专利名称：抑制肝癌细胞生长的发酵液的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术领域的制备方法，具体地，涉及一种抑制肝癌细胞 生长的发酵液的制备方法。
背景技术：
肝癌是全世界死亡率很高的疾病， 一般的治疗方法是采用手术切除，但许 多病例中多为中心发生，极易发生癌细胞的早期转移，这种病情限制了手术切 除的应用。因此需要一些药物的辅助治疗，但是现有药物对肝癌病人进行的全 身化疗效果较差，因此寻找新的有效化学治疗药物对提高晚期和复发肝癌病人 的生存率具有重大意义。
植物内生真菌是一类生存在宿主植物茎叶内并完成其生活周期的真菌，在 演化过程中二者形成了稳定的生态关系。内生真菌的代谢物能刺激植物生长发 育，提高寄主植物对生物和非生物胁迫的抵抗能力，特别是内生真菌往往能与 植物相互作用，产生相同或相似的代谢产物。考虑到微生物具有繁殖迅速，容 易培养，生物量大等特点，研究从药用植物中分离内生真菌，获得产药用物质 的内生真菌，将是一种很有潜力的药物来源。
胡桃楸(Juglans mandshurica Maxim)是胡桃科胡桃属的落叶乔木，主要 分布于我国黑龙江省东部小兴安岭、完达山以及张广才岭等山区，为我国珍贵 树种之一。楸树中含有丰富的环烯醚萜类化合物，不仅有利尿、降血糖及迟缓 和泻下作用，还有抗炎、抗氧化、神经保护作用；胡桃楸有抗肿瘤活性，有可 能作为有效的端粒酶活性抑制剂。胡桃楸提取液是通过诱导细胞凋亡从而起到 抗肿瘤作用的。胡桃揪的抗肿瘤研究预示其内生真菌也可能具有产抗癌物质的 能力。然而，目前还没有从胡桃楸中分离出具有抗肿瘤效果的内生真菌的报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种抑制肝癌细胞生长的发 酵液的制备方法。本发明利用从胡桃楸树皮部分离纯化得到纯的内生真菌菌株，
3并通过传统的形态学方法，发酵方法进行鉴定，适合工业规模化发酵生产具有 抑制人肝癌细胞株H印G2生长的作用且高效低毒的发酵液。 本发明是通过以下技术方案实现的
本发明菌株的获得本发明所使用的楸树内生真菌菌株由胡桃楸树皮中分 离制得。分离方法为取胡桃楸树皮刮去浮皮，灭菌后削去表层，切取组织小 块，置于水琼脂固体平板培养基上，放入培养箱培养；取切口处新长出的菌丝， 转接至培养基上培养，待菌落长出后，根据菌落形态、颜色的差异以及长出时 间的不同，分别挑取各平板上菌落边缘处的菌丝接于新的培养基平板上进行分 离培养；从中筛选出具有抗肿瘤活性的内生真菌，经鉴定为半知菌亚门，丝孢 纲，丛梗孢目，木霉菌属长枝木霉(Trichoderima longibrachiatum)，现保 存在中国典型培养物保藏中心，保存编号为CCTCC M 208102。
本发明包括以下步骤
第一步、内生真菌的分离分离内生真菌并且采用菌丝尖端切割法进行纯
化；
第二步、诱导孢子产生将长枝木霉CCTCC M 208102接种到马铃薯-琼脂 培养基(PDA培养基)上培养，将长有菌丝的PDA培养基切下一小块，放于CMX 培养基(Leach， Lang and Yoder， 1982. Journal of General Microbiology, 128: 1719-1729中公开)上，室温下培养，1到3天后有孢子长出；
第三歩、液体发酵培养挑取孢子转接到装有CM液体培养基(Leach, Lang and Yoder， 1982. Journal of General Microbiology, 128: 1719-1729中公 开)中，26。C到28t:， 180 rpm摇床振荡培养，7 8天后中止发酵，即得具有 抑制肝癌细胞生长作用的发酵液。
所述第一歩中分离内生真菌的方法如下取胡桃楸树皮刮去浮皮，使用自 来水冲洗20分钟后置于无菌超净工作台，用无菌水冲洗3到4遍，再用体积百分 比为75。/。的酒精浸泡3到5分钟，然后用质量百分比为P/。的NaC10溶液灭菌20分钟， 再使用无菌水反复洗涤4到5遍，用无菌纸吸干树皮上的无菌水，削去黑色表层， 切取0.5cnV'的小块，置于水琼脂固体平板培养基上，放入25'C培养箱培养。
所述第一歩中的纯化方法如下取切口处新长出的菌丝，及时转接至新鲜 的PDA培养基上培养，待菌落长出后，根据菌落形态、颜色的差异以及长出时间的不同，分别挑取各平板上菌落边缘处的菌丝接于新的PDA平板上进行分离 培养，然后切取培养菌丝的尖端，移入一新的培养基上培养，切割3到5次即 可得到纯化的菌株。
所述第二步中PDA培养基组成为200 g新鲜土豆煮的汁，20 g葡萄糖， 固体培养基加1.5%琼脂，加蒸馏水至总体积为1000 ml。
本发明所述的一种从楸树树皮中分离出来的内生真菌长枝木霉CCTCC M 208102的生物学特性如下
1、 菌落形态特征固体培养基上，菌落产生白色绒状菌丝体，呈辐射状分
布，菌丝发达，液体培养液中形成均匀的圆形菌球，菌球表面粗糙有丝状，质 地疏松，发酵液呈黄色。
2、 孢子形态特征肉眼观孢子为绿色，显微观察可见孢子为椭球型，表面 光滑。分生孢子梗的主轴长而粗壮，二次分支短，且分枝呈坛形，柄梗常常单 生，孢子着生于二次分支的顶端。
3、 培养特征该菌在PDA平板上生长迅速，接种2天即可见直径约2厘
米的菌落，正面观菌丝为白色绒状，辐射状向外生长，菌体分泌黄色色素类物
质，使得培养基反面均匀呈淡黄色。在CMX培养基上培养能很快长出孢子，产 孢簇松散，孢子为绿色。在液体培养液中发酵后菌体呈圆形，表面粗糙有丝状， 质地疏松，发酵液呈淡黄色，并有一种芳香气味。
4、 菌株具有较好的稳定性菌株继代培养5次，发酵液仍具有很好的活
性，发酵液具有较好的热稳定性，在80'C以下处理2小时，仍具有较好的活性。 可以在-2(TC保存3个月以上。
本发明通过利用从胡桃楸树皮部分离纯化得到纯的内生真菌菌株，其发酵 液高效低毒具有抑制人肝癌细胞株H印G2生长的作用，显示出较好的癌细胞选 择性。同时考虑到发酵液成份具有较好的水溶性，避免了目前抗癌药物水溶性 差的弊端，具有良好的开发前景。
本发明所使用的菌株为
菌株分类命名木霉菌属长枝木霉(Trichoderima longibrachiatum)， 保藏单位名称中国典型培养物保藏中心(CCTCC)， 保藏H期2008年6月27 R，保存号CCTCC M 208102。
图1长枝木霉CCTCC M 208102在PDA平板上的形态学图。 图2长枝木霉CCTCC M 208102真菌孢子显微镜下图。 图3长枝木霉CCTCC M 208102真菌发酵液图。
图4不同稀释倍数的发酵液对H印G2及HL-7702增殖抑制率情况示意图。
具体实施例方式
以下对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提 下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述 的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或 按照制造厂商所建议的条件。
实施例l
内生真菌的分离
取胡桃楸树皮刮去浮皮，在自来水下冲洗20分钟后置于无菌超净工作台， 用无菌水冲洗3 4遍，用体积百分比为75%的酒精浸泡3 5分钟，然后用质量百 分比为l。/。的NaC10溶液灭菌20分钟，再使用无菌水反复洗涤4 5遍，用无菌纸吸 干树皮上的无菌水，削去黑色表层，切取0.5 cmX0.5 cm的小块，置于水琼脂 固体平板培养基上，放入25'C培养箱培养。
取切口处新长出的菌丝，及时转接至新鲜的PDA培养基上培养，待菌落长出 后，根据菌落形态、颜色的差异以及长出时间的不同，分别挑取各平板上菌落 边缘处的菌丝接于新的PDA平板上进行分离培养。切取培养菌丝的尖端，移入一 新的培养基上培养，切割3 5次即可得到纯化的菌丝。对菌株编号后，转至PDA 斜面培养基上，于28'C培养箱中培养4 5天，期间观察并记录菌株生长形态，
然后放入4t:冰箱保存备用。
实施例2
楸树内生真菌的鉴定
菌落形态固体培养基上，菌落产生白色绒状菌丝体，呈辐射状分布，菌 丝发达，如图1所示。液体培养液中形成均匀的圆形菌球，菌球表面粗糙有丝状， 质地疏松，发酵液呈黄色。
6孢子形态肉眼观孢子为绿色，显微观察可见孢子为椭球型，表面光滑。 分生孢子梗的主轴长而粗壮，二次分支短，且分枝呈坛形，柄梗常常单生，孢 子着生于二次分支的顶端。显微镜下观该分生孢子梗的主轴长，着生的二次分 支短，再次分枝少，且分枝呈坛形和柄梗常常单生；此外，分生孢子为单细胞， 呈椭圆形。如图2所示。
培养特征该菌在PDA平板上生长迅速，接种2天即可见直径约2厘米的 菌落，正面观菌丝为白色绒状，辐射状向外生长，菌体分泌黄色色素类物质， 使得培养基反面均匀呈淡黄色。在CMX培养基上培养能很快长出孢子，产孢簇 松散，孢子为绿色。在液体培养液中发酵后菌体呈圆形，表面粗糙有丝状，质 地疏松，发酵液呈淡黄色，如图3所示，并有一种芳香气味。
菌株具有较好的稳定性，继代培养5次，发酵液仍具有很好的活性，发酵 液具有较好的热稳定性，在8(TC以下处理2小时，仍具有较好的活性。可以在 -20。C保存3个月以上。
经过鉴定该内生真菌为半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，木霉菌属长枝木 霉(Trichoderima longibrachiatum)。 实施例3
抑制肝癌细胞生长的发酵液的制备
将分离出来的长枝木霉CCTCC M 208102于PDA平板上培养，然后将长有菌丝 的PDA培养基切下一小块，放于CMX培养基上，于室温下培养，两天后可见有孢 子长出。然后挑取孢子转接到装有250ml CM液体培养基的三角瓶中，26'C到 28°C， 180rpm摇床振荡培养，7 8天后中止发酵，即得具有抑制人肝癌细胞株 H印G2生长作用的发酵液。收集菌液用于抗肿瘤活性初步分析。 实施例4
真菌发酵液的体外抗癌试验
用含重量百分比为10%的胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养液(购自Gibco 公司)培养的人肝癌H印G2细胞株(购自浙江中医药大学生命科学学院分子与遗 传研究室)以及人肝正常细胞HL-7702 (购自中国生命科学院生化与细胞所)以 1X10MV孔接种于96孔板，37°C, 5%C02的培养箱中培养，24h后用系列梯度(发 酵液稀释倍数分别为40， 20， 10, 5)稀释后的发酵液处理细胞，每个浓度6个复孑L，以未发酵的CM培养液作空白对照，以姜黄素作为阳性对照，于37'C， 5%C02 的培养箱中培养，培养至24h后，加入3- (4， 5-二甲基噻唑-2) -2, 5-二苯基 四氮唑溴盐(MTT)孵育4h后，吸弃上清液，加入150yL/孔二甲基亚砜(DMSO) 振荡IO min，在酶联免疫监测仪上检测570nm处的0D值。重复三次。
由图4可以看出，MTT法结合定时显微镜观察记录显示真菌发酵液对人肝癌 细胞株H印G2有较强的抑制作用，发酵液虽然对正常细胞也具有一定的抑制或 杀伤作用，但不如对肝癌细胞作用强。
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权利要求
1、一种抑制肝癌细胞生长的发酵液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤第一步、内生真菌的分离分离内生真菌并且采用菌丝尖端切割法进行纯化；第二步、诱导孢子产生将长枝木霉CCTCC M 208102接种到PDA培养基上培养，将长有菌丝的PDA培养基切下一小块，放于CMX培养基上，室温下培养，1到3天后有孢子长出；第三步、液体发酵培养挑取孢子转接到装有CM液体培养基中，26℃到28℃，180rpm摇床振荡培养，7到8天后中止发酵，即得具有抑制肝癌细胞生长作用的发酵液。
2、 根据权利要求1所述的抑制肝癌细胞生长的发酵液的制备方法，其特 征是，第一歩中分离内生真菌的方法如下取胡桃楸树皮刮去浮皮，使用自来 水冲洗20分钟后置于无菌超净工作台，用无菌水冲洗3到4遍，再用体积百分 比为75%的酒精浸泡3到5分钟，然后用质量百分比为1%的NaClO溶液灭菌20 分钟，再使用无菌水反复洗涤4到5遍，用无菌纸吸干树皮上的无菌水，削去 黑色表层，切取0.5 cnr'的小块，置于水琼脂固体平板培养基上，放入25'C培 养箱培养。
3、 根据权利要求1所述的抑制肝癌细胞生长的发酵液的制备方法，其特 征是，第一步中的纯化，其方法如下取切口处新长出的菌丝，及时转接至新 鲜的PDA培养基上培养，待菌落长出后，根据菌落形态、颜色的差异以及长出 时间的不同，分别挑取各平板上菌落边缘处的菌丝接于新的PDA平板上进行分 离培养，然后切取培养菌丝的尖端，移入一新的培养基上培养，切割3到5次 即得到纯化的菌丝。
4、 根据权利要求1所述的抑制肝癌细胞生长的发酵液的制备方法，其特 征是，第二歩中PDA培养基组成为200 g新鲜土豆煮的汁，20g葡萄糖，固 体培养基加1.5%琼脂，加蒸馏水至总体积为1000 ml。
全文摘要
一种分子生物学技术领域的制备方法，该制备方法包括如下步骤第一步、内生真菌的分离分离内生真菌并且采用菌丝尖端切割法进行纯化；第二步、诱导孢子产生将长枝木霉CCTCC M 208102接种到PDA培养基上培养，将长有菌丝的PDA培养基切下一小块，放于CMX培养基上，室温下培养，1到3天后有孢子长出；第三步、液体发酵培养挑取孢子转接到装有CM液体培养基中，26℃到28℃，180rpm摇床振荡培养，7到8天后中止发酵，即得具有抑制肝癌细胞生长作用的发酵液。本发明适合工业规模化发酵生产具有抑制人肝癌细胞株HepG2生长的作用且高效低毒的发酵液。
文档编号C12P1/02GK101487022SQ20081004121
公开日2009年7月22日 申请日期2008年7月31日 优先权日2008年7月31日
发明者唐克轩, 李美芽, 苗志奇 申请人:上海交通大学