收集流穿液，经超滤浓缩后，即得马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab)2。
[0031]其中，洗脱亲和层析柱时使用的洗脱缓冲液成分为:pH2.71mM Tris-HCl?洗脱后用IM Tris中和。洗脱速度为2.5ml/min。
[0032]过Protein G琼脂糖凝胶柱时，先用A液平衡，再用30mM PB液(磷酸二氢钠)洗脱，最后加入PH2.7的0.lmol/L甘氨酸溶液洗脱。在收集洗脱样品的过程中加入lmol/LTris中和。
[0033]洗脱速度为:A液平衡洗脱速度为20mL/min，30mM PB液(磷酸二氢钠)洗脱速度为20mL/min，0.lmol/L甘氨酸洗脱速度为10mL/min。
[0034]实施例2马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab’)2对小鼠急性毒性试验
[0035]考察实施例1制备的马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab’)2在较大剂量和浓度下，单次腹腔注射给予小鼠所产生的急性中毒反应和死亡情况。具体如下:
[0036]马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab’)2单次腹腔注射分别给予昆明种小鼠和BALB/c小鼠，给药容量为0.2ml/10g体重，给药剂量为300mg/kg，对照组腹腔注射等容量的生理盐水。每组均10只小鼠，雌雄各半，给药后连续观察14天。结果表明，给药后动物出现不安、活动性增强，十多分钟后恢复正常。连续14天观察，各组动物精神状态、行为活动、采食量、生长发育、营养状况、临床表现、对外界刺激反应均无异常改变，各组动物无死亡。生长发育正常，未见其他异常表现，无死亡。大体解剖未见异常。
[0037]结论:在本试验条件下，马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab’)2单次腹腔注射给予小鼠的最大量为300mg/kg，小鼠生长发育正常，无急性中毒表现。
[0038]实施例3马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab’)2对兔红细胞溶血试验
[0039]采用体外试管法考察了实施例1制备的马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab’)2对兔红细胞溶血及凝集的影响。具体如下:
[0040]将浓度为15mg/ml的马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白？(&13’)2按0.5ml,0.4ml、
0.3ml,0.2ml,0.1ml 分别加入盛有 2.0ml,2.lml,2.2ml,2.3ml,2.4ml 生理盐水和 2.5ml 的2%红细胞混悬液的玻璃试管中，同时以氯化钠注射液(2.5ml)和注射用水(2.5ml)分别作为阴性和阳性对照品。结果表明，该浓度的马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白？(&13’)2无溶血作用，不引起红细胞凝聚。氯化钠注射液阴性对照无溶血无凝聚，注射用水阳性对照全部溶血。
[0041]结论:浓度为15mg/ml的马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab’)2体外对兔红细胞无溶血作用，不引起红细胞凝聚。
[0042]实施例4马抗H7N9亚型流感免疫球蛋治疗效果评价
[0043]参照杨松涛等(2006年)中公开的方法，构建H7N9亚型流感小鼠模型，用构建的H7N9亚型流感小鼠模型进行马抗H7N9亚型流感免疫球蛋治疗效果评价。将小鼠分8组，每组8只小鼠，小鼠攻毒后4小时、24小时经腹腔注射0.2mg、0.4mg、0.6mg实施例1制备的马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab’)2，每隔18小时注射一针，共三针。结果表明，阳性对照组小鼠全部死亡，阴性对照组小鼠正常；小鼠攻毒后分别在4小时经腹腔注射免疫球蛋白F(ab’ )20.2mg、0.4mg、0.6mg，保护率达100 %，小鼠攻毒后分别在24小时经腹腔注射免疫球蛋白F(ab’ )20.4mg、0.6mg，保护率达80%，注射0.2mg免疫球蛋白F(ab’)2，保护率达40%。
[0044]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0045]参考文献
[0046]杨松涛，高玉伟，王承宇，邹嘯等环虎源H5N1亚型禽流感病毒感染小鼠模型的建立中国病毒学第21卷4期21⑷:353-357，2006年。
【主权项】
1.马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab’) 2的制备方法，其特征在于，将H7N9亚型流感病毒株A/shanghai2/2013的病毒灭活液与免疫佐剂混合作为免疫原，通过多次免疫健康马匹，获得高免血浆，分离纯化IgG蛋白，经胃蛋白酶酶切，将酶切产物过Protein G琼脂糖凝胶柱，收集洗脱液即得马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab’)2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)将H7N9亚型流感病毒株A/shanghai2/2013接种7-9日龄SPF鸡胚，37°C孵育72h，收获鸡胚尿囊液，用甲醛37°C灭活72h，灭活病毒接种7-9日龄SPF鸡胚，盲传3代，3代鸡胚尿囊液中均检不出病毒为灭活合格；收获鸡胚尿囊液，4°C离心，沉淀用PBS溶解后，进行蔗糖密度梯度离心，获得纯化浓缩的H7N9亚型流感病毒灭活液； 2)将上述病毒灭活液与弗氏完全佐剂或弗式不完全佐剂混合，马经过背部皮下分点注射的方法进行初免、多次加强免疫，检测马血浆效价达到1:5000以上时，采血；采用饱和硫酸铵沉淀法，分离纯化IgG蛋白，然后用胃蛋白酶进行酶切； 3)将酶切产物过ProteinG琼脂糖凝胶柱，收集流穿液，经超滤浓缩后，即得马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab’)2。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中病毒灭活液与弗氏完全佐剂或弗式不完全佐剂按I '2的体积比混合。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述饱和硫酸铵沉淀法具体为:a)将I体积血浆与2体积无热原水混合后，加入3体积的饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，使溶液中硫酸铵浓度达到50%，全部加入后于室温静置30-40min，5000rpm离心20min，弃上清；b)取沉淀用2体积无热原水重悬，加入I体积的饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，使溶液中硫酸钱浓度达到33.3%，全部加入后于室温静置30-40min，5000rpm离心20min，取沉淀；重复b) 2-3次，获得纯化的IgG蛋白。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)中使用的亲和层析柱中填料为Sepharose 4B0
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)中洗脱亲和层析柱时使用的洗脱缓冲液成分为:ρΗ2.7的ImM Tris-HCl。
7.根据权利要求1-6任一项所述方法制备的马抗Η7Ν9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab，)2 ο
8.权利要求7所述马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab’) 2在制备用于预防和/或治疗H7N9亚型流感药物中的应用。
9.由权利要求7所述马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab’) 2制备的用于预防和/或治疗H7N9亚型流感的药物。
【专利摘要】本发明提供马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab’)2及其制备方法，是将H7N9亚型流感病毒株A/shanghai2/2013的病毒灭活液与免疫佐剂混合作为免疫原，免疫健康马匹，获得高免血浆，分离纯化IgG蛋白，经胃蛋白酶酶切、纯化，得马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab’)2。本品是用于预防和治疗H7N9亚型流感病毒所引起的重症肺炎型H7N9流感的有效药物，对H7N9亚型流感病毒感染重症患者具有显著疗效。本发明的制备工艺采用独特的工艺参数控制，适于工业化生产，产品安全可靠。
【IPC分类】A61K39-42, C07K16-10, C07K16-06, A61P31-16
【公开号】CN104844708
【申请号】CN201510236784
【发明人】赵永坤, 杨松涛, 王承宇, 王化磊, 高玉伟, 万忠海, 张国利, 吴永魁, 黄耕, 李楚芳, 罗琴芳, 王铁成, 郑学星, 冯娜, 任志广, 王超, 孟令楠, 程楠, 冀显亮, 夏咸柱
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年5月11日