专利名称：高效RNA干扰联合Bt基因双重防治番茄根结线虫的方法
技术领域：
本发明属于植物病虫防治技术领域，高效RNA干渉基因和杀线虫Bt基因聚合转化番茄，双重效果共同防治根结线虫。
背景技术：
根结线虫病严重危害我国蔬菜、棉花、花生、烟草等多种经济作物和水稻、玉米等粮食作物的重要生物灾害，近年来农业种植结构与布局调整后问题进一歩突出。目前对于作物线虫病害的防治主要依赖于杀线虫剂，由于杀线虫剂防治效果差导致农业减产，加之不合理使用带来了产品污染和生态环境破坏。因此，作物线虫病害的严重危害，直接威胁着我国的粮食安全和农产品安全。利用植物介导的RNAi沉默线虫的关键基因成为潜在的最有价值的防治策略，可实现对植物线虫RNAi介导的分子调控(Urwin et al., 2002; Atkinson etal.，2003; Victoria et al.，2008)。根结线虫和胞囊线虫的生长和繁殖所需的营养物质是通过寄生在植物根部提供，利用植物表达线虫特异基因的dsRNA可实现对植物线虫的RNAi介导的分子调控。从微生物资源中挖掘抗线虫基因是另ー个重要的途径。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)产生的内毒素是ー种对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、线虫等无脊椎动物具有活性的杀虫晶体蛋白(Crystal protein)，对人、畜和ー些有益昆虫不产生毒害作用，且不会造成环境污染。目前全世界共获得了 70种转Bt基因的植物，种植面积达到26亿公顷(James，2005)。虽然在80年代初就有公司对Bt对线虫具有毒杀作用进行了专利保护。但是，人们对Bt杀线虫基因的研究却较少。2000年,加州大学Marroquin等(Marroquin et al.，2000)证实Bt杀虫晶体蛋白对线虫具有毒杀作用，具有杀线剂的潜力。将晶体蛋白喂食模式线虫发现线虫出现不育，死亡等症状。2003年，加州大学的Wei等(Weiet al., 2003)研究表明，Cry5Aa> Cry5B> Cry6B> Cryl2A> Cryl3A> and Cryl4A> Cry21A 蛋白对模式线虫均有毒杀作用。随后，Barrows等(Barrows et al.，2007)验证了 Cry5B对模式线虫的作用。但是Bt杀虫晶体蛋白对植物寄生线虫的研究却没有进展。直到2007年和2008年，美国加州大学才将对模式线虫具有杀虫效果的Cry6A和Cry5B基因分别转化到番茄(Li et al., 2007; Li et al.，2008)，接种南方根结线虫后发现，与对照相比，转基因番茄的根结数量和卵块数量均明显下降，说明Bt杀线虫基因具有巨大的应用潜力。目前，已发现cry5、cry6、cryl2、cryl3、cryl4和cry21基因对线虫具有毒杀作用。苏云金芽胞杆菌的晶体毒蛋白具有广谱的毒杀线虫功能，其基因在转基因抗线虫育种中将具有广泛的利用前景，但仍需提高特异毒杀寄生线虫的活性。如通过转基因叠加多个抗线虫功能基因来转化培育作物广谱高效的抗线虫新品种。利用转基因技术 创造新的抗线虫植物品系对植物寄生线虫的防治，环境保护及农业可持续发展具有重要意义。但是，単一基因的转化，其防效有限。因此，采用转化作用不同的分子靶标基因有助于提高植物的抗性。由于RNA干渉和Bt对植物线虫的作用分子靶标不同，将这两种基因以不同的进行叠加转化与功能聚合，将可达到高效、广谱和持久抗线虫的效果。
发明内容
本发明根据上述领域存在的空白和根结线虫防治的需要，提供一种高效RNA干渉基因和杀线虫Bt基因共同作用的抗线虫方法及品种资源，本发明的技术方案如下:一种高效RNA干扰联合Bt基因双重防治番茄根结线虫的方法，其特征在于，包括如下步骤:(1)以转入有尺熟干扰载体？046(:1341づ6 11018熟1的转基因番茄为宿主植物转化外植体，(2)构建含有外源基因的表达载体，所述外源基因指编码苏云金芽孢杆菌的Bt-Cry6A晶体蛋白的基因，(3)将重组表达载体转入宿主植物转化外植体中，筛选阳性转化子。所述构建好的重组表达载体指pBI121-06。所述将重组表达载体转入宿主植物转化外植体中，筛选阳性转化子，其特征在于采用农杆菌介导的转化，所述农杆菌为根瘤农杆菌EHA105。所述将重组表达载体 转入宿主植物转化外植体中，筛选阳性转化子，包括如下步骤:( I)准备宿主植物转化外植体，(2)制备根瘤农杆菌转化液，(3)根癌农杆菌转化液侵染外植体,然后共培养，(4)对共培养的外植体进行选择培养以分化愈伤组织，，(5)生根培养分化的愈伤组织获得转基因植株。所述准备植物转化外植体包括外植体预培养，指将取自番茄幼苗的外植体放置在MS+50 u g/ u Iこ酰丁香酮的固体培养基上，光照预培养2天，所述共培养指采用MS+100ii g/ii Iこ酰丁香酮固体培养基，避光培养2天。所述选择培养指采用MS+2mg/L 6BA+0.2mg/L IAA+300mg/L羧苄青霉素+50 y g/ml卡那霉素+IOy g/ml玉米素,26_28°C,光照培养16h,所述生根培养指长到2 3厘米的分化良好的愈伤组织转移到生根培养基MS+0.25mg/LIAA+25 u g/ml 卡那霉素 +200 u g/ml 头孢霉素上。所述制备根瘤农杆菌转化液指采用1/2浓度的液体MS + 200 U g/ U I的こ酰丁香酮为悬浮剂悬浮菌体。本发明前期，将南方根结线虫的蛋白激酶基因MiMPKl基因的编码区域的片段构建成RNA干扰载体转入番茄中，获得转MiMPKl基因RNA干扰载体的番茄植株，对转基因番茄植株接种南方根结线虫，结果表明，转基因植株的根结和卵块数量降低。本发明提供优化的Bt_Cry6A核苷酸序列，为使Bt_Cry6A基因其更适合于在植物中表达，本发明对表达Bt_Cry6A晶体蛋白Seq ID No2的初始核苷酸序列Seq ID No3的密码子进行优化并合成。合成后的核苷酸序列Seq ID N0.4。本发明将合成的Bt_Cry6A基因克隆至载体pB1121获得表达载体pB1121-06，转入PBI121-06，获得转双基因的番茄植株——同时表达MiMPKl基因和Bt-Cry6A基因的Ttl代植株，将南方根结线虫的2龄幼虫接种到该植株的根部，45天后发现转双基因植株比对照植株的卵块数量低70%，以转化単一基因的阳性植株为对照，表达2个基因的植株对根结线虫的抗性明显更強。本发明的实验充分说明高效RNA干渉基因和杀线虫Bt基因共同作用的番茄品种是抗线虫的优质品种资源。在植物抗线虫的转基因工程中具有重要的应用价值。本发明提供了可靠的有效的线虫防治策略。
图1.载体pCAGC1341构建流程图2.载体 pCAGC1341_TGPM01RNAi 构建流程图3.T0代转基因番茄植株靶标基因的PCR检测图4 载体pBI121-06结构示意5.转Bt_Cry6A基因的Ttl代番茄植株靶标基因的PCR检测图6.T0代转双基因番茄植株RT-PCR检测图7.转基因番茄的根部接种线虫45天后的根结和卵块情況。A:对照植株的根部；转干扰基因植株的根部；B ■ 转Bt基因植株的根部；D:转双基因植株的根部
具体实施例方式以下通过试验及数据具体说明本发明的实施和其取得的有益效果。生物材料: 南方根结线虫(Meloidogyne incognita),本实验室保存。根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株 EHA105,本实验室保存。植物材料番爺(SolanumIycopersicum),品种 Moneymaker (在 MAGDALENAROSSI, FIONA L.G0GGIN, STEPHEN B.MILLIGAN, ISG0UHI KAL0SHIAN, DIANE E.ULLMAN, ANDVALERIE M.WILLIAMSON.The nematode resistance gene Mi of tomato confersresistance against the potato aphid.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA:95(1998):9750 -9754.中记载)，本实验保存。骨架载体pBI121为已知载体(见Rugang Chen, Hanxia Li, Liying Zhang, Junhong/ihang, jmghua Xiao, /,hioiao fe.CaMi, a root—knot nematode resistance gene fromhot pepper(Capsium annuum L.) confers nematode resistance in tomat0.Plant CellRep (2007) 26:895 - 905),由本实验室保存。苏云芽孢杆菌目的基因Bt-Cry6A，其序列已知，由本实验合成。申请人:声明，以上生物材料均在申请人实验室有保存，可向公众发放用于验证试验。主要仪器和试剂仪器:冷冻离心机、恒温培养箱、冰箱、电子天平、高压灭菌锅、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、水浴锅、移液器、匀浆器、离心管、枪头、烧杯和PH计等。
试剂:柱式DNA小量抽提试剂盒和柱式DNA胶回收试剂盒、Taq DNA聚合酶、DNAMarker2Kplus和克隆所用的大肠杆菌感受态细胞等均购自全式金生物公司；TA克隆试剂盒、限制性内切酶BamH I和Xba I等均购自Takara生物公司。MS培养基粉末购自SIGMA公司。TAE 缓冲液(50X ):Tris 碱 242g，冰醋酸 57.1ml,0.5mol/L EDTA (pH8.0) 100ml。LB 培养基:酵母粉 5g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 10g/L。卡那霉素:溶于水中，配制浓度为10mg/ml,储存于_20°C ；氨苄青霉素:溶于水中，配制浓度为10mg/ml，储存于_20°C ；利福平:溶于甲醇中，配制浓度为10mg/ml，储存于_20°C，使用时稀释为34iig/ml ；头孢霉素:溶于水中，200mg/ml,储存于_20°C,使用时稀释为400 y g/ml。こ酰丁香酮AS:100mM，用无水こ醇溶解，放置于_20°C。实施例1:载体 pCAGC1341_TGPM01RNAi 构建流程RNA干扰诱导载体pFGC5941(英国立兹大学惠赠，为常用载体，可在市场上购买到)上带有抗除草剂(BAR)基因，并且酶切位点与插入片段重复，所以需要构建含有潮霉素选择标记的RNA干扰诱导载体，将pFGC 5941上的RNA干扰功能区(3577bp)插入带有潮霉素选择标记的克隆载体pCAMBIA1300(中国农业科学院蔬菜花卉研究所实验室保存，可向公众发放)用EcoRI/PstI 分别双酶切 pFGC5941 和 pCAMBIA1300，37。C 消化过夜，将PCAMBIA1300的酶切产物电泳后切胶回收8.9kb片段，pFGC5941的酶切产物电泳后切胶回收3.5kb片段，用T4 DNA连接酶连接，16° C温育过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，挑取长出的阳性单菌落，37° C 230rpm摇菌培养过夜，提取质粒。对提取的质粒用EcoRI/PstI酶切鉴定，如果能够切出大小为3.5kb和8.9kb的两条特异性的条带，即可确认转化子为插入了上述3.5kb的RNA干扰功能片段的PCAMBIA1300。连接所得的新质粒为适合番茄转化的RNA干扰诱导载体，命名为pCAGC1341 (图1)。扩增目的基因MiMPKl干扰区段核苷酸序列所用引物: PM01F: 5’-CGCTCTAGAGCTCTGGAGAAGGTGCTTATGGAATG-3，，PM01R:5’-CGCGGATCCATGGCATAATTTCAGGCGCTCGATAC-3’ ，退火温度为:65°C目的基因插入片段PMOl的序列为Sequence N0.1所不，两端含有Ncol、Sac1、BamH1.Xbal四个酶切位点，长度为531bp。将目的基因MiMPKl基因的干扰片段PMOl (Sequence N0.1)插入到重组子载体PCAGC1341 上。选择重组子载体pCAGC1341的4个限制性内切酶位点:Nco1、Sac1、BamHI和Xbal，识别位点分别为C丨CATGG，GAGCT丨C，G丨GATCC和T丨CTAGA。将PMOl接在T载体上标注为T-PM01，测序验证后，T-PM01与pCAGC1341同时用NcoI/SacI双酶切，使PMOl正向连接到载体中；PM01与上一步得到的含有PMOl正向插入的中间载体同时用BamHl/Xbal双酶切，使PMOl反向插入了载体中得到RNA干扰载体pCAGC1341-TGPM01RNAi (图2)。
两步构建过程中得到的载体均转化大肠杆菌DH5 a菌株，培养后提取质粒，并用NcoI/SacI双酶切检测其正确性。实施例2:构建表达Bt_Cry6A的植物表达载体-pBI 121-06根据植物对核苷酸密码子的偏好性，人工合成Bt_Cry6A，其的核苷酸序列，如SeqID N0.4 所示。载体pBI121-06的构建以常规载体pB1-121为骨架，用限制性内切酶Xba I和BamH I双酶切，将合成的Bt-CryBA基因与骨架载体分别酶切，回收目的片段，连接，鉴定后转化，获得植物表达载体pBI121-06(图 4)。实施例3 -M pCAGC1341-TGPM01RNAi载体番茄植株的获得本实验以根瘤农杆菌为介导，把装载有MiMPKl基因片段的pCAGC1341-TGPM01RNAi载体转化到番茄中。通过优化转化条件，获得转基因植株的方法。2.1根瘤农杆菌的培养1.将根瘤农杆菌(EHA105)划线接种在LB培养基上，28°C恒温培养2_3天；2.挑取单个菌落接种于基本培养基中，28°C，200rpm振荡培养24h ;3.在离心管中收集菌体，加入液体诱导培养基，使0D600调节至0.20左右，28°C，200rpm振荡培养6h，0D600升高到0.4左右时即可停止。2.2农杆菌感受态制作:(I)挑取农杆菌EHA105单菌落，接种于20ml液体LB培养基中(含有50mg/L的利福平)，28 0C，200rpm 培养 48h ；(2)转接500 u I摇培的EHA105至50ml液体LB (含有50mg/L的利福平)培养基中，28°C，200rpm培养至0D600值为0.6左右；(3)将菌液冰浴 30min, 4°C, 5000rpm 离心 IOmin,弃上清；(4)用50ml预冷的10%的甘油悬浮菌体,4°C, 5000rpm,离心IOmin,弃上清，收集菌体；(5)用25ml预冷的10%的甘油悬浮菌体,4°C, 5000rpm,离心IOmin,弃上清，收集菌体；(6)用IOml预冷的10%的甘油悬浮菌体,4°C, 5000rpm,离心IOmin,弃上清，收集菌体；(7)用l_2ml预冷的10%的甘油悬浮菌体，分装50 U I/管，液氮中速冻后_80°C保存。2.3电转法转化农杆菌:1.冰上融化农杆菌感受态细胞50 ill;2.将I ill pCAGC1341-TGPM01 RNiA加入到50 U I农杆菌感受态细胞中，轻弹混匀，在离心管中混匀后转移到电击杯中，冰浴30s-60s ；3.将电击杯放在适当的 位置，按住电击按钮进行电击；4.加500 ill不含任何抗生素的LB液体培养基，28 °C，220rpm,振荡培养3h，活化菌体；5.用灭菌枪头将菌液混匀，吸取100 U I均匀涂于LB固体培养基(卡那50mg/L和利福平50mg/L)上，28°C培养48h。6.提取农杆菌质粒进行酶切鉴定或通过菌液PCR进行检測。2.4侵染菌液的制备:1.取转化后的农杆菌划线接种于LB固体培养基上，28°C培养48h，至单菌落出现；2.挑取单菌落接种于LB液体培养基中，28°C，220rpm，振荡培养，0D600达到0.6左右时终止；3.5000rpm离心IOmin,弃上清,沉淀物即为收集的菌体；4.将菌体用1/2浓度的液体MS培养基洗涤两遍。5.为提高农杆菌的转化效率，加悬浮液悬浮菌体，悬浮液为1/2浓度的液体MS加入200 u g/ u I的こ酰丁香酮(AS),悬浮后立即用于侵染。2.5番茄转化外植体的准备1.番爺种子用无菌水浸泡洗漆两遍。2.用70%的こ醇浸泡番茄种子2min。3.弃去こ醇，加无菌水洗涤两次。4.弃去无菌水，用20%的次氯酸钠消毒15min。轻摇容器，加大种子与溶液的接触。 5.弃去次氯酸钠，用无菌水漂洗5-6次后吸干多余水分。6.将种子移入装有MS培养基的三角瓶中，每瓶20 30粒，均匀摆放。7.26_28°C避光培养出芽后光照培养6-7天至子叶张开角度120度。2.6番茄转化外植体的预培养将待切番茄幼苗放在牛皮上，用镊子夹住幼苗胚轴部分，使两片子叶重叠、平铺于培养皿底部，将子叶顶端切去，然后在靠近叶柄部位切一刀，切下方形子叶块；胚轴截为小段。放置在MS+50 ii g/ill AS培养基上，光照，预培养2天。2.7番茄外植体转化共培养1.将预培养2d的子叶和胚轴从培养皿中移出，放入盛有农杆菌菌液的锥形瓶中，轻轻摇荡，侵染lOmin，控制侵染时间，以免时间较长农杆菌过量，污染外植体，同时时间长外植体容易褐化，时间短则侵染效率低。2.取出后用液体MS冲洗后置无菌滤纸上吸干，转入MS+lOOiig/iUAS共培养基平皿。3.避光，共培养2天。2.8番茄转化外植体选择分化将共培养结束的外植体转到筛选培养基上(MS+2mg/L 6BA+0.2mg/L IAA+300mg/L羧苄青霉素+20 u g/ml潮霉素+10 u g/ml玉米素)，加入玉米素促进外植体分化。26-28°C，16h光照培养，分化緑色愈伤组织。2.9番茄转化继代每2周继代一次，弃去愈伤生长不良者，将苗移入新的培养基中。待小苗长到2-3cm,再转到生根培养基上(MS+0.25mg/L IAA+25 u g/ml卡那霉素+200 y g/ml头孢霉素)，加入200 y g/ml头孢霉素，在抑制农杆菌的同时促进跟的生长，同时为了壮苗，抗生素浓度减半。待小苗长出4-5条根，并有大量侧根生出时进行炼苗，待根系发达后移栽到灭菌的土中。待苗长到四片叶时，取根和叶片进行鉴定。2.10植物基因组DNA提取1.在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液I，60°C水浴预热。2.分别取番茄新鲜叶片和根尖，在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中，剧烈摇动混匀，60°C水浴保温30-60分钟(时间长，DNA产量高)，不时摇动。3.加入20ml氯仿/戊醇/こ醇溶液，颠倒混匀(需带手套，防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟，使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。4.室温下5000rpm离心5分钟。5.仔细移取上清液至另ー 50ml离心管，加入I倍体积异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。6.在1.5ml eppendorf中加入Iml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团，在干净吸水纸上吸干，转入含TE的离心管中，DNA很快溶解于TE。7.如DNA不形成絮状沉淀，则可用5000rpm离心5分钟，再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀，往往难溶解于TE，可在60°C水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。8.将DNA溶液3000rpm离心5分钟，上清液倒入干净的5ml离心管。9.加入 5 U I RNaseAdO U g/u I), 37 °C 10 分钟，除去 RNA (RNA 对 DNA 的操作、分
析一般无影响，可省略该步骤)。10.加入1/10体积的3mol/L NaAc及2X体积的冰こ醇混匀，_20°C放置20分钟左右，DNA形成絮状沉淀。11.用玻棒捞出DNA沉淀，70%こ醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。12.将 DNA 重溶解于 Iml TE, -20 贮存。13.取2 ill DNA样品在0.7% Agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小。同时取15 ill稀释20倍，测定0D260/0D280，检测DNA含量及质量。2.11转干扰基因番茄植株的PCR检测取具有潮霉素抗性的转基因番茄植株新鮮叶片提取的DNA作PCR扩增模板。利用下列特异引物进行PCR扩增。能扩增出特异条带的植株即初步鉴定为阳性植株。检测MiMPKl基因RNA干扰片段的特异引物PMF:TGGAGAAGGTGCTTATGGAATG
PMR:CATAATTTCAGGCGCTCGATACPCR反应体系:
权利要求
1.效RNA干扰联合Bt基因双重防治番茄根结线虫的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)以转入有1 嫩干扰载体？046(:1341-16 11011 嫩1的转基因番茄为宿主植物转化外植体， (2)构建含有外源基因的表达载体，所述外源基因指编码苏云金芽孢杆菌的Bt-Cry6A晶体蛋白的基因， (3)将表达载体转入宿主植物转化外植体中，筛选阳性转化子。
2.据权利要求1所述的方法，所述构建好的重组表达载体指PBI121-06。
3.据权利要求2任一所述的方法，所述将重组表达载体转入宿主植物转化外植体中，筛选阳性转化子，其特征在于采用农杆菌介导的转化，所述农杆菌为根瘤农杆菌EHA105。
4.权利要求3所述的方法，所述将重组表达载体转入宿主植物转化外植体中，筛选阳性转化子，包括如下步骤: (1)准备宿主植物转化外植体， (2)制备根瘤农杆菌转化液， (3)根癌农杆菌转化液侵染外植体,然后共培养， (4)对共培养的外植体进行选择培养以分化愈伤组织， (5)生根培养分化的愈伤组织获得转基因植株。
5.据权利要求4所述的方法，所述准备植物转化外植体包括外植体预培养，指将取自番茄幼苗的外植体放置在MS+50y g/ylこ酰丁香酮的固体培养基上，光照预培养2天， 所述共培养指采用MS+100y g/ylこ酰丁香酮固体培养基，避光培养2天， 所述选择培养指采用MS+2mg/L 6BA+0.2mg/L IAA+300mg/L羧苄青霉素+50 u g/ml卡那霉素+10 u g/ml玉米素，26-280C，光照培养16h， 所述生根培养指长到2 3厘米的分化良好的愈伤组织转移到生根培养基MS+0.25mg/LIAA+25 u g/ml卡那霉素+200 u g/ml头孢霉素上。
6.据权利要求5所述的方法，所述制备根瘤农杆菌转化液指采用1/2浓度的液体MS + 200 V- g/ u I的こ酰丁香酮为悬浮剂悬浮菌体。
全文摘要
本发明“高效RNA干扰联合Bt基因双重防治番茄根结线虫的方法”，属于植物病虫防治领域。以转入有RNA干扰载体pCAGC1341-TGPM01RNAi的转基因番茄为宿主植物转化外植体，转入表达Bt-Cry6A晶体蛋白的载体，获得双重抗根结线虫的转基因番茄品种。本发明还提供了转基因的优化方法。本发明合成的基因是对密码子进行优化的。将优化后的编码Bt-Cry6A晶体蛋白的人工基因以及转有该基因的番茄品种，显示比转化单一基因的抗线虫效果好。
文档编号C12N15/82GK103088053SQ201210468420
公开日2013年5月8日 申请日期2012年11月19日 优先权日2011年11月18日
发明者陈国华, 王殿东, 田雪亮, 王运生, 茆振川, 杨宇红, 谢丙炎 申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所