专利名称：p53蛋白的表位(SQAMDDLMLS)与丝状噬菌体基因8蛋白的杂合蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域。
背景技术：
肿瘤是仅次于心血管疾病的世界第二号”杀手”疾病。截至到1999年底，全球肿瘤病人总数已逾4000万人。我国每年有130万人死于肿瘤。目前，还缺少无法对肿瘤的发生进行有效地诊断、预防和治疗的药品。
p53是一种抑癌基因，其蛋白对维持正常的细胞分裂与生长起重要的调节作用，但是一旦发生突变，突变蛋白半衰期延长，失去抑癌作用，积累于细胞内则刺激免疫系统产生相应抗体。N端20-25肽段、37-46肽段构成的B细胞表位的基因片段插入到整合有丝状噬菌体主要外壳蛋白基因的载体中，构建成新的重组载体。这种重组载体被转入宿主菌，大肠杆菌中，在辅助噬菌体存在的条件下，肿瘤表位基因产物被分泌到细胞外，并组装于噬菌体外壳蛋白中，形成具有具有对应表位的杂合蛋白。
利用噬菌体展示外源多肽技术的优点是有效地实现了基因型和表型的体外转换，使研究者完全可以在基因分子克隆的基础上有效地实现蛋白质构象的体外控制，在体外获得具有良好生物学活性的表达产物。这种新型的基因工程技术在制备生物制品方面具有简便、快速、灵敏、成本低等优点。
发明内容
本发明的目的是确立一种能够用于制备肿瘤临床检测的生物制品。
本发明的杂合蛋白是含有人类p53N端37-46肽段构成的表位的丝状噬菌体基因8杂合外壳蛋白。
P53-37-46杂合蛋白基因的核苷酸序列atg aaa aag tct tta gtc ctc aaa gcc tcc gta gcc gtt gct acc ctc 48
gtt ccg atg ctg tct ttc gcc gcg gag ggt tct caa gct atg gat gat96tta atg tta tct cca tcg aac gat cct gca aaa gcg gcc ttt gac tcc 144ctg caa gcc tca gcg acc gaa tat atc ggt tat gcg tgg gcg atg gtt 192gtt gtc att gtc ggc gca act atc ggt atc aag ctg ttt aag aaa ttc 240acc tcg aaa gca agc 255P53-37-46杂合蛋白的氨基酸序列为Met Lys Lys Ser Leu Val Leu Lys Ala Ser Val Ala Val Ala Thr15 10 15Leu Val Pro Met Leu Ser Phe Ala Ala Glu Gly Ser Gln Ala Met20 25 30Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Ser Asn Asp Pro Ala Lys Ala Ala3540 45Phe Asp Ser Leu Gln Ala Ser Ala Thr Glu Tyr Ile Gly Tyr Ala50 55 60Trp Ala Met Val Val Val Ile Val Gly Ala Thr Ile Gly Ile Lys65 70 75Leu Phe Lys Lys Phe Thr Ser Lys Ala Ser80 85杂合蛋白的制备包括以下步骤第一步，构建表达载体和重组载体。
用SacII和BstB I两种限制性内切酶处理pfd88质粒，然后将人工合成的寡核苷酸片段插入到经酶处理的质粒载体，获得重组载体pfd8p53-37。
第二步，合成p53蛋白N端37-46肽段表位的基因序列，并在序列两端加上酶切位点。用商业公司的DNA合成仪进行人工合成。表位基因的序列为(均为5’-3‘方向)正义链GGAGGGTTCTCAAGCTATGGATGATTTAATGTTATCTCCAT反义链CGATGGAGATAACATTAAATCATCCATAGCTTGAGAACCCTCCGC。
第三步，将重组载体转入宿主细胞。宿主细胞为带有F因子的大肠菌株TG1菌株。获得的转化体为新的工程菌株pfd8p53-37。
第四步，制备杂合蛋白。培养工程菌株，经过离心、沉淀等步骤可获得该发明的杂合蛋白。
免疫检测杂合蛋白可以作为一种抗原与多种肿瘤患者血清中的抗体产生免疫应答用本发明制备的杂合蛋白为抗原，采用免疫检测方法(如ELISA)，可以检测到临床肿瘤(比如，胃癌、结肠瘤、肝癌、乳腺癌和肺癌等)病人血清中的相关抗体。说明该杂合蛋白可以用来制备肿瘤临床的检测药物。
具体实施例方式
1.表位基因的合成利用商业生物公司的DNA合成仪进行表位基因片段GGAGGGTTCTCAAGCTATGGATGATTTAATGTTATCTCCATCGATGGAGATAACATTAAATCATCCATAGCTTGAGAACCCTCCGC)的合成。
2.重组载体的构建1)取pfd88质粒5μg，加入1-2μL的SacII酶，然后加入缓冲液和无菌水至总体积200μl。37℃保温24小时。酶切后，用常规方法抽提质粒DNA。抽提后，用乙酸胺和二倍体积的乙醇沉淀DNA，并溶于50μL TE液中。
2)用第二种限制性内切酶BstBI处理已经第一种酶切的质粒DNA，方法同上。
3)双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，测定载体浓度。
4)载体与人工合成的外源DNA片段按摩尔浓度1∶3混合。10μL混合液加入0.5μLT4DNA连接酶和1μL缓冲液。在15-20℃条件下，培养过夜，获得重组载体(pfd8p53-37)。
3.制备感受态细胞将TG1细胞培养于LB培养基上，37℃培养16-20小时。挑选单菌落接种于2ml LB液培养基中，37℃培养过夜。培养液转入100ml新鲜LB培养液中，37℃培养5小时。5000rpm离心15分钟。用8ml预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮沉淀，获感受态细胞。
4.重组载体转化宿主细胞取浓度约为150μg/mL的重组载体DNA溶液1.25μL；加入100μl的感受态细胞，置于碎冰中15分钟；加入600μl LB培养液，置于37℃恒温条件培养1小时；10000rpm离心5分钟；弃上清，将剩余部分涂于含氨苄青霉素的LB培养基表面，37℃恒温箱中培养过夜。选在培养平面生长的单菌落，进行扩大培养和低温保存(-70℃)。
5.杂合蛋白的制备取冻存的转化细胞在LB平板上划线培养，过夜；选单菌落接种于含氨苄青霉素的3mlLB培养液中，37℃培养过夜；将培养液转入80-100ml LB培养液中继续培养，并加入IPTG(终浓度为0.5-1mM/mL)，37℃培养30分钟；离心(10 000rpm)10分钟；沉淀用培养液重新悬浮，37℃培养2-4小时；离心(8000rmp)20分钟，弃上清，用TE液悬浮沉淀；离心(5000rmp)20分钟，取上清，并加入20％聚乙二醇和2.5mol/L氯化钠。冷环境中放置4-5小时，离心(8000rmp)10分钟；弃上清，用TE液悬浮沉淀，获得有外源多肽展示的丝状噬菌体杂合外壳蛋白。
6.制备的杂合蛋白的检测1)采用SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳法进行蛋白的纯度检测将待测蛋白样品在沸水中处理3-5分钟。按常规方法进行电泳。电泳后，用硝酸银染色法对胶板进行染色。如果杂合蛋白表达成功，胶板上出现两条带。上方带为杂合蛋白带，下方为野生型丝状噬菌体外壳蛋白带。由于硝酸银染色法比较灵敏，如胶板上无其它杂带出现，说明制备的蛋白已达到纯净标准。
2)采用紫外分光光度法进行制备蛋白的浓度检测取5-10μL的样品，稀释100倍后，测定在270纳米处的吸光值。用吸光值除以3.84便得到蛋白溶液的浓度(μg/μL)。
7.免疫检测实验采取ELISA方法，用杂合噬菌体作为包被抗原，对待检者的血清进行检测。抗原的包被浓度为60μg/mL，一抗为稀释200倍的患者血清，二抗为羊抗人IgG。染色方法采用TMB法。检测波长为450/620。对367名肿瘤患者血清进行检测的结果表明结肠癌28.6％(8/28)、食管癌27.3％(6/22)、胃癌26.9％(7/26)、肺癌23.5％(23/98)、鼻咽癌23.1％(3/13)、乳腺癌18.8％(27/144)、卵巢癌18.2％(2/11)、脑瘤16.7％(2/12)、肝癌15.4％(2/13)。检测的特异度94.2％，灵敏度为21.8％。
SEQUENCE LISTING<110>东北师范大学<120>p53蛋白的表位(SQAMDDLMLS)与丝状噬菌体基因8蛋白的杂合蛋白及其应用<130>none<140>---------<141>2005-10-23<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>255<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>p53蛋白表位(SQAMDDLMLS)基因片段与丝状噬菌体基因VIII的重组序列<220>
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1.p53蛋白的表位(SQAMDDLMLS)与丝状噬菌体基因8蛋白的杂合蛋白，其特征在于将p53蛋白表位(SQAMDDLMLS)展示于丝状噬菌体主要外壳蛋白表面，形成的杂合蛋白，蛋白的氨基酸结构序列为Met Lys Lys Ser Leu Val Leu Lys Ala Ser Val Ala Val Ala Thr15 10 15Leu Val Pro Met Leu Ser Phe Ala Ala Glu Gly Ser Gln Ala Met20 25 30Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Ser Asn Asp Pro Ala Lys Ala Ala3540 45Phe Asp Ser Leu Gln Ala Ser Ala Thr Glu Tyr Ile Gly Tyr Ala50 55 60Trp Ala Met Val Val Val Ile Val Gly Ala Thr Ile Gly Ile Lys65 70 75Leu Phe Lys Lys Phe Thr Ser Lys Ala Ser80 85
2.p53蛋白的表位(SQAMDDLMLS)与丝状噬菌体基因8蛋白的杂合蛋白，其特征是这种杂合蛋白的核苷酸序列为atg aaa aag tct tta gtc ctc aaa gcc tcc gta gcc gtt gct acc ctc 48gtt ccg atg ctg tct ttc gcc gcg gag ggt tct caa gct atg gat gat 96tta atg tta tct cca tcg aac gat cct gca aaa gcg gcc ttt gac tcc144ctg caa gcc tca gcg acc gaa tat atc ggt tat gcg tgg gcg atg gtt192gtt gtc att gtc ggc gca act atc ggt atc aag ctg ttt aag aaa ttc240acc tcg aaa gca agc 255
3.如权利要求1所述的p53蛋白的表位(SQAMDDLMLS)与丝状噬菌体基因8蛋白的杂合蛋白作为制备检测肿瘤的临床检测药品的用途。
4.如权利要求2所述的p53蛋白的表位(SQAMDDLMLS)与丝状噬菌体基因8蛋白的杂合蛋白作为制备检测肿瘤的临床检测药品的用途。
全文摘要
本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域。利用DNA重组技术，将P53蛋白N端37－46肽段构成的B细胞表位的基因片段插入到整合有丝状噬菌体主要外壳蛋白基因的载体中，构建成新的重组质粒。在宿主菌中，表位基因产物被分泌到细胞外，并组装于噬菌体外壳蛋白中，形成杂合蛋白。杂合蛋白可以作为一种抗原可以检测到临床肿瘤(比如，胃癌、肝癌、乳腺癌和肺癌等)病人血清中的相关抗体患者血清中的抗体。所以，这种杂合蛋白在制备肿瘤临床诊断试剂方面具有良好的应用前景。
文档编号C12N15/62GK1803846SQ20051011914
公开日2006年7月19日 申请日期2005年12月27日 优先权日2005年12月27日
发明者王丽, 华攀玉, 高瑞娟 申请人:东北师范大学