用于治疗骨关节炎的疫苗的制作方法

专利名称：：用于治疗骨关节炎的疫苗的制作方法用于治疗骨关节炎的疫苗本发明涉及用于治疗脊椎动物骨关节炎的疫苗，IL-Iβ和任选地TNF-α细胞因子生产该疫苗的用途和通过给予该疫苗来治疗脊椎动物的骨关节炎。骨关节炎(OA)是一种主要发生在老年人和动物中的非炎性变性关节病，其特征在于关节软骨的变性、边缘的骨质增生和滑膜的变化。尽管该疾病可能是由于多种起因引起的，但一般认为机械力和生化力是其出现和进展的主要原因。该疾病伴随疼痛和僵硬，特别是在长时间的活动之后。它是一种在人和动物，特别是狗和马中泛发的疾病，因而在人以及动物健康中是严重的问题。患有轻微OA的患者仅用缓解疼痛的药剂如醋氨酚就可以治疗。然而，给予了许多患者非类固醇抗炎药(NSAID)。这些NSAID不仅可缓解疼痛而且还具有潜在危险的副作用，包括诱发胃溃疡、对日照过敏、肾障碍、神经过敏和抑郁。用直接注射入关节中的皮质类固醇来治疗一些患者，以减缓OA的发展。然而，由于皮质类固醇的潜在危险的副作用，因此这不是优选的。在文献中，还提出了使用细胞因子拮抗剂通过原位治疗，即，在OA关节中来治疗0A，据认为细胞因子拮抗剂在介导增加的基质变性中起着作用，所述基质变性表征OA软骨损伤。例如，这可以从Pelletier(Arthritis&Rheumatism，Vol.40，No.6，1997年6月，pp.1012-1019)和Fernandes(Biorheology39，2002，237-246)中得知，这两篇文献描述了基于白细胞介素受体拮抗剂(IL-Ra)基因的关节内注射的基因治疗，这可以降低实验诱发的损伤的进展。然而，积极效果是非常短暂的，并且作为治疗的适用性也有待得到证实。此夕卜，针对细胞因子自身(特别是白细胞介素6)的单克隆抗体的原位给药从欧洲专利申请EP1715891(Warner-LambertCompany，2006年公开)中可以得知。这种治疗的缺陷在于所需的高剂量这使得该治疗固有地昂贵、局部(侵入性)给药和短暂效果。本发明的目的是提供用于骨关节炎的治疗，其没有或至少在较低程度上具有已知OA治疗的缺陷。这种意义上的治疗包括预防0A、提供临床病征缓解、减轻或治愈该疾病或在已经开始发展后抑制其进展的治疗。为此，已经研发了根据序言部分的疫苗，其含有IL-Iβ和任选的TNF-α细胞因子或其衍生物，并且所述IL-Iβ和任选的TNF-α或其衍生物与对于脊椎动物而言不是其自体的部分结合，使得疫苗在脊椎动物体内引发对抗IL-Iβ和TNF-α自体-分子的免疫应答。任选地，该疫苗含有用于携带与非自体部分结合的IL-Iβ和TNF-α细胞因子或其衍生物的介质。在这方面中，疫苗是适于应用于脊椎动物的构造，S卩，任何具有关节的活着的动物，如鱼、两栖动物、爬行动物、鸟类和哺乳动物，包括人(从现在开始，术语“动物”用于表示任何脊椎动物)。通常，疫苗包含一种或多种抗原，如减毒的或杀灭的微生物及其亚基，或任何其他物质，如生物体的代谢产物。将疫苗给予动物时，引发了对抗抗原的免疫应答，该应答有助于预防、缓解或治疗疾病或失调。通常，将抗原与用于携带抗原的介质结合，通常将所述介质称为“药物学上可接受的载体”。这样的载体可以是在生理上与脊椎动物相容的任何溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。这样的载体介质的一些实例是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、细菌培养流体、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其组合。提供了它们的液体、半固体和固体剂型，这取决于打算的给药方式。如所公知的，载体介质的存在对于疫苗的功效不是必需的，但其可以明显地简化抗原的剂量和给药。疫苗可以另外含有非特异性免疫刺激剂，通常称为佐剂。原则上，能够促进或增强免疫事件级联中的特定过程并最终导致更好的免疫应答(即，对抗原的综合身体应答，特别是由淋巴细胞介导的并通常涉及特定的抗体或之前敏化的淋巴细胞对抗原的识别)的每种物质可以被定义为佐剂。必需注意通常对于所述将要发生的特定过程，佐剂不是必需的，但其可促进或扩大所述过程。本发明的疫苗是基于IL-Iβ(白细胞介素1β)和TNF-α(肿瘤坏死因子α)细胞因子的使用。通常，细胞因子是由细胞群接触抗原时释放的非抗体蛋白，其在免疫应答的产生中作为细胞间的介质。白细胞介素-ιβ是白细胞介素类的亚组，白细胞介素是一类主要由巨噬细胞和T淋巴细胞分泌的并诱导淋巴细胞和造血干细胞的生长和分化的蛋白。其是有效的免疫调节剂，其介导各种免疫和炎性应答，包括B-和T-细胞的激活。TNF-α是最为公知的“肿瘤坏死因子”家族的成员，其中该家族表示在内毒素存在下由巨噬细胞产生的并且其中通过实验显示出能够攻击并破坏癌性肿瘤的蛋白。在本发明的情况下，疫苗含有IL-Ιβ和TNF-α或其衍生物，并与对于脊椎动物而言非自体的一部分结合。在这种情况下，非自体的意思是在治疗的动物中是免疫原性的，即，能够引发免疫应答。如通常所知的，通过结合另一种分子使用非自体部分，可以提供对抗这种其他分子的免疫应答，即使这种其他分子是该动物自体的。通过选择动物异源的IL-Iβ和TNF-α来简单地提供结合细胞因子的非自体部分(或多个部分)。在这方面中，异源意思是不是源自相同的物种(与同源相对)。在这种情况下，细胞因子在其分子结构中固有地含有对于治疗的动物为非自体的部分。例如，另一种可能是选择治疗动物同源的细胞因子，但是突变体，或通过重组技术来带有外源蛋白。例如，提供结合细胞因子或其衍生物的非自体部分的其他方式是在物理或化学上结合一个或多个对细胞因子而言的非自体分子、非自体结构、化合物或仅仅是任何非自体构造。在任何情况下，提供了免疫构建体，其中在细胞因子或其衍生物和非自体部分之间存在可操作的连接，使得构建体能够引发对抗自体细胞因子(即，IL-Ιβ和TNF-a)的免疫应答。如上所述，用于产生对抗自体蛋白(也称为自身蛋白)的疫苗的技术通常是已知的，从20世纪80年代中期开始，例如，通过自体蛋白与大的外源和免疫载体蛋白结合(US4,161，519)，或通过在自体蛋白和外源载体蛋白之间制备融合构建体(W086/07383)，乃至通过在自体蛋白中取代少至一个单个的外源T-辅助子表位(W095/05849)。在这些情况下，免疫原性的构建体的非自体部分负责提供用于T-辅助淋巴细胞的表位，这使得可能的自体耐受性得到破坏。注意关于本发明的IL-Ιβ和/或TNF-α的衍生物意思是比起始细胞因子更小或更大但仍然含有一个或多个该起始细胞因子同源部分的分子，这样的一个或多个部分构成这些细胞因子的抗原决定簇。这样的部分可以小至一个单个的表位。使用少至一个单个的表位具有非常独特的优势，实际上可以引发单克隆抗体来对抗自体IL-Iβ和TNF-α。这降低乃至完全防止了与其他细胞因子交叉反应的风险。这种原理同样是公知的，并且例如在W02005/084198、W003/084979和EP218531中有描述，其明确地公开了细胞因子的免疫原性肽(即，能够诱导免疫应答的肽)。注意在疫苗中，可以同时使用两种细胞因子的衍生物，但也可以一种细胞因子使用其天然形式，而另一种是其天然形式的衍生物。申请人:令人惊讶地发现了通过给予根据本发明的疫苗，可以成功地治疗骨关节炎。特别地，已经发现了在发生OA之前给动物接种疫苗时，当动物真正产生OA时显现出较少的临床病征。疾病的临床病征得到抑制，且没有任何严重的慢性副作用。鉴于这些积极结果，毫无疑问与预期的相反，适量引发的IL-Iβ和适用的TNF-α抗体达到OA关节。已知细胞因子拮抗剂当存在于OA关节中时可抑制OA进展(参见上述的Pelletier，Fernandes和Warner-LambertCompany)，用根据本发明的疫苗治疗的动物较少受到OA进展的影响。因为OA是一种渐进性的变性疾病，可以理解在开始发生OA后用根据本发明的疫苗治疗动物可以获得相应的结果。不希望受到理论的束缚，可以通过假设用根据本发明的疫苗接种没有导致动物体内自体细胞因子IL-Iβ和TNF-α的功能完全阻断但导致了关节中这些细胞因子的浓度降低到正常水平来解释出乎意料的不存在严重的慢性副作用。注意到Goldring(ClinicalOrthopaedicsandRelatedResearch(临床整形外科及相关研究)，No427S，ppS27-S36)提及提出了促炎细胞因子，如IL-I和TNF-α，引起软骨细胞功能的调节异常，其可导致软骨基质的渐进性变性和关节功能的丧失。然而，他还指出ClementsMffi白勺ff胃(Arthritis&Rheumatism，Vol.48,No.12,pp3452-3463,2003)表明了IL-Ιβ或IL-Ιβ转化酶的基因删除甚至加速了膝盖骨关节炎的发展！因此，现有技术关于这些细胞因子在OA中的作用是模糊不清的。甚至连它们是否明确地刺激或抑制OA都是未知的。例如，通过最近描述了为确定细胞因子在OA发展中的作用的研究项目的论文可以了角军该情况(Baggio,VeterinaryImmunologyandImmunopathology(兽医免疫学和免疫病理学)107(2005)27-39)。该论文明确地提及报道了IL-I和TNF两者都能促进0A，但仍然不清楚这些细胞因子的消除是否适于治疗OA。Wildbaum(Immunity，Vol.19，679-688，2003年11月)甚至报道了中和TNF-α抑制了炎性疾病类风湿性关节炎，但没有抑制骨关节炎。因此，本领域技术人员在探寻用于OA的治疗时尚未明确IL-Iβ和任选的TNF-α抑制。此外，从现有技术中能明确地知道在使用可能帮助对抗OA的细胞因子拮抗剂的原位治疗的情况下，全身性方法是不成功的(参见ΕΡ1715891；实施例3)。这与由于血液-关节屏障而使得关节相当难以研究的一般了解相一致(Bas等，BritishJournalofRheumatology,1996；35(6):548_552禾口Kushner等，ArthristisRheum，1971；14(5)560-570)。还注意到许多涉及急性炎性疾病治疗的参考文献是已知的，其中已经表明了可以通过使用含有IL-I和/或TNF-α的疫苗来引发对抗自体IL_1和/或TNF-α的免疫应答，以治疗这些疾病。这样的参考文献的典型是W02007/039552，属于CytosBiotechnologyAG，瑞士。在炎症中，与OA这样的疾病相反，细胞因子的作用非常明确下调提供缓解并因此对于治疗是有效的。在所述参考文献中，没有公开实例形式的证明，通常建议乃至声称相同的治疗在骨关节炎中也是有效的，因为已知IL-Iβ和TNF-α可能在该疾病中起作用。然而，如以上所解释的，OA是一种非炎性疾病，并且因此完全不同于炎性疾病。细胞因子如IL-Iβ和/或TNF-α的作用尚不清楚，甚至看起来也不明确。因此，对于骨关节炎领域的技术人员而言，即使对于通过使用免疫原性IL-Iβ和/或TNF-α来成功治疗OA的合理机会的预期，这样的参考文献也没有提供合理的基础，更别说是预期全身给予的免疫原性IL-Iβ和任选的免疫原性TNF-α提供适当的OA治疗。简而言之，为什么本领域技术人员基于可获得的关于骨关节炎的知识仍然无法生产对抗IL-Iβ和任选的TNF-α的疫苗来治疗0A，存在两个重要的原因首先，现有技术没有明确地教导细胞因子特别是IL-Iβ和TNF-α在OA中有什么作用，其次，即使基于相同拮抗剂的原位治疗证明了是成功的，但已经证明了使用细胞因子拮抗剂来调节关节自身中细胞因子的作用的全身方法是不成功的。因此，本领域技术人员基于目前可获得的知识，仍然没法产生对抗自体细胞因子IL-Iβ和/或TNF-α的疫苗来治疗0Α，更何况因为这意味着将存在对抗这些细胞因子的全身攻击，这是非常不利的。例如，已知白细胞介素-ι涉及对抗微生物感染的免疫应答，能提高骨髓细胞的数量，在(口腔)伤口愈合中起重要作用，具有抗糖尿病的作用，甚至能调节怀孕后期过程中的细胞事件。因此，通常认为该细胞因子的阻断是不利的。在一个实施方案中，IL-Iβ和TNF-α细胞因子或其衍生物对于治疗的脊椎动物是同源的。在这个意义上的同源意指源自相同的物种，与以上定义的异源相对。与预期的相反，已经发现了源自相同物种的抗原细胞因子在治疗的脊椎动物中诱导较高的抗体滴度。在另一个实施方案中，对于脊椎动物非自体的部分含有源自微生物的抗原决定簇。在这个意义上的微生物意思是显微镜可见的或亚显微大小的生物体，特别是属于细菌、酵母、霉菌、原生动物、藻类、立克次氏体、微生物或病毒。显而易见的是通过包括这样的抗原决定簇，即，提供免疫活性区域的表位，该免疫活性区域结合淋巴细胞上的抗原特异性膜受体或结合分泌的抗体，可以提供对抗脊椎动物自体细胞因子的高抗体滴度。在另一个实施方案中，对于脊椎动物非自体的部分包含佐剂。如上所述的，佐剂原则上可以是任何非特异性的免疫刺激剂。可以通过任何化学或物理键，或以任何其他方式，将佐剂部分与IL-Ιβ和TNF-a细胞因子或其衍生物结合，只要该佐剂部分与IL_1β和TNF-α细胞因子或其衍生物可操作地连接，即，只要该佐剂部分能够刺激对抗这些IL-Iβ和TNF-α细胞因子或其衍生物，并因此也对抗脊椎动物自体IL-Iβ和TNF-α的相应抗原决定簇的免疫应答。通常，可以根据它们诱导的免疫事件来将佐剂归类。第一类，其中包含ISC0M(免疫刺激复合物)、皂角苷(或其级分和衍生物，如QuilA)、氢氧化铝、脂质体、cochleates、聚乳酸/乙醇酸，促进抗原摄取、转运和APC(抗原呈递细胞)呈递。第二类，其中含有油乳液、凝胶、聚合物微球体、非离子嵌段聚合物和最可能还有氢氧化铝，提供储存作用。第三类，其中包含富含CpG的基序、单磷酰基脂质A、分枝杆菌(胞壁酰二肽)、酵母提取物、霍乱毒素，是基于保守微生物结构，即所谓病原体相关微生物模式(PAMP)，被定义为信号0的识别。第四类，其中包含油乳液表面活性剂、氢氧化铝、缺氧，是基于刺激免疫系统分辨危险和无害的能力(其不需要与自体和非自体相同)。第五类，其中包含细胞因子，是基于APC上共刺激分子，即信号2的上调。佐剂帮助提供适当的免疫应答。因此，细胞因子或其衍生物的非自体部分已经能够破坏自体耐受性不太重要。因此，佐剂在抗原的选择中提供更多的自由。特别地，使用来自第1类的佐剂，例如以皂角苷、其级分和水包油型乳液(例如，脂质体)举例说明，已经获得了良好的结果。在再一个实施方案中，当与脊椎动物的自体IL-Iβ和TNF-a细胞因子相比时，IL-Iβ和TNF-a细胞因子或其衍生物具有降低的生物活性。降低的生物活性，即，该试剂对活的动物或对其组织降低的作用，可降低给予疫苗时急性副作用的风险。当细胞因子的生物活性没有降低时，可能发生如呕吐、休克、绞痛等急性副作用。可以通过各种细胞因子灭活方法，如与用于将细菌毒素转化成类毒素相似的化学甲醛处理，可以获得生物活性的降低。这样的方法是疫苗
技术领域：
中公知的。在可替换的方法中，可以制得具有降低生物活性的突变细胞因子。这也是本领域公知的。注意到具有降低生物活性的细胞因子也称为生物无活性的(尽管可能留下实质性的生物活性)。本发明还涉及IL-Iβ和任选的TNF-α细胞因子来生产用于治疗脊椎动物骨关节炎的疫苗的用途和治疗自身。可以通过疫苗
技术领域：
中所用的任何常规途径来给予疫苗，特别是通过肌内途径、皮下、皮内或粘膜下途径或通过静脉内途径，例如，以可注射悬浮液的形式。可以作为单次剂量或作为在一定的时间间隔后重复一次或多次的剂量来进行给药。合适的剂量可以尤其作为所治疗个体体重的函数而改变。将通过参照以下实施例来更详细地解释本发明。1.材料和方法Α.诱导狗体内对抗自体IL-Iβ和TNF-α的抗体。重组犬(Ca)和马(Ea)蛋白。使用各自从狗或马血提取的外周血淋巴细胞(PBL)分离的RNA，使用标准分子生物学技术来克隆CaIL-Iβ、CaTNF-α、EqIL-Iβ和EqTNF-α。将Ca分子的3’端在遗传上与来自犬瘟热病毒融合蛋白(CDV-F)的最小(17aa)T-细胞表位融合(Ghosh等，(2001)Immunologyl04pp.58-66)。最后，将编码IL-1β和TNF-α的CDNA片段连接至pET-载体中，使得5’端与His-标记物一起在框内(用于纯化目的)。马IL-Ιβ和TNF-α没有⑶V-标记。所有蛋白通过大肠杆菌表达，His-标记物纯化并检测LPS含量。用作抗原的蛋白都具有LPS含量<20U/ml。SEQID1表示最小的⑶V-F标记的CaIL-Iβ的DNA。核苷酸1-75表示His-标记物，核苷酸532-585表示⑶VF-表位(17个氨基酸+终止密码子)。SEQID2表示最小的⑶V-F标记的CaIL-Iβ蛋白自身。SEQID3表示最小的⑶V-F标记的CaTNF-α的DNA。核苷酸1-63表示His-标记物，核苷酸535-588表示CDVF-表位(17个氨基酸+终止密码子)。SEQID4表示最小的⑶V-F标记的CaTNF-α蛋白自身。SEQID5表示马IL-Iβ的DNA。核苷酸1-63表示His-标记物。SEQID6表示马IL-Iβ蛋白自身。SEQID7表示马TNF-α的DNA。核苷酸1-63表示His-标记物。SEQID8表示马TNF-α蛋白自身。接着上段中所提到的这些野生型分子，使用定点诱变产生了一系列生物无活性突变(mt)分子，以避免可能的全身性不良反应(注在本发明说明书中，生物活性的、野生型分子称为或表示为t”；生物无活性的或生物“低”活性的突变分子称为或表示为“mt”；没有指出或表示时，意思是野生型形式)。将这些突变体在3’-末端在遗传上与来自犬瘟热病毒融合蛋白(CDV-F)的最小(17aa)或最大(32aa)的T-细胞表位融合(Ghosh等，(2001)Immunology104pp.58-66)，并且在5，-末端(在His-标记物之后)与来自犬细小病毒(CPV)的最大(35aa)T_细胞表位融合(Rimmelzwaan等，(1990)，J.Gen.Virology71pp.2321-2329)。基于可获得的关于人IL-Iβ和TNF-α的科学文献来选择突变位点对于IL-Iβ点突变=Simon等(1993)J.Biol.Chem.268pp.9771-9779和Evans等(1995)J.Biol.Chem.270pp.11477-11483，对于TNF-点突变=Zhang等(1992)J.Biol.Chem.267pp.24069-24075。一种TNF-突变体(突变体No12，参见下文)是特定的点突变结合自发突变的衍生物。所有蛋白通过大肠杆菌表达，His-标记物纯化并检测LPS含量。用作抗原的测试蛋白都具有LPS含量<20U/ml。制得了十八个生物无活性突变体。以下列出了编码这些突变体的DNA。突变体No1由最小的CDV-F标记的H30GCaIL-Iβ突变体的DNA编码。该DNA的核苷酸1-75表示His-标记物，核苷酸532-585表示最小的⑶V-F表位(17个氨基酸+终止密码子)，核苷酸163C>G和164A>G表示H30G突变。突变体No2由最小的CDV-F标记的K92GCaIL-Iβ突变体的DNA编码。核苷酸1-72表示His-标记物，核苷酸529-582表示最小的⑶V-F表位(17个氨基酸+终止子密码)，核苷酸346A>G和347A>G表示K92G突变。突变体No3由最小的CDV-F标记的H30G加K92GCaIL-Iβ双突变体的DNA编码。核苷酸1-75表示His-标记物，核苷酸532-585表示最小的⑶V-F表位(17个氨基酸+终止子密码)，核苷酸163C>G和164A>G表示H30G突变，核苷酸349A>G和350A>G表示K92G突变。突变体No4由最小的⑶V-F标记的C7SCaIL-Iβ突变体的DNA编码。核苷酸1-75表示His-标记物，核苷酸532-585表示最小的⑶V-F表位(17个氨基酸+终止子密码)，核苷酸98G>C表示C7S突变。突变体No5由最小的⑶V-F标记的K8ECaIL-Iβ突变体的DNA编码。核苷酸1-75表示His-标记物，核苷酸532-585表示最小的⑶V-F表位(17个氨基酸+终止子密码)，核苷酸100A>G和102G>A表示K8E突变。突变体No6由最小的⑶V-F标记的L9SCaIL-Iβ突变体的DNA编码。核苷酸1-75表示His-标记物，核苷酸532-585表示最小的⑶V-F表位(17个氨基酸+终止子密码)，核苷酸104T>C表示L9S突变。突变体No7由最小的⑶V-F标记的C7S加K8E加L9SCaIL-Iβ三重突变体的DNA编码。核苷酸1-75表示His-标记物，核苷酸532-585表示最小的CDV-F表位(17个氨基酸+终止子密码)，核苷酸98G>C表示C7S突变，核苷酸100A>G和102G>A表示K8E突变，核苷酸104T>C表示L9S突变。突变体No8由最大的CPV和⑶V-F标记的C7SCaIL-Iβ突变体的DNA编码。核苷酸1-75表示His-标记物，核苷酸76-171表示最大的CPV表位(32个氨基酸+终止子密码)，核苷酸628-726表示最大的⑶V-F表位(32个氨基酸+终止密码子)，核苷酸194G>C表示C7S突变。突变体No9由最大的CPV和⑶V-F标记的K8ECaIL-Iβ突变体的DNA编码。核苷酸1-75表示His-标记物，核苷酸76-171表示最大的CPV表位(32个氨基酸+终止子密码)，核苷酸628-726表示最大的⑶V-F表位(32个氨基酸+终止密码子)，核苷酸196A>G和198G>A表示K8E突变。突变体No10由最大的CPV和CDV-F标记的L9SCaIL-Iβ突变体的DNA编码。核苷酸1-75表示His-标记物，核苷酸76-171表示最大的CPV表位(32个氨基酸+终止子密码)，核苷酸628-726表示最大的⑶V-F表位(32个氨基酸+终止密码子)，核苷酸200T>C表示L9S突变。突变体No11由最大的CPV和CDV-F标记的C7S加K8E加L9SCaIL_lβ三重突变体的DNA编码。核苷酸1-76表示His-标记物，核苷酸76-171表示最大的CPV表位(32个氨基酸+终止子密码)，核苷酸628-726表示最大的⑶V-F表位(32个氨基酸+终止密码子)，核苷酸194G>C表示C7S突变，核苷酸196A>G和198G>A表示K8E突变，核苷酸200T>C表示L9S突变。突变体No12由最大的CPV和CDV-F标记的K8D加L9S加QlOdelCaIL-Iβ三重突变体的DNA编码。核苷酸1-76表示His-标记物，核苷酸76-171表示最大的CPV表位(32个氨基酸+终止子密码)，核苷酸625-723表示最大的⑶V-F表位(32个氨基酸+终止密码子)，核苷酸196A>G和198G>T表示K8D突变，核苷酸200T>C表示L9S突变，与野生型序列相比，删除了氨基酸IO(QlOdel)。突变体No13由最小的CDV-F标记的Y87SCaTNF-α突变体的DNA编码。核苷酸1-63表示His-标记物，核苷酸535-588表示最小的⑶V-F表位(17个氨基酸+终止子密码)，核苷酸323A>C表示Y87S突变。突变体No14由最小的CDV-F标记的Y119NCaTNF-α突变体的DNA编码。核苷酸1-63表示His-标记物，核苷酸535-588表示最小的⑶V-F表位(17个氨基酸+终止子密码)，核苷酸418T>A表示Y119N突变。突变体No15由最小的CDV-F标记的Y87S加Y119NCaTNF-α突变体的DNA编码。核苷酸1-63表示His-标记物，核苷酸535-588表示最小的⑶V-F表位(17个氨基酸+终止子密码)，核苷酸323A>C表示Y87S突变，核苷酸418T>A表示Y119N突变。突变体No16由最大的CPV和⑶V-F标记的Y87SCaTNF-α突变体的DNA编码。核苷酸1-63表示His-标记物，核苷酸64-159表示最大的CPV表位(32个氨基酸)，核苷酸631-729表示最大的CDV-F表位(32个氨基酸+终止密码子)，核苷酸419A>C表示Y87S突变。突变体No17由最大的CPV和CDV-F标记的Y119NCaTNF-突变体的DNA编码。核苷酸1-63表示His-标记物，核苷酸64-159表示最大的CPV表位(32个氨基酸)，核苷酸631-726表示最大的⑶V-F表位(32个氨基酸+终止密码子)，核苷酸514T>A表示Y119N突变。突变体No18由最大的CPV和CDV-F标记的Y87S加Y119NCaTNF-α双突变体的DNA编码。核苷酸1-63表示His-标记物，核苷酸64-159表示最大的CPV表位(32个氨基酸)，核苷酸631-726表示最大的⑶V-F表位(32个氨基酸+终止密码子)，核苷酸419A>C表示Y87S突变，核苷酸514T>A表示Y119N突变。疫苗佐剂。所用的佐剂是QuilA(0.OlM磷酸盐缓冲盐水中250g/ml，缩写为PBS，也称为“盐水，，)、MatrixC(0.OlMPBS中125μg/ml)和Microsol(25%水包油型乳液)。QuilA是从南美的皂树(蔷薇科)树皮分离的公知的皂角苷佐剂。其可以获自BiolangJalveHave，丹麦或Roth，Karlsruhe，德国。MatrixC(免疫刺激复合物或ISC0M)是含有皂角苷、胆固醇和磷脂(磷脂酰胆碱)的疫苗佐剂，其形成通常直径为40nm的笼状结构。其可以获自CSL，墨尔本，澳大利亚或Isconova,Uppsala，瑞典。Microsol是水包油型乳液，其由水中小的(通常小于1μm)矿物油液滴(ExxonMobil的Marcol52)组成，通过使用吐温80去污剂(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单油酸酯)，获自AcrosOrganics0实验设计。对于生物活性(wt)细胞因子“唯一的”实验，设计如下。用1.Oml如表1中所示的制剂在右侧将五组大约4个月大的常规小猎犬s.c.接种疫苗。表1.狗实验性接种疫苗的建立<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>在第一次接种疫苗后4、8、20和24周时，狗接受了1.0ml(s.c.，在右侧)的加强剂接种。在第一次接种疫苗后1=0、3、6、9、12、16、20、24、28、32和36周时采取血样。使用血清来(1)测定对抗CaIL-10和CaTNF-a的抗体水平，使用抗原特异性ELISA；(2)用于蛋白质印迹分析；和(3)检测中和抗体。对于混合的生物活性(wt)/生物无活性(mt)细胞因子实验，设计如下。用1.0ml如表1A中所示的制剂在右侧将六组15-18周大的常规小猎犬s.c.接种疫苗。在该实验中，作为单种蛋白抗原或结合测试了1种突变CaIL-10蛋白(突变体No4:最小的CDV-F标记的C7SCaIL-l3突变体)和1种突变的CaTNF-a蛋白(突变体No.13最小的CDV-F标记的Y87SCaTNF-a突变体)。表1A.狗实验性接种疫苗的建立<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>在第一次接种疫苗后4、8、11、14和16周时，狗接受了1.0ml(S.c.，在右侧)的加强剂接种。在第一次接种疫苗后1=0、4、8、11、14、16和17周时采取血样。使用血清来测定对抗CaIL-10和CaTNF-a的抗体水平，使用抗原特异性ELISA(夹层-捕捉方法)。ELISA和蛋白质印迹分析。使用标准程序进行ELISA分析。为此，使用捕捉多克隆山羊-抗-犬IL-10和捕捉单克隆鼠-抗-犬TNF-a抗体来覆盖96-孔微滴定平板。然后将C_末端His(C_His)-标记的CaIL-10或0见8-标记的0^顺-0加入平板中，随后接着连续稀释狗血清。使用多克隆兔子-抗-犬IgG(H+L)HRP-标记的抗体检测抗IL-10或抗-TNF-a特异性抗体的结合。IL-1P和TNF-a牛物测定的抑制。使用IL-10和TNF-a反应性的NIH-3T3NFkB萤光素酶报道细胞系来测量抑制。用lOng/mlCa和EqIL-10和TNF_a蛋白预先培养来自几个时间点的合并的血清并测试中和活性，即，抑制受体结合的活性。以相对光单位(RLU)来定量抗体对IL-10和TNF-a的抑制作用。B.小猎犬中尿酸盐晶体i秀发的OA1草型的歲立实验设计。我们使用了尿酸盐晶体诱发的骨关节炎模型(其中参见Bormeau等；RevueMed.Vet.，2005，156，4，179-181)。将两组4只常规的小猎犬(大约5个月大)进行关节内注射，1个膝关节(后腿)注入1.0ml0.9%NaCl(对照组)或1.0ml0.9%NaCl中的10mg/ml尿酸盐晶体(OA模型组)。在全身麻醉下进行1.0ml溶液的关节内注射。在注射后T=0、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、24小时、30小时、48小时、72小时和96小时时，对于每只单独的狗，进行一般行为、跛足(在站立和行走时评分)、触诊时的疼痛和膝关节积液(肿胀)的评分。在实验结束时，将狗安乐死并由病理学家肉眼检查膝盖。尿酸盐晶体。将0.9%NaCl溶液中的10mg/ml尿酸盐晶体(Sigma产品号U2875；批号120K5305)用于关节内注射。为此，在0.9%NaCl中制得了22g具有50mg/g浓度的尿酸盐晶体溶液。将该溶液进行超声处理直至获得具有颗粒<50ym悬浮液(显微镜检查)。显微镜图像证实了颗粒具有彡50um的大小后，用0.9%NaCl将20g悬浮液稀释至100g(终浓度10mg/ml)。将pH调节至pH7.0并将悬浮液高压灭菌。就在高压灭菌之前和之后，也检查了悬浮液显微镜图像的晶体大小(应当<50i!m)。制得后，将悬浮液存储在2-8°C直至进一步的使用。鉴定。将狗单独地在耳朵上编号(纹身)。圈养。将狗在天然的非限制环境下单独地圈养在常规的狗窝中，具有户外运动的可能性并且随意饮水。碎屑是有限程度地获得。表2.分组和定量<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>0.9%NaCl的沣射。在全身麻醉下，给4只来自组1(对照组)的动物进行关节内注射，将1.0ml0.9%NaCl注入1个膝关节中(剃过毛的左后腿)。尿酸盐晶体的沣射。在全身麻醉下，给4只来自组2(OA模型组)的动物进行关节内注射，将1.0ml0.9%NaCl中的10mg/ml尿酸盐晶体注入1个膝关节中(剃过毛的左后腿)。实验方法和参数。观察。在注射后T=0、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、24小时、30小时、48小时、72小时和96小时时，对于每只单独的狗，进行一般行为、跛足(在站立和行走时评分)、触诊时的疼痛和膝关节积液(肿胀)的评分。首先对笼子中的狗进行观察和评分，随后在观察台上对行走过程中并最终在站立时的狗进行观察和评分。跛足评分站立评分0正常站立，全重量支撑。1异常位置，部分重量支撑。2异常位置，没有重量支撑(3条腿3不愿意站起来。行走评分0正常行走，全重量支撑。1略有跛足，部分重量支撑。2明显跛足，间歇的部分重量支撑。3没有重量支撑(3条腿的狗)。4不愿意行走。小、跑步评分0正常小跑，全重量支撑。1略有跛足，部分重量支撑。2明显跛足，间歇的部分重量支撑。3没有重量支撑(3条腿的狗)。4不愿意小跑。触诊时疼痛的评分0没有疼痛的表现。1轻度至中度疼痛(允许触诊但转头或甩开，发出声音，消沉)。2严重疼痛(不允许检查者触诊关节)。与未沣射的关节相比，膝关节积液(肿胀)的评分0无关节积液(明显的髌韧带可触知)。1轻度积液(最小的滑膜填充，可感知到韧带)。2中度积液(明显的滑膜填充，模糊的韧带)。3严重积液(韧带不可触知)。C.设得S群岛种马中尿酸盐晶体i秀发的OA1草型的歲立实验设计。我们在矮种马中使用了相同的骨关节炎模型。将两组2匹常规的设得兰群岛矮种马(大约12个月大)进行关节内注射，1个膝关节(右后腿)注入5.0ml0.9%NaCl(对照组)或5.0ml0.9%NaCl中的10mg/ml尿酸盐晶体(OA模型组)。在光镇静下进行5.0ml溶液的关节内注射。在注射后T=0、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、24小时、30小时、48小时、72小时和96小时时，对于每只单独的矮种马，进行一般行为、跛足(在站立和行走时评分)、触诊时的疼痛和膝关节积液(肿胀)的评分。在实验结束时，将矮种马安乐死并由病理学家肉眼检查膝盖。尿酸盐晶体。参见B部分。鉴定。通过植入的芯片和编号的颈圈来鉴定设得兰群岛矮种马。圈养。在天然的非限制环境下，将矮种马单独圈养在常规的稳定箱中，随意食用干草和饮水，碎屑是有限程度地获得。表3.分组和定量<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>0.9%NaCl的沣射。在光镇静下，给2匹来自组1(对照组)的动物进行关节内注射，将5.0ml0.9%NaCl注入1个膝关节中(剃过毛的右后腿)。尿酸盐晶体的沣射。在光镇静下，给2匹来自组2(OA模型组)的动物进行关节内注射，将5.0ml0.9%NaCl中的10mg/ml尿酸盐晶体注入1个膝关节中(剃过毛的右后腿)。实验方法和参数。观察。在注射后T=0、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、24小时、30小时、48小时、72小时和96小时时，对于每匹单独的矮种马，进行一般行为、跛足(在站立和行走时评分)、触诊时的疼痛和膝关节积液(肿胀)的评分。对稳定箱中的矮种马进行观察和评分，随后在走廊对行走过程中的矮种马进行观察和评分。跛足评分站立评分0正常站立，全重量支撑。1异常位置，部分重量支撑。2异常位置，没有重量支撑(3条腿的矮种马)。3:不愿意站起来。行走评分0:正常行走，全重量支撑。1略有跛足，部分重量支撑。2明显跛足，间歇的部分重量支撑。3没有重量支撑(3条腿的矮种马)。4:不愿意行走。触诊时疼痛的评分0:没有疼痛的表现。1轻度至中度疼痛(允许触诊但转头或甩开，发出声音，消沉)。2严重疼痛(不允许检查者触诊关节)。与未沣射的关节相比，膝关节积丨夜(肿胀)的i平分0无关节积液(明显的髌韧带可触知)。1轻度积液(最小的滑膜填充，可感知到韧带)。2中度积液(明显的滑膜填充，模糊的韧带)。3严重积液(韧带不可触知)。P.预防性接种对抗IL-Iβ和TNF-α疫苗的小猎犬中OA症状的防止实验件疫苗接种设计。在研究A中，对于“wt-唯一”实验，每组接种疫苗后T=0、T=4、T=8、T=20和T=24周时，给狗接种用几种不同的免疫增强剂配制的IL-Iβ和TNF-α(参见表1)。对于该研究，这些狗在最后一次接种疫苗后24周时再接种两次，即，第一次接种1.Oml(s.c.右侧)如表4中所示的疫苗制剂后T=48和T=54周时。在第一次接种疫苗后T=48,T=54和T=58周时采取用于血清学的血样。将血清用于测定对抗IL-Iβ和TNF-α的抗体水平，使用抗原特异性ELISA和标准程序。表4.狗实验性接种疫苗的建立，表1的继续<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>对于混合的wt/mt实验，使用了表IA中所示的实验性疫苗接种。OA的诱发。对于wt-唯一实验，最后一次采取血样后一(1)周(T=59周)，将组1的狗(PBS对照组)分成2个新的组(N=2和N=4)。在该时间点，来自5组的所有狗都约为18个月大，通过关节内注射给1个膝关节(后腿)注入1.0ml0.9%妝(1(对照组1)或1.Oml0.9%NaCl中的10mg/ml尿酸盐晶体(OA模型组2_5)。在全身麻醉下进行1.Oml溶液的关节内注射。在注射后T=1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、24小时、32小时、48小时、72小时和96小时时，对于每只单独的狗，进行一般行为、跛足(在站立和行走时评分)、触诊时的疼痛和膝关节积液(肿胀)的评分。在实验结束时，将狗安乐死并由病理学家肉眼检查膝盖。表5.接种疫苗的狗体内OA诱发的建立。组INI测试物质动物号~I<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>统计学分析。使用具有最小显著性差异(L.S.D.)的方差分析(ANOVA)作为多重比较试验进行了平均分值的比较。使用SASEnterpriseGuide2(SASInstituteInc.,Cary,NC)软件产生了所有结果。在95%的置信水平下认为差异是显著的(ρ<0.05)。2.结果Α.狗体内对抗自体IL-Iβ和TNF-α的抗体的诱导由疫苗接种(wt-唯一实验)引起的副作用。初次接种(首次)后，接受了QuilA中Eq蛋白的狗的局部(皮肤)反应是明显的。在随后的加强接种中，我们因此在该接种组中用PBS替代了QuilA(请参阅表1)。就在第一次加强接种后不久，组2(QuilA中的Ca蛋白)、3(Matrix-C中的Ca蛋白)和4(Micr0S0l中的Ca蛋白)的大部分狗都生病了，可能是由于疫苗制剂中高浓度(游离)生物活性TNF-a的存在。通过将用于Ca和Eq蛋白的TNF-α量从50μg/剂/狗降至5μg/剂/狗，在随后的加强接种中防止了这些急性全身性副作用。由梓种疮苗(、混合的Wt/mt引fe的副作用。初次接种(首次)后，大部分接受了Microsol佐剂的狗(组3_6)的局部(皮肤)反应是明显的。第一次和随后的(加强)接种后，局部反应不太明显。在所用的CaIL-Iβ和CaTNF-α蛋白浓度下，没有观察到急性全身性副作用。对抗IL-Iβ和TNF-α的抗体滴度(wt_唯一实验)。如图IA-D中所示，可以产生明显的对抗自体分子CaIL-Iβ和CaTNF-α的ELISA抗体滴度。从这些图中可以清楚抗体是交叉反应性的，即，产生了对抗识别Eq蛋白的Ca蛋白的抗体，并且反之亦然。值得注意的是所产生的对抗CaTNF-α的抗体以高于CaTNF-α蛋白的滴度识别EqTNF-α(可能是由于亲和性/特异性引起的)，特别是在早期的时间点(图IC和1D)。通常，与相应的Eq对应物相比较时，接种Ca蛋白的狗体内产生较高的整体抗体滴度。首次接种疫苗后十二周时，由于圈养限制，从实验中除去了组1和3。总的说来，可以推断出通过使用遗传修饰的犬自体分子或异源马蛋白，可以破坏对自体的免疫耐受性并诱导高抗体滴度。注意到使用突变的细胞因子，获得了相当的结果。蛋白质印迹分析。为了证实抗-IL-Iβ和抗-TNF-α抗体的特异性，使用⑶V-标记的和未标记的蛋白进行了蛋白质印迹分析。用来自首次接种后T=9周时的血清培养蛋白质印迹。如图2中所示的，所有抗体与Ca和EqIL-Iβ和TNF-α蛋白交叉反应。将不相关的His-标记物纯化的大肠杆菌表达的蛋白，鸡IL-18(ChIL-18)，用作对照并且没有被抗体识别。抗-IL-Iβ和抗-TNF-α抗体的中和能力。尽管在狗体内诱导了对抗IL-Iβ和TNF-α的高抗体滴度，但不清楚这些抗体是否能够中和相应蛋白的生物活性。为此，我们使用了IL-Iβ和TNF-α反应性NIH-3T3NFκB萤光素酶报道细胞系。用来自几个时间点的合并的血清预先培养Ca和EqIL-Iβ和TNF-α并测试中和活性，即，抑制受体结合的活性。从图3Α和3Β中所示的结果看，可以推断出来自首次接种后24周的合并的血清含有最高的抗-CaIL-Iβ和抗-EqIL-Iβ中和抗体。与其他血清相比较时，以相对光单位(RLU)测量的CaIL-Iβ和EqIL-Iβ的生物活性明显降低。尽管没有那么明显，但对于CaTNF-α和EqTNF-α的生物活性的抑制也是这种情况(图3C和3D)。来自首次接种后6周和9加12周的合并的血清含有少量的中和IL-Iβ抗体，但含有显著量的中和TNF-α抗体。结论最后，我们提供了明显的证据我们可以通过活性免疫来产生对抗最小的⑶V-标记的野生型和突变的CaIL-Iβ和CaTNF-α自体分子的抗体。B.小猎犬中尿酸盐晶彳本i秀发的OAlt型的歲立。流体沣入膝关节中。通常，将1.Oml0.9%NaCl或1.Oml0.9%NaCl中的10mg/ml尿酸盐晶体注入膝关节中，而没有任何严重的副作用。临床评估跛足的评分。注射了尿酸盐晶体的动物在注射后的2小时内，在行走和站立时都显示出明显的跛足(参见图4)。两只狗在24内完全恢复了，而另外2只狗遭受了尿酸盐晶体的影响，直至实验结束。安乐死狗的膝关节的目测结果揭示了这2只狗具有膝盖骨异位(解剖关节异常)。这种膝盖骨异位结合尿酸盐晶体的注射最可能导致上述延长时间段的不适。在注射了0.9%NaCl溶液的狗的组中，只有1只狗受到了注射很短时间的影响(在T=8小时时是明显的)。在这只狗的膝关节目测时，清楚了该动物也具有膝盖骨异位。临床评估触诊时的疼痛和膝关节积液(肿胀)。还监控了触诊时的疼痛和膝关节积液。如图5中可看到的，SEM(均值标准误差)大，表示在个体狗之间存在着一定的差异。在注射尿酸盐晶体后2至8小时之间，触诊时的疼痛是可测量的，最大值在4至6小时之间。与触诊时的疼痛相比，膝关节积液有些延迟，开始于注射后4小时，最大在8小时时。临床评估膝盖病理学。在实验结束时，将所有狗安乐死并肉眼观察膝盖。在所有狗中，没有发现注射溶液的痕迹。只有1只狗中的注射部位仍然是明显的。在3只狗的膝盖中，可见到大量流体。这证明了这3只狗具有膝盖骨异位。结论狗中所用的通过将含有尿酸盐晶体的溶液通过关节内注入ι个膝关节中(后腿)的关节炎模型是快速的(2小时内，可看到效果)、短期的(几小时至1-2天)和可逆的。监控进展的相关参数包括行走和站立时的跛足评分、触诊时的疼痛和关节积液。在该模型中，体温和关节温度不是相关的参数。C.设傳兰群岛M种马Φ尿II^H秀发的OAIt型的建立。流体注入膝关节中。通常，将5.Oml0.9%NaCl或5.Oml0.9%NaCl中的10mg/ml尿酸盐晶体注入膝关节中，而没有任何严重的副作用。临床评估跛足的评分。注射了尿酸盐晶体的动物在注射后的2小时内，在行走和站立时都显示出明显的跛足(参见图6)。在注射后6至8小时之间评分为最大的不适。2匹对照的矮种马未显示出跛足的体征。临床评估触诊时的疼痛和膝关节积液(肿胀)。还监控了触诊时的疼痛和膝关节积液。如图7A中可看到的，在注射后2小时内对疼痛进行评分，而在之后的阶段(>48小时)才检测到膝关节积液(图7B)。由于在72至96小时之间，膝关节积液没有增加，这可能表示了在96小时时肿胀达到最大值。临床评估膝盖病理学。在实验结束时，将所有矮种马安乐死并肉眼观察膝盖。在所有矮种马中，没有发现注射溶液的痕迹。注射了尿酸盐的矮种马的膝关节的肉眼观察显示了增加量的黄色滑液，滑膜增厚，伴有水肿和出血。对照未显示出病状。Mrk和我们在狗中所示的一样，在评价跛足和疼痛时，矮种马中所用的通过将含有尿酸盐晶体的溶液通过关节内注入1个膝关节中(右后腿)的关节炎模型是快速的(2小时内，可看到效果)、短期的(几小时至1-2天)和可逆的。膝关节积液(肿胀)在注射后48小时开始是可触知的，并且似乎在72和96小时之间达到了最大值。_3]P.予页防t牛梓种对杭IL-I3^PTNF-α疮苗的小猎犬中OA症状的防I卜_4]再次梓种后对杭IL-Iβ和TNF-α的杭体滴度。如图8A-D(wt_唯一实验)中所示，在接种后T=48周(即，最后一次加强接种后24周)的整体抗体滴度，维持在相当高的水平。狗的再次接种导致了在所有测试的抗原和所有组中抗体滴度的适度提高。临床评估不适评分。在图9(wt-唯一实验)中，描绘了对“站立”(图9B)、“行走”(图9C)、“触诊时的疼痛”(图9D)、“膝关节积液(肿胀)”(图9E)的不适评分和“总临床评分”，这是所测量的所有不适评分的平均值(图9A)。从所有图中清楚的是未接种疫苗的狗在注射后2小时内显示出明显的不适。接种疫苗的狗在几个情况下明显地显示出降低的或中度至轻度的不适。如在图中可看到的，接种疫苗的狗与未接种疫苗的狗相比时，不适评分明显较低，并显示出延迟。临床评估膝盖病理学。在实验结束时，将所有狗安乐死并由病理学家肉眼检查膝盖。总的来说，除了NaCl对照狗，在所有狗中，滑膜显示出增厚和微红。然后，在所有膝盖中，检测到少量滑液。临床评估不适评分。在图10(混合的wt/mt实验)中，描绘了在关节内尿酸盐注射后6小时和8小时时间点的“站立”(图10A)和“行走”(图10B)的不适评分。从两张图清楚的是未接种疫苗的狗(尿酸盐对照组)在注射后6小时和8小时时显示出明显的不适。接种疫苗的狗，在一些情况下，明显地显示出降低的或中度至轻度的不适。如在图10中可看到的，接种疫苗的狗与未接种疫苗的狗(尿酸盐对照组)相比，不适评分明显较低。还清楚的是，特别是在注射后8小时时，只接种野生型CaIL-Iβ或只接种突变的CaIL-Iβ与未接种的尿酸盐对照狗相比时减轻了不适。Mrk从该实验获得的结果，我们可以推断出基于使用野生型或突变的细胞因子可以诱导对抗自体分子IL-Iβ和TNF-α的抗体，并且这些只针对IL-Iβ或者还针对TNF-α的抗体能够抑制关节炎症状。还可以推断出使用同时针对IL-Iβ和TNF-α的疫苗似乎获得了最佳结果。Ε.各种形式注意到使用生物活性IL-Iβ和TNF-α，我们看到了急性副作用。可以通过使用这些细胞因子的生物无活性形式来防止这些副作用，例如从美国专利6，093，405所知的。可以选择部分失活的细胞因子来获得免疫原性和生物活性之间的平衡。我们使用了尿酸盐晶体模型用于诱发OA。注意到其他用于OA的模型是现有技术中已知的，例如，AnteriorCruciateLigamentTransection模型(ACLT,描述于Fleming等；CurrOpinOrthop.2005年10月；16(5)354-362)或Groove模型(描述于Mastbergen等；Rheumathology，2006；45(4):405-413)。已知本申请中所述实验的积极结果，认为使用这些模型或由于自然原因患有或产生了OA的患者时也能获得相应的结果。我们已经显示了接种IL-Iβ和TNF-α及其衍生物的组合时OA患者缓解的明显效果。这已经在小猎犬中得到显示。已知在该脊椎动物中的结果和关于脊椎动物组中关节的生理过程的相似性，特别是哺乳动物脊椎动物，如狗、马和人，本发明可以用于任何脊椎动物中，特别是哺乳动物脊椎动物。F.附图描述图1显示了在接种疫苗后不同的时间点测量的IL-Ιβ和TNF-α特异性抗体应答。狗是未免疫的(盐水对照)，用在QuilA、MatrixC或Microsol中配制的[CaIL-Iβ+CaTNF-α]蛋白免疫的(缩写为Ca)，或用在QuilA(只有首次)/盐水(加强)中配制的[EqIL-Iβ+EqTNF-α]蛋白免疫的(缩写为Eq)。在首次接种后4、8、20和24周时，狗接受了加强接种。使用抗原特异性ELISA测量抗体，其中所用的蛋白没有CDV-标记物。[Α],对抗CaIL-Iβ测量的抗体滴度；[B].对抗EqIL-Iβ测量的抗体滴度；[C].对抗CaTNF-α测量的抗体滴度；[D]对抗EqTNF-α测量的抗体滴度。T=首次接种后的周数。图2显示了CDV-标记的和未标记的CaIL-Iβ、CaTNF-α以及EqIL-1β禾口EqTNF-α蛋白的蛋白质印迹分析。在首次接种疫苗后9周时，使用每个接种组的1只狗的血清通过4-12%Nu-PAGE和蛋白质印迹分析蛋白质(lyg/泳道)。[A],考马斯染色的凝胶；[B].用对照血清培养的蛋白质印迹；[C].用接种了在QuilA佐剂中配制的[CaIL-Iβ+CaTNF-α]的狗的血清培养的蛋白质印迹；[D].用接种了在MatrixC佐剂中配制的[CaIL-Iβ+CaTNF-α]的狗的血清培养的蛋白质印迹；[Ε].用接种了在Microsol佐剂中配制的[CaIL-Iβ+CaTNF-α]的狗的血清培养的蛋白质印迹；[F].用接种了在QuilA(只有首次)/盐水(加强)佐剂中配制的[EqIL-Iβ+EqTNF-α]的狗的血清培养的蛋白质印迹。图3显示了通过来自接种了疫苗的狗的血清抑制了IL-Ιβ或TNF-α诱导的NFkB激活。将10ng/ml的[A]CaIL-Iβ，[B]EqIL-Iβ，[C]CaTNF-α或[DjEqTNF-α与抗体血清稀释液混合并用ΝΙΗ-3Τ3受体细胞培养，该血清来自接种了[CaIL-Iβ+CaTNF-α]的狗。以相对光单位(RLU)定量了抗体对IL-Iβ或TNF-α活性的抑制作用。T=6周这是在首次接种后6周取自组2+3+4的狗的合并血清(参见表1)。T=9+12周这是在首次接种后9和12周取自组2+3+4的狗的合并血清(参见表1)。T=24周这是在首次接种后24周取自组2+4的狗的合并血清(参见表1)。图4显示了对小猎犬站立[Α]和行走[B]时的平均评分和平均总跛足评分[C](站立+行走)。将数据表示为几何平均数士SEM。图5显示了对小猎犬触诊时疼痛的平均评分[A]和膝关节积液的平均评分[B]。将数据表示为几何平均数士SEM。图6显示了对设得兰群岛矮种马站立[A]和行走[B]时的平均评分和平均总跛足评分[C](站立+行走)。将数据表示为几何平均数士SEM。垂直轴左侧的箭头表示所示参数的最大评分。图7显示了触诊时疼痛的平均评分[A]和膝关节积液的平均评分[B]。图7[C]显示了对设得兰群岛矮种马的总临床评分(站立+行走+疼痛+肿胀)。将数据表示为几何平均数士SEM。垂直轴左侧的箭头表示所示参数的最大评分。图8显示了在首次接种后的几个时间点测量的IL-Iβ和TNF-α特异性抗体应答。狗时未接种疫苗的(盐水对照)或在首次接种后T=48和T=54周时再次接种的，再次接种了在QuilA或Microsol中配制的[CDV-标记的CaIL-Iβ+CaTNF-α]蛋白(缩写为Ca)，或再次接种了在QuilA(只有首次)或盐水(加强)中配制的[EqIL-Iβ+EqTNF-α](缩写为Eq)。在首次接种后T=48,T=54和T=58时测量抗体，使用抗原特异性ELISA，其中所用的蛋白没有⑶V-标记物。[Α]对抗CaIL-Ιβ测量的抗体滴度；[B]对抗EqIL-Iβ测量的抗体滴度；[C]对抗CaTNF-α测量的抗体滴度；[D]对抗EqTNF-α测量的抗体滴度。★=与盐水组明显差异(Ρ<0.05);O=所示组之间■明显差异(尸<0.05)。τ=首次接种后的周数。图9显示了对于小猎犬的平均总临床评分。图9[Α]给出了总临床评分(站立+行走+触诊时的疼痛+膝关节肿胀)。图9[Β]给出了站立时的平均评分。行走显示于[C]中，触诊时的疼痛显示于[D]中，膝关节积液(肿胀)显示于[Ε]中。将数据表示为几何平均数士SEM。★=在所示时间点与尿酸盐晶体对照组的明显差异(P<0.05)。O=所示组之间明显差异(户<0.05)。图10显示了对于小猎犬的平均临床评分。[Α].站立时的平均临床评分；[B].行走时的平均临床评分。将数据表示为几何平均数士SEM。★=在所示时间点与尿酸盐晶体对照组的明显差异(P<0.05)。权利要求用于治疗脊椎动物骨关节炎的疫苗，其含有IL-1β和任选的TNF-α细胞因子或其衍生物，并且所述IL-1β和任选的TNF-α或其衍生物与对于脊椎动物而言非自体的部分结合，使得该疫苗在脊椎动物体内引发对抗所述脊椎动物的IL-1β和任选的TNF-α自体分子的免疫应答。2.根据权利要求1的疫苗，其中IL-Iβ和TNF-α细胞因子或其衍生物相对于治疗的脊椎动物是同源的。3.根据权利要求1或2的疫苗，其中相对于脊椎动物而言非自体的部分含有源自微生物的抗原决定簇。4.根据在前任一项权利要求的疫苗，其中相对于脊椎动物而言非自体的部分包括佐剂。5.根据在前任一项权利要求的疫苗，其特征在于IL-Iβ和TNF-α细胞因子或其衍生物当与脊椎动物的自体IL-Iβ和TNF-α细胞因子相比较时具有降低的生物活性。6.IL-Iβ和任选的TNF-α细胞因子生产用于治疗脊椎动物骨关节炎的疫苗的用途。7.根据权利要求6的用途，其中IL-Iβ和TNF-α细胞因子或其衍生物相对于治疗的脊椎动物是同源的。8.根据权利要求6或7的用途，其中IL-Ιβ和TNF-α细胞因子或其衍生物与源自微生物的抗原决定簇结合，以产生疫苗。9.根据权利要求6-8任一项的用途，其中IL-Iβ和TNF-α细胞因子或其衍生物与佐剂结合，以产生疫苗。10.根据权利要求6至8任一项的用途，其特征在于IL-Iβ和TNF-α细胞因子或其衍生物当与脊椎动物的自体IL-Iβ和TNF-α细胞因子相比较时具有降低的生物活性。11.通过给予根据权利要求1至5任一项的疫苗来治疗脊椎动物的骨关节炎。全文摘要本发明涉及用于治疗脊椎动物骨关节炎的疫苗，其含有IL-1β和任选的TNF-α细胞因子或其衍生物，并且所述IL-1β和任选的TNF-α或其衍生物与对于脊椎动物而言非自体的部分结合，使得该疫苗在脊椎动物体内引发对抗所述脊椎动物的IL-1β和TNF-α自体分子的免疫应答。文档编号A61K39/00GK101808656SQ200880108631公开日2010年8月18日申请日期2008年9月24日优先权日2007年9月25日发明者V·E·J·C·希金斯,W·G·J·德根申请人:英特威国际有限公司