一种抑癌能力遗传风险评估的基因检测方法

专利名称：：一种抑癌能力遗传风险评估的基因检测方法
技术领域：
：本发明涉及一种抑癌能力遗传风险评估的基因检测方法，用于评估个体对癌症易感性的强弱，针对性地提示受检者面对各种可能导致细胞癌变的外界因素时应采取的恰当应对措施，属于分子生物学
技术领域：
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背景技术：
：肿瘤已成为二十一世纪的人类第一杀手，在2005年全世界5800万死亡总数中，癌症死亡者为760万，占总数的13%，并且2005年癌症死亡者的70%以上发生在低收入和中等收入国家，预计全世界癌症死亡者将继续增加，据估计，2015年将有900万人死于癌症，并且2030年将有1140万人死亡。在我国，癌症发病及死亡率一直呈上升趋势，在城镇居民中，癌症已占死因的首位，为此，我国制定了《中国癌症预防与控制规划纲要(2004-2010)》，确定肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、乳腺癌、宫颈癌及鼻咽癌为我国癌症防治重点，强调癌症的早期发现、早期诊断及早期治疗。在人们生活的环境中存着不少物理的、化学的和生物的致癌因子，它们在一定条件下可以诱发肿瘤，其中主要是致癌的化学毒物，但是尽管人们都接触各种致癌因子，却远非人人都发生肿瘤，这表明还存在个体易感性的差异，而易感性在很大程度是遗传物质的结构或功能变化才会使正常细胞转变为癌细胞。我国自上世纪70年代以来，癌症发病及死亡率一直呈上升趋势，在20年的时间里，癌症死亡率上升29.42%。估计2000年癌症新发病人数约为180到200万，死亡140到150万，在城镇居民中癌症已经成为死因的首位。随着社会条件的发展，我国在肝癌、胃癌高居不下的同时，肺癌、结直肠癌及乳腺癌等又出现了显著上升趋势，从而进一步加大防治的难度。目前，我国癌症每年要花掉数百亿元，每死亡5人中就有一个是死于癌症，而在64岁以下的人口中，每死亡4人即有1人死于癌症。不仅影响劳动力人口健康，也是医疗费用上涨的重要因素。目前到医院来看病的病人如果被确诊为肺癌，有80%已经是晚期了，而且有些已经开始转移，所以如何能使癌症的一级病因学预防、重点地区重点人群的二级预防和临床的三级预防结合在一起更显得重要。环境因素是机体患上以下肿瘤的主要病因，遗传因素做为内因起着重要的作用。肺癌是一种严重威胁人民健康和生命的疾病，在多数发达国家中，肺癌居男性恶性肿瘤首位。该疾病是多基因疾病，与多种基因、吸烟、职业致癌因子等环境因素相关。首先，现代医学已证明，任何疾病的发生均是遗传因素与外界环境相互作用的结果。遗传因素对疾病发生的作用有强有弱，强到单个基因位点变化就可以导致疾病的发生，如镰刀状贫血就是由于a-球状蛋白6号密码子GAG—GTG的基因突变所引起。遗传因素对疾病的发生可以是由单一一个基因引起，也可以是由多个基因共同作同而产生，如糖尿病已证实是由于多个基因的作用而产生。其次，疾病的遗传易感性是指在相同的环境因素作用下，某些个体、人群患有某种疾病都高的风险(或为可能性)。一个明显的例子是，普通妇女患上乳腺癌的风险约为510%，但如果妇女的BRCA1/2基因突变，就会使该妇女患上乳腺癌的风险提高1085%不等。因此，抑癌基因的遗传易感风险是指在相同的环境因素情况下，人群由于其本身的遗传体质，发生癌症的可能性，目前的基础研究已能从理论上证明基因分型检测可以用于判断抑癌基因易感性的强弱，而且检测方法简便、检测成本在可接受程度中、检测结果可信。因此，基因分型检测用于评估抑癌基因的可行性是明确的。不同的人在相同的环境下抑癌基因易感性存在个体差异，需要采取不同的风险预防手段。因此，综合利用现代科学研究成果，开发一项基于分子遗传基础的抑癌基因易感性的基因检测方式具有明确的市场需求，检测意义明确，适用范围广，而且具有可行性，可用于制定群体的肿瘤预防措施和高危行业的劳动保障措施具有很强的社会意义和市场前景。目前对涉及抑癌基因易感性通路的一些基因已经进行了大量研究。其作用机制、生化功能、通路情况、调控、转录等等方面都有明确可靠的研究结果；已经有可靠的检测方法、仪器设备和检测试剂等。因此利用现有科学、技术研究成果来开发这样一个产品，时机是成熟的。
发明内容本发明的目的是提供一种抑癌能力遗传风险评估的基因检测方法，可以让受检者了解自身抑癌能力的强弱，加强对可能发生细胞癌变的环境的辨别能力，采取适当措施防止或降低细胞癌变的发生，从而有效减少癌症患病风险。为实现以上目的，本发明的技术方案是提供一种抑癌能力遗传风险评估的基因检测方法，其特征在于，其方法为步骤l.检测的样品类型与采样方法用采样拭在20-30个被测者口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮40次以上，以保证采集到足量的细胞样本；步骤2.基因组DNA的抽提方法采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA,时间为2小时一2.5小时，共抽提20—30个被测者样本，经电泳检测后，用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；步骤3:荧光定量PCR反应将每一个被测者样本分别放入3个反应孔，同时检测3个位点，即抑癌基因TP53(P53BP1)SEQIDN01:T-885G、抑癌基因TP53(P53BP1)SEQIDN02:Glnll36Lys、抑癌基因TP53(TP53)SEQIDN03:Arg72Pro;20—30个被测者样本就有60-90个反应孔，另外根据实验需要增设不含DNA模版的NTC空白对照孔；每一个反应孔的基因分型可以根据下表的引物和探针设计，采用TaqMan-MGB技术，进行检测试剂合成；在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为10W,即浓度为20ng/Pl的DNA模板、1W10X荧光定量PCR反应缓冲液ABITaqmanMGB、0.25mMdNTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.25mMMgCl2溶液、0.02ri(5units/W)TaqDNA聚合酶、去离子水5.43W、3个位点分别采用不同的正向引物(20幽，0.225W)、反向引物(20幽，0.225W)、VIC荧光探针(10,，0.25W)和F細荧光探针(10,，0.2514)工具进行检测，详见下表；<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>将61-91个反应孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，先进行预热:50°C、2分钟，95°C、10分钟，然后再进行60个循环的95。C、30秒，60°C、1分钟、反应结束后取出后再放入ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，并自动将20—30个被测者样本检测3个点位的数据对号入座到3个图中，同时生成3张图，即抑癌基因TP53(P53BP1)SEQIDN01:T-885G图、抑癌基因TP53(P53BP1)SEQIDN02:Glnll36Lys图、抑癌基因TP53(TP53)SEQIDN03:Arg72Pro图；步骤4:SNP基因型分析将ABI7900型荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的3个表和一个NTC空白对照进行比较，每个位点理论上存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；(1)、抑癌基因TP53(P53BP1)SEQIDN01:T-885G在检测结果图中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，坐标轴(X:0.4-0.5Y:0.3-0.4)区域为空白对照、坐标轴(X:0.2-0.4Y:1.1-1.3)区域为TT基因型、坐标轴(X:0.6-0.8Y:0.7-1.0)区域为TG基因型、坐标轴(X:0.7-0.9Y:0.3-0.4)区域为GG基因型，其中，TT、TG为风险基因型，携带风险基因型时，蛋白质翻译减少或编码突变型蛋白质时均可导致细胞的恶变，导致癌症易感性增加。(2)、抑癌基因TP53(P53BP1)SEQIDN02:Glnll36Lys在检测结果图中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，坐标轴(X:0.0-0.1Y:0.1-0.3)区域为空白对照、坐标轴(X:0.0-0.1Y:1.1-1.3)区域为AA基因型、坐标轴(X:0.2-0.3Y:0.9-1.2)区域为AG基因型、坐标轴(X:0.35-0.45Y:0.4-0.6)区域为CC基因型，其中，AA为风险基因型，携带风险基因型时，蛋白质翻译减少或编码突变型蛋白质时均可导致细胞的恶变，导致癌症易感性增加。(3)、抑癌基因TP53(TP53)SEQIDN03:Arg72Pro在检测结果图中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，坐标轴(X:0.0-0.1Y:0.3-0.4)区域为空白对照、坐标轴(X:0.1-0.3Y:1.6-1.9)区域为CC基因型、坐标轴(X:0.6-0.8Y:1.1-1.4)区域为CG基因型、坐标轴(X:0.9-1.1Y:0.4-0.6)区域为GG基因型，其中，CC为风险基因型，携带风险基因型时，蛋白质翻译减少或编码突变型蛋白质时均可导致细胞的恶变，导致癌症易感性增加。每一个被测者的3个点落在3个表上哪个区域，即可知道被测者抑癌基因的遗传风险；本发明通过检测抑癌基因Tp53的单核苷酸多态性位点来评估个体对抑癌基因的遗传风险，并根据遗传风险评估结果进行个性化健康指导，针对性的提示受检者面对于各种可能导致基因损伤的外界因素时应采取的恰当应对措施。目前，经证实并且机理研究清楚的与抑癌能力密切相关的基因有抑癌基因TP53BP1(tumorproteinTp53bindingprotein1，TP53BP1)、抑癌基因Tp53(tumor-supprossorgene，TP53)等。在不同人群中与抑癌基因易感性有显著相关性的基因位点包括T-885G、Glnll36Lys、Arg72Pro。以上位点有国内外大量的关联分析数据支持。一、抑癌基因Tp53(TP53)人类Tp53基因位于染色体17p13.1，全长1620kb，含有ll个外显子和10个内含子，编码393个氨基酸，相对分子质量53000的核磷酸化蛋白。wt-Tp53蛋白可分为三部分。第一部分为含转录激活结构域和生长抑制结构域，定位于l-95Aa的酸性氨基末端，此区也是Tp53与Mdm-2、pl4ARF和p300结合的区域。第二个部分是能与特异性识别的DNA序列结合的102-292Aa的中央核心区，Tp53的5个保守序列(BoxI-V)有4个位于此区，这4个保守序列是此区功能执行的重要结构。对存在Tp53突变的肿瘤进一步检测发现，97M的Tp53基因突变集中于中央核心区，其中75%以上为错义突变，突变改变了Tp53的立体结构或影响其与DNA的结合而使Tp53功能丧失。第三部分为300-393Aa的碱性羧基末端，含四聚体寡聚化结构域、非特异DNA结合区域及3个核定位信号和1个核输出信号。核定位信号介导Tp53蛋白定位于胞核内，核输出信号则具有介导Tp53蛋白从胞核穿梭入胞质的功能。Zhang等发现Tp53氨基末端ll-27Aa存在第2个核输出信号，与己发现的核输出信号协同调节Tp53蛋白在胞核和胞质间的穿梭。X-衍射三维结构显示Tp53蛋白拥有2个ci螺旋，11个e折叠和3个环，Tp53单体通过上述相互作用形成有活性的四聚体。Kato等利用寡核苷酸定位诱变技术(site-directedmutagenesis)合成Tp53所有编码序列的点突变寡核苷酸，用来研究Tp53基因突变和编码蛋白的结构和功能的关系发现，氨基端和羧基端的突变很少引起Tp53蛋白功能改变，但会影响四聚体的形成。中央区的突变则很容易造成Tp53功能丧失。正常情况下Tp53蛋白以潜在形式存在并维持低水平。电离辐射、紫外线照射、化疗药物及低氧的应激损伤时，Tp53即被活化并维持稳定表达，进一步与其特异结合的下游基因作用发挥细胞周期监控、促细胞凋亡、防癌变的作用。Tp53蛋白的稳定表达对其功能的执行具有重要意义，此调节机制有赖于Tp53与其他蛋白的相互作用及Tp53的翻译后修饰。关联分析研究方面，目前国内外学者已作了大量研究，主要成果有1、rsl042522:Lee等报道，Pro/Pro基因型是台湾人食管癌的遗传易感因素，Pro/Pro基因型携带者患食管鳞癌的风险分别是Arg/Pro型和Arg/Arg型的1.6倍和2.3倍。张雷等对91例食管鳞癌研究表明，携带Pro/Pro基因型者患食管癌的风险比携带Arg/Arg型者高2倍，Arg/Pro杂合型与食管癌的风险无关，且吸烟能增加食管癌的风险，但与Pro/Pro基因型无协同作用，认为p53基因CD72Pro/Pro基因型是中国人食管癌的易感因素。最近张健慧等对173例中国北方人食管鳞状上皮癌与p53基因多态性研究得出的结论与张雷基本相同，认为Pro/Pro基因型是中国北方人患食管癌的独立危险因素，Pro纯合子患食管癌的风险较Arg纯合子高2倍左右，且与吸烟无协同作用。Kawaguchi等研究了HPV相关性食管癌与p53基因多态性的关系，发现在HPV感染的食管癌病人中，Arg等位基因频率明显高于无HPV感染者；携带Arg/Arg基因型者患HPV相关性食管癌的风险是Arg/Pro和Pro/Pro基因型者的3倍；他们还比较了HPV相关性食管癌组织与癌旁正常组织的p53基因状况，发现在8例癌旁正常组织为Arg/Pro杂合基因型患者中有6例在肿瘤组织中p53Pro等位基因缺失，认为Pro等位基因的丢失与HPV相关性食管癌的发生中起一定作用。2、rsl869258、rs2602141:Hongxia，Ma等对P53BP1(T-885Grsl869258,Glnll36Lysrs2602141)和P53(Arg72Prorsl042522)的三个SNP位点与乳腺癌的相关性进行了分析，在404例乳腺癌和472例正常对照的实验分析中发现三个位点与乳腺癌显著相关，结论如下01=2.36，95%CI1.16-4.83for—885TG/GG+p53Pro/Pro;0R=2.24，95%CI1.15-4.37for1136Gln/LystLys/Lys+p53Pro/Pr。本发明通过检测抑癌基因Tp53的单核苷酸多态性位点来评估个体对抑癌能力的遗传风险，并根据遗传风险评估结果进行个性化健康指导，针对性的提示受检者面对于各种可能导致细胞癌变的外界因素时应采取的恰当应对措施。本发明所需检测的DNA可以利用口腔粘膜上皮细胞进行抽提获得。采用口腔粘膜上皮细胞采样方法和器材进行样本采集。样本的DNA抽提利用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的DNA抽提并进行DNA浓度和纯度的测定。本发明位点的基因分型可以采用T叫MarYB"MGB技术对这些位点进行基因分型。经重复实验验证，基因分型的准确率达到99%以上，重复性达到了100%。除此之外，基因测序技术等技术也可以作为备选的基因分型手段。本发明的优点是1.可在细胞癌变发生前就采取干预措施，从而避免癌变细胞蔓延，从而降低与致癌相关的疾病(如肿瘤)的发病率和死亡率。2.从分子机理上进行肿瘤发病机理的分析，可用于肿瘤分子流行病学调査和肿瘤防治措施的制定。图1为抑癌基因TP53(P53BP1)SEQIDN01:T-885G示意图;图2为抑癌基因TP53(P53BP1)SEQIDN02:Glnll36Lys示意图;图3为抑癌基因TP53(TP53)SEQIDN03:Arg72Pro示意图。具体实施例方式以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。实施例1一种抑癌能力遗传风险评估的方法为步骤l.检测的样品类型与采样方法-用采样拭在25个被测者口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮40次以上，以保证采集到足量的细胞样本；步骤2.基因组DNA的抽提方法采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时一2.5小时，共抽提25个被测者样本，经电泳检测后，用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；步骤3:荧光定量PCR反应将每一个被测者样本分别放入3个反应孔，同时检测3个位点，即抑癌基因TP53(P53BP1)SEQIDN01:T-885G、抑癌基因TP53(P5犯P1)SEQIDN02:Glnll36Lys、抑癌基因TP53(TP53)SEQIDN03:Arg72Pro;25个被测者样本就有75个反应孔，另外根据实验需要增设不含DNA模版的NTC空白对照孔;每一个反应孔的基因分型可以根据下表的引物和探针设计，采用TaqManS"MGB技术，进行检测试剂合成；在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为1(H4，即浓度为20ngA4的DNA模板、1W10X荧光定量PCR反应缓冲液ABITaqmanMGB、0.25函dNTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.25mMMgCl2溶液、0.02ri(5unitsAH)TaqDNA聚合酶、去离子水5.43W、3个位点分别采用不同的正向引物(2(^M，0.225W)、反向引物(20幽，0.225W)、VIC荧光探针(10)41，0.和FAM荧光探针(IO幽，0.工具进行检测(详见下表)；<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>将76反应孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，先进行预热50。C、2分钟，95°C、IO分钟，然后再进行60个循环的95。C、30秒，60°C、1分钟、反应结束后取出后再放入ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，并自动将25个被测者样本检测3个点位的数据对号入座到3个图中，同时生成3张图，即抑癌基因TP53(P53BP1)SEQIDN01:T-885G图、抑癌基因TP53(P53BP1)SEQIDN02:Glnll36Lys图、抑癌基因TP53(TP53)SEQID跳Arg72Pro图;步骤4:SNP基因型分析将ABI7900型荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的3个表和一个NTC空白对照进行比较，每个位点理论上存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；(1)、抑癌基因TP53(P53BP1)SEQIDN0hT-885G在检测结果图1中，共有26个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，坐标轴(X:0.4-0.5Y:0.3-0.4)区域为空白对照、坐标轴(X:0.2-0.4Y:1.1-1.3)区域为TT基因型，有12个被测者样本在这个区域，坐标轴(X:0.6-0.8Y:O.7-1.O)区域为TG基因型、有9个被测者样本在这个区域，坐标轴(X:O.7-0.9Y:0.3-0.4)区域为GG基因型，有4个被测者样本在这个区域，其中，TT、TG为风险基因型，携带风险基因型时，蛋白质翻译减少或编码突变型蛋白质时均可导致细胞的恶变，导致癌症易感性增加。(2)、抑癌基因TP53(P53BP1)SEQIDN02:Glnll36Lys在检测结果图2中，共有26个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，坐标轴(X:0.0-0.1Y:0.1-0.3)区域为空白对照、坐标轴(X:0.O-O.1Y:1.3)区域为AA基因型，有4个被测者样本在这个区域，坐标轴(X:0.2-0.3Y:0.9-1.2)区域为AG基因型，有15个被测者样本在这个区域，坐标轴(X:0.35-0.45Y:0.4-0.6)区域为CC基因型，有6个被测者样本在这个区域，其中，AA为风险基因型，携带风险基因型时，蛋白质翻译减少或编码突变型蛋白质时均可导致细胞的恶变，导致癌症易感性增加。(3)、抑癌基因TP53(TP53)SEQIDN03:Arg72Pro在检测结果图3中，共有26个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，坐标轴(X:0.0-0.1Y:0.3-0.4)区域为空白对照、坐标轴(X:0.1-0.3Y:1.6-1.9)区域为CC基因型，有6个被测者样本在这个区域，坐标轴(X:0.6-0.8Y:1.1-1.4)区域为CG基因型，有10个被测者样本在这个区域，坐标轴(X:0.9、1.1Y:0.4-0.6)区域为GG基因型，有9个被测者样本在这个区域，其中，CC为风险基因型，携带风险基因型时，蛋白质翻译减少或编码突变型蛋白质时均可导致细胞的恶变，导致癌症易感性增加。每一个被测者的3个点落在3个表上哪个区域，即可知道被测者抑癌基因的遗传风险；步骤5，根据检测结果给予个性化指导建议，主要有以下几点1、避免吸烟吸烟已经较明确的为人们所熟知的致癌因素，与30%的癌症有关。烟焦油中含有多种致癌物质和促癌物质，如3-4苯丙芘，多环芳香烃、酚类、亚硝胺等，当烟草燃烧的烟雾被吸入时，焦油颗料便附着在支气管粘膜上，经长期慢性刺激，可诱发癌变。吸烟主要引起肺、咽、喉及食管部癌肿，在许多其他部位也可使其发生肿瘤的危险性增高。2、饮食结构美国饮食、营养及癌委员会(DNC)的调查表明结肠癌、乳腺癌、食管癌、胃癌及肺癌是最有可能通过改变饮食习惯而加以预防的。事实上，合理的膳食可能对大部分癌都有预防作用，特别是植物类型的食品中存在各种各样的防癌成分，这些成分几乎对所有癌的预防均有效果。1997年中国营养学会公布的8条膳食指南为1)食物多样，谷物为主。多种食品应包括谷物与薯类、动物性食品、豆类及其制品、蔬菜与水果及纯热量食品等5大类。2)多吃蔬菜、水果与薯类，维护心血管健康，增加抗病能力，预防癌症，预防眼疾。3)每天吃奶类、豆类及其制品。我国膳食中钙普遍缺乏，仅为推荐供应量的一半。而奶类食品含钙量高，并与豆类食品一样，是优良的蛋白质来源。4)经常吃适量的鱼、禽、蛋、瘦肉，少吃肥肉与荤油。动物性蛋白的氨基酸组成全面，赖氨酸含量高；而鱼类的不饱和脂肪酸有降血脂、防血栓形成的作用。5)膳食与体力活动平衡，保持适当体重。早、中、晚餐的供热量分别为30%、40%及30%为宜。6)吃清淡少盐的膳食。我国居民的平均食盐摄入量约每天15克，是世界卫生组织建议值的两倍以上，故应减少食盐量的摄入。7)饮酒应节制。8)吃清洁卫生、不变质的食品。包括选购符合卫生标准的食品，尤其是绿色食品。3、其它如职业、环境、感染、药物等因职业和环境的原因而按触一些化学物质可导致不同部位的肿瘤。例如肺癌(石棉)、膀胱部(苯胺染料)、白血病(苯)。有些感染性疾病与某些癌症也有很密切的联系如乙肝病毒与肝癌，人乳头瘤病毒与宫颈癌。在一些国家，血吸虫寄生感染显著增加膀胱癌的危险性。暴露于一些离子射线和大量的紫外线，尤其是来自太阳的紫外线，也可以导致某些肿瘤，特别是皮肤癌。常用的有致癌性的药物包括性激素--雌激素和雄激素、抗雌激素药三苯氧胺。绝经后妇女广泛应用的雌激素与宫内膜癌及乳腺癌有关。位点序列的确定根据文献提供的位点序列信息和rs号，在NCBISNP数据库中进行检索比对，获得以上位点的参考序列如下1.P53BP1T-885Grsl869258CAAGGTGAGCCACTGTTCTGGCTGTGCTTCAGGCATCTCTACCCTGTGCT50TCTCCGCCTTCTGCATTCAACTACCAATGCATACGTCTGCATCTCCATCC100CTAGTGTGCACTTCCTGAGATCTGCGCCCTTGTCACCTGCATCTTCCATG150CCATGTGTCCGTATCCTCTCGCTCTACTMCATCTCGCTTGCCCATCCTT200T/GSNPCTGCACACTCCATGGCGTTCCGCAGTCTCCCTGAGGCAGCGGAGCTCTAT250GCAGCCCCTGGGGCCCCTCTGGTCACACCCTCCACCGCAGTGTTTTGGAC300CAGGTGTCCTG嵐GTCCTCACCATCCCTGGAGMTCCACGTCCCTATCT350TCCTGTATCTTCTTTATGGTCCCTGAACCAGCACGGGGAGCTTTCTGAAC4002.P53BP1Glnll36Lysrs2602141ACTCCCCCTCTCAGTCTGAACTGTGGCATCTTGCTTTCCAMGTTCTGGT50CCACTGTACTGGTCCCCTGCTCACACACATTCTTTATAGTCTGGGTTGCT100GCTGAMCAGTTTCTGGGACCCTCMGGAACACTCCATGGTTTGGATTCC150TATGTTATTTTGGCTGGGCCTTTCAATCMGGCCTTACTAGGATTTTCCT200A/CSNPATTAGTACTCCGTCCTTCTTTCTGGTCTTCTAGCACATCTGTCACCATTG250CCTCTCCTTGAGGACTGGATGGCCCTTGTATGACCATCTTCTGGGMGCA300GGAGMACAGGGTCCTTGACAGGACTMTGGGCTTCATAGGCTGTTGACT350CTGCCTGATTGTATGGTCACCCTCCAATTTTTCTTTCTCCTCTTCTCCTT4003.TP53Arg72Prorsl042522TGGAGGGCTGGGGACCTGGAGGGCTGGGGGGCTGGGGGGCTGAGGACCTG50GTCCTCTGACTGCTCTTTTCACCCATCTACAGTCCCCCTTGCCGTCCCAA100GCMTGGATGATTTGATGCTGTCCCCGGACGATATTGAACMTGGTTCAC150TGMGACCCAGGTCCAGATGMGCTCCCAGAATGCCAGAGGCTGCTCCCC200G/CSNPCGTGGCCCCTGCACCAGCAGCTCCTACACCGGCGGCCCCTGCACCAGCCC250CCTCCTGGCCCCTGTCATCTTCTGTCCCTTCCCAGAAMCCTACCAGGGC300AGCTACGGTTTCCGTCTGGGCTTCTTGCATTCTGGGACAGCCAAGTCTGT350GACTTGCACGGTCAGTTGCCCTGAGGGGCTGGCTTCCATGAGACTTCMT400。权利要求1.一种抑癌基因遗传风险评估的基因检测方法，其特征在于，其方法为步骤1.检测的样品类型与采样方法用采样拭在20-30个被测者口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮40次以上，以保证采集到足量的细胞样本；步骤2.基因组DNA的抽提方法采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时-2.5小时，共抽提20-30个被测者样本，经电泳检测后，用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；步骤3荧光定量PCR反应将每一个被测者样本分别放入3个反应孔，同时检测抑癌基因TP53(P53BP1)SEQIDNO1T-885G、抑癌基因TP53(P53BP1)SEQIDNO2Gln1136Lys、抑癌基因TP53(TP53)SEQIDNO3Arg72Pro3个位点，20-30个被测者样本就有60-90个反应孔，并增设不含DNA模版的NTC空白对照孔；每一个反应孔的基因分型根据下表的引物和探针设计，采用id="icf0001"file="A2008100420270002C1.tif"wi="15"he="4"top="136"left="147"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>-MGB技术，进行检测试剂合成；在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为10μl，即浓度为20ng/μl的DNA模板2μl、1μl10X荧光定量PCR反应缓冲液ABIid="icf0002"file="A2008100420270002C2.tif"wi="12"he="3"top="162"left="158"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>id="icf0003"file="A2008100420270002C3.tif"wi="2"he="2"top="170"left="22"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>MGB、0.1μl25mMdNTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5μl25mMMgCl2溶液、0.02μl(5units/μl)TaqDNA聚合酶、去离子水5.43μl、3个位点分别采用不同的正向引物(20μM，0.225μl)、反向引物(20μM，0.225μl)、VIC荧光探针(10μM，0.25μl)和FAM荧光探针(10μM，0.25μl)工具进行检测，将61-91个反应孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，先进行预热50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟、反应结束后取出后再放入ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，并自动将20-30个被测者样本检测3个点位的数据对号入座到3个图中，同时生成3张图，是抑癌基因TP53(P53BP1)SEQIDNO1T-885G图、抑癌基因TP53(P53BP1)SEQIDNO2Gln1136Lys图、抑癌基因TP53(TP53)SEQIDNO3Arg72Pro图；步骤4SNP基因型分析将ABI7900型荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的3个表和一个NTC空白对照进行比较，每个位点理论上存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；(1)、抑癌基因TP53(P53BP1)SEQIDNO1T-885G在检测结果图中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，坐标轴(X0.4-0.5Y0.3-0.4)区域为空白对照、坐标轴(X0.2-0.4Y1.1-1.3)区域为TT基因型、坐标轴(X0.6-0.8Y0.7-1.0)区域为TG基因型、坐标轴(X0.7-0.9Y0.3-0.4)区域为GG基因型，其中，TT、TG为风险基因型，携带风险基因型时，蛋白质翻译减少或编码突变型蛋白质时均可导致细胞的恶变，导致癌症易感性增加；(2)、抑癌基因TP53(P53BP1)SEQIDNO2Gln1136Lys在检测结果图中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，坐标轴(X0.0-0.1Y0.1-0.3)区域为空白对照、坐标轴(X0.0-0.1Y1.1-1.3)区域为AA基因型、坐标轴(X0.2-0.3Y0.9-1.2)区域为AG基因型、坐标轴(X0.35-0.45Y0.4-0.6)区域为CC基因型，其中，AA为风险基因型，携带风险基因型时，蛋白质翻译减少或编码突变型蛋白质时均可导致细胞的恶变，导致癌症易感性增加；(3)、抑癌基因TP53(TP53)SEQIDNO3Arg72Pro在检测结果图中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，坐标轴(X0.0-0.1Y0.3-0.4)区域为空白对照、坐标轴(X0.1-0.3Y1.6-1.9)区域为CC基因型、坐标轴(X0.6-0.8Y1.1-1.4)区域为CG基因型、坐标轴(X0.9-1.1Y0.4-0.6)区域为GG基因型，其中，CC为风险基因型，携带风险基因型时，蛋白质翻译减少或编码突变型蛋白质时均可导致细胞的恶变，导致癌症易感性增加；每一个被测者的3个点落在3个表上哪个区域，即可知道被测者抑癌基因的遗传风险。全文摘要本发明公开了一种抑癌基因遗传风险评估的基因检测方法，其特征在于，通过同时检测分析个体的TP53BP1基因、TP53基因SNPs位点基因携带型为所有的受检者提供抑癌基因的遗传风险评估、相关疾病风险规避的个性化健康指导。本发明的优点是可在基因损伤发生前就采取干预措施，从而避免基因损伤，从而降低与基因损伤相关的疾病(如肿瘤)的发病率和死亡率；从分子机理上进行肿瘤发病机理的分析，可用于肿瘤分子流行病学调查和肿瘤防治措施的制定。文档编号C12Q1/68GK101560549SQ20081004202公开日2009年10月21日申请日期2008年8月25日优先权日2008年8月25日发明者傅咏南,毛丹丹,校王申请人:上海中优医药高科技有限公司