专利名称：增强噬菌体溶菌基因打孔效率的dna序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种增强子样DNA序列，尤其涉及一种经基因重排后获得的非编 码区的DNA序列，该DNA序列能够有效提高噬菌体溶菌基因(mE)编码蛋白对 细菌的打孔效率，本发明还涉及该DNA序列在制备细菌菌蜕中的用途，属于基因 工程领域。
背景技术：
增强子(enhancer)是指增加同它连锁的基因转录频率的DNA序列，增强子是通 过启动子来增加转录的。有效的增强子可以位于基因的5'端，也可位于基因的3， 端，有的还可位于基因的内含子中。增强子的效应很明显， 一般能使基因转录频率 增加10 200倍，有的甚至可以高达上千倍。
增强子是真核细胞中增强启动子功能的顺式作用元件。随着人们对原核生物基 因表达调控的深入研究，人们发现在原核生物的调控系统和某些病毒基因组DNA 片段中也具有增强子样功能。这些研究对揭示原核系统的基因表达调控和增强外源 基因在原核系统中的表达水平具有重要的理论意义和实用价值。
1981年，Benerji在SV40DNA中发现一个140bp的序列，它能大大提高 SV40DNA/兔(3-血红蛋白融合基因的表达水平，这是发现的第一个增强子。它位 于SV40早期基因的上游，由两个正向重复序列组成，每个长72bp。目前发现的增 强子多半是重复序列， 一般长50bp,通常有一个8-12bp组成的"核心"序列，如SV40 增强子的核心序列是5，-GGTGTGGAAAG-3，。增强子有别于启动子处有两点1) 增强子对于启动子的位置不固定，而能有很大的变动；2)它能在两个方向产生相 作用。 一个增强子并不限于促进某一特殊启动子的转录，它能刺激在它附近的任一 启动子。
增强子可分为细胞专一性增强子和诱导性增强子两类1 )組织和细胞专一性 增强子。许多增强子的增强效应有很高的组织细胞专一性，只有在特定的转录因子 (蛋白质)参与下，才能发挥其功能。例如免疫球蛋白基因的增强子只有在B淋巴胞
3内，活性才最高。除此以外，在胰岛素基因和胰凝乳蛋白酶基因的增强子中都发现 了有很强的组织特异性。此外，所有的增强子中均有一段由交替的嘧啶-嘌呤残基组
成的DNA，这种DNA极易形成Z-DNA型；故有人认为在形成一小段Z-DNA后， 增强子才有功能。在酵母中有类似增强子的顺序，称为上游激活顺序(UAS)。 UAS 能向两个方向起作用。并位于启动子上游的任何距离处，但在启动子下游则无作用 (有别于一般的增强子)。小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)DNA的转录可受糖类固醇激素 的刺激。这个能受激素影响的顺序位于转录起点上游约100bp处。此顺序能和激素 及其蛋白受体组成的复合物相结合。当将此顺序放在某基因的启动子的任一方面(即 上游或下游)和各种不同的距离时，它仍能刺激该基因的转录。所以增强子激活作用 可能是糖类固醇调控一组靶基因的机制:糖类固醇激素进入细胞后即与其受体结合。 结合作用激活受体，使其能识别存在于增强子中的共同顺序，进而激活了在增强子 附近能对糖类固醇起反应的基因。即当糖类固醇-受体复合物和增强子结合时，其附 近的启动子即起始转录。2)诱导性增强子。这种增强子的活性通常要有特定的启 动子参与。例如，金属硫蛋白基因可以在多种组织细胞中转录，又可受类固醇激素、
锌、镉和生长因子等的诱导而提高转录水平。 1、原核生物基因组中增强子样序列的研究
在氮缺乏培养基中,大肠杆菌g/" ALG操纵子的转录激活需低浓度的ntrc基因产 物NR1。 Reifzer及Magasam等研究发现，该操纵子的glnAP启动子上游区有两个NRl 强结合位点。缺失突变研究表明，定位于2 100bp及2 150bp附近的这两个NRl强结合 位点与转录活性密切相关。它们的缺失会使低浓度NR1的转录激活作用丧失。将这 段DNA序列向上移动1 400bp或向下移动2 OOObp,不影响他们对NR1的应答。 Drummond等对i:. ;7MeMmom'ae操纵子的研究也发现，该启动子上游159bp处的缺失 会使其依赖高浓度NR1的转录起始减弱4倍。缺失的2170bp至2 156bp的核苷酸序列 为GCACNsCGGCCC，仅3个碱基与glnAP2的结合序列GCACN5TGGTGC不同，这可 能是它与其它氮调节基因 一样需高浓度而不是低浓度NR1激活的原因。Ames和 Nikaido在研究X 0^^w,^m系统时也发现了 一个NR1强结合位点，定位于ArgT基因 下游60bp和hisJ基因上游120bp处，NR1结合该位点可激活这两个基因的启动子。这 些原核生物基因调控区的结合位点都具有不依赖于位置及方向激活启动子转录的 特征,与真核细胞中的增强子极为相似。Buckd等发现，X. ;wewmom'ae的m/H启动子 上游272bp至2 184bp间的缺失可极大降低m/特异激活物m/ A对它的转录活化。对 "i/H、 myU和myB启动子上游序列的研究分析表明，这种上游序列只存在于m/A激活的基因中。他们确定了一个在K/7wewmom'ae、 i /z/zoWwn和爿zoto6fl"er的m/启动子 中共同存在的保守序列，它是一个蛋白质结合位点，m/A在此与m/启动子相互作 用。该序列位于转录起始点上游100bpA处，是一个由AT富含序列隔开的TGTNACA 序列。它本身不具启动子活性，必须与转录起始点上游的224区及212区保守序列一 起才能启动高效的转录。进一步的研究表明，该序列对下游启动子的转录活化作用 与位置及方向无关，即使移位至2 000bp以外，也具转录活化作用。但其最佳位置在 2 136bp附近。Better等也发现iC户"ewmo"/ae的基因m'/A产物对i /zizo6/wm 的m/HDK启动子的最大激活作用需上游序列的存在，相似的上游序列要求也存在于 i /zizo6/"w乂w/ om'Mm的m/H和m/D启动子转录活化中，可见m/A结合序列也是一 种增强子相似序列。Goreiarrubio和Grarmbias对大肠杆菌g/" ALG及邻近的82kD蛋白 基因的转录调控进行了对比研究。82kD蛋白基因的转录起始位点位于上游2 272bp 处，转录方向与g/"ALG相反，这样g/"AP上游的两个NRl强结合位点也同样处于 82kD上游相似位置。但研究结果表明结合NRl位点仅对g/" AP2有作用，它存在与否 对82kD的转录无明显影响，这说明g/n AP2上游的原核增强子样序列的作用具启动 子特异性。进一步研究分析表明，这种特异性是由RNA聚合酶cj因子种类及启动子 结构共同决定的。g/" AP2启动子保守区位于227bp至2410bp间的 TTGGCACANTCGCT , 与Ntr-型启动子的224bp和212bp保守区序 CTGGYAYRNTTGCA相似，可被60识别。而82P启动子保守区是235区和210区间的 TTGTAGNTACAAT，属于Pribnow2型启动子，识别它的o因子为o70。 Herendeew等 在对T4噬菌体的转录控制机制进行深入研究后，进一步阐明原核增强子与真核增强 子的不同在于其具较强的启动子特异性，可分为两大类Pribnow-型启动子的保守 区为210区及235区，为o70识另'J,位于它们上游区的增强子样序列为AT丰富区；Ntr-型启动子的保守区为212区和224区，可为cj60识别，位于其上游区的增强子序列为 TGTNACA。
1990年中国学者潘卫等发现，大肠杆菌JM103染色体DNA中一个1 000 bp长的片段(M)能以方向不依赖的特性促进痘苗病毒P715及N启动子对CAT基 因及]32半乳糖苷酶基因的表达，但具一定的位置依赖性，位于基因的3端或上游2 000bp外则无增强作用。它也具有一定的宿主特异性，在JM103、 MC1061及C600中 增强表达的效应大致相近，但在HB101中则无明显的增强作用。同时，该片断本身 还具有启动子功能,可启动检测载体中位于其下游的CAT基因的表达。此片段的转 录增强作用不能简单地以串联启动子功能来解释，因为以M2P7.52CAT方式排列时，M可增强P7.5的转录活性；而以P7.52M2CAT方式排列时，CAT表达不明显增加。上 述研究结果表明，该l殳具有原核增强子样功能。宫庆红等对此M片^R进行了进一步 研究，他们用BstI将M片段消化成LM(2 535bp)及SM(2 355bp)两个小片段，克隆入 检测载体后发现，M片段的原核增强子样功能主要集中在5，端355bp的SM小片段上。 该小片段可在大肠杆菌中使疫苗病毒N启动子控制下的CAT基因表达提高3-7倍，其 增强活性与M片段相似，也无方向依赖性。它也具相对的宿主依赖性，在不同大肠 杆菌中的增强作用依次JM103〉DH5cOLE392〉HB101 。谢明等采用缺失突变对M片段 的研究进一步证明，M片段的活性部位位于该序列的5，端，为多位点协同作用。在 M序列3，端上游440bp-2 500bp、 5 80bp-2 640bp和740bp-2 800bp处各存在一个长度为 60bp的活性位点，取中间值标定410bp、 610bp和770bp处左右范围30bp。三个位点 同时存在增强活性最高，同时缺失两个位点时增强活性即丧失。 2真核病毒基因组中原核增强子样序列的研究
原核增强子样序列除存在于原核生物基因组中外，在某些真核病毒基因组中也 发现了一些序列可以增强子样功能促进外源基因在大肠杆菌中的表达。1985年我国 学者侯云德在探讨SV40增强子对原核表达系统的影响时发现,SV40历'"c/ IIIB片段 对人aD型IFN基因在大肠杆菌中的表达有明显的增强作用。SV40基因组DNA经 顶^/III酶切后可产生A、 B、 C、 D、 E、 F六个片段，其中B片段(4 002bp-2 517bp) 含有完整的t抗原基因，C片段(517bp-2 1046bp)含SV40DNA的ori及721bp重复序列。 将它们分别插入PL启动子控制的IFN基因上游1200bp处，历m/ IIIB片段的插入可使 IFN的表达提高711倍,而C片段的插入无明显增强作用。吴激华等的研究也表明预V^ niB片段在大肠杆菌中可使PL控制下IFN-(3的表达水平提高515倍。1996年吴激华等 又发现不仅SV40历'wt/IIIBl 100bp片段(SV40-HB)具原核增强子样功能，痘苗病毒的 MM III K的211 OOObpBgl片段(w-k)及呼吸道合胞病毒(RSV)SflmH I-G的0.7KB片段 (RSV-G)也具有原核增强子样功能。这些片段正向插入可使外源基因表达增强 3.7-7.3倍，反向插入可增强1.5-7.6倍，增强强度次序为RSV2G〉w-k〉SV40-HB。这些 片段也均具有原核启动子功能，可使克隆至下游的CAT基因表达。对w-k片^殳的
列进行比较,采用微机与已知的原核和真核转录激活蛋白的DNA结合位点进行对比 检索发现，在SV40-HB片断中具SV40中Ap-l结合位点的共同序列，w-k中有细菌F13 因子和真核NF-III结合位点，JM103-M中有两处SPI结合位点(GCbox)和一处Ap-l结合
位点，提示这些序列可能以顺式作用元件方式与反式作用因子相互作用,来增强基因
6在原核细胞中的表达。刘哲伟等1992年又发现人乳头瘤病毒6b型(HPV-6b)的上游调 控区在大肠杆菌中也具有增强子样功能。HPV-6b基因组中位于E6的ATG起始密码 子上游310bp至852bp间的540bp片段，即其非编码区(uuR)的上游端,在大肠杆菌 JM103及MC 1061中可使痘苗病毒P715启动子及P 11启动子控制下的CAT及P-半乳糖 苷酶基因表达显著增强。正向插入可使p-半乳糖苷酶基因表达在JM103及MC1061中 分别提高10倍和6倍，反向插入可提高3倍左右。序列分析表明，这段DNA序列中有 74bp的排列顺序为噤呤嘧啶间隔排列，可分为三组,前两组均为24bp，呈重复排列顺 序，第三组为26bp,但组合方式与前两者略有不同。曾有报道指出这种。票呤嘧"定排 列结构倾向于形成Z-DNA,在真核增强子中，SV40增强子也含这种形式排列,这可 能就是该540bp片段增强子功能的结构基础。
增强子作为一种顺式调控元件，其功能的实施必然离不开反式因子，如增强子 对相应启动子的正确选择，就需要与一些组织特异性及公共蛋白因子的协同作用， 这些蛋白因子可能负责识別启动子的核心序列及增强子的保守序列。
从上述研究可以看出，存在于真核生物病毒基因组中的原核增强子样序列与原 核生物基因组中增强子样序列具有不同的特性。它们没有显著的宿主特异性，但具 有一定的方向特异性，虽然两种方向的插入均具增强子样功能，但正向插入一般较 反向插入增强作用更强。更为显著的是，真核生物病毒基因组中的原核增强子样序 列还同时具有原核启动子功能，^提示两类原核增强子样序列在结构及作用^L理上有 一定的差异。这些机理的进一步阐明，无论是对原核生物表达调控的理论研究还是 对原核基因工程的实际应用都将是极为重要、极具价值的。
发明内容
本发明目的之一是提供一种能够增强噬菌体溶菌基因编码蛋白对细菌的打孔 效率的DNA序列；
本发明目的之二是将上述的DNA序列应用于制备细菌菌蜕(包括大肠杆菌菌 蜕和禽沙门氏菌菌蜕等)。
本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的
本发明将PhiX174噬菌体E基因经过基因重排后获得PhiX174噬菌体E基因 (mE )非编码序列DNA序列，该DNA序列长度为74bp ( SEQ ID NO: 1 )，具有增
强子作用。
本发明将包含有本发明增强子序列(SEQ ID NO:l)的噬菌体mE基因(SEQ IDNO:2 )与质粒pBV220相连接得到打孔载体pBV-mE;将没有包含本发明增强子序 列的噬菌体AE基因(SEQ ID NO:3 )与质粒pBV220相连接得到打孔载体pBV-AE; 将打孔载体pBV-mE转化到大肠杆菌通过对选取的菌落进行28""C过夜震荡培养和 42。C培养以诱导mE基因表达，肉眼观察打孔效率，可以观察到非常显著的打孔结 果。即呈现清澈透明的菌液，打孔效率达99.9999%。表明本发明DNA序列(SEQ IDNO:l)具有增强mE基因的转录的功效，表达出更多的mE蛋白，从而有更多的 mE蛋白参与了对细菌的打孔，使打孔效率有显著提高。
同样的，将打孔载体pBV-AE转化到大肠杆菌，通过对选取菌落进行28°C过夜 震荡培养和42。C培养以诱导AE基因表达，肉眼观察打孔效率。结果表明，在缺失 SEQ ID NO:l序列的情况下，打孔质粒载体pBV-AE呈现出非常低的打孔效率，培 养的菌液混浊；打孔载体pBV-mE的打孔效率要高于打孔载体pBV-AE的打孔效率 1000倍以上，说明SEQ ID NO:l序列确实具有增强子样作用。
图1大肠杆菌菌影的肉眼观察结果 图2禽沙门氏菌菌影的肉眼观察结果
具体实施例方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述 而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本 领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方 案的细节和形式进行修改或替换，但这些^^改和替换均落入本发明的保护范围内。
试验材料
菌才朱及质粒大肠杆菌TG1以及为^研究室自藏；噬菌体PhiX174购于Promega (北京)生物技术有P艮^^司。质粒pBV220的构建过程可按照以下文献构建张智 清，姚立红，侯云德，含PrPl启动子的原核高效表达载体的组建及其应用，病毒学 报，19卯，6 (2), 111 - 116。
实施例1 打孔质粒载体pBV-mE的构建、筛选和打孔效果观察
1.1基因重排技术制备PhiX174溶菌基因E (mE)
根据GenBank中逸菌体PhiX174溶菌基因E的编码序列设计引物
8Lysis mE陽U: 5'-AGGGAATTCTGGTACGCTGGACTTTGTGG-3' ( SEQ ID N0.4)
Lysis mE-L: 5'-AGGGGATCCGAGCTCTCACTCCTTCCG-3' (SEQ ID N0.5) 上、下游引物5'端分别引入了限制性酶切位点￡coR I和5am H I，由上海生工 合成。以噬菌体PhiX174双链DNA为模板扩增溶菌基因E: PCR扩增反应体系为 50jiL,其中MgS042mM，上、下游引物各l一， dNTP200 ^M， 10x %《buffer, 7^TMDNA聚合酶2U (TaKaRa),模板DNA10ng。 PCR反应程序为95°C预变 性5 min, 94°C 30 s, 59°C 30 s, 72°C 30 s, 30个循环，72°C 5 min。 PCR扩增后的mE 基因经凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收，大小为275bp (SEQ ID NO:2 ),其中，增 强子序列为SEQ ID NO: 1所示。
1.2打孔质粒载体pBV-mE的构建
将溶菌基因mE纯化后用￡coR I/Bam H I进行双酶切，用T4 DNA连接酶 (TaKaRa)与经五coR I和万am H I双酶切消化的pBV220载体相连接，16。C过夜 连接并热激转化入大肠杆菌TGI感受态细胞，经菌落PCR鉴定为阳性的克隆进行 增菌并利用碱裂解法小量提取质粒，命名为pBV-mE。
1.3含打孔质粒载体pBV-mE大肠杆菌的打孔效率观察及与74bp非编码基因的 相关性
选取含打孔质粒载体pBV-mE的大肠杆菌TGI的菌落，接种在5 mL含50(ig/mL 氨苄青霉素的LB中，28"过夜震荡培养(220 r/min),然后转接1-2 mL于50mL 含50)ig/mL氨节青霉素的LB中，28。C震荡培养至OD,咖达0.4左右。取出lOO^il 培养物备用，将剩余培养物迅速调高到42。C培养以诱导mE基因表达，继续培养3-5 小时，肉眼可以观察到非常显著的打孔效率，即呈现出清澈透明的菌液，打孔效率 达99.9999%,而对照组则为非常混浊的菌液。表明SEQ ID NO:l能够增强打孔质 粒载体pBV-mE的打孔效果，具有增强子样作用。
的相关性试验
1.1 PCR扩增PhiX174缺失74bp的E基因(AE) 冲艮据GenBank中噬菌体PhiX174溶菌基因E的编码序列设计引物 LysisAE隱U: 5'-AATGGATCCTCACTCCTTCCGCAC-3' ( SEQ ID N0.6 ) LysisAE-L: 5'-GTGGAATTCATGTTCATCCCGTCAAC-3' (SEQ ID N0.7)上、下游引物5'端分别引入了限制性酶切位点￡coR I和万am H I，由上海生工 合成。以噬菌体PWX174双链DNA为模板扩增溶菌基因AE: PCR扩增反应体系 为50fiL,其中MgS042mM,上、下游引物各1 dNTP200pM， 10x %《buffer, rfl《TMDNA聚合酶2U (TaKaRa),模板DNA10ng。 PCR反应程序为95°C预变 性5 min, 94°C 30 s, 59°C 30 s, 72。C 30 s, 30个循环，72°C 5 min。 PCR扩增后的mEA 基因经凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收，大小为201bp ( SEQIDN0.3 )。
1.2打孔质粒载体pBV-AE的构建
将纯化溶菌基因AE用五coR I/^zm HI进行双酶切，用T4 DNA连接斷TaKaRa) 与经￡coRI和5flm H I双酶切消化的pBV220载体相连接，16"过夜连接并热激转 化入大肠杆菌TGI感受态细胞，经菌落PCR鉴定为阳性的克隆进行增菌并利用碱 裂解法小量提取质粒，命名为pBV-AE。
1.3含pBV-AE大肠杆菌的打孔效率及与74bp非编码基因的相关性 选取含打孔质粒载体pBV-AE的大肠杆菌TGI的菌落，接种在5 mL含50吗/mL 氨卡青霉素的LB中，28。C过夜震荡培养(220 r/min)，然后转接1-2 mL于50mL 含50吗/mL氨苄青霉素的LB中，28。C震荡培养至OD60(tan达0.4左右。取出100^1 培养物备用，将剩余培养物迅速调高到42。C培养以诱导AE基因表达，继续培养3-5 小时，肉眼可以观察到打孔效率微弱，效果不明显，即呈现出混浊的菌液，与对照 组非常混浊菌液的差异不显著。AE基因在缺失74bp非编码基因的情况下，非但没 有提高打孔效率，反而降低了打孔效率。表明含有74bp非编码基因的mE基因及编 码蛋白打孔效率非常显著，而缺失74bp非编码基因的AE基因及蛋白没有打孔^:果。 结果证明了 74bp非编码基因具有增强子样作用。
实施例3 禽沙门氏菌菌影疫苗的制备
在5 mL含50pg/mL氨苄青霉素的LB中接种含打孔质粒载体pBV-mE的禽沙 门氏菌，28°C过夜震荡培养(220 r/min )，然后转接1-2 mL于50mL含50昭/mL氨 千青霉素的LB中，28。C震荡培养至OD6oo^达0.8(l()9cfo)左右。取出10(^1培养 物备用，将剩余培养物迅速调高到42。C培养以诱导mE基因表达，继续培养3-5小 时；取诱导前后的培养物各10(^1适当稀释后涂LB平板进行活菌CFU检测。试验 结果溶菌前后的培养物溶菌灭活效率达99.99%。溶菌结束后形成的菌影用PBS 洗涤3次，经过紫外消除残留的活菌，冻干保存，即得。
10实施例4 大肠杆菌Ghost (菌蜕)的制备
在5 mL含50昭/mL氨卡青霉素的LB中接种含打孔质粒载体pBV-mE的大肠 杆菌TGI, 28。C过夜震荡培养(220 r/min )，然后转接1-2 mL于50mL含50ng/mL 氨苄青霉素的LB中，28。C震荡培养至OD6oo^达0.4左右。取出lOOpl培养物备用， 将剩余培养物迅速调高到42。C培养以诱导E基因表达，继续培养3-5小时；取诱导 前后的培养物各100|lU适当稀释后涂LB平板进行活菌CFU检测。溶菌结束后形成 的ghost菌蜕用PBS洗涂3次，冻干保存，并对冻干后的菌蜕进行活菌CFU检观'J。
试验结果溶菌前后的培养物从3.1xl()S下降到1.2xl04(CFU/ml),溶菌灭活效 率达99.99%。序列表
<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
<120>增强噬菌体溶菌基因打孔效率的DNA序列及其应用
<130〉 KLPI08078
〈160> 5
<170> Patentln version 3. 5
<210〉 1
<211〉 74
〈212> DNA
<213> phage
<400> 1
tggtacgctg gactttgtgg gataccctcg ctttcctgcc cctgttgagt ttattgctgc cgtcattgct tatt
60 74
<210〉 2
〈211〉 275
<212> DNA
〈213〉 phage
〈400> 2
tggtacgct ggactttgtg ggataccctc gctttcctgc ccctgttgag tttattgctg ccgtcattgc ttattatgtt catcccgtca acattcaaac ggcctgtctc atcatggaag gcgctgaatt tacggdaaac attattaatg gcgtcgagcg tccggttaaa gccgctgaat tgttcgcgtt taccttgcgt gtacgcgcag gaaacactga cgttcttact gacgcagaag aaaacgtgcg tcaaaaatta. cgtgcggaag gagtga
60 120
180 240 275
<210> 3
〈211〉 201
<212> DNA
<213> phage
<400> 3
atgttcatcc cgtcaacatt caaacggcct
aaaacattat taatggcgtc gagcgtccgg
tgcgtgtacg cgcaggaaac actgacgttc
aaUacgtgc ggaaggagtg a
<210〉 4
<211〉 29
〈212〉 DNA
<213〉 artifical
<400> 4
agggaattct ggtacgctcg acttt gtgg
gtctcatcat ttaaagccgc ttactgacgc
ggaaggcgct tgaattgttc
gaatttacgg gcgtttacct gtgcgtcaaa
60 120 180 201
29
<210〉 5
<211〉 29
〈212〉 腿
〈213〉 artifical
〈400> 5
aggggatccg agctctcact ccttc eg
27
<210〉 6 <211〉 29 <212> DNA<213> artifical <400> 6
agggaattct ggtacgctgg actttgtgg 29
<210> 7
<211> 27
〈212〉 DNA
〈213〉 artifical
<400> 7
aggggatccg agctctcact ccttccg 27
1权利要求
1、增强噬菌体溶菌基因编码蛋白打孔效率的DNA序列，其特征在于其核苷酸序列为SEQ ID NO1所示。
2、 重排噬菌体溶菌基因，其特征在于其核苷酸序列为SEQ ID NO: 2所示。
3、 含有权利要求1所述DM序列的打孔载体。
4、 含有权利要求2所述重排噬菌体溶菌基因的打孔载体。
5、 按照权利要求3或4所述的打孔载体，其特征在于所述打孔载体是pBV-mE, 其中，所述mE的核苷酸序列为SEQ ID NO: 2所示。
6、 权利要求1所述的DNA序列在制备细菌菌蜕中的用途。
7、 权利要求2所述的重排噬菌体溶菌基因在制备细菌菌蜕中的用途。
8、 按照权利要求6或7所述的用途，其特征在于所述的细菌菌蜕包括大肠 杆菌菌蜕和禽沙门氏菌菌蜕。
9、 一种制备细菌菌蜕的方法，包括(l)将权利要求4所述的打孔载体转化 到细菌中；(2)增殖培养；(3)诱导噬菌体溶菌基因表达；(4)收集溶菌结束后形 成的细菌菌蜕，冻干保存，即得。
10、 按照权利要求9所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述的细菌是大 肠杆菌；步骤(2)中所述的增殖培养是在28。C过夜震荡培养至OD6i达0M;步骤(3 )中所述的诱导是在42。C温度下进行诱导培养。
全文摘要
本发明公开了增强噬菌体溶菌基因打孔效率的DNA序列及其应用。本发明利用基因重排技术对噬菌体E基因进行重排，使其阅读框架为276个核苷酸的E突变成阅读框架为201个核苷酸的ΔE(SEQ ID NO3)，而前74bp基因变为非编码区序列(SEQ ID NO1)，具增强子类作用。本发明非编码区DNA序列能够提高噬菌体溶菌基因对大肠杆菌和禽沙门氏菌的打孔效率，由含有本发明非编码区DNA序列的mE基因构建到的打孔质粒在大肠杆菌中具有很高的裂解效率，而由不含有该非编码区DNA序列的ΔE基因构建得到的打孔质粒pBV-ΔE则只有微弱的打孔效果，二者打孔效果相差1000倍以上。
文档编号A61K39/02GK101503686SQ200910118380
公开日2009年8月12日 申请日期2009年3月2日 优先权日2009年3月2日
发明者刘思国, 刘慧芳, 微 司, 常月红, 伟 彭, 王春来 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所