专利名称：建立神经元烟碱型乙酰胆碱亚型受体细胞模型的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术领域的方法，特别是一种建立神经元烟碱型乙酰胆 碱亚型受体细胞模型的方法。
技术背景阿尔茨海默病(Alzheimer' s Disease, AD)是一种以进行性痴呆为主要 临床表现的神经退行性疾病。阿尔茨海默病的病理生理特征主要包括神经元中的 神经纤维缠结、细胞内A0产生和神经元外Ae聚集形成的淀粉样斑块。AP由 淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)经过特定的途径加工修饰 而成。烟碱型乙酰胆碱受体为配体门控型离子通道，是由不同基因各自编码的5 种不同亚单位(a, e, Y, S， O形成的五聚体结构，在中枢神经系统中最主 要表达的有a 7和a 4 0 2两禾中nAChR亚型。神经生物学研究显示，中枢烟碱受 体亚型激动可以改善认知功能；在对APP转基因动物的研究中发现长时间经口途 径给予尼古丁也可显著降低脑中0淀粉样蛋白量且伴有a7烟碱型乙酰胆碱受 体水平上调。在文献The consequences of reducing expression of the alpha 7 nicotinic receptor by RNA interference and of stimulating its activity with an alpha 7 agonist in SH-SY5Y cells indicate that this receptor plays a neuroprotective role in connection with the pathogenesis of Alzheimer's disease. Ne罰chemistry International. 51， 377-383中作者Qi, X通过RNA 干扰的方法观察到经由a 7受体亚型所介导的神经保护作用，主要包括可溶性淀 粉样前体蛋白的增加和淀粉样蛋白诱导的细胞毒性的降低。这也印证了 Marina R. Picciotto等人提出的包括a 7在内的中枢烟碱型乙酰胆碱受体对神经退行性疾 病可起到一定的祌经保护作用，但其具体涉及到的受体亚型和机制并不清楚。因 此，建立高通量特异性受体作用的细胞筛选模型用于新药先导化合物筛选，藉此 模型进行特定化合物作用类型及效价和效能的研究，利用此细胞模型进行受体信号转导及生物学机制研究等，都是亟待解决的问题。 发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种建立神经元烟碱型乙酰 胆碱亚型受体细胞模型的方法。本发明在体外模拟阿尔茨海默病的病理特征之 一0淀粉样蛋白(e-amyloid, A3)的过度增多，采用脂质体转染的方法， 实现了建立人淀粉样前体蛋白和人烟碱型乙酰胆碱受体共表达的细胞模型，对于 观察a 7烟碱受体亚型的激动对内源性APP加工修饰的影响，从而为筛选具有更 高效能的治疗阿尔茨海默病的药物提供了基础。本发明是通过以下技术方案实现，具体步骤如下第一步、表达载体pcDNA3. l(-)- APP695的构建将APP695基因克隆进 pcDNA3. 1(-)质粒，选择Hind III和Xba I为进行双酶切的工具酶；第二步、稳定转染将pc丽A3. 1 (-)- APP695用脂质体方法转染进SH-EPl-a7 细胞并用筛选抗生素进行加压筛选；然后用有限稀释法将细胞进行单克隆化；第三步、稳定转染细胞克隆APP695 raRNA表达的鉴定用逆转录-聚合酶链 反应(RT-PCR)方法检测APP695 mRNA表达；第四步、稳定转染细胞克隆APP695和A|3蛋白表达的鉴定用 Western-blotting检测细胞克隆APP695蛋白表达；用ELISA检测细胞外液中 的表达a. 检测细胞克隆APP695:对RT-PCR挑选出的阳性克隆，裂解细胞，提取细胞蛋白； 用酶标仪测定蛋白浓度，lOng上样进行SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳，硝酸纤维素膜半干电转移， 一抗室温孵育3h， 二抗室温孵育lh， ECL荧光检测，显影定影并且拍照。b. 检测A(3:用含有蛋白酶抑制剂PMSF和AEBSF的裂解液裂解细胞；BCA法测定蛋白浓度，取30. 5ug上样进行Tris-tricine电泳，PVDF膜湿 转， 一抗室温孵育3h，二抗室温孵育lh， ECL荧光检测，显影定影并拍照。本发明获得稳定表达烟碱a7受体和A13的细胞株，建立神经元烟碱型乙 酰胆碱a 7亚型受体和AP共表达的细胞模型，可用于研究a 7烟碱受体亚型的 激动对于AP水平及APP加工修饰的影响，并为研制和筛选防治AD的新型先导化合物提供平台，它为对烟碱受体亚型在AD发病作用的研究提供了有力工具，通 过以此细胞模型为介导，可以研究烟碱受体亚型对于AP水平的影响，进而进行相关化合物的药物筛选，化合物(包括烟碱受体激动剂和拮抗剂)作用于细胞模型上烟碱受体亚型产生对于Ae的调节，为预防和治疗AD的药物提供了有效的 途径。本发明所涉及的已稳定表达a 7 nAChR的SH-EP1细胞株是人成神经母细胞 瘤，可用于神经退行性疾病机制等研究，购于美国Barrow神经生物学研究所。
图1 APP695片段的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图； 其中1为PCR产物；2为DNA marker 。图2 Hind III、 Xba I双酶切产物的PCR琼脂糖凝胶电泳图； 其中1为经过双酶切的App695的PCR产物；M为丽A marker。 图3重组质粒转化菌的菌落PCR琼脂糖凝胶电泳图；其中1为以pXC几-CMV/pA-APP质粒为模板的阳性对照；2-7为以转化细菌 为模板的PCR产物；M为DNA marker 。图4 RT-PCR鉴定APP稳定转染细胞示意图；其中1为转染重组质粒的细胞内参GAPDH; 2为转染重组质粒的细胞APP;3为阳性对照；M为DNA marker 。图5 Western blotting鉴定APP稳定转染细胞示意图；其中1为未转染质粒的对照细胞；2为转染空载体的对照细胞；3_5为转染重组质粒的细胞。图6 ELISA方法测定细胞外液中A e浓度示意图；其中1为对照组；2为尼古丁 0. 1 n M; 3为尼古丁 1 u M; 4为尼古丁 10 y M。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于 下述的实施例。 实施例一1、以pXC几-CMV/pA-APP质粒，分子量IO. 5kb为模板，PCR扩增两端带有Hind III、 Xba I酶切位点的APP695目的片断，如图1所示。2、 对PCR产物和pcDNA3. 1 (-)进行双酶切，凝胶回收后用T4 DNA连接酶 定向连接，如图2所示pcDNA3. 1- APP695重组质粒转化至大肠杆菌DH5 a感 受态。3、 pcDNA3. 1- APP695重组质粒进行PCR初步筛选，氨苄青霉素抗性筛选 重组子pcDNA3. 1- APP695，扩增提取质粒，如图3所示。质粒测序鉴定，测定 的序列结构如下1 agctggctag cgtttaaacg ggccctctag accaccatgc tgcccggttt ggcactgctc 61 ctgctggccg cctggacggc tcgggcgctg gaggtaccca ctgatggtaa 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3min，经31个循环后72。C复性10min。 APP695引物为 5， -tctccctgctctacaacgtg-3，禾口 5， -cagccccaaaagaagcc-3，凝胶电泳鉴定 PCR产物，如图4所示。2、 收集细胞单克隆，裂解细胞提取细胞膜蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳。采 用12%分离胶，5%积层胶，其后用硝酸纤维素膜半干法进行电转膜，转膜电压为 100V，转膜时间为2h。转膜结束后用小鼠抗人APP695单抗孵育3h，山羊抗小鼠 二抗孵育lh， ECL荧光显色拍照，如图5所示。此为Western blotting方法在 蛋白水平证明细胞内过表达外源型野生型人APP695基因。实施例三应用ELISA方法观察在此细胞模型基础上给予不同浓度尼古丁作用6小时后 细胞外液中AP浓度的变化。用含有蛋白酶抑制剂PMSF和AEBSF的裂解液裂解 细胞，BCA法调整蛋白浓度使一致。采用ELISA试剂盒直接测定AP浓度，并作 统计分析，如图6所示。序列表<110>上海交通大学<120〉建立神经元烟碱型乙酰胆碱亚型受体细胞模型的方法 〈160〉 1〈170〉 Patentln version 3. 1〈210〉 1〈211〉 2601〈212〉 DNA〈213>人工序列〈400〉 11 agctggctag cgtttaaacg ggccctctag accaccatgc tgcccggttt ggcactgctc61ctgctggccg:ctggacggctcgggcgctggaggtaccca ctgatggtaatgctggcctg121ctggctgaaccccagattgccatgttctgtggc卿ctgaacatgcacatgaatgtccsg181aatgggaagtgggattc卿tccatcagggaccaaaacctgcattgatacc鄉gaaggc241atcctgcagtattgccaagaagtctaccctg犯CtgC3g3tcaccaatgtggt卿agcc301aacc幼cc3gtgaccatccagaactggtgc卿cggggccgcaagcagtgcaagacccat361ccccactttgtgattccctaccgctgcttagttggtgagtttgt犯gtgatgcccttctc421gttcctgacaagtgcaaattcttacaccagg卿ggatggatgtttgcg已aactcatctt481cactggcacaccgtcgccaaagagacatgcagtgag已已gagtacc犯cttgcatgactac541ggcatgUgctgccctgcggaattgacaagttccgaggggtagagtttgtgtgttgccca601ctggctgaag幼agtgacaatgtggattctgctgatgcgg鄉aggatgactcggatgtc661tggtggggcggagcagacacagactatgcag3tgggsgtgagtag3agta721gc卿ggagg腿gaagtggctgaggtggaacg郷acgat781gaggatggtga/tgaggt卿gga卿ggctgaggaaccctacgaag犯gccacagagaga841;acc3cc3gcattgccaccaccaccaccaccacracagagtCtgtgg已3g已ggtggttxga901gttcctacaacagcagccagtacccctgatgccgttgacaagtatctcgagacacctggg961ggitg卿iatgaacatgcccatttccagaaaggcttgaggccaagcaccga1021 gagagaatgt cccaggtcat gagagaatgg gaagaggcag aacgtcaagc aaagaacttg1081 cctaaagctg ataagaaggc 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权利要求
1、一种建立神经元烟碱型乙酰胆碱亚型受体细胞模型的方法，其特征在于，包括如下步骤第一步、表达载体pcDNA3.1(-)-APP695的构建将APP695基因克隆进pcDNA3.1(-)质粒，选择Hind III和Xba I为进行双酶切的工具酶；第二步、稳定转染将pcDNA3.1(-)-APP695用脂质体方法转染进SH-EP1-q7细胞并用筛选抗生素进行加压筛选；然后用有限稀释法将细胞进行单克隆化；第三步、稳定转染细胞克隆APP695 mRNA表达的鉴定用逆转录-聚合酶链反应方法检测APP695 mRNA表达；第四步、稳定转染细胞克隆APP695和Aβ蛋白表达的鉴定用Western-blotting检测细胞克隆APP695蛋白表达；用ELISA检测细胞外液中Aβ的表达。
2、 根据权利要求1所述的建立神经元烟碱型乙酰胆碱亚型受体细胞模型 的方法，其特征是，所述的APP695基因和pcDNA3. 1 (_)进行Hind III和Xba I 双酶切，凝胶回收后用T4 DNA连接酶连接，转化至DH5a感受态细胞，氨苄青 霉素抗性筛选重组子pcDNA3. 1- APP695，扩增提取质粒，测序鉴定。
3、 根据权利要求1所述的建立神经元烟碱型乙酰胆碱亚型受体细胞模型 的方法，其特征是，所述的稳定转染，采用脂质体法将载体转染。
4、 根据权利要求1或3所述的建立神经元烟碱型乙酰胆碱亚型受体细胞 模型的方法，其特征是，稳定转染后收集单克隆细胞，用Trizol法提取细胞总 RNA，以RNA为模板，APP695引物1和引物2进行PCR。
5、 根据权利要求4所述的建立神经元烟碱型乙酰胆碱亚型受体细胞模型 的方法，其特征是，PCE程序具体为94t:变性3分钟进入循环过程，94"C变性 1. 5分钟，60'C退火1分钟，72i:延伸4. 3分钟，经31个循环后72'C复性10 分 钟 ； APP695 弓| 物 为 5' -tctccctgctctacaacgtg-3' 禾口 5' -cagcccc認卿agcc-3',凝胶电泳鉴定PCR产物。
6、 根据权利要求1所述的建立神经元烟碱型乙酰胆碱亚型受体细胞模型 的方法，其特征是，第四步中检测细胞克隆APP695，是指对RT-PCR挑选出的阳性克隆，裂解细胞，提取细胞蛋白； 用酶标仪测定蛋白浓度，10wg上样进行SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳，硝酸纤维素膜半干电转移， 一抗室温孵育3h， 二抗室温孵育lh， ECL荧光检测，显影定影并且拍照。
7、 根据权利要求1所述的建立神经元烟碱型乙酰胆碱亚型受体细胞模型的方法，其特征是，第四步中检测A0蛋白表达，是指用含有蛋白酶抑制剂PMSF和AEBSF的裂解液裂解细胞； BCA法测定蛋白浓度，取30. 5 u g上样进行Tris-tricine电泳，PVDF膜湿 转， 一抗室温孵育3h， 二抗室温孵育lh， ECL荧光检测，显影定影并拍照。
全文摘要
本发明涉及的是一种生物技术领域的建立神经元烟碱型乙酰胆碱亚型受体细胞模型的方法，包括如下步骤第一步，通过双酶切后产物定向连接将APP695基因克隆进pcDNA3.1(-)质粒；第二步，将pcDNA3.1(-)-APP695用脂质体方法转染进SH-EP1-α7细胞并用筛选抗生素进行加压筛选；第三步，用逆转录-聚合酶链反应方法检测APP695 mRNA表达；第四步，用Western-blotting检测细胞克隆APP695蛋白表达；用ELISA检测细胞外液中Aβ的表达。本发明建立神经元烟碱型乙酰胆碱α7亚型受体和Aβ共表达的细胞模型，可用于研究α7烟碱受体亚型的激动对于Aβ水平及APP加工修饰的影响，为对烟碱受体亚型在AD发病作用的研究提供了有力工具。
文档编号C12N5/10GK101333532SQ20081004146
公开日2008年12月31日 申请日期2008年8月7日 优先权日2008年8月7日
发明者明 殷, 沈颖华, 莎 石, 聂惠贞 申请人:上海交通大学