定向固定化pega复合型树酯的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，特别是含有06-烷基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT) 的重组蛋白固定于固体材料表面，以建立MGMT重组蛋白固定化方法。
【背景技术】
[0002] 以固定化蛋白质为核心的酶反应器、生物传感器、生物芯片等技术对于生物催化、 蛋白质组学、临床诊断和新药开发具有重要意义。固定化后蛋白质生物活性强弱是成功构 建上述固定化蛋白质界面的前提和决定因素，也是影响后期催化、识别、诊断和筛选等结果 最为关键的因素。因此，蛋白质的高活性固定化方法学研宄不仅能提高上述技术研宄结果 的准确性，而且对揭示生命科学领域蛋白质-蛋白质和蛋白质-小分子药物相互作用机制、 理解信号传导过程具有重要意义。
[0003] 目前，将蛋白质固定在固体材料表面的方法一般可分为物理吸附法和化学键合 法。物理吸附法简便，易于操作，且蛋白质的固载量大。然而，由于所用方法无特异性，且蛋 白质与固体材料间作用较弱，该方法所得固定化蛋白质在使用过程中蛋白质易于流失，从 而也影响了研宄结果的准确性。化学键合方法中又可分为随意固定化和定向固定化，随意 固定化方法一般利用蛋白质结构中的氨基、羧基和巯基等基团，与固体材料表面修饰的醛 基等发生化学反应，通过共价键将蛋白质随意固定在固体表面，此类方法由于固定过程中 蛋白质在固体表面取向和构象不一，容易使其活性位点受到影响。而定向固定化方法可很 好地解决这类问题，可以使蛋白质在固体表面的取向和构象达到统一。本专利就是一种定 向固定化方法，由于重组蛋白中的MGMT标签在重组蛋白质上的位置是固定的，一般位于目 标蛋白的N末端、C末端或其两端，因此，不会影响目的蛋白本身的构象和活性位点。本专 利旨在建立一种高选择性的MGMT标签融合蛋白的固定化新方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供定向固定化PEGA复合型树酯的制备方法及应用。
[0005] 本发明采用以下技术方案：
[0006] 定向固定化PEGA复合型树酯的制备方法，包括以下步骤：
[0007] a、将2-氨基-6-氯嘌呤（化合物A)和4-硝基苄醇（化合物B)加入溶剂中，在 一定温度和碱性条件下发生Williamson成醚反应，生成4-硝基-苄基鸟嘌呤；如下反应式 所示：
[0008]
【主权项】
1. 定向固定化PEGA复合型树醋的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： a、 将2-氨基-6-氯嘌呤和4-硝基苄醇加入溶剂中，在一定温度和碱性条件下发生 Williamson成醚反应，生成4-硝基-苄基鸟嗓呤； b、 将4-硝基-苄基鸟嘌呤经叔丁氧羰基保护，在钯碳催化下常压加氢，溶剂为四氢呋 喃，在4-二甲氨基吡啶存在的条件下，加入二碳酸二叔丁酯，搅拌还原生成化合物（3); c、 搅拌还原生成化合物（3)，苄氧羰基氯保护的Y-氨基丁酸在乙基二甲基碳二亚胺 和1-羟基苯并三氮唑的存在下，发生偶合反应，生成化合物（5); d、 发生偶合反应生成的化合物（5)经钯碳加氢还原、分离纯化后，在二氯乙烷、1-羟基 苯并三唑的存在下，与表面富含羧基的PEGA反应，并在二氯甲烷、三氟乙酸的作用下，其反 应的摩尔比为1:1~1. 5酸性条件下，脱保护即得苄基鸟嘌呤衍生物修饰的PEGA树酯（8); e、 含06-烷基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶标签一类蛋白质与苄基鸟嘌呤修饰的树酯直 接混合后，即可发生高效的烷基转移反应，将以硫醚共价键的形式定向固定在PEGA树酯表 面。
2. 如权利要求1所述的定向固定化PEGA复合型树醋的制备方法，其特征在于，步骤a 中的溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或其中任意组合，反应底物摩尔比为1: 1，反应温度 为80°C，加热回流时间为0. 5~24小时之间。
3. 如权利要求1所述的定向固定化PEGA复合型树醋的制备方法，其特征在于，步骤b 中钯碳用量为反应原料用量的5%，反应温度为25°C，搅拌时间为5~8小时。
4. 如权利要求1所述的定向固定化PEGA复合型树醋的制备方法，其特征在于，所述步 骤c经苄氧羰基保护的反应条件为：NaOH水溶液，室温反应14小时后可得反应产物（4)。 发生偶合反应的条件为：加入乙基二甲基碳二亚胺反应0. 5小时之后，加入1-羟基苯并三 氮唑，搅拌反应2小时可得反应产物（5)。
5. 如权利要求1所述的定向固定化PEGA复合型树醋的制备方法，其特征在于，所述步 骤e中06-烷基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶标签一类蛋白质为a-型受体、0 -型受体、M-型受 体、N-型受体、血管紧张素受体AT的任一种。
6. 如权利要求1-5任一所述的定向固定化PEGA复合型树酯的制备方法方法制得的定 向固定化PEGA复合型树酯。
7. 如权利要求6所述的定向固定化PEGA复合型树醋，其特征在于，定向固定化PEGA复 合型树酯应用于制备具有特异性识别作用的试剂诊断盒。
【专利摘要】本发明公开了定向固定化PEGA复合型树酯的制备方法及应用，以2-氨基-6-氯嘌呤和4-硝基苄醇为原料，发生Williamson成醚反应，合成4-硝基-苄基鸟嘌呤，经叔丁氧羰基保护还原，与苄氧羰基氯保护的γ-氨基丁酸在乙基二甲基碳二亚胺和1-羟基苯并三氮唑的存在下，发生偶合反应。经还原、分离纯化，与PEGA反应，脱保护即得苄基鸟嘌呤衍生物修饰的PEGA树酯，与含MGMT标签的一类蛋白质发生烷基转移反应，将以硫醚共价键的形式定向固定在PEGA树酯表面。该方法反应稳定、步骤简单，制备的产物可在固体材料表面形成稳定、均匀、取向统一的蛋白质涂层，用于制备具有特异性识别作用的试剂诊断盒。
【IPC分类】C07K17-08
【公开号】CN104844710
【申请号】CN201510175637
【发明人】赵新锋, 郑晓晖, 张亚军, 肖超妮, 王静
【申请人】西北大学
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年4月13日