专利名称：同时检测番茄TY-1基因和Mi基因的双重PCR方法
技术领域：
本发明涉及同时检测番茄TY-1基因和Mi基因的检测方法。
技术背景 '
番茄黄化曲叶病毒(Tomato Yellow Leaf Curl virus)病和根结线虫 (Root-knotoematode)病是两种世界性病害。TY-1基因和Mi基因分别是 番茄抗黄化曲叶病毒和根结线虫病的重要基因。
随着近年来番茄黄化曲叶病毒病和根结线虫病在国内的逐年加重，选 育含有TY-1基因和Mi基因的番茄品种变得愈加迫切。
目前，文献Zamir, D., Ekstein画Michelson, L, Zakay, Y., Navot， N.,Zeidan， M.， Sarfatti, M., Eshed, Y.， Harel， E., Pleben,T.， Van-Oss, H,， Jedar, N., Rabino witch, H. D. and Czosnek, H," 1994， Mapping and introgression of a Tomato yellow leaf curl virus tolerance gene，Ty-1 .Theoretical and Applied Genetics,88:141 146报道发现了番茄抗黄化曲叶病毒病Ty-l基因的CAPS 标记，文献Williamson, V. M.， Ho， J. Y., Wu, F. F., Miller, N., and Kaloshian， I., 1994 A PCR國based marker tightly linked to the nematode resistance gene, Mi, in tomato. Theoretical and Applied Genetics, 87， 757-763报道，获得了番茄抗 根结线虫病Mi基因的CAPS标记。
目前，常规的检测TY-l基因和Mi基因的方法，如Zamir,D文献公开的方 法，但是，该方法存在一个明显的缺陷是，无法同时检测TY-l基因和Mi基 因，因此，鉴定时间长、鉴定成本高，不能满足有关方面的需要
发明内容
本发明的目的是建立一种同时检测番茄TY-l基因和Mi基因的双重PCR 方法，旨在节省鉴定时间、降低实验成本，加快番茄Ty-l基因和Mi基因的 聚合育种进程。
本发明的方法，包括如下步骤
(1)将PCR体系按照如下的程序进行PCR反应 95。C变性5min，然后94。C变性lmin、 6KC退火lmin、 72。C延伸2min， 35个循环，最后72。C延伸10min，获得PCR产物，4'C保存； 所说的PCR体系为水溶液，组分和含量为 模板DNA 20ng/L Ty-l引物 0.2umol/L Mi引物 0.2umol/L 10xbuffer 2ul/L Mg2+ 3.5mmol/L dNTPs 250umol/L Taq酶 0.2uL /L
所说的模板DNA指的是番茄DNA，制备方法如下
1、 取番茄嫩叶放入研钵中，加入液氮，研磨成粉末状，取40mg装入2mL 的圆头离心管中。
2、 加入700ulCTAB提取液，剧烈摇晃，使CTAB提取液与样品充分混 合均匀。
(100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)， 20 mmol/L EDTA， 1.4 mol/L NaCl， 3%CTAB， 2%PVP， 2%p-巯基乙醇)
3、 65。C水浴lh。
4、 置于4"C冰箱或室温冷却至15"C以下。 ''
5、 加入700^il24:l氯仿/异戊醇，上下缓慢颠倒混匀，抽提15min至溶 液呈乳浊状，保证样品和氯仿充分混合。
6、 12000rpm离心10min。
7、 取上清液于1.5ml离心管中，加入等体积的预冷一2(TC的异丙醇，轻 轻上下颠倒混匀。
8、 一2(TC冰箱静置3h以上。
9、 12000rpm离心10min，弃上清液。用70°/。乙醇洗涤沉淀2次。
10、 吹干DNA，让乙醇挥发干净。
11 、加200 TE 65 °C水浴溶解DNA 。
(TE : 10mmol/L Tris-Hcl和l腿ol/LEDTA， PH二8) Ty-l引物序列
CAPS IF: 5 ，- TAATCCGTCGTTACCTCTCCTT画3' CAPS 1 R: 5 ，-CGGATGACTTCAATAGCAATGA -3'
Mi引物序列
CAPS2 F: 5，曙TCGGAGCCTTGGTCTGAATT-3' CAPS2 R: 5 ，-GCCAGAGATGATTCGTGAGA -3'; 10xbuffer为一种PCR反应缓冲液，为10 50mmol/LTris-Hcl(PH8.3 8.8)，可采用上海生工公司的产品； M^+来源于氯化镁的化合物;'dNTPs为一种PCR反应必须物，其化学名称为三磷酸脱氧核苷酸，可
采用上海生工公司的产品；
T'aq酶化学名称为耐热DNA聚合酶。可采用上海生工'公司的产品；
(2) 酶切产物的制备 将酶切体系在65。C保温1.5h，获得及酶切产物；
所说的酶切体系为水溶液，组分和含量为
酶切体系为.-
PCR产物0.35uL/L， T^I酶0.05uL/L， BufferO.l uL/L，
(3) 配置2. 5%的琼脂糖凝胶，加入lpLEB (0.5jig/ml)倒入胶槽中， 插入梳子，待胶凝固后检测。分别取10uLPCR产物和10uL酶切产物进行检 测，终结果用EB染色，采用Bio-RAD凝胶成像系统拍照；
所说的EB的化学名称为溴化乙锭，可采用市售产品，如上海生工公司 的产品，染色方法，为现有技术，如Williamson, V.M.文献报道的方法； Bio-RAD凝胶成像系统为一种通用的系统，可釆用Bio-RAD公司的产
叩？
(4) 结果分析抗感基因型酶切前都成398bp和750bp的特异片断。 经TaqI酶切后，纯合含Ty-l和Mi基因的材料成570bp、 303bp、 180bp、 95bp的特异片段，杂合含Ty-l和Mi基因的材料成750bp、 570bp、 398bp、 303bp、180bp、95bp的特异片段，杂合含Ty-l纯合含Mi基因的材料成570bp、 398bp、 303bp、 180bp、 95bp的特异片段，杂合含Mi纯合含Ty-l基因的材料成750bp、 570bp、 303bp、 180bp、 95bp的特异片段，纯合不含Ty-l和
Mi基因的材料不被酶切。
'
图1为实施例1中，酶切前的照片。
图2为实施例1中，酶切后的照片。
图3为实施例2中，酶切前的照片。
图4为实施例2中，酶切后的照片。
本双重PCR技术有以下优点1、在一个PCR中同时检测两个基因， 所用的时间只是分别检测两个基因所用时间的一半，大大节省了鉴定时间； 2、大大节约了PCR所用的药品，降低了实验成本。
具体实施例方式
实施例1
取番茄2300品种的嫩叶，采用Williamson, V.M文献公开的方法，分 别提取DNA，为模板DNA。
番茄2300为上海农科院园艺所番茄组选育的高代自交系。 (1)将PCR体系按照如下的程序进行PCR反应
95。C变性5min，然后94。C变性lmin、 61。C退火lmin、 72。C延伸2min， 35个循环，最后72t:延伸10min，获得PCR产物，4tM呆存；
所说的PCR体系为水溶液，组分和含量为-
模板DNA 20ng/L
Ty-l引物 0.2umol/L
Mi引物 0.2umol/L10xbuffer 2ul/L
Mg2+ 3.5mmol/L
dNTPs 250umol/L '
Taq酶 0.2uL /L Ty-1引物序列
CAPS IF: 5 ， - TAATCCGTCGTTACCTCTCCTT-3'
CAPS1 R: 5，-CGGATGACTTCAATAGCAATGA -3'
Mi引物序列
CAPS2 F: 5 ， -TCGGAGCCTTGGTCTGAATT-3' CAPS2 R: 5 ，-GCCAGAGATGATTCGTGAGA -3';
(2) 酶切产物的制备
将酶切体系在65。C保温1.5h，获得及酶切产物；
所说的酶切体系为水溶液，组分和含量为
PCR产物0.35uL/L， ra《I酶0.05uL/L， BufferO.l uL/L，
(3) 配置2. 5%的琼脂糖凝胶，加入lpLEB (0.5吗/ml)倒入胶槽中， 插入梳子，待胶凝固后检测。分别取10uLPCR产物和10uL酶切产物进行检 测，终结果用EB染色，采用Bio-RAD凝胶成像系统拍照；
所说的EB的化学名称为溴化乙锭，可采用市售产品，如上海生工公司 的产品，染色方法，为现有技术，如Williamson, V.M.文献报道的方法； Bio-RAD凝胶成像系统为一种通用的系统，可采用Bio-RAD公司的产P
BO 5
分析结果如图1和图2，结果表明，番茄2300不含TY-l基因和Mi基 因。('由于番茄2300酶切前后都成750、 398bp的条带，所以番茄2300不 含TY-1基因和Mi基因)。
实施例2
取番茄2583或2697品种的嫩叶，采用Williamson, V. M文献公开的方 法，分别提取DNA，为模板DNA。
番茄2583或2697为上海农科院园艺所番茄组选育的品种。 (1)将PCR体系按照如下的程序进行PCR反应
95。C变性5min，然后94。C变性lmin、 61。C退火lmin、 72。C延伸2min， 35个循环，最后72。C延伸10min，获得PCR产物，4卩保存；
所说的PCR体系为水溶液，组分和含量为
模板DNA 20ng/L
Ty-l引物 0.2umol/L
Mi引物 0.2umol/L
10xbuffer
Mg2+
dNTPs
2ul/L
3.5mmol/L 250umol/L
Taq酶 0.2uL/L Ty-l引物序列
CAPS IF: 5 ，- TAATCCGTCGTTACCTCTCCTT-3 ， CAPS1 R: 5'-CGGATGACTTCAATAGCAATGA -3，Mi引物序列
CAPS2 F: 5 ，-TCGGAGCCTTGGTCTGAATT-3' CAPS2 R: 5'-GCCAGAGATGATTCGTGAGA -3，；
(2) 酶切产物的制备
将酶切体系在65X:保温1.5h，获得及酶切产物；
所说的酶切体系为水溶液，组分和含量为
PCR产物0.35uL/L， 7^I酶0.05uL/L, BufferO.l uL/L，
(3) 配置2. 5%的琼脂糖凝胶，加入肌EB (0.5ug/ml)倒入胶槽中， 插入梳子，待胶凝固后检测。分别取IO uL PCR产物和IO uL酶切产物进行 检测，终结果用EB染色，采用Bio-RAD凝胶成像系统拍照；
所说的EB的化学名称为溴化乙锭，可采用市售产品，如上海生工公司 的产品，染色方法，为现有技术，如Williamson, V.M.文献报道的方法； Bio-RAD凝胶成像系统为一种通用的系统，可采用Bio-RAD公司的产
P
P口 S
拍照分析结果如图3和图4，结果表明，番莉2583不含TY-1基因和 Mi基因，2697杂合含TY-1基因和杂合Mi基因。
权利要求
1.同时检测番茄TY-1基因和Mi基因的双重PCR方法，其特征在于，包括如下步骤(1)将PCR体系进行PCR反应，获得PCR产物；Ty-1引物序列CAPS1 F5’-TAATCCGTCGTTACCTCTCCTT-3’CAPS1 R5’-CGGATGACTTCAATAGCAATGA-3’Mi引物序列CAPS2 F5’-TCGGAGCCTTGGTCTGAATT-3’CAPS2 R5’-GCCAGAGATGATTCGTGAGA-3’；(2)酶切产物的制备将酶切体系在65℃保温1.5h，获得及酶切产物；(3)分别取PCR产物和酶切产物进行检测，终结果用EB染色，采用Bio-RAD凝胶成像系统拍照，分析结果。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将PCR体系按照如下的 程序进行PCR反应95。C变性5min，然后94。C变性lmin、 61。C退火lmin、 72。C延伸2min， 35个循环，最后72。C延伸10min。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的PCR体系为水溶 液，组分和含量为模板DNA 20ng/L Ty-1引物 0.2umol/L Mi引物 0.2umol/L10xbuffer 2ul/L Mg2+ 3.5mmol/L dNTPs 250umol/L Taq酶 0.2uL /L所说的模板DNA指的是番茄DNA。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的酶切体系为水溶 液，组分和含量为PCR产物0.35uL/L， T^I酶0.05uL/L， BufferO.l uL/L。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，分别取 10 uL PCR产物和10 uL酶切产物进行检测。
全文摘要
本发明提供了一种同时检测番茄TY-1基因和Mi基因的双重PCR方法，包括如下步骤(1)将包括Ty-1引物和Mi引物序列的PCR体系进行PCR反应，获得PCR产物(2)将酶切体系在65℃保温1.5h，获得酶切产物；(3)将PCR产物及酶切产物进行检测，终结果用EB染色，采用Bio-RAD凝胶成像系统拍照，分析结果。本发明双重PCR技术有以下优点1.在一个PCR中同时检测两个基因，所用的时间只是分别检测两个基因所用时间的一半，大大节省了鉴定时间；2.大大节约了PCR所用的药品，降低了实验成本。
文档编号C12Q1/68GK101638683SQ20081004108
公开日2010年2月3日 申请日期2008年7月28日 优先权日2008年7月28日
发明者万延慧, 力 于, 朱为民, 朱龙英 申请人:上海市农业科学院