权利要求1的组合物。
10.权利要求9的方法，其中所述异常关节病症是骨关节炎、类风湿性关节炎和局部关节炎症。
11.一种在受试者中延迟异常关节病症发作的方法，所述方法包括给予有需要的受试者权利要求1的任何组合物。
12.权利要求11的方法，其中所述异常关节病症是骨关节炎、类风湿性关节炎和局部关节炎症。
13.一种在受试者中降低受试者罹患异常关节病症的危险的方法，所述方法包括给予有需要的受试者权利要求1的任何组合物。
14.权利要求13的方法，其中所述异常关节病症是骨关节炎、类风湿性关节炎和局部关节炎症。
15.一种在受试者中改变一个或多个基因表达的方法，所述方法包括给予所述受试者权利要求1的任何组合物；所述一个或多个基因选自膜联蛋白Al、组织蛋白酶D、组织蛋白 Bl F^liRSSSI S, RELA, HMGBU IL-I β、TNF α、TNF^、TLR—2、TLR—4、p38 MAPK、TIMP_1、 TIMP-2、MMP-1、MMP-2、MMP-13、IL—15 和 IL-17 受体。
全文摘要
本发明提供用于在受试者中治疗异常病症的组合物和方法，其中所述异常病症影响所述受试者的肌骨骼关节。
文档编号A61P19/02GK102159197SQ200980137455
公开日2011年8月17日 申请日期2009年7月20日 优先权日2008年7月18日
发明者N·Z·弗兰茨, R·M·杨卡, 穆拉尼 S·阿尔, 高向明 申请人:希尔氏宠物营养品公司