专利名称：：牛口蹄疫病毒Asial型多表位重组疫苗及制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种动物重组疫苗，尤其涉及牛口蹄疫病毒Asial型多表位重组疫苗及其制备方法，属于动物口蹄疫病毒重组疫苗领域。
背景技术：
：口蹄疫作为重大动物疫病不仅严重威胁畜牧业的健康发展，而且会引起人们对食品安全的担忧等一系列社会问题。疫苗免疫仍然是有效防控口蹄疫的主要手段之一。但目前使用的疫苗大多是采用病原体研制的灭活疫苗，生产此类疫苗不仅需要防止病原体逃逸的高级别生物安全生产车间，而且需要区分疫苗免疫和自然感染动物。此外，病毒灭活不完全有引起疫苗毒株流行的危险，曾经在欧洲发生过由病毒灭活不彻底引起田间FMD流行的事例。再者，当口蹄疫流行时，疫苗免疫牛羊等反刍动物虽然不出现临床症状，但容易形成持续感染动物，有可能成为下次流行的潜在危险源。尤其是，21世纪初暴发的口蹄疫0型泛亚谱系毒株横扫亚欧大陆，就连几十年无疫的经济发达国家如英国、法国、日本、韩国等国家也难以幸免，经济损失惨重。以英国为例，2001年口蹄疫大流行导致450万动物被扑杀，经济损失高达103亿美元，此次疫情引起世界各国对口蹄疫防控形势的重新谈论和评估。大多数学者认为疫苗免疫仍然是防控口蹄疫的主要手段。为了克服传统疫苗的缺陷，开展安全、优质高效的新型疫苗是现在疫苗研制的必然趋势。目前，除中国上海复旦大学郑赵鑫教授研制的猪口蹄疫病毒0型重组疫苗申获了专利并获得农业部颁发的"一类新兽药证书"外，没有查阅到有关牛口蹄疫病毒Asail型多表位重组疫苗的专利信息。因此，研制价廉、安全、高效的牛口蹄疫新型疫苗对提升我国口蹄疫防控能力，保护畜牧业健康可持续发展，保障农民增收、促进农村经济快速稳定发展等具有重要意义。现代免疫学、基因组学、分子生物学和生物信息学技术的快速发展，为研制分子疫苗奠定了基础。但是，以小分子靶标抗原为基础的疫苗组装体系以及最大化模拟自然感染免疫的能力依然是小分子表位疫苗研究的瓶颈。早在20世纪80年代初，研究者发现口蹄疫病毒VP1结构蛋白能够诱导机体产生免疫应答，并能抵抗同源病毒攻击。1982年，Bittle等发现化学合成的口蹄疫病毒VP1结构蛋白部分短肽(表位)，能够诱导免疫应答。此后，研究者纷纷采用化学合成肽或基因工程技术研究分子疫苗。研究最为广泛的是用口蹄疫病毒VP1结构蛋白的优势抗原表位(140-160和200-213氨基酸序列)构建基因工程亚单位疫苗和DNA疫苗及合成肽，除了美国UBI公司研制的猪口蹄疫病毒0型合成肽已经商品化外，所有其他分子疫苗虽然能诱导小动物模型(小鼠、豚鼠)及部分本动物产生保护性抗体，保护动物抵抗病毒攻击。但大规模本动物试验均以失败告终(攻毒保护率达不到国家标准)，主要是由于研制的小分子抗原不能剌激机体产生保护水平的中和抗体，有些即使能产生一定水平的保护性抗体，但持续时间短，不能满足疫病防控的需要。另外，研制的病毒颗粒样衣壳蛋白能够诱导机体产生高效价的保护性抗体，免疫动物能够抵抗同源病毒的攻击，但是该抗原的低产量和高成本限制了该疫苗的应用。近来，人们通过增加T细胞表位和外源载体蛋白以加强抗原递呈能力、增加分子量、促进B细胞成熟分化等手段来提高疫苗的免疫原性，增强免疫应答能力、提升外周血循环抗体的水平和持续时间，虽然在某种程度上明显提高了抗原的免疫原性，但是多次免疫后能产生高水平的外源载体蛋白抗体，反而影响了靶标抗原的免疫效果；另外，由于研究者采用的T细胞表位不是通用性表位，即不能被所有宿主动物的主要组织相容性复合物(MHC分子)识别，故并不能诱导所有动物产生免疫应答。近年来，以主要免疫因子如IFN-Y、IL-2等与抗原表位小分子偶联构建的表位疫苗成为表位疫苗研究的新突破点，但对本动物的免疫效果并不理想。
发明内容本发明的目的之一是提供一种口蹄疫病毒Asial型多表位基因；本发明的目的之二是提供一种口蹄疫病毒Asial型多表位基因和载体蛋白的融合基因；本发明的目的之三是提供一种牛口蹄疫病毒Asial型多表位重组疫苗，该疫苗含有由上述口蹄疫病毒多表位基因和载体蛋白融合基因所表达的重组蛋白；本发明的目的之四是提供上述牛口蹄疫病毒Asial型多表位重组疫苗的制备方法；本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的—种口蹄疫病毒多表位基因，其碱基序列为SEQIDN0:1所示；所编码的氨基酸序列为SEQIDNO:2所示。—种口蹄疫病毒多表位基因和载体蛋白的融合基因，由SEQIDNO:1所示的碱基序列和牛IgG基因组成；本发明利用分子生物学、生物信息学以及相关技术分析Asial型口蹄疫病毒的全基因组序列(JS/05株，GenBankaccessionnumber:)，采用计算机软件预测、设计和筛选优势抗原表位基因和辅助表位基因。选取口蹄疫病毒的主要结构蛋白基因VP1上的两个免疫原性B细胞表位(136-160aa，198-21laa)进行适当串联(即136-160aa-linker-198-211aa)，为了防止相邻表位相互连接形成新的表位，本发明采用一种全新高效的接头(GGSSGG)连接相邻的表位，避免不同表位连接后形成新表位，保护天然表位的结构和功能，以保证表位的结构和功能的完整性。为了增加表位的效价，将两个表位的串联体重复一次；为了提高表位的免疫原性即效价，将表位重复串联一次，即B1-B2-B1-B2，得到复合表位基因(SEQIDNO:l)。本发明采用RT-PCR扩增牛IgG基因(SEQIDNO:5;其推导的氨基酸序列为SEQIDN0:6)，阳性扩增子与复合表位基因融合后插入表达载体pPK。EXTb(Invitrogen)构建重组表达质粒pPK。EXTb-EBIG。这种融合蛋白称为"抗体化抗原分子"。其中牛IgG基因通过增加小分子表位的分子量使其完全抗原化，增强靶标抗原的免疫原性，另外，通过MHC分子与IgG分子Fc端的高效结合促进靶标抗原的递呈，不仅增加了靶标抗原的免疫原性，同时延长了靶标抗原的半衰期，保证了免疫后较长时间内血清高效价抗体水平。本发明还提供了牛口蹄疫病毒Asial型多表位重组疫苗，该重组疫苗包括以下组分口蹄疫病毒多表位基因和牛IgG重链区基因的融合基因所编码的蛋白以及口蹄疫病毒3D蛋白;4—种制备上述牛口蹄疫病毒Asial型多表位重组疫苗的方法，包括(l)制备口蹄疫病毒多表位基因和牛IgG重链区基因的融合基因蛋白；(2)制备口蹄疫病毒3D蛋白；(3)分别将步骤(1)和步骤(2)所制备的蛋白稀释后，混和均匀，加入佐剂，乳化，即得。优选的，步骤(3)中将步骤(1)和步骤(2)所制备的蛋白稀释后按照等体积比例混合均匀，再加入与混合物体积相同的佐剂进行乳化。其中，口蹄疫病毒3D蛋白基因的碱基序列为SEQIDNO:3所示，所推导的氨基酸序列为SEQIDNO:4所示；基于传统疫苗和目前分子疫苗的诸多缺点和不足，本发明采用全新的免疫学理论，采用分子设计、基因操作、蛋白质工程及相关技术构建牛口蹄疫Asial型多表位重组疫苗。本发明疫苗在设计上既考虑B细胞的功能，又兼顾T辅助细胞对B细胞的辅助功能及T细胞的细胞免疫功能。最主要的是选用了能被绝大多数动物MHC分子识别的T细胞表位即通用型表位，克服MHC分子的异质性限制，加强MHC分子对抗原的递呈能力和水平。另外，Thl细胞表位能诱导T细胞免疫应答。本发明采用宿主动物牛自身蛋白分子(IgG)作为载体蛋白，不仅增大了小分子靶标抗原的分子量，使其完全抗原化，明显增强了靶标抗原的免疫原性，延长了半衰期，而且最大程度降低了副反应。载体蛋白IgG作为主要免疫成分能被MHC分子有效识别，促进抗原的递呈能力和水平。本发明通过实验动物模型和本动物免疫效力实验验证靶标抗原的免疫原性，即诱导产生保护性中和抗体和细胞免疫能力，以及抵抗病毒攻击的能力(PD50测定)，全面评价抗原的免疫效力。实验结果表明，本发明牛Asial表位疫苗能产生全面的免疫保护反应，注射免疫豚鼠和牛体均能诱导产生高水平的中和抗体，同时也能诱导细胞免疫应答，说明本发明牛Asial表位疫苗能有效保护动物抵抗口蹄疫病毒强毒攻击。图1各组疫苗免疫豚鼠后血清抗体水平消长规律。图2各组疫苗免疫豚鼠后血清抗体水平变化柱状图。具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1牛口蹄疫病毒Asial型多表位重组疫苗的制备(1)口蹄疫多表位基因设计和合成选用Asial型口蹄疫病毒JS/05毒株全基因组序列(GenBankaccessionnumber:EF149009.1)进行多表位的设计，即选取主要结构蛋白基因VP1上的两个免疫原性B细胞表位(136-160aa，198-211aa)进行适当串联(即136-160aa-linker-198-211aa)，为了防止相邻表位相互连接形成新的表位，在相邻表位之间加入接头-GGSSGG，最大化减小相邻表位之间的影B向，以保证表位的结构和功能的完整性。为了增加表位的效价，将两个表位的串联体重复一次，即136-160aa-linker-198-2115aa-linker-136-160aa-linker-198-211aa。为了将该多表位融合基因插入重组表达载体，在该融合基因的两端引入酶切位点，即5'端-BamHl，3^^-EcoRl，插入pUC_18载体即为重组质粒pUC-E。复合多表位基因序列为SEQIDN0:1所示，所推导的氨基酸序列为SEQIDNO:2所示。(2)牛IgG重链区基因的扩增根据牛IgG重链区基因序列(SEQIDNO:5)设计引物并扩增得到牛IgG重链区基因；特异性引物为上游，5-gctGAATTC(EcoRl)GCCTCCACCACAGCCCCGAAA-3;下游，5-gctCTCGAG(xhol)TTTACCCGCAGACTTAGAGGTGGAC-3。总RNA的提取及PCR扩增用RNA提取试剂盒(Qigen)分别从牛新鲜脾脏中提取总RNA。用onest印RNAPCR试剂盒(Takara，Japan)扩增目的基因总反应体积为50yl，包含liil10Xonest印RNAPCR缓冲液，10ii1MgCl2，5iildNTPs，1ii1RNaseinhibitor,liilAMVRTaseXL，1ii1AMVOptimizedTaq，1ii1上游引物，1ii1下游引物，5ii1RNA，力口无离子水20ii1。按以下条件扩增，50。C反转录30min;94。C热变性5min;94。C，lmin;60。C，lmin;72°C，lmin;30个循环。用DNA纯化回收试剂盒回收扩增产物，并插入pMD-18T载体(Tak,，Dalian，China)进行测序鉴定。(3)多表位-载体蛋白融合基因重组表达质粒的构建上述(1)和(2)所得到的目的基因分别酶切，纯化回收后，插入表达质粒pPK。EXHTb(购自Invitrogen)，构建重组表达载体pPK。EXHTb_EBIgG;(4)富集T细胞表位的口蹄疫病毒基因的扩增及表达载体构建参考(1)述Asial型口蹄疫病毒JS/05株的基因组序列合成引物上游5-GCTCCATGG(Ncol)ATGGATTGATAGTTGACACCAGAGAT-3;下游5-GCTAAGCTT(HindiII)TGCGTCACCGCACACGGCGTTC-3。参照(2)所述反应条件扩增口蹄疫病毒3D基因，扩增产物插入pMD-18T构建重组质粒pMD-3D，经生物公司(Takara，Dalian,China)测序验证目的基因的正确性。用Ncol/Hindlll将目的基因3D从测序正确的阳性重组体切割下来插入表达载体pET30a(购自Novagen)，构建重组表达质粒pET30-3D。(5)多表位融合抗原和3D蛋白的表达和纯化重组多表位抗原和3D抗原的表达按照《分子克隆实验指南》第三版第15章进行，科学出版社，2002年8月。融合蛋白的纯化参照试剂公司手册进行(Novagen，TB273Rev.A0603)。(6)重组疫苗的制备用PBS变性液将纯化的重组多表位抗原稀释成浓度为0.8mg/ml，3D蛋白稀释为0.4mg/ml。两种蛋白溶液等体积(0.5ml:0.5ml)混匀后，加入等体积(lml)206佐剂，用乳化机进行乳化(先低速搅拌，慢慢调高转速，总时间不超过2min)制备成疫苗(油包水)。以上操作均在无菌条件下进行。(7)疫苗的无菌检测取适当量的疫苗接种琼脂斜面、肉汤和肝汤培养基，37t:培养7天，以琼脂斜面未见菌落，液体清亮为合格，否则为不合格产品。另外，用BABL/c小鼠检测疫苗在动物体内的安全性，即选用5只BABL/c小鼠，每只注射0.5ml疫苗，观察72小时内是否出现不良反应，以未出现临床症状为合格。试验例1本发明重组疫苗的免疫效力试验为了验证本发明重组疫苗的免疫原性，在动物模型豚鼠以及牛上进行了疫苗的免疫效力实验。(1)选取健康豚鼠(250-300g)20只，分成4组，每组5只豚鼠。其中，PBS为阴性对照，E/BIgG为重组蛋白组(SEQIDNO:1+牛IgG重链区)，E/BIgG/3D为重组蛋白加3D蛋白组(SEQIDNO:1+牛IgG重链区+3D蛋白)，IV为重组疫苗组(实施例1所制备的重组疫苗)；每只豚鼠经腹股沟注射抗原制剂1ml(300yg)，一免28天后同剂量加强免疫。分别予免疫前1天，免疫后7，14，28及加强免疫后14天采血，用全病毒作为包被抗原，采用间接ELISA测定循环抗体效价，各组疫苗免疫豚鼠后血清抗体水平消长规律结果见表1和图1所示，首免后血清抗体随时间延长而上升，到35天达最高，加强免疫后，表位载体蛋白组上升幅度不明显，但表位载体蛋白-30组血清抗体明显升高，说明重组抗原能诱导产生较高水平的中和抗体，但抗体水平低于全病毒灭活抗原的水平。令人鼓舞的是，加强免疫豚鼠能够抵抗1000个50%豚鼠感染剂量的攻击，100%保护。图2能明显反应各注苗组血清抗体效价消长情况随免疫次数及时间的动态变化趋势。表1各组疫苗免疫豚鼠后血清抗体消长规律时间(天)疫苗分组PBSE/BIgGE/BIgG/3DIV00.112±0.018■VV—■V■V\_/140.156±0.054210.226±0.048280.261±0.021350.406±0.145420.337±0.0520.112±0.013vw■■vyvww0.599±0.080.672±0.1080.918±0.1451.373±0.2291.374±0.2460.145±0.0170.888±0.1131.298±0.1451.797±0.2282.645±0.0972.474±0.1270.133±0.0170.299±0.0552.62±0.033.051±0.043.282±0.073.268±0.0433.178±0.077(2)重组抗原在牛体的免疫效力试验选用口蹄疫病毒特异性抗体和非结构蛋白抗体均为阴性牛6头(4月龄)，分成3组，每组两只，分别注射PBS(阴性对照组)，E/BIgG(:SEQIDNO:l+牛IgG重链区)，E/BIgG/3D(SEQIDNO:1+牛IgG重链区+3D蛋白)。免疫牛在一免30天后进行加强免疫。定期采血(免疫前、一免疫后30天及加强后14天)，用液相阻断ELISA测定血清抗体效价。如表2所示，多表位重组抗原(E/BIgG/3D)能够诱导高水平保护性中和抗体，尤其是加强免疫后血清抗体水平高达l:180，具有良好的应用前旦豕。表2候选疫苗免疫牛体后血清抗体水平消长规律<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求一种口蹄疫病毒多表位基因，其特征在于其碱基序列为SEQIDNO1所示。2.权利要求1所述口蹄疫病毒多表位基因所编码的蛋白质，其特征在于其氨基酸序列为SEQIDNO:2所示。3.—种口蹄疫病毒多表位基因和载体蛋白的融合基因，其特征在于由权利要求1所述的口蹄疫病毒多表位基因和牛IgG基因连接组成。4.按照权利要求3所述的融合基因，其特征在于所述牛IgG基因序列为SEQIDNO:5所示。5.牛口蹄疫病毒Asial型多表位重组疫苗，其特征在于，包括由权利要求3所述融合基因所编码的蛋白和口蹄疫病毒3D蛋白。6.—种制备权利要求5所述重组疫苗的方法，包括(l)将权利要求3所述的融合基因表达，得到重组蛋白；(2)制备口蹄疫病毒3D蛋白；(3)分别将步骤(1)和步骤(2)所制备的蛋白稀释后，混和均匀，加入佐剂，乳化，即得。7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于步骤(3)中将步骤(1)和步骤(2)所制备的蛋白稀释后按照等体积比例混合均匀，再加入与混合物体积相同的佐剂进行乳化。8.权利要求1所述的口蹄疫病毒多表位基因在制备预防或治疗口蹄疫药物中的用途。9.权利要求3所述的融合基因在制备预防或治疗口蹄疫药物中的用途。10.按照权利要求8或9所述的用途，其特征在于所述的口蹄疫是牛口蹄疫。全文摘要本发明公开了牛口蹄疫病毒Asia1型多表位重组疫苗及其制备方法。该重组疫苗包括以下组分口蹄疫病毒多表位基因和载体蛋白的融合基因所编码的蛋白以及口蹄疫病毒3D蛋白；其制备方法包括分别将口蹄疫病毒多表位基因和载体蛋白的融合基因所表达蛋白和口蹄疫病毒3D蛋白稀释后，混和均匀，加入佐剂，乳化，即得。动物模型和动物免疫效力实验表明，本发明牛Asia1表位重组疫苗能产生全面的免疫保护反应，注射免疫牛和豚鼠均能诱导产生高水平的中和抗体，同时也能诱导细胞免疫应答，说明本发明重组疫苗能有效保护动物抵抗口蹄疫病毒强毒攻击。文档编号A61K48/00GK101775399SQ201010122010公开日2010年7月14日申请日期2010年3月11日优先权日2010年3月11日发明者丛国正,常惠芸,林彤,独军政,王景锋,邵军军,高闪电申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所