用于在植物中表达的多结构域酶的修饰的制作方法

专利名称：用于在植物中表达的多结构域酶的修饰的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物分子生物学，特别地涉及用于在植物中增加一种蛋白质的表达和 /或活性的方法和组合物。
背景技术：
近十年来，已经设计了多种异源表达系统用于生产临床上和农艺学上有用的重组蛋白。在大多数系统中的重要挑战在于优化重组蛋白产物的产率和质量。近15年来， 在植物的转基因转录和翻译的优化方面(Potenza et al. ,2004, In Vitro Cell. Dev. Biol. -Plant, 40,1-22 ；Streatf ield, 2007，Plant Biotechnol. J. 5，2-15)、以及植物细胞结构的复合体蛋白翻译后修饰特征的说明和调节方面(Gomord and Faye, 2004, Curr. Opin. Plant Biol. 7,171-181 ；Faye et al.，2005，Vaccine，23，1770-1778)已经实现了显著的进展。尽管实现了这些进展，确保重组蛋白的令人满意的产率和质量通常仍然是困难的任务。强烈影响重组蛋白质量和产率的一个因素是在一种异源环境中表达的多肽链的相对固有稳定性(Faye et al.，2005)。蛋白水解酶，或蛋白酶，通过指导在关键调控过程中涉及的蛋白质的活化或水解、 或通过促成错误折叠蛋白的消除和来自短寿蛋白的氨基酸的选择性再循环而促成代谢和转导途径的总体控制(Vierstra，2003，Trends Plant Sci. 8,135-142 ；Schaller, 2004, Planta，220，183-197)。在植物中，这些酶还启动了开始衰老的器官中的一般的蛋白质再循环以及在发芽期间的种子或块茎贮存蛋白的氨基酸组分的动员(MUntZ，2007，J. Exp. Bot. 58,2391-2407)。在植物体内的蛋白表达过程中以及在植物体外的提取和后续下游加工过程中两者，蛋白酶可能影响不同途径中的重组蛋白的完整性(Michaud et al. , 1998, Methods Biotechnol. 3,177-188 ；Rivard et al.，2006，Plant Biotechnol. J. 4，359-368)。取决于用于肽键水解的对于内源蛋白酶可接近的“敏感的”切割位点的数目，该蛋白质可能经历直接影响其最终产率的完全水解或部分修整，这改变了最终蛋白产物的活性或均质性。虽然以净蛋白水平的方式可以获得感兴趣的产率，最终产物可能显示改变的完整性、结构不均勻性和/或不足的生物活性，这潜在地改变了它的商业化价值(Faye et al.，2005)。发明概述在此提供了用于在植物中表达修饰的多结构域酶的组合物和方法。这些组合物包括表达一种修饰的多结构域酶的植物、种子、植物组织、以及植物部分，其中该多结构域酶的组成为至少一个第一结构域、至少一个第一连接序列、以及至少一个第二结构域。该修饰的多结构域包括异源连接区域，当修饰的多结构域酶表达在植物中时，该区域不被切割。 进一步提供了用于生产一种修饰的多结构域酶的方法，包括将表达这种修饰的多结构域酶的植物进行培养。包含本发明的表达构建体的转基因植物或植物材料的下游用途包括农艺学用途、 药物用途、以及工业用途，例如人类食品、动物饲料、生物燃料、工业酒精、发酵原料、以及类似物。发明详述概述本发明是针对用于转基因表达多结构域酶的植物的用途。高等植物特别有用于异源蛋白的生产，这是由于植物易于进行大规模生产，它们不像细菌重组蛋白生产系统一样需要无菌状态，并且在植物中由转基因编码的蛋白质的水平可以超过总蛋白含量的1 %。迄今为止，在植物中已经成功表达了一些商业上感兴趣的蛋白质，包括多种抗体、疫苗抗原、 蛋白质变应原、酶以及酶抑制剂、凝血因子、细胞因子以及激素。然而，表达高水平的稳定的并且功能性蛋白仍然是许多科学和生物技术意图(包括生产用于农业和治疗目的的蛋白质)的瓶颈。因此，在此提供了用于改进植物细胞中的多结构域酶的表达量、稳定性、和/或活性的方法以及组合物。这些方法包括向植物细胞中引入一种核酸构建体，该核酸构建体包括修饰的多结构域酶，其中在所述多结构域酶中的天然连接序列已经被异源连接序列所代替，该异源连接序列不被植物蛋白酶切割。对于“异源的”连接序列，旨在是一种对于被修饰的酶不是天然的(即，并不天然发生在野生型序列中)的连接序列。该连接序列可以从一种不同种类或生物得到，或可以是合成的连接序列(即，在任何生物中都不是天然存在的) 或可以是修饰的天然连接序列。不被植物蛋白酶所切割的连接区域不旨在限于由宿主植物生产单一的多肽，但是当该多结构域酶的连接区域是天然序列时旨在是指优选生产全长多肽(与产生的多肽的范围相比较)。该修饰的多结构域酶的组成为至少一个第一结构域、至少一个异源连接物、以及至少一个第二结构域。该第一结构域和该第二结构域是非异源的序列。对于“非异源的”，是旨在该第一结构域和该第二结构域是从相同的天然多结构域酶得到的并且可以包含较少的修饰，这导致了一种结构域多肽序列，它与天然多肽序列是大于80%—致的、大于85% 一致的、大于90%—致的、大于95%—致的、大于96%—致的、大于97%—致的、大于98% 一致的、或大于99% —致的。在不同的实施方案中，当与一种对照核酸构建体相比时，编码在此所述的修饰的多结构域酶的核酸构建体导致了该植物细胞中该酶的表达、稳定性和/或活性的增加。在表达、稳定性、或活性上的增加是指一种酶活性酶的可测量的量的增加。一种酶的稳定性还涉及它的构象稳定性(反映在酶的三维结构方面)、或它的化学稳定性(是指酶的组成氨基酸的化学构成)。应该认识到的是，在异源系统中合成的多肽能够以大小范围进行生产。所生产的百分比的多肽可以是全长酶，它被定义为从编码序列以其整体进行翻译而得到的多肽；然而，还可以生产更小的多肽或更大的多肽。更小的多肽可以是通过多肽的蛋白质分解加工来加工多肽的结果，而更大的多肽可以是向多肽添加碳水化合物的结果。本申请描述了一种用于在宿主植物中生产多结构域蛋白的方法，其中所生产的全长多肽的量与当该多结构域酶包含天然连接物时所生产的全长多肽的量相比是更大的。用对植物蛋白酶的切割具有抵抗性的异源连接物代替天然连接物将导致更大量的由该宿主植物生产的全长多结构域酶。虽然不受任何特定理论或机理的束缚，这种增加可以归因于酶的在翻译方面的增加或在降解方面的降低、和/或酶的在催化活性方面的增加。在另一个实施方案中，这种增加涉及一种全长多结构域酶的在表达、稳定性、和/或活性方面的增加。为了本发明的目的，一种全长多结构域酶是指包括至少一个功能结合结构域、连接物、以及功能催化结构域的一种多结构域酶。具有“功能结合结构域”的修饰的蛋白质是其中结合特性实质上类似于天然蛋白在其天然环境中的结合特性的蛋白质、或相对于天然蛋白在其天然环境中的结合特性是改进的蛋白质。同样，具有一个“功能催化结构域”的一种修饰的蛋白质是其中催化特性实质上类似于天然蛋白在其天然环境中的催化特性的蛋白质、或相对于天然蛋白在其天然环境中的催化特性是改进的蛋白质。对于“实质上类似”(“基本上类似”)，是指天然蛋白的至少约80%或更大的结合特性或催化特性。本领域的普通技术人员将认识到，任何特定的多结构域蛋白的一个或少数几个氨基酸的缺失可能对于该蛋白质的稳定性或活性没有显著影响。在一个实施方案中，当与一种对照相比时，在表达、全长多肽的量、稳定性、和/或活性方面的增加是至少大约10%、至少大约20%、至少大约30%、至少大约40%、至少大约 50%、至少大约60%、至少大约70%、至少大约80%、至少大约90%、至少大约2倍、至少大约3倍、至少大约4倍、至少大约5倍、至少大约6倍、至少大约7倍、至少大约10倍、至少大约20倍、或更大。对于“对照”核酸构建体，是指一种包括编码一种多结构域酶的核苷酸序列的核酸构建体，该多结构域酶具有一个天然连接序列、或已知的将被一种植物蛋白酶所切割的连接序列。除非另外说明，该对照构建体包括编码一种具有一个天然连接序列的多结构域酶的一种核酸。一种“天然结构序列”是指存在于生物体内的多结构域序列(该多结构域序列从该生物体得到)中的连接序列(即，天然发生的连接序列)。因此，本发明的这些方法在当前的实践(用于栽培多种作物植物为了获得商业上所希望的、具有一种多结构域酶的增加的表达、稳定性和/或活性的植物材料)与将这些作物植物的残余物作为一种生物质的来源用于生产可发酵的糖类、或用于农业、药物和/或人类消费的用途的整合中找到了特定的用途。对于“作物植物”，是指出于生产人类所寻求的、用作口服消费的、或者是在工业、 药学、或商业过程中加以利用的植物材料的目的而种植的任何植物。本发明可以应用到许多种植物的任何一种，包括但不仅限于玉米、小麦、稻、大麦、大豆、棉花、高粱、燕麦、烟草、 芒草(Miscanthus grass)、柳枝稷(Switch grass)、树、一般的豆类、油菜(rape)/低芥酸菜籽、苜蓿、亚麻、向日葵、红花、粟、黑麦、甘蔗、甜菜、可可、茶树、芸苔属(Brassica)、棉花、咖啡、甘薯、亚麻、花生、三叶草；蔬菜(例如，莴苣、番茄、葫芦、木薯、马铃薯、胡萝卜、萝
卜、豌豆、小扁豆、甘蓝、花椰菜、西兰花、抱子甘蓝、胡椒(P印per)、以及菠萝(cucurbits， cassava, potato， carrot， radish， pea， lentils， cabbage， cauliflower， broccoli，Brussels sprouts, peppers, and pineapple)；果树(例如，柑橘树、苹果树、梨树、桃树、杏树、胡桃树、鳄梨树、香蕉树、以及椰子树(tree fruits such as citrus, apples, pears, peaches, apricots, walnuts, avocado, banana, and coconut ；) ； ΙΜΜ^ Ψ ( 歹ll女口， 乃馨、以及玫瑰)。如在此使用的，术语“植物部分”或“植物组织”包括植物细胞、植物原生质体、植物可以由之再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛(Plant clumps)、以及在以下植物或植物的部分中的完整植物细胞，这些植物的部分是如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、 枝、果实、核、穗、穗轴、外壳、茎、根、根尖、花药，等等。在一个实施方案中，该植物是一种无限生长植物。这些品种在温带地区营养性地进行不限定时期的生长。这些品种可以被工程化以便在液泡中积累所感兴趣的多肽并且可以生长直到初霜期(first frost)。在那时，该植物可被允许干燥、收获干燥，并用于食品、 牲畜饲料、或用于生物质转化或其他商业上有用的过程中。如在此所使用的，“生物质”或“原料”是指有用的生物材料(包括感兴趣的产物)， 该材料会被收集并且旨在进行进一步加工以便将该感兴趣的产物分离或浓缩。该生物质或原料可以包括果实或它的多个部分，或种子、叶、或茎或根，其中这些是用于工业目的而特定感兴趣的植物部分。“生物质”，当它指植物材料时包括植物的任何一种结构或多种结构， 该结构包含或代表所感兴趣的产品。在此使用的冠词“一种”和“一个”是指一个或多于一个(即，至少一个)的该冠词的合乎语法的对象。作为举例，“要素”(元件)是指一种或多种要素。贯穿本说明书，单词“包括”或其变体例如“包括了”(" comprises")或“包括”“包含”(“comprising") 应被理解为意味着包括一种所陈述的要素、整体或步骤，或成组的要素、整体或步骤，但是不排除任何其他要素、整体或步骤，或成组的要素、整体或步骤。“分离的”是指“通过人工”从其天然状态而被改变；S卩，如果它在自然界中发生，则它已经被改变从其原始环境移出，或两者并存。例如，在活的动物中以其天然状态而天然存在的一种天然发生的多核苷酸或多肽是未被“分离的”，但是按照在此采用的术语，从其天然状态的共存物质中分离出的同样的多核苷酸或多肽则是“分离的”。例如，就多核苷酸而言，术语分离的是指它从其天然发生在其中的染色体和细胞中分离出。假如将一种序列从它在其中天然发生的染色体和细胞中分离出但是将其插入它并不在其中天然发生的遗传背景、染色体、或细胞中，则该序列也是分离的。多结构域酶本发明的这些方法包括修饰的多结构域酶。一种“多结构域酶”或一种“多结构域蛋白”是指包含两个或更多个结构域的任何蛋白质。这些区域可以是在单一的多肽上； 它们还可以在不同的多肽上。结构域通常被视为是可以自主折叠(Wetlaufer(1973)Proc. Natl Acad. Sci. 70 :697-701)的紧凑的、半独立的单元(Richardson(1981)Advan. Protein Chem. 34 :167-339)。示例性的区域包括免疫球蛋白超家族恒定域(如CH2或CH3结构域)、受体结合结构域、配体结合结构域、酶的或催化的结构域、纤连蛋白结构域、锚定结构域(dockerin domain)、等等。在不同的实施方案中，在此涵盖的多结构域酶包括至少一个第一结构域、至少一个第一连接物、以及至少一个第二结构域。在一些实施方案中，该多结构域酶包括至少一个第一结合结构域、至少一个第一连接物、以及至少一个第一催化结构域。结合结构域是一种非催化结构域，涉及底物结合或特定的蛋白质相互作用。一经结合，蛋白质可能经历构象变化。因此，这些结合结构域对于许多蛋白质的功能是必要的。术语“催化结构域”在此被定义为具有该多结构域酶的催化活性的该酶的氨基酸序列的结构部分或区域。“连接物”(接头)(linker)被定义为连接两个结构域的区域。在多个结构域之间的连接在一个结构域相对于另一个的定位中起到重要的结构作用，或该连接仅仅可以将两个结构域彼此限定在一定的距离之内。该连接区域还可以包括用于蛋白酶切割的位点。多结构域酶的连接区域典型地是三维地线性的区域，它是将两个结构域连接在一起的柔性铰链。高等生物的多种蛋白质具有由一串可移动的模块组成的多结构域结构 (Doolittle (1995) Annu Rev Biochem. 64 :287-314)。到现在为止所鉴定的这些模块具有确定的结合和/或催化功能(即结合结构域或催化结构域)，但是一些可以仅充当仅为了将结合表面安排在空间而需要的简单间隔元件(即，连接区域)。用于蛋白质结构预测(包括结构域识别和连接序列预测)的多种软件应用描述 T Lobley(2009)Bioinformatics Advance Access Online, May 7,2009 ；Bryson(2005) Nucl. Acids Res. 33(网络服务器发行):W36-38 Jones (1999) J. Mol. Biol. 292 :195-202 ； McGruffin and Jones (2003)Bioinformaticsl9 :8740881 Jones (1999)J. Mol. Biol 287 797-815 Jones(2007)Bioinformatics 23 :538-544 Jones et al (1994)Biochem. 33 3038-3049 ；Ebina et al. (2009) Biopolymers 92 (1) : 1-8 中，并且一些程序在因特网上是可得到的，例如在 www. tuat. ac. jp/ domserv/cgi-bin/DLP-SVM. cgi ；在 www. predictprotein.org/about.html; 以及在 bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/index. html#more。连接物在此提供了用于改进植物中多结构域酶的表达、稳定性、和/或活性的方法以及组合物。这些方法包括向植物细胞中引入一种核酸构建体，该核酸构建体包括一种修饰的多结构域酶，其中在修饰的多结构域酶中的天然连接序列已经被异源连接序列所代替，该异源连接序列不被植物蛋白酶切割。该异源结构序列可以对于植物蛋白酶的切割具有抵抗性，由于用蛋白酶不敏感位点代替蛋白酶敏感位点，或通过改变多结构域酶的结构构象，从而使得蛋白酶敏感位点对于植物蛋白酶是难以进入的。“蛋白酶敏感的”位点是被一种特定的植物蛋白酶识别并且切割的氨基酸残基或序列。如以上所讨论的，对于蛋白酶切割敏感的酶可以经历完全水解，直接影响其最终产率，或可以经历部分修整，由此改变最终蛋白产物的活性或均质性。因此，在多结构域蛋白中用异源连接序列代替天然连接序列可以导致酶的在完整性、结构不均勻性和/或生物活性方面的改进。来自不同酶的连接序列很少共享任何明显的序列同源性，但是它们的氨基酸组成是典型地富含脯氨酸和羟基氨基酸(Gilkes et al. (1991)Microbiol. Rev. S5, 303-315 ； IMM Claeyssens and Tomme (1989) in Tkichalenna reesei Cellulases :Biochemistry, Genetics,Physiology and Application(Kubicek, C. P. ,Eveleigh,D. Ε. ,Esterbauer,H., Steiner, W. , and Kubicek-Pranz, Ε. Μ. ,eds)pp. 1-11,Proceedings,Tricell(1989) Royal Society of Chemistry))。大体上，连接物可以是在大约5至60个氨基酸残基之间、在大约15至50个氨基酸残基之间、以及在大约25至45个氨基酸残基之间。对于T. reeseiCBHl 的连接肽的讨论，参见，例如 Srisodsuk et al.，1993，J. Biol. Chem. 268 (28) 20756-20761 (将其通过引用以其整体结合在此)。在本发明的一个实施方案中，该天然连接序列被从一种真菌生物或从一种细菌中得到的连接序列所代替。虽然不受任何特定理论或机理的束缚，从细菌或真菌生物得到的
连接序列对于植物酶的切割可以是更不敏感的。通过对于“从......得到”，是指该异源
连接序列是在由生物表达的蛋白质中鉴定的并且在此处所涵盖的修饰的多结构域酶中被用作连接序列。在修饰的多结构域酶中的天然连接序列可以用与真菌或细菌蛋白中鉴定的连接序列相同的连接序列所代替，或可以被进一步修饰以改进植物中的连接序列的功能性 (包括但不局限于，使用植物偏爱密码子以改进修饰的酶在植物中的表达和/或用植物蛋白酶不敏感位点代替一个或多个植物蛋白酶敏感位点)。在另一个实施方案中，用于改进多结构域酶的表达、稳定性、和/或活性的方法包括用一个或多个包括糖基化位点序列的残基代替连接区域内的一个或多个切割敏感性残基(或通过加入一个或多个糖基化位点序列)。在许多的多结构域酶中的糖基化的作用包括在催化核心与结合结构域之间提供足够的空间分离，并且包括保护该连接肽免于蛋白水解作用(Srisodsuk et al.，1993，J. Biol. Chem.，268，20756-20761 ；Clarke, 1997, Biodegradation of cellulose. In Enzymology and biotechnology. Technomic Publishing, Pennsylvania, p. 55)。因此，虽然不受任何特定理论或机理的束缚，为了增加糖基化而修饰多结构域酶的连接区域可以防止修饰的多结构域酶被植物酶蛋白质分解降解。在一个实施方案中，该异源连接区域包括一个或多个N-连接的糖基化位点。 “N-连接糖基化”位点包括对于N-连接糖基化敏感的氨基酸残基或序列。在不同的实施方案中，该异源连接物包括一个或多个N-连接糖基化共有序列，包括一个或多个Asn-X-Ser/ Thr/Cys序列，其中X是除了脯氨酸以外的任何氨基酸。可替代地，或另外地，该异源连接区域包括一个或多个0-连接糖基化位点。“0-连接糖基化位点”包括对于0-连接糖基化敏感的氨基酸残基或序列。迄今为止，还没有鉴定出对于0-糖基化的共有初级氨基酸序列，然而，已经提出了不同的结构基序(参见，例如 Young et al.，1979，Biochemistry. 18(20) :4444-4448 ；Muller et al.，1997，J Biol Chem. 272(40) :24780-24793 ；Yoshida et al. ,1997, J Biol Chem. 272(27) :16884-16888; Gooley et al. (1991)Biochem Biophys Res Commun. 178(3) :1194-1201 ；以及 Christlet Veluraja (2001) Biophys. J. 80 (2) =952-960，它们中的每一个都通过引用以其整体结合在此)。因此，在不同的实施方案中，该异源连接区域包括一个或多个0-连接糖基化结构基序，包括但不局限于 Thr-Ala-Pro-Pro、Thr-Val-X-Pro、Ser/Thr-Pro-X-Pro、以及 Thr-Ser-Ala-Pro 的一个或多个。可替代地，该异源连接序列可以从糖基化蛋白(包括一种植物糖蛋白)的连接序列得到。近年来，已经公布了许多糖基化蛋白的序列。SWISSPROT、PIR、PROSITE、PDB、EMBL、 HSSP、LISTA、以及MIM数据库包含糖基化蛋白条目。许多O-连接糖基化蛋白在0-GLYCBASE 数据库(Gupta et al. (1999)Nucleic Acids Research 27:370-372)中列出。在又另一个实施方案中，一种多结构域酶的天然连接区域可以用一种跨膜蛋白的跨膜结构域的全部或一部分来代替。某些膜蛋白是“跨膜蛋白”并且它们具有与细胞外环境相互作用的细胞外结构域、与细胞内环境相互作用的细胞内结构域、以及横跨细胞脂双层的跨膜结构域。包括“跨膜区域”的“跨膜结构域”是指位于质膜内的跨膜蛋白的结构域，并且还可以包括相应的细胞质(细胞内)和细胞外环。因此，跨膜蛋白的所有或基本上所有的跨膜区域可以用作一种多结构域酶中的连接序列。跨膜蛋白的TMPDB数据库描述于(Ikeda et al. (2003)Nucleic Acids Res. 31 :406-409)。跨膜蛋白的蛋白质数据库(PDBTM)描述于 Tusnddy et al. (2004) Bioinformatics 20(17) :2964-72 以及 Tusn ady et al. (2005) Nucleic Acids Res. 33 (Database issue) :D275_8 中。一种多结构域酶的表达、稳定性、和/或活性还可以通过去除在连接序列之内的蛋白酶切割位点来改进。许多种植物蛋白酶和它们的目标切割位点序列在本领域是已知的。修饰的多结构域酶可以通过用从其他的蛋白质得到的连接区域代替天然连接区域来产生，或可以通过诱变方法来产生。在一个实施方案中，位点定向诱变或随机诱变被用来修饰在连接序列之内的一个或多个位点以产生对蛋白酶切割更不敏感的连接物。在另一个实施方案中，使用定向进化方法来改进这些连接区域。在过去的几年里，定向进化已经出现作为接近合理设计的一个替代方案，使之能够改进结构和功能特性(如在不同条件下的稳定性和性能)或在它们的反应和底物特异性方面的改变(Tao and Cornish(2002) Curr Opin Chem Biol 6:858-864)。胜于设计有限数目的位点定向突变体，定向进化实现了一种迭代的Darwinian优化方法，由此从随机突变的总体中选出最合适的变体。通过筛选或选择感兴趣的特性来鉴定改进的变体，并且它们的编码基因然后被用作对于随后的进
(round of evolution)白勺.* ! (Roodveldt et al. (2005) Current Opinion in Structural Biology 15(1) :50-56)。对于改进的变体的筛选或选择能够以两种途径来进行筛选或选择蛋白质自身的功能或筛选或选择一种报告蛋白的活性。筛选或选择蛋白质自身的功能将根据被评价的多结构域蛋白的活性而变化。用于筛选或选择一种报告蛋白的活性的方法在本领域中是已知的。参见，例如，美国专利公开20090092982，它描述了一种将蛋白质(或蛋白质的变体)的折叠状态和/或稳定性与可筛选的(例如可选择的)表型相结合的方法，这种表型(例如抗生素抗性)由分开的实体所赋予。这种可筛选的表型被用来评定稳定性。纤维素酶在本发明的不同实施方案中，这种修饰的多结构域酶是一种纤维素降解酶。植物是纤维素基质的丰富来源，因此，在纤维素原料中表达纤维素降解酶将最小化或消除对于酶的外源加入的需要。因此，在此提供了编码一种修饰的纤维素酶的核苷酸序列。出于本发明的目的，“纤维素酶”是一种能够催化l-4-β -D-糖苷键的水解的酶，并且是由至少一个催化结构域和至少一个选自下组的其他结构域组成的，该组由催化结构域和纤维素结合结构域组成。多种纤维素酶的结构描述于Gilkes et al. (1991)Microbiological Reviews55(2) :303_315，将其通过引用以其整体结合在此。使用根据本发明生产的转基因生物质的纤维素降解过程比起常规方法可以更廉价地、容易地、并且更环境安全地进行。在此涵盖的修饰的纤维素酶具有连接序列，当该修饰的纤维素酶表达于植物中时，该连接序列导致更少的切割。在一些实施方案中，当表达于植物中时，小于大约90%的修饰的酶被切割，当表达于植物中时，小于大约80%、小于大约70%、小于大约60%、小于大约50 %、小于大约40 %、小于大约30 %、小于大约20 %、小于大约10 %、小于大约5 %、或没有修饰的酶被切割。由于如以上所讨论的蛋白酶敏感的切割位点的代替或保护，该异源连接序列可以导致更少的切割。因此，相对于一种对照纤维素酶，在此所涵盖的修饰的纤维素酶具有改进的表达、稳定性、和/或活性。在不同的实施方案中，用一种改进的连接序列代替一种或多种天然连接序列导致了全长纤维素酶在表达量、稳定性、和/或活性方面的增加。这种全长酶包括至少一个结合结构域、至少一个异源连接物、以及至少一个催化结构域。这种全长蛋白的一个特殊优点是结合结构域特别是纤维素结合结构域的保留。虽然不受任何特定理论或机理的束缚，在修饰的纤维素酶中的纤维素结合结构域的存在可以导致在不溶性纤维素底物(如微晶纤维素)在水解方面的改进。在一些实施方案中，相应于SEQ ID NO 2的氨基酸残基471直至499的天然连接序列被异源连接序列所代替。可替代地，与SEQ ID NO :2同源的纤维素酶中的一个天然连接序列被一个异源连接序列所代替。将理解的是，同源纤维素酶序列的天然连接区域可以比由SEQ ID N0:2的氨基酸残基471直至499定义的连接区域短或长1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或更多个氨基酸。在本发明的不同实施方案中，该核苷酸序列编码了一种纤维素酶，该纤维素酶包括SEQ ID N0:18、19、或20中列出的连接序列。基于这个信息，连同关于纤维素酶结构特征的本领域的详细信息，可以设计另外的异源连接序列并且测试在植物细胞中的表达。用于监测纤维素酶的表达、加工(包括切割)、以及活性的方法在本领域是已知的。在一个实施方案中，修饰的多结构域酶是一种纤维二糖水解酶或一种葡聚糖内切酶。纤维二糖水解酶和葡聚糖内切酶是结构上类似的并且经常由多个结构域组成。至少一个结构域是一个催化核心结构域，该催化核心结构域可以与另外的催化结构域或至少一个纤维素结合结构域(CBD)相结合。这两个结构域是通过具有6-59个氨基酸的相对长的、糖基化的连接肽进行连接的。术语“纤维二糖水解酶”(CBH)是指如EC 3. 2. 1. 91所分类的一组纤维素酶。这些酶还称为外切葡聚糖酶或外纤维二糖水解酶。CBH酶已经从多种来源分离出来，这些来源包括微生物来源，如细菌、酵母、以及真菌，它们中的每一种被包括在此。在不同的实施方案中，该CBH酶是一种修饰的纤维二糖水解酶I (CBHI)酶。CBHl在微晶纤维素的分解中起着关键作用(Claeyssens et al. (1990)Biochem J 270(1) :251-256 ；以及，Wood et al. (1989) Biochem J 260(1) :37-44)。通常，一种CBHl类型的酶优先地从纤维素的还原端水解纤维二糖，而一种纤维二糖水解酶II(CBH2)类型的酶优选水解纤维素的非还原端。葡聚糖内切酶(l，4-p_D-葡聚糖葡聚糖水解酶；EC 3. 2. 1. 4)是普遍存在的水解靠近未取代的葡萄糖残基的1,4-β键的酶(Henrissat et al. (1989)Gene81 :83-95)，是由宽范围的生物产生的，包括真菌、细菌、植物、以及昆虫。葡糖淀粉酶在本发明的不同实施方案中，这种修饰的多结构域酶是一种淀粉降解酶。淀粉降解酶广泛分布遍及许多动物、植物以及微生物种类。这些酶已经被分类为α-淀粉酶和葡糖淀粉酶，属于糖苷水解酶家族13、14或15。在不同的实施方案中，本发明包括一种修饰的葡糖淀粉酶。葡糖淀粉酶类(α -1，4-葡聚糖葡萄糖水解酶类Ε. C. 3. 2. 1. 3)是淀粉水解外切活性的糖酶类。葡糖淀粉酶类催化了连续的葡萄糖单元从淀粉或相关的寡聚糖以及多糖分子的非还原端去除，并且可以水解淀粉(淀粉酶和支链淀粉)的直链糖苷键和分支糖苷键两者。商业上，葡糖淀粉酶是非常重要的酶类，它们已经用于需要淀粉水解的多种多样的应用中。可以通过在本发明的所收获的植物材料中的至少一个种类中异源表达葡糖淀粉酶提供葡糖淀粉酶。与其他多糖降解酶类似，大多数葡糖淀粉酶具有模块结构，该模块结构的组成为 催化结构域、淀粉结合结构域、以及高度0-糖基化的连接物，该连接物将这两个结构域进行连接(Bourne and Henrissat (2001)Curr. Opin. Struct. Biol. 11(5) :593-600 ； Sauer et al. (2000) Biochim. Biophys. Acta. 1543 (2) :275-293)。对于这类酶的催化部位、作用机理、底物识别、连接区域、以及多结构域构造的描述可以在Sauer et al. (2000)Biochim. Biophys. Acta. 1543(2) :275-293中找到，将其通过引用以其整体结合在此。在此涵盖的修饰的葡糖淀粉酶具有连接序列，当该修饰的葡糖淀粉酶表达于植物中时，该连接序列导致较少的切割。在一些实施方案中，当表达于植物中时，小于大约90% 的修饰的酶被切割，当表达于植物中时，小于大约80%、小于大约70%、小于大约60%、小于大约50 %、小于大约40 %、小于大约30 %、小于大约20 %、小于大约10 %、小于大约5 %、 或没有修饰的酶被切割。由于如以上所讨论的蛋白酶敏感的切割位点的代替或保护，该异源连接序列可以导致较少的切割。在本发明的不同实施方案中，该修饰的葡糖淀粉酶包括 SEQ ID N0:18、19、或20中列出的连接序列。因此，相对于一种对照葡糖淀粉酶，在此所涵盖的修饰的葡糖淀粉酶具有改进的表达、稳定性、和/或活性。植物表达盒本发明的这些组合物还包括用于在感兴趣的一种植物细胞中转化并表达多结构域酶的核酸序列。这些核酸序列可以存在于DNA构建体或表达盒中。如此处使用的“表达盒”表示能够在适当的宿主细胞中指导一种特定核苷酸序列的表达的一种核酸分子，包含可操作地连接到感兴趣的核苷酸序列(即，编码感兴趣的多肽的一种核苷酸序列)(它被可操作地连接到终止信号)的启动子。它还典型地包括用于核苷酸序列的正确翻译所需要的序列。包含这种感兴趣的核苷酸序列的表达盒可能是嵌合体的，意味着它的至少一种组分对于它的至少一种其他组分是异源的。该表达盒也可以是天然发生的但已经是以有用于异源表达的一种重组体形式获得的表达盒。然而，典型地，该表达盒对于宿主是异源的，即，该表达盒的特定DNA序列并不天然发生于该宿主细胞内，并且必须通过转化事件而被引入该宿主细胞或该宿主细胞的祖先(ancestor)中。在该表达盒中的核苷酸序列的表达可以在组成型启动子或诱导型启动子的控制之下，该启动子只有在该宿主细胞暴露于一些特定的外部刺激时才引发转录。另外，该启动子对于一种特定的组织或器官或发育阶段也可以是特异性的。本发明涵盖了具有表达盒的植物的转化，这些表达盒能够在植物细胞中指导多结构域酶的表达。该表达盒将在5'至3'的转录方向上包括转录和翻译起始区(例如，一种启动子)以及一种编码修饰的多结构域酶的多核苷酸。该表达盒可以任选地包括在植物中起作用的转录和翻译终止区(即终止区)。此外，该构建体还进一步包括另外的调控元件，从而促进修饰的多结构域酶的转录、翻译、或转运。该表达构建体的调节序列被可操作地连接到编码修饰的多结构域酶的多
12核苷酸上。对于“可操作地相连”，是指在调节元件与第二序列之间的功能性连接，其中该调节元件引发和/或介导了相应于第二序列的DNA序列的转录、翻译、或易位。通常，可操作地连接意味着被连接的核苷酸序列是连续的。这些调控元件包括启动子、增强子、以及用于将细胞质合成的蛋白靶向该植物细胞的内膜系统的信号序列。所表达的多结构域酶还可以被靶向到某些细胞器(如液泡)中以缓解毒性问题。 为了液泡靶向的多结构域酶的表达，用包括液泡靶向序列(如形成烟草甲壳酶基因)的载体转化植物。在这种情况下，所表达的多结构域酶将被存贮在液泡中，其中它们将不能够降解纤维素并且危害植物。在本发明的一个实施方案中，该液泡分选信号序列是由大麦多氨基氧化酶2(BPA02)信号序列衍生的。BPA02具有一种用于进入分泌途径的N端信号肽。 这个信号肽的C-末端延伸的存在导致BPAO在植物细胞中的液泡定位(参见Cervelli et al. (2004)The Plant Journal 40:410-418)。在另一个实施方案中，有用的液泡分选信号描述于美国申请号12/359,421中，将其通过引用以其整体结合在此。在本发明的不同的实施方案中，修饰的多结构域酶编码序列被融合到在植物中活性的启动子上并且被转化到核基因组或质体基因组中。叶绿体表达具有的优点是，该多结构域酶对于质体是较少损害的，因为它包含很少的或没有纤维素。在其他的实施方案中，该构建体在转录的5'到3'的方向上包括转录和翻译起始区(即，启动子)、一种编码内质网信号序列的多核苷酸、以及一种编码修饰的多结构域酶的多核苷酸。示例性的信号序列包括SEKDEL(SEQID NO 23)内质网靶向序列、Y玉米蛋白27kD信号序列、以及大豆的大豆球蛋白GYl信号序列。在本发明的方法中有用的其他方法对于本领域的普通技术人员而言将是清楚的。在本发明的实践中可以使用任何能够在感兴趣的植物中驱动表达的启动子。这种启动子可以是天然的或模拟的或外来的或与该宿主植物是异源的。当在此用来提及核酸序列(例如，DNA或RNA序列)或基因时，术语“异源的”和“外源的”是指源自对于特定的宿主细胞是外来的来源、或者如果源自相同的来源是自其原始形式被修饰的一种序列。因此， 在宿主细胞中的异源基因包括对于该特定宿主细胞是内源性的但是已经通过例如使用DNA 改组而修饰的一种基因。这些术语还包括一种天然发生的DNA序列的非天然发生的多份拷贝。因此，这些术语是指一种DNA区段，它是外来的或与该细胞异源的或与该细胞同源的但是处于该宿主细胞核酸的位置中(其中通常找不到该元件)。表达了外源DNA区段以产生外源性多肽。“同源的”核酸(如DNA)序列是与它被引入其中的宿主细胞天然相关联的一种核酸(例如DNA或RNA)序列。有待包括的启动子的选择取决于几个因素，包括但不限于效率、可选择性、诱导性、所希望的表达水平、以及细胞或组织优先的表达。对于本领域的技术人员而言，通过适当地选择并且相对于该序列来定位启动子以及其他的调节区域而调整一种序列的表达是一种惯例。一些适当的启动子仅仅或者主要在某些细胞类型中启动转录。因此，如在此所使用的，一种细胞类型或组织优先的启动子是优选在靶组织中驱动表达、但也可以在其他细胞类型或组织中导致某种表达的启动子。用于鉴定并表征在植物基因组DNA中的启动子区的方法包括例如以下参考文献中描述的那些Jordano，et al.，Plant Cell,l 855-866(1989) ；Bustos,et al. ,Plant Cell,1 :839-854(1989) ；Green,et al. ,EMBO J. 7， 4035-4044(1988) ；Meier, et al.，Plant Cell，3，309-316 (1991)；以及 Zhang, et al.， Plant Physiology 110:1069-1079(1996)。为了驱动绿色组织(如叶和茎)中的转录而在光合组织中活跃的启动子也是本发明感兴趣的。最适合的是仅仅或主要在此类组织中驱动表达的启动子。该启动子可以遍及该植物组成性地、或对于绿色组织差异性地、或对于其中发生表达的绿色组织的发育阶段差异性地、或响应外部刺激来赋予表达。此类启动子的实例包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(RbcS)启动子，如来自美洲落叶松(Larix laricina)的 RbcS 启动子、松树 cab6 启动子(Yamamoto et al. (1994)Plant Cell Physiol. ；35 :773-778)、来自小麦的 Cab-I 基因启动子(Fejes et al. (1990)Plant Mol. Biol. 15 :921-932)、来自菠菜的 CAB-I 启动子(Lubberstedt et al. (1994)Plant Physiol. 104 :997-1006)、来自水稻的 cablR 启动子(Luan et al. (1992)Plant Cell 4 971-981)、来自玉米的丙酮酸正磷酸双激酶(PPDK)启动子(Matsuoka et al. (1993)Proc Natl Acad Sci USA90 :9586-9590)、烟草 LhcblM 启动子(Cerdan et al. (1997) Plant Mol. Biol. 33 :245-255)、拟南芥SUC2蔗糖-H+同向转运体启动子(Truernit et al. (1995) Planta 196 :564-570)、以及来自菠菜的类囊体膜蛋白启动子psaD、psaF、psaE、PC、FNR、 atpC、atpD、cab、rbcQ。在美国专利申请号2007/0006346中描述了在茎、叶和绿色组织中驱动转录的其他启动子，通过引用将该申请以其全部内容结合在此。Hudspeth & Grula(Plant Molec Biol 12:579-589(1989))已经描述了一种编码磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉米基因。使用标准分子生物学技术，用于这种基因的启动子可以用来在转基因植物中以一种绿色组织特异的方式驱动任何基因的表达。在本发明的其他一些实施方案中，诱导型启动子可能是令人希望的。诱导型启动子响应于外部刺激(如化学试剂或环境刺激)而驱动转录。例如，诱导型启动子可以响应于激素类(如赤霉酸或乙烯)、或响应于光或干旱而赋予转录。用一种化学上诱导型启动子，通过叶敷一种化学诱导剂，可以在适当的时间活化转化到植物中的多结构域酶基因的表达。可以得到许多种转录终止子用于表达盒中。这些负责对越过该转基因的转录终止和正确的mRNA聚腺苷酸化。该终止区可以是与该转录起始区天然在一起的、可以与感兴趣的可操作地连接的DNA序列天然在一起的、可以与该宿主植物天然在一起的、或者可以是源自另一种来源(即，对于该启动子、该感兴趣的DNA序列、该宿主植物、或它们的任何组合是外来的或异源的)。适当的转录终止子是已知在植物中发挥作用的那些，并且包括CAMV 35S终止子、tml终止子、胭脂碱合成酶终止子以及豌豆rbcS E9终止子。这些终止子可以在单子叶植物和双子叶植物中使用。此外，可以使用一种基因的天然转录终止子。在某些实施方案中，该表达盒将包括一种选择性标记基因用于选择转化的细胞。 利用选择性标记基因来选择转化的细胞或组织。已经发现众多序列增强了来自转录单位内的基因表达并且这些序列可以与本发明的基因结合使用来增加它们在转基因植物中的表达。已经显示不同的内含子序列增强了特别是在单子叶植物的细胞中的表达。例如， 已经发现在将玉米Adhl基因的内含子引入玉米细胞中时显著增强了在其同源启动子下的野生型基因的表达。已经发现内含子1是特别有效的并且增强了在与氯霉素乙酰转移酶基因的融合构建体中的表达(Callis et al.，Genes Develop. 1 1183-1200 (1987))。在同一个实验体系中，来自玉米青铜色1基因(maize bronze lgene)的内含子在增强表达方面具有相似的效果。常规地已经将内含子序列结合到植物转化载体中，典型地在非翻译前导序列之内。也已知许多源自病毒的非翻译前导序列增强了表达，并且这些序列在双子叶植物的细胞中是特别有效的。确切地说，已经显示来自烟草花叶病毒01^，“1-序列”)、玉米枯黄斑点病毒(MCMV)、以及苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列在增强表达方面是有效的(例如，Gallie et al. Nucl. Acids Res. 15 :8693-8711 (1987) ；Skuzeski et al. Plant Molec. Biol. 15 :65-79(1990))。本领域中已知的其他前导序列包括但不限于细小核糖核酸病毒前导序列，例如，EMCV前导序列(脑心肌炎5'非编码区)(Elroy-Mein，0.，Fuerst, T. R. , and Moss, B. PNAS USA 86:6126-6130(1989))；马铃薯 Y 病毒属前导序列，例如 TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Allison et al. , 1986) ；MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)；病毒学(154 9-20)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导序列(Macejak, D. G.， and Samow, P.，Nature 353 :90-94(1991))；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的未翻译前导序列(AMV RNA 4) (Jobling, S. Α.，and Gehrke, L.，Nature 325 :622-625(1987))； 烟草花叶病毒前导序列(TMV) (Gallie, D. R. et al.，Molecular Biology of RNA, pages 237-256(1989))；以及玉米枯黄斑点病毒前导序列(MCMV) (Lomme 1，S. A. et al.， Virology 81:382-385(1991))。还参见 Della-Cioppa et al.，Plant Physiology 84: 965-968(1987)。还应当认识到可以将编码这种修饰的多结构域酶的核苷酸序列进行优化用于在所转化的宿主细胞中增加表达。换言之，可以使用用于改进表达的宿主细胞偏爱密码子来合成这些核苷酸序列，或可以按照一种宿主偏爱密码子使用频率来使用密码子进行合成。通常，这种基因的GC含量将会增加。参见例如，Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92 :1-11的对于宿主偏爱密码子使用的讨论。在本领域中可以获得多种方法用于合成植物偏爱基因。参见例如，美国专利号5，380，831和5，436，391，以及Murray et al. (1989)Nucleic Acids Res. 17 :477_498，通过引用结合于此。植物在本发明中有用的植物包括对于修饰的多结构域酶是转基因的植物。本领域中的普通技术人员应当认识到，植物可以表达一种或多种另外的多肽序列，这种或这些多肽序列与一种或多种感兴趣的次级性状相关联或促成这种或这些性状。这些多肽可以是细胞质表达的、可以靶向一种亚细胞器、或可以是由该植物细胞分泌的。感兴趣的次级性状包括农艺学性状，这些性状主要是对种子公司、种植者、或谷粒处理机有益的，例如除草剂抗性、 病毒抗性、细菌性病原体抗性、昆虫抗性、线虫抗性、以及真菌抗性。参见例如美国专利号 5，569, 823 ；5, 304，730 ；5, 495, 071 ；6, 329，504 ；以及 6，337，431。一种感兴趣的次级性状还可以是提高植物活力或产量的性状(包括允许植物在不同的温度、土壤条件以及日光和降水量水平下生长的性状)、或是允许鉴定展现出感兴趣性状的一种植物的性状(例如，选择性标记基因、种皮颜色等)。有益于产生具有所希望的次级性状的植物的大量基因在本领域中是可获得的。
所选择的植物的类型取决于多种因素，包括例如收获的植物原料的下游使用、植物物种对转化的适应性、以及在植物将要生长、收割、和/或加工之下的条件。普通技术人员将进一步认识到用于选择用于本发明适当的植物种类的另外的因素包括高产量潜力、 良好的茎强度、对特殊病害的抵抗力、耐旱性、快速干燥以及足以允许储存和输送至市场而具有最小损失的谷物质量。进一步考虑到本发明的构建体可以被引入具有改进的对于具体的下游用途是适合的或最佳的特性的植物种类中。例如，在具有改变的淀粉代谢的植物中自然发生的遗传变异性在本发明的这些方法中是有用的。许多此类植物在编码淀粉降解酶或淀粉合成酶的同种型的基因中携带多种突变。例如，已经鉴定出多种植物，它们对于糯性基因(wx)、直链淀粉扩充基因(ae)、 暗胚乳基因(du)、角质基因(h)、皱缩基因(sh)、易脆基因(bt)、粉质基因(fl)、不透明基因(O)、或甜质基因(su)的突变体等位基因中的一种或多种是杂合的或纯合的。参见例如，美国专利号 4，428，972 ；4，767，849 ；4，774，328 ；4789738 ；4，789，557 ；4，790，997 ； 4，792，458 ；4，798，735 ；以及4，801，470，通过引用结合在此。这些植物可以以它们天然形式进行使用，或可以进行修饰以展示一种或多种感兴趣的附加性状。对于具有增加的营养品质的植物，可以获得几个玉米品种，如具有增加的赖氨酸(Crow' s Hybrid Corn Company, Mil ford, 111)、增加的蛋白(BASF)以及增加的油 (Pfister Hybrid Corn Company, El Paso, 111.商标为KERNOIL )水平的那些。其他适当的高油玉米包括被称为伊利诺高油(IHO)以及亚历山大高油(Alexo)的玉米种群，它们的样品可以从 University of Illinois Maize Genetics Cooperative—Stock Center (Urbana, 111.)获得。还可以获得甜玉米，其中存在着在正常情况下在未成熟玉米粒中发现的淀粉量的降低以及葡萄糖、蔗糖和/或水溶性多糖的量的增加(Creech，R. and Alexander, D. Ε. In Maize Breeding and Genetics ；D. B. ffalden, Ed. ；John Wiley and Sons :New York, 1978 ；pp. 249-264) 在几种植物品种中(例如，玉米(Shannon & Garwood，1984)、豌豆 (Bhattacharyya et al.，1990)、马铃薯(Hovenkamp-Hermelink et al.，1987)、拟南芥 (Caspar et al. ，1985 ；Lin et al. ，1988a ；Lin et al. ，1988b) UR'M^· (Hanson et al.， 1988))，已经发现了具有一种改变的碳水化合物构成的突变体。几十年来褐色中脉(Bmr) 玉米已经被用作一种替代物用于改进青贮杂交体的可消化性。在反刍动物的摄入以及可消化性方面的改进是源自降低在Bmr突变的杂化体中的木质素含量。具有令人希望的、用于下游加工的性状(如在此说明)的另外的品种(自然发生的和转基因的)对于本领域的普通技术人员是熟知的。本发明中有用的植物还包括(但不限于)产生可食用的花的作物，例如花椰菜(Brassica oleracea)、朝鲜蓟(Cynara scolvmus)、以及红花(红花属，例如红花) artichoke (Cynara scolvmus), and saff lower (Carthamus, e. g. tinctorius) ； 7_K 果，例如苹果(苹果属，例如苹果)、香蕉(芭蕉属，例如小果野蕉)、浆果(例如荼薦子属植物， 荼薦子属，例如红醋栗)、樱桃类(例如甜樱桃，李属，例如欧洲甜樱桃)、黄瓜(黄瓜属， 例如黄瓜)、葡萄(葡萄属，例如葡萄)、柠檬(Citrus limon)、甜瓜(Cucumis melo)、坚果(例如胡桃，胡桃属，例如胡桃；花生，Arachis hypoaeae)、橙(柑桔属，例如柚)、桃(李属O^imus)，例如桃)、梨(梨属(Pyra)，例如西洋梨)、胡椒(茄属，例如珊瑚樱)、李子(李属，例如欧洲李)、草莓(草莓属，例如麝香草莓)(fruits such as apple (Malus, e. g. domesticus), banana(Musa, e. g. acuminata), berries (such as the currant, Ribes, e. g. rubrum), cherries (such as the sweet cherry, Prunus, e. g. avium), cucumber(Cucumis, e.g.sativus), grape(Vitis, e.g.vinifera), lemon(Citrus limon)， melon (Cucumis melo), nuts(such as the walnut, Juglans, e. g. regia ；peanut, Arachis hypoaeae), orange(Citrus, e. g. maxima), peach(Prunus, e. g. persica), pear(Pyra, e. g. communis)，pepper (Solanum, e. g. capsicum)，plum (Prunus, e. g. domestica)， strawberry (Fragaria，e. g. moschata))、番茄(番茄属，例如番茄)；叶类，例如苜蓿(苜蓿属，例如紫苜蓿)、甘蔗(Saccharum)、甘蓝(例如Brassica oleracea)、菊苣(菊苣属 (Cichoreum)，例如菊苣)、韭(葱属，例如韭葱)、莴苣(莴苣属，例如莴苣)、菠菜(菠菜属，例如菠菜(oleraceae))、烟草(烟草属，例如烟草)；根类，例如竹芋(竹芋属，例如竹芋)、甜菜(甜菜属，例如甜菜)、胡萝卜(胡萝卜属，例如野胡萝卜)、木薯(木薯属， 例如木薯)、芜菁(芸苔属，例如芜青)、萝卜(萝卜属，例如萝卜)、山药(薯蓣属，例如山 药)tomato(Lycopersicon, e. g. esculentum) ；leafs，such as alfalfa (Medicago， e. g. sativa) , sugar cane (Saccharum), cabbages(such as Brassica oleracea), endive(Cichoreum, e.g.endivia), leek (Allium，e. g. porrum), lettuce(Lactuca， e· g· sativa)，spinach (Spinacia e· g· oleraceae)，tobacco (Nicotiana，e. g. tabacum)； roots，such as arrowroot (Maranta，e.g.arundinacea), beet (Beta，e· g·vulgaris)， carrot (Daucus, e. g. carota), cassava (Manihot, e. g. esculenta), turnip (Brassica, e. g. rapa), radish (Raphanus，e. g. sativus) yam (Dioscorea, e· g· esculenta)、 甘暮 (Ipomoea batatas)；种子，例如豆(菜豆属，例如菜豆)、豌豆(豌豆属，例如豌豆)、大豆(大豆属，例如大豆)、小麦(小麦属，例如普通小麦)、大麦(大麦属，例如大麦)、玉米 (玉蜀黍属，例如玉蜀黍)、水稻(稻属，例如Oryza sativa) ((Phaseolus, e. g. vulgaris)， pea (Pisum, e. g. sativum)，soybean (Glycine, e. g. max)，wheat (Triticum，e. g. aestivum)， barley (Hordeum，e. g. vulgare) , corn (Zea, e. g. mays), rice (Oryza, e.g. sativa))； 草类，例如芒草(芒属，例如巨芒)以及柳枝稷(黍属，例如柳枝稷MMiscanthus grass (Miscanthus，e. g.，giganteus) and switchgrass (Panicum，e. g. virgatum))；树，例如白杨(杨属，例如欧洲山杨)、松树(Pinus)；灌木，例如棉花(例如Gossypium hirsutum) (poplar (Populus, e. g. tremula), pine (Pinus) ；shrubs, such as cotton (e· g·，Gossypium hirsutum))；以及块茎，例如甘蓝(芸苔属，例如甘蓝(oleraceae))、马铃薯(茄属，例如马铃暮)(tubers, such as kohlrabi (Brassica, e. g. oleraceae)，potato (Solanum, e. g. tuberosum))、以及类似物。植物转化在此描述的表达构建体能以几种本领域公认的方式引入植物细胞中。术语“引入” 在多核苷酸(例如，感兴趣的核苷酸构建体)的背景下是意指以这样一种方式将多核苷酸呈现在植物中，即该多核苷酸得到了进入植物细胞的内部的途径。在有待引入多于一个多核苷酸时，这些多核苷酸可以作为单个核苷酸构建体的一部分、或作为分开的核苷酸构建体来组装，并且可以位于相同的或不同的转化载体上。因此，这些多核苷酸可以在单一的转
17化事件中、在多个分开的转化事件中、或者例如在植物中作为育种试验计划的一部分被引入感兴趣的宿主细胞中。本发明的这些方法并不依赖于用于将一个或多个多核苷酸引入植物中的一种具体的方法，只要这个或这些多核苷酸得到了进入该植物的至少一个细胞的内部的途径。用于将多核苷酸引入植物中的方法在本领域中是已知的，包括但不限于瞬时转化法、稳定转化法、以及病毒介导法。“瞬时转化”在多核苷酸的背景下意指多核苷酸被引入植物中而并不整合到该植物的基因组中。在被引入植物中的多核苷酸的背景下，对于“稳定引入”或“被稳定地引入”是指被引入的多核苷酸被稳定地结合到该植物基因组中，并且因此该植物用该多核苷酸被稳定地转化。“稳定的转化”或“被稳定地转化”是意指被引入植物中的多核苷酸(例如，在此描述的核苷酸构建体)整合到该植物的基因组中并且能够被其子代更具体地说是被多个连续世代的子代遗传。可用于植物转化的众多转化载体对于植物转化领域的普通技术人员来说是已知的，并且与本发明相关的基因可以与任何这样的载体结合使用。载体的选择将取决于优选的转化技术以及用于转化的目标物种。对于某些目标物种，不同的抗生素或除草剂选择标记可能是优选的。在转化中常规使用的选择标记包括nptll基因，它赋予了对卡那霉素及相关抗生素的抗性(Messing & Vierra. Gene 19:259—268(1982) ；Bevan et al. , Nature 304 :184-187(1983)) ；bar基因，它赋予了对于除草剂草丁膦的抗性(White et al. ,Nucl. Acids Res 18:1062(1990) ；Spencer et al. Theor.Appl. Genet 79 :625-631 (1990))； hph基因，它赋予了对抗生素潮霉素的抗性(Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4 =2929-2931)；以及dhfr基因，它赋予了对于甲氨蝶呤的抗性(Bourouis et al.， EMBO J. 2 (7) :1099-1104(1983)) ；EPSPS基因，它赋予了对草甘膦的抗性(美国专利号 4，940，935和5，188, 642)；以及甘露糖_6_磷酸异构酶基因，它提供了使甘露糖代谢的能力 (美国专利号 5，767，378 和 5，994，629)。用于植物再生的方法在本领域中也是熟知的。例如，Ti质粒载体已用于递送外来 DNA、以及直接的DNA摄取、脂质体、电穿孔、显微注射、以及微粒轰击。此外，可以将来自农杆菌属的细菌用来转化植物细胞。以下是对用于转化双子叶和单子叶植物两者的代表性技术、以及一种代表性的质体转化技术的说明。许多使用根癌农杆菌用于转化的载体是可获得的。这些典型地携带至少一个 T-DNA边界序列，并且包括如pBmi9的载体(Bevan, Nucl. Acids Res. (1984))。对于在农杆菌转化中有用的载体的构建，参见例如美国专利申请公开文件号2006/(^60011，该公开通过引用结合在此。不使用根癌农杆菌的转化回避了在选择的转化载体中对T-DNA序列的需要，并且因此除了例如以上描述的含有T-DNA序列的载体之外，可以使用缺乏这些序列的载体。不依赖于农杆菌的转化技术包括通过粒子轰击、原生质体摄入(例如，PEG和电穿孔)以及微注射的转化。载体的选择主要取决于对被转化的品种的优先选择。对于这样的载体的构建， 参见例如美国申请号20060260011，该公开通过引用结合在此。为了本发明的核苷酸序列在植物质体中的表达，使用了质体转化载体pPH143(W097/32011，实例36)。将该核苷酸插入pPH143中由此替换PR0T0X编码序列。然后将这种载体用于质体转化以及对于大观霉素具有抗性的转化体的选择。可替代地，将该核苷酸序列插入PPH143中这样它替换了 aadH基因。在此情况下，针对PR0T0X抑制剂的抗性选择了转化体。对于双子叶植物的转化技术在本领域是熟知的并且包括基于农杆菌的技术以及不需要农杆菌的技术。非农杆菌技术涉及通过原生质体或细胞直接摄入外源性遗传物质。 这可以通过PEG或电穿孔介导的摄入、粒子轰击介导的递送、或显微注射来完成。这些技术的实例由 Paszkowski et al.，EMBO J. 3 :2717-2722 (1984) ；Potrykus et al.，Mol. Gen. Genet. 199 :169-177(1985) ；Reich et al. , Biotechnology 4:1001-1004(1986)；以及 Klein et al.，Nature 327:70-73(1987)进行了描述。在各自情况下，使用本领域中已知的标准技术将这些转化的细胞再生为全植株。农杆菌介导的转化是一种用于双子叶植物的转化的优选技术，因为它的转化效率高并且它的对于许多不同物种的实用性宽广。农杆菌转化典型地涉及将携带感兴趣的外源DNA(例如，pCIB200或pCIB2001)的二元载体转移到合适的农杆菌菌株中，这可能依赖于由宿主农杆菌菌株携带的或者在共同存在的Ti质体上或染色体上的vir基因的互补物(例如，用于 PCIB200 和 pCIB2001 的菌株 CIB542(Uknes et al. Plant Cell 5 159-169(1993)))。将重组二元载体转移到农杆菌是使用携带该重组二元载体的大肠杆菌、 一种辅助大肠杆菌菌株(携带一种质粒如PRK2013并且能够使该重组二元载体移动到目标农杆菌菌株)通过一种三亲本杂交方法来完成的。可替代地，该重组二元载体可以通过DNA 转化转移到农杆菌中(Hofgen & ffillmitzer, Nucl. Acids Res. 16:9877(1988))。通过重组农杆菌转化目标植物品种通常涉及该农杆菌与来自该植物的外植体的共培养，并且遵循本领域熟知的科学试验计划。将转化的组织在存在于二元质粒T-DNA边界之间的携带有抗生素或除草剂抗性标记的选择性培养基上再生。另一种用基因转化植物细胞的方法涉及在植物组织和细胞上注入惰性的或生物学活性的粒子。美国专利号4，945，050,5, 036，006、以及5，100，792 (都是授予Sanford等人)中披露了这种技术。通常，这种方法涉及在有效穿透细胞的外表面并提供结合在其内部中的条件下向细胞注入惰性的以及生物学活性的粒子。当使用惰性粒子时，可以通过用含所希望的基因的载体包被这些粒子来将该载体引入细胞中。可替代地，目标细胞可以被该载体围绕使得该载体通过激发该粒子而被带入该细胞中。也可以将生物学活性粒子(例如，干酵母细胞、干细菌或噬菌体，各自包含有待引入的DNA)注入植物细胞组织中。多数单子叶植物品种的转化现在也已经变成了常规操作。优选的技术包括使用 PEG或电穿孔技术的直接基因转移进入原生质体、以及粒子轰击进入愈伤组织。用单一 DNA 种类或多种DNA种类(即，共转化)可以进行转化，并且这两种技术都适合用于本发明中。 共转化可能具有避免完全型载体构建以及生成对于感兴趣的基因与选择性标记具有非伴性基因座的转基因植物的优点，能够在随后的世代中去除该选择性标记(如果这被认为是令人希望的)。然而，使用共转化的一个缺点是小于100%的频率，分离的DNA种类以该频率整合到基因组中(Schocher et al. Biotechnology 4:1093-1096(1986))。专利申请EP 0 292 435、EP 0 392 225、以及WO 93/07278描述了从优良近交系玉米用于制备愈伤组织和原生质体、使用PEG或电穿孔转化原生质体、以及从转化的原生质体再生玉米植株的技术。Gordon-Kamm等人(Plant Cell 2 :603-618(1990))以及Fromm 等人(Biotechnology 8 :833-839(1990))已经发表了使用粒子轰击用于转化源于A188的玉米系的技术。此外，W093/07278 和 Koziel 等人(Biotechnology 11:194-200(1993)) 描述了通过粒子轰击用于转化优良近交系玉米的技术。这种技术利用了从授粉之后 14-15天的玉米穗切下的1.5-2. 5mm长的未成熟玉米胚以及用于轰击的一台PDS-IOOOHe Biolistics 装置。水稻的转化也可以通过利用原生质体或粒子轰击的直接基因转移技术来进行。 就Japonica型和hdica型已经对原生质体介导的转化进行了描述(Siang et al. Plant Cell Rep 7:379-384(1988) ；Shimamoto et al. Nature 338:274-277(1989) ；Datta et al. Biotechnology 8:736-740(1990))。使用粒子轰击，两种类型也是常规地可转化的 (Christou et al. Biotechnology 9:957-962(1991))。此外，WO 93/21335 描述了通过电穿孔用于转化水稻的技术。专利申请EP O 332 581描述了用于产生、转化以及再生早熟禾亚科原生质体的技术。这些技术允许转化鸭茅属和小麦。而且，小麦转化已经由Vasil等人(Biotechnology 10 :667-674(1992))进行了说明，其中使用了微粒轰击进入C型长期可再生的愈伤组织的细胞中，并且还由 Vasil 等人(Biotechnologyl 11 1553-1558 (1993))和 Weeks et al. (Plant Physiol. 102 :1077-1084(1993))进行了说明，其中使用了对未成熟胚和未成熟胚衍生的愈伤组织的微粒轰击。然而，对于小麦转化的一种优选的技术涉及通过离子轰击未成熟胚的小麦转化，并且包括在基因送递之前的高蔗糖或高麦芽糖步骤。在轰击之前，将任意数目的胚(长度为0. 75-lmm)铺板在具有3%蔗糖(Murashiga & Skoog， Physiologia Plantarum 15:473-497(1962))以及 3mg/12，4-D 的 MS 培养基上用于诱导体细胞坯，这允许在黑暗中进行。在选择的进行轰击的那天，将胚从诱导培养基中取出并且放置在渗压剂上(即，具有以希望的浓度(典型地是15%)添加的蔗糖或麦芽糖的诱导培养基)。允许这些胚发生质壁分离2-3小时，然后进行轰击。每个靶板二十个胚是典型的，尽管不是关键性的。使用标准方法使一种适当的携带基因的质粒(如PCIB3064或 PS0G35)沉淀在微米大小的金颗粒上。使用约IOOOpsi的爆破压力，使用标准的80目网筛， 用DuPontBIOLISTICS 氦装置射击每个板的胚。在轰击之后，将这些胚放回到黑暗中恢复约M小时(仍在渗压剂上)。M小时后，从渗压剂上取出这些胚并将其放回到诱导培养基上，在再生之前它们在这里停留约1个月。约一个月之后，将具有发育中的胚性愈伤组织的胚外植体转移到再生培养基(MS+lmg/升NAA、5mg/升GA)上，该再生培养基进一步包含适当的选择剂(在PCIB3064的情况下是10mg/l的basta而在pS0G35的情况下是^ig/ 1的甲氨蝶呤)。约一个月之后，将发育的嫩枝转移到更大的被称为“GA7”的无菌容器中， 这些容器包含半浓度的MS、2 %的蔗糖、以及相同浓度的选择剂。也已经说明了使用农杆菌来转化单子叶植物。参见WO 94/00977以及美国专利号5，591，616，这两者均通过引用结合在此。还参见Negrotto et al. ,PlantCell Reports 19 :798-803(2000),通过引用结合在此。例如，水稻(Oryza sativa)可以用于产生转基因植物。可以使用不同的水稻栽培变种(Hiei et al. , 1994，Plant Journal 6 :271-282 ；Dong et al. , 1996, Molecular Breeding 2 :267-276 ；Hiei et al.，1997，Plant Molecular Biology, 35 :205-218)。还
20有，以下描述的各种培养基组分可以在量上变化或者被替换。通过在MS-CIM培养基(MS 基础盐，4. 3g/升；维生素B5 (200X)，5ml/升；蔗糖，30g/升；脯氨酸，500mg/升；谷氨酰胺， 500mg/升；酪蛋白水解物，300mg/升；2，4-D(lmg/ml)，2ml/升；用 IN KOH 调节 pH 到 5. 8 ； 植物凝胶，3g/升)上培养由成熟的胚开始胚性反应和/或建立培养物。或者将在培养物反应的初始阶段的成熟胚或者将已建立的培养系进行接种并且与含有所希望的载体构建体的根癌农杆菌菌株LBA4404(农杆菌)进行共同培养。将来自甘油母液的农杆菌在固体YPC 培养基(100mg/L大观霉素或任何其他适当的抗生素)上进行培养，在培养大约2天。 将农杆菌重新悬浮于液态MS-CIM介质中。将该农杆菌培养物稀释至0D600为0. 2-0. 3，并且添加乙酰丁香酮直到最终浓度为200uM。在将该溶液与这些水稻培养物混合之前添加乙酰丁香酮以诱导农杆菌用于将DNA转移到植物细胞中。为了接种，将这些植物培养物浸入细菌悬浮液中。去除该液体的细菌悬浮物并将接种过的培养物放在共培养培养基上并且在 22°C下培养两天。然后将这些培养物转移到具有替卡西林(400mg/升)的MS-CIM培养基中以抑制农杆菌的生长。对于使用PME选择性标记基因的构建体(Reed et al. , In Vitro Cell. Dev. Biol. -Plant37 :127-132)，在7天后将培养物转移到含有甘露糖作为碳水化合物来源(具有2%的甘露糖、300mg/升的替卡西林的1^)的选择培养基中，并且在黑暗中培养3-4周。然后将抗性菌落转移到再生诱导培养基(不具有2，4-D、0. 5mg/升的IAAUmg/ 升的玉米蛋白、200mg/升的特美汀、2%的甘露糖以及3%的山梨糖醇的MS)中并且在黑暗中生长14天。然后将增殖中的菌落转移到另一轮的再生诱导培养基中并且移到光照生长室中。将再生的嫩枝转移到带有GA7-1培养基(不含激素以及2%的山梨糖醇的MS)的GA7 容器中培养2周，然后在它们足够大并具有足够的根时将其移到温室中。将植株移栽到温室的土壤中(用于再生)长至成熟，并且收获Tl代种子。通过用本发明的核酸序列的转化而获得的植物可以是各种各样的植物品种的任何一种，包括单子叶植物和双子叶植物的那些；然而，在本发明的方法中所使用的植物优先选自以上提出的农艺学上重要的目标作物的列表。本发明的一种基因连同对于生产和质量重要的其他特征的表达可以通过育种结合到植物系中。育种的方法和技术在本领域中是己知的。参见例如 Welsh J. R. , Fundamentals of Plant Genetics and Breeding, John Wiley & Sons,NY(1981) ；Crop Breeding,Wood D. R. (Ed. )American Society of Agronomy Madison, Wis. (1983) ；Mayo 0. , The Theory of Plant Breeding, Second Edition, Clarendon Press, Oxford(1987) ；Singh, D. P.，Breeding for Resistance to Diseases and Insect Pests, Springer-Verlag, NY (1986)；以及 Wricke and Weber, Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding, Walter de Gruyter and Co. , Berlin(1986)。对于质体的转化，使烟草“Xanthienc”的种子在T琼脂培养基上以1〃圆形阵列在每个板上发芽七个，并且在播种12-14天后用Ium的钨粒子进行轰击(M10，Biorad, Hercules, Calif.)，这些粒子包被有基本上如所描述的来自pPH143和pPH145的DNA (Svab, Z. and Maliga，P. (1993)PNAS 90，913-917)。将轰击的苗在T培养基上孵育两天，在此之后将其叶子切除并且在强光中(350-500umol光子/m2/s)将背轴侧向上放置于含有500 μ g/ ml 二盐酸大观霉素(Sigma，St. Louis, Mo.)的 RMOP 培养基上(Svab，Ζ.，Hajdukiewicz, P. and Maliga，P. (1990)PNAS 87,8526-8530)。将轰击后三到八周出现在褪色的叶子下面出现的抗性嫩枝亚克隆到相同的选择性培养基上，允许其形成愈伤组织、并将次级嫩枝分离出并进行亚克隆。在独立的亚克隆中经转化的质体基因组拷贝的完整分离(同质体性，homoplasmicity)是由DNA印迹杂交的标准技术进行评定的(Sambrook et al.， (1989)Molec μ Lar Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor) BamHI/EcoRI 酶切的总细胞 DNA (Mettler，I. J. (1987) Plant Mol Biol Reporter 5,346349)在的Tris-硼酸(TBE)琼脂糖凝胶上被分离、转移到尼龙膜 (Amersham)上、并且用sup. 32P标记的随机配对的DNA序列进行探测，这些DNA序列对应于 0. 7kb BamHI/HindHI DNA片段，该片段来自包含rps 7/12质体靶向序列的一部分的pC8。 使同质体的(homoplasmic)嫩枝在含有大观霉素的MS/IB培养基上无菌地生根(McBride， K. Ε. et al. (1994) PNAS 91，7301-7305)并转移到温室中。被工程化进入以上描述的转基因的种子以及植物中的遗传特性通过有性生殖或营养生长被传代，并且由此可以被维持并在子代植物中使之遗传。一般而言，维持和遗传使用了已知的为满足特定的目的(如耕种、播种或收割)而开发的农业方法。在植物育种中可以进一步使用根据本发明的转基因植物和种子的有利的遗传特性。取决于所希望的特性，可以采取不同的育种措施。相关的技术是在本领域内是熟知的， 并且包括但不限于杂交、近交、回交育种、多系育种、品种混合(variety blend)、种间杂交、 非整倍体技术、等等。因此，根据本发明的转基因种子和植物可以用来改良植物系的育种， 这些植物系例如增加了常规方法(例如除草剂或杀虫剂处理)的效力，或由于它们经修饰的遗传特性而允许免除所述的方法。用途从在此说明的转基因植物中收获的植物材料在下游农艺学和工业使用中是有用的，这些使用例如人类食品、动物饲料、生物燃料、工业酒精、发酵原料、以及类似物。因此， 在此提供了用于生产一种修饰的多结构域酶的方法，这些方法包括将表达这种修饰的多结构域酶的植物进行培养。还涵盖了用于生产乙醇的方法，这些方法包括使一种表达修饰的多结构域酶的植物发酵，连同通过向混合饲料中加入一种表达修饰的多结构域酶的植物用于增强动物饲料可消化性的方法。在一个实施方案中，该植物材料可以用来配制用于人类消费的食品或饮料或动物饲料，可以用来配制具有易于消化的淀粉并且因此具有更多可引出的能量的食物，或可以用来改进这种食品或饲料的营养品质(例如，增加的维生素含量、增加的油含量、增加的蛋白含量、等等)。这种食品、饲料或饮料可以是面粉、生面团、面包、面制品(pasta)、饼干、蛋糕、增稠剂、啤酒、麦芽饮料或一种食品添加剂。这种食品、饲料、或啤酒产品可以具有降低的变应原性和/或增加的可消化性。此外，一种生面团产品与从这些相同物种的非转基因种子或谷粒制成的生面团相比可以具有增加的强度和体积。这种食品、饲料、或饮料可以具有超级可消化的蛋白质和/或超级可消化的淀粉。这种食品、饲料、或饮料可以是低变应原性的。从本发明的收获的植物材料中提取的油可以用作用于化学修饰的原料、生物可降解材料的成分、混合的食品产品的成分、食用油或烹调油的成分、润滑剂或它的成分、生物柴油或它的成分、休闲食品的成分、发酵工艺的原料、或化妆品的成分。所收获的本发明的植物材料还可以与其他成分组合以生产一种有用的产品。产品中所包括的具体成分将根据该产品的最终用途来确定。示例性的产品包括动物饲料、用于化学修饰的原料、生物可降解材料、混合的食品产品、食用油、烹调油、润滑剂、生物柴油加工原料、休闲食品、化妆品、清洗剂和洗涤剂的组合物(例如，衣物洗涤剂类、盘子清洗洗涤剂类、以及硬表面清洗组合物类)、以及发酵工艺原料。包含在此说明的所收获的植物材料的产品还包括完整的或部分地完整的猪、家禽、以及牛的饲料，宠物食品，以及人类食品产品(例如挤出式休闲食品、面包)、作为一种食品粘合剂、水产养殖饲料、可发酵的混合物、 食品增补剂、运动饮料、营养食品棒、多种维生素增补剂、食物饮料、以及谷类食品。结合在此说明的所收获的植物材料的产品包括例如纸板、纸产品、以及工业材料。这些产品可以结合粗收获的植物材料、或可以结合所收获的植物材料的一种经加工或提取的形式(例如， 从所收获的植物材料中提取的油、蛋白质、淀粉、等)。以下实例是作为说明而并不作为限制而提供的。实验在此使用的标准重组DNA和分子克隆技术在本领域是熟知的并且由J. Sambrook， Ε.F.Fritsch 禾口 Τ·Maniatis, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)以及由 Τ. J. Silhavy, Μ.L. Berman,禾口 L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1984)以及由 Greene Publishing Assoc.禾口 Wiley-Interscience(1987)出版的Ausubel,F. Μ·等人，Current Protocols in Molecular Biology进行了描述。实例1 双子叶植物优化的多个纤维素酶基因使用Vector NTI 9. 0中的回译程序设计了双子叶植物的合成基因。使用对于双子叶植物偏爱密码子将六种蛋白序列回译成双子叶植物优化的编码序列。将额外的序列加到每种纤维素酶基因编码序列的5’和3’端用于克隆以及差异性地靶向到多个亚细胞区室。 为了构建双子叶植物瞬时表达载体，将AscI、BamHI、和烟草Kozak序列添加在5’端。将靶向ER的序列以及McI-NotI克隆位点添加在3’端。引入沉默突变以去除干扰克隆策略的任何限制性酶切位点。通过GENEART(德国)合成了多种合成基因。实例2 构建植物表达载体设计了能够在转基因植物中指导具有新颖连接物的一种优化的纤维二糖水解酶基因(CBHl)的表达的多种表达载体。表1概述了所产生的这些序列和载体。使用组成型CaMV 35S启动子来驱动这些双子叶植物的优化的纤维素酶基因的表达。烟草表达的纤维素酶通过融合到烟草I3Rla信号序列(SEQ ID N0 13)以及ER滞留序列(SEQ ID NO 14)上而靶向到内质网(ER)上。烟草表达载体使用二元载体PGR106，该载体含有马铃薯病毒X(PVX)扩增子(Lu等人，2003，EMBO J，22 :5690-5699)。载体组分信息如表1中所示。表1:序列说明
权利要求
1.一种用于在植物细胞中表达多结构域酶的方法，包括向所述植物细胞中引入核酸构建体，该核酸构建体包括编码修饰的多结构域酶的核苷酸序列，其中所述多结构域酶包括至少一个第一结构域、至少一个第一连接序列、以及至少一个第二结构域，其中所述第一结构域以及所述第二结构域是非异源的序列，其中在所述修饰的多结构域酶中的天然连接序列已经被异源连接序列所代替，其中所述异源连接序列是不被植物蛋白酶切割的连接序列。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述异源连接序列源自微生物。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述修饰的多结构域酶的所述异源连接序列当在所述植物细胞中表达时是糖基化的。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述异源连接序列被修饰以去除至少一个植物蛋白酶切割位点。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述植物细胞表达所述修饰的多结构域酶，其中全长多结构域酶是由所述植物细胞产生的。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述异源连接序列选自下述组成的组SEQID NO 18、19、和 20。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述多结构域酶选自下述组成的组纤维素酶和葡糖淀粉酶。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述植物细胞选自下述组成的组稻、小麦、包括玉米的作物(corn)、大豆、糖甜菜(sugar beet)、和甘蔗植物细胞。
9.一种植物细胞，包括一种核酸构建体，该核酸构建体包括编码修饰的多结构域酶的核苷酸序列，其中所述多结构域酶包括至少一个第一结构域、至少一个第一连接序列、以及至少一个第二结构域，其中在所述修饰的多结构域酶中的天然连接序列已经被异源连接序列所代替，其中所述第一结构域以及所述第二结构域是非异源序列，其中在所述修饰的多结构域酶中的天然连接序列已经被异源连接序列所代替，其中所述异源连接序列是不被植物蛋白酶切割的连接序列。
10.如权利要求9所述的植物细胞，其中所述异源连接序列源自微生物。
11.如权利要求9所述的植物细胞，其中所述修饰的多结构域酶的所述异源连接序列当在所述植物细胞中表达时是糖基化的。
12.如权利要求9所述的植物细胞，其中所述异源连接序列被修饰以去除至少一个植物蛋白酶切割位点。
13.如权利要求9所述的植物细胞，其中所述植物细胞表达所述修饰的多结构域酶，其中全长多结构域酶是由所述植物细胞产生的。
14.如权利要求9所述的植物细胞，其中所述异源连接序列选自下述组成的组SEQID NO :18、19、以及 20。
15.如权利要求9所述的植物细胞，其中所述多结构域酶是纤维素酶。
16.如权利要求9所述的植物细胞，其中所述植物细胞选自下述组成的组稻、小麦、包括玉米的作物(corn)、大豆、糖甜菜(sugar beet)、和甘蔗植物细胞。
17.一种植物，包括如权利要求9-16中任一项所述的植物细胞。
18.由如权利要求17所述的植物产生的转基因种子。
19. 一种从植物生物质生产可发酵糖的方法，所述方法包括(a)获得包括核酸构建体的植物，该核酸构建体包括编码修饰的多结构域酶的核苷酸序列，其中所述多结构域酶包括至少一个第一结构域、至少一个第一连接序列、以及至少一个第二结构域，其中在所述修饰的多结构域酶中的天然连接序列已经被异源连接序列所代替，其中所述第一结构域以及所述第二结构域是非异源序列，其中所述异源连接序列是不被植物蛋白酶切割的连接序列，并且其中所述多结构域酶涉及植物材料到可发酵糖的转化；(b)使所述植物在其中核酸构建体被表达的条件下生长；和(c)在一种生物质转化方法中使用所述植物。
全文摘要
在此提供了用于在植物中表达多结构域酶的组合物和方法。该组合物包括表达修饰的多结构域酶的植物、种子、植物组织、以及植物部分。该修饰的多结构域酶具有异源连接区域，当该修饰的多结构域酶表达在植物中时，该异源连接区域不被切割。在不同的实施方案中，该连接区域包括在SEQ ID NO18、19、或20中提出的序列。进一步提供了用于生产一种修饰的多结构域酶的方法，包括将表达这种修饰的多结构域酶的植物进行培养。本发明的转基因植物材料的下游用途包括农艺学用途和工业用途，例如人类食品、动物饲料、药物制剂、生物燃料、工业酒精、发酵原料，以及类似物。
文档编号C12N9/34GK102307994SQ201080006811
公开日2012年1月4日 申请日期2010年2月4日 优先权日2009年2月6日
发明者S.迈尔斯 申请人:先正达参股股份有限公司