专利名称：非侵入性自动细胞增殖装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞培养工艺。更具体地，本发明涉及一种细胞增殖装置，及一种以非 侵入、持续的方式培养细胞的方法。
背景技术：
传统的贴壁依赖性细胞的体外细胞培养具有的固有局限性，限制了在包括细胞、 组织及基因工程等许多领域的发展。贴壁依赖性细胞习惯上是在平面二维(2D)聚苯乙烯 培养皿上进行培养。一旦形成单层细胞，通过蛋白水解酶的消化作用或机械方法，将细胞从 培养皿表面移除。当需要大量的细胞时，如在组织和基因工程中，需要重复进行细胞分裂、 种植、细胞生长直至铺满并且随后使细胞从该聚苯乙烯培养皿移除，以获得期望数量的细 胞。传统的单层细胞培养方法累赘、耗时久且劳动密集，增大了在每次收获或培养分裂时细 胞培养污染的风险。二维(2D)培养物往往不模拟体内组织及所谓的3D培养物，特别是关于细胞形状 和细胞的环境。对于体外细胞培养，理想的细胞支架应该呈现类似于生理学上的细胞外基 质(ECM)的三维(3D)形态。由于改善了细胞间相互作用及营养、氧气和废物交换、提高了 细胞生存能力和功能，该三维系统与体内细胞微环境非常的近似。已发现，用作用力太强的酶促法或机械分离法去释放2D和3D细胞培养物中的粘 连细胞，不利于细胞的形态和功能。已发现，酶消化作用，典型地为使用胰蛋白酶，会破坏 所培养细胞的细胞外基质(ECM)，产生解聚的且成为圆形的细胞。此外，细胞膜上的细胞 间连接蛋白及受体蛋白质经常会受到破坏。机械释放法所产生的细胞被具有缺乏抵抗力 (compromised)的细胞外基质的晶状间质所包围。已知对细胞外基质的破坏会导致细胞活 性和功能降低，危害细胞的生长和分化。本发明目的在于解决上述问题。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供一种用于自动培养细胞的细胞增殖装置，所述增殖 装置包括在其中包含刺激-反应三维(3D)细胞支架的生物反应器。所述刺激-反应三维(3D)细胞支架可以可逆地将其表面性质在亲水状态和疏水 状态之间改变。所述支架材料可由一种基质制成，所述基质选自纤维、半渗透或非渗透中空纤维、 水凝胶、颗粒和由聚合物或陶瓷制成的单片多孔支架中的一种或多种。该支架可包括半渗 透中空纤维基质。所述支架可选自聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚酯、聚酰胺、天然聚合物(如胶原、 透明质酸等等)及其他任何适宜于细胞培养的支架材料中任一成份。所述支架可通过枝接(如化学修饰)用热-反应聚合物表面层修饰。所述枝接技术可选自下列任一项或多项溶液自由基聚合(solutionfreeradical polymerization)；伽玛辐射；等离子体辐射；电子束辐射；及紫外辐射。所述支架可通过吸附或物理附着技术用热_反应聚合物表面层修饰。所述热_反 应聚合物可选自聚N-取代的丙烯酰胺、聚乙烯_氧化物及其各自的共聚物或其类似物中的 任一项或多项。所述热-反应聚合物可以是聚-N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAm)。所述PNIPAm链可 配置在支架上，其层厚度为0. Inm至100 μ m。更具体地，所述PNIPAm链可配置在支架上，其 层厚度为0. Inm至lOOnm。所述细胞增殖装置可包括用于存储所述生物反应器上游的细胞培养基的储蓄槽， 所述储蓄槽与所述生物反应器流体流动联系(fluid flowcommunication)。所述细胞增殖装置可包括排代设备，用于将细胞培养基从所述储蓄槽转移到所述 生物反应器。所述排代设备可为正排量泵。所述细胞增殖装置可包括一个或多个温度传感器，用于监测细胞培养基、生物反 应器及支架中任一个或多个的温度。所述细胞增殖装置可包括一个或多个氧合器，用于氧合所述生物反应器中所包括 的细胞培养基或细胞中的任一项。所述细胞增殖装置可包括组合的温度/氧合器单元。所述细胞增殖装置可包括可编程序逻辑控制器(PLC)，用于所述系统操作程序的 自动化。所述细胞增殖装置可包括细胞回收单元，其与所述生物反应器流动联系，并且其 是所述生物反应器的下游，用于分离从细胞培养基释放的细胞。所述细胞回收单元可为离 心机，用于分离从细胞培养基释放的细胞。所述细胞回收单元的出口可与细胞培养基储蓄槽通过流体流动联系，以便所述细 胞培养基的再利用。所收获和分离的细胞可截留到(entrap)细胞存储槽中备用或者低温 冷冻待用。该细胞增殖装置可包括，在所述生物反应器的一侧或两侧上有至少一个注入/提 取口，以便于在操作该装置的过程中添加生物化学品/化学品及进行取样。其目的可为添 加化学品调节或改变细胞习性和/或功能和/或生存能力，监控细胞功能和/或生存能力， 或者确定这些化学品对细胞功能和/或生存能力的作用。在一个具体方式方式中，可使用溶液自由基聚合的枝接技术制备支架，可通过使 用氧化还原剂(如Fe2YH2O2)、过硫酸盐及热引发剂(如偶氮化合物、过氧化物、氢过氧化 物、过氧化氢二磷酸盐等等)中的任一种实现所述溶液自由基聚合。当该枝接技术依靠辐射或光诱导时，同时或预照射法都可使用，在前者中，该 NIPAm和该支架同时在溶液中被照射，而对于后者，该支架在NIPAm溶液中先被预照射，然 后被活化(通过加热或化学引发)。在溶液自由基聚合过程中，可用多价阳离子，如Cu2+或Fe2+，还原该均聚物。优选 地，可用硫酸亚铁铵，也称为莫尔盐，还原该均聚物。为了提高支架的反应性，可在枝接前或枝接过程中，使用选自下列任一种 或多种的离子化技术辐射技术如伽玛辐射、等离子体辐射及电子束辐射；光化学技 术如紫外照射；臭氧化作用，化学法如使用含多价离子的过硫酸盐溶液，氧氟化作用
6(oxyfluorination)等等，将官能基浸渍/共价键结合到支架上。在某些实施方式中，该多 价离子可为镍(II)或铈(IV)。物理改性技术可包括使用溶胀/退胀(swelling/deswelling)法或吸附技术，将 PNIPAm链物理截留到该支架表面上。在使用中空纤维膜生物反应器的特定情况中，氧合作用可直接在该生物反应器中 发生，并且可经由中空纤维的内腔或外毛细管空间(extracapillary space,ECS)发生温度 控制。然后，该温度释放机制在细胞沿纤维附着的点处直接发生，而细胞培养基温度不会发 生剧烈的变化，这些在无纺布支架或其他支架情况下是必须的。本领域普通技术人员还可 以想到其他可以达到同样效果的设计，比如通过对该生物反应器支架表面进行内部温度控 制，如利用中空支架内的液体循环，在生物反应器的外部进行氧合。根据本发明的另一方面，提供一种非侵入的持续培养细胞的方法，所述方法包括 以下步骤提供在其中包括刺激_反应三维(3D)支架的生物反应器；接种细胞到所述支架上；提供适宜来源的细胞培养基；使细胞在适宜细胞附着和增殖的温度增殖，直到达到期望的细胞密度；及通过将该刺激_反应支架的表面性质从疏水状态改变为亲水状态，收获所述细 胞，从而释放所附着的细胞。细胞类型的例子可包括哺乳动物初生细胞、微生物细胞、干细胞、无限增殖化细胞
系等等。该方法可包括，根据预设程序，使用控制系统自动调控所述系统参数，用于细胞的 增殖和收获。可通过对选自温度、pH、流速、压力降及耗氧量等等中的一种或多种参数的实时测 量，调控所述控制系统。所述系统的输入参数可包括特定基材(substrate)的代谢活动、耗 氧量、PH、压力降及温度。可编程序逻辑控制(PLC)系统用于自动化该系统的操作程序。使细胞充分增殖以填充所述生物反应器支架的期望区域或达到期望密度(取决 于耗氧量、新陈代谢活动、压力降或其他)，所述方法包括降低或升高所述系统温度的步骤， 以影响支架表面疏水性的可逆变化，然后使细胞从所述支架上分离。该方法还包括通过例如离心分离或其他任何适宜的细胞分离/回收方法分离该 培养基和细胞混合物的步骤。多余的培养基可被反向循环到培养基储蓄槽用于细胞培养基的再利用。收获细胞可包括，降低通过中空纤维支架的内腔的氧气的温度，以致所述支架的 表面温度降至温度为或低于该热_反应材料的最低临界溶解温度(LCST)(例如就PNIPAm 而言，LCST为32°C )，以影响细胞释放。因此该方法使得细胞被从该生物反应器或支架的 某些部分选择性地释放。因此，通过从某些部分选择性释放细胞并且随后接种不同细胞类 型，就可能在同一生物反应器中同时培养不同类型的细胞。该方法包括氧合所述细胞。可经由所述中空纤维基质的内腔或外毛细管空间氧合 所述细胞。因此可以建立所述具有可通过温度变化可分别定位的(addressable)支架部分的系统，也可用于在进行如DNA/RNA提取的过程中，从生物反应器提取少量的细胞，以提供 有关该生物反应器中的细胞状态的有价值信息。这样就能够在3D环境里的细胞培养过程 中进行DNA/RNA监控，据我们所知在本发明之前是不可能实现的。此能力对于将该系统应 用于诸如药物筛选的应用的情况是特别有益的，因为这种情况下常常需要知道体外给药期 间不同时间点的基因表达，而常规的DNA/RNA提取技术要求终止实验并破坏所有细胞，因 而通常是不可能实现的。支架中可定位的部分还使得半连续的细胞产物能够通过循环释放经过该可定位 的部分，而有充足时间用于该部分的种群恢复(!^population)。收获细胞可包括逐渐降低进料培养基的温度。可通过中空纤维基质进行细胞的氧合作用，使氧气在中空纤维中流动以通过该纤 维扩散到培养基中。这使得有充足供应的氧气能够到达细胞，以确保充分的细胞增殖。中空 纤维表面温度控制和细胞氧合作用可以经由该中空纤维的内腔或外毛细管空间同时完成。 可通过使用合成氧载体，例如全氟化碳乳剂或非合成血红蛋白基氧载体，加强氧气输送。本领域普通技术人员可以设想到该系统的其他应用。例如，该装置还可用于固着 悬浮细胞的独立细胞增殖，籍此细胞可以由于该支架孔径(例如就中空纤维而言)而截留 到基材中，或者当该SRP处于扩展状态(例如就无纺布和胶而言)，所分泌的蛋白质优先吸 附到该SRP包被的基材上。因此，本发明可以根据所述LCST或者所用SRP的其他相关反应 性能提供选择性蛋白质吸附，保留疏水蛋白质或亲水蛋白质。同样地，可使用当前的系统作 为组合的细胞增殖器和选择性蛋白质纯化装置也因此是显而易见的。对于PH敏感的SRP 也可用于截留细胞和蛋白质到这样的基材中，因此也具有细胞增殖器和蛋白质纯化装置的 功能。参照附图，以不为实施例所限制的方式记载本发明的其他特征。
图1显示了 a)纯PP，b)PP-g_PNIPAm(使用如实施例1所记载的10wt% NIPAm)及 c)纯PNIPAm的ATR-FTIR光谱。在该枝接基质的表面上可检测到N-H存在于3294CHT1和 1536cm-1 ；以及 C = O 存在于 1643cm-1 ；图2显示了 a)纯PP无纺布支架，及b)根据实施例1的枝接有IOwt % NIPAm的 PP-g-PNIPAm无纺布支架的SEM图，显示存在枝接层；图3显示了根据本发明的细胞增殖装置的示意图；图4显示了当温度从37°C变化为4°C后，从PNIPAm中空纤维支架释放的细胞的 图。图5显示了在细胞接种前，浸在细胞培养基中的PP-g-PNIPAm无纺布支架的图。
具体实施例方式本发明提供一种非侵入性自动细胞增殖器。该装置包括一刺激_反应三维基材/ 支架，由此通过改变或者添加一种或多种刺激物，使增殖的细胞同时从系统释放。该系统以 一种易于重复和轻松的方式应用于细胞和组织工程学，由此使得细胞培养效果得以扩大规 模到可产生大量有活力的、类似体内的3D细胞培养物(或者类组织结构)。这种装置还可用于基因工程中蛋白质和基因的表达分析。聚-N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAm)是一种聚合物，当温度跨越约为32°C的最低临界 溶解温度(LCST)时，该聚合物可在疏水状态和亲水状态之间可逆地转变。这样，当在37°C 该PNIPAm表面为疏水状态时，细胞可以附着到其表面上，而在低于LCST时，细胞自发地从 亲水表面释放。已知，使用PNIPAm进行细胞培养的主要优势是，细胞可以被非侵入性地收获，而 具有临界细胞表面蛋白质、生长因子受体及细胞间连接蛋白质的完整的细胞层片仍然保持完整。实施例1-使用PP无纺布的溶液自由基枝接法将聚丙烯(PP)纤维针刺和热熔(145°C，1.5m/s)到密度为130g/m2、开孔率为 (40%孔< 100 μ m，40%孔为100-200 μ m，及20%孔> 200 μ m)的无纺布垫中。在乙醇中洗 无纺布垫(6CmX6CmX3.21Cm)l小时，水洗，之后用烘箱50°C干燥。然后将无纺布支架放 置到10wt%的过硫酸铵(APS)水溶液中，并且室温条件放置24小时。用氮气清洁溶胀的 支架30分钟后，放置到用氮气预起泡30分钟的10wt% NIPAm水溶液中。在一个密封容器 中70°C进行枝接24小时。然后将枝接后的纤维支架在冷的去离子水中洗涤3天。通过用 190-400nm的UV-VIS光谱监测水洗涤物和观察45°C时洗涤物的混浊度，查证枝接后的垫的 纯度，最后在烘箱50°C干燥。在进行细胞培养(参见实施例7)前，将该枝接后的无纺布在 120°C条件下高压灭菌15分钟。用傅立叶变换衰减全反射红外光谱法(ATR-FTIR)扫描和 扫描电子显微镜法(SEM)确认枝接。实施例2 使用PP无纺布的溶液自由基枝接法2为提高枝接产量，可重复实施例1，在枝接前，在该NIPAm溶液中加入0. 25衬％的 硫酸亚铁(II)铵六水合物(莫尔盐)。实施例3 用方法3进行溶液自由基枝接如上所述，洗涤PP无纺布(6cmX6cmX3. 21cm)。将支架放入IOwt %的APS水溶 液中并且在80°C条件下加热3小时，之后在去离子水中彻底洗涤。然后将处理后的支架放 置到由氮气预起泡30分钟的、含有0. 002M硝酸铺(IV)铵和0. 04M硝酸的、10wt% NIPAm 水溶液中。在烘箱中50°C枝接24小时。然后如前所述，将枝接后的支架洗涤3天并干燥。 通过ATR-FTIR确认枝接。实施例4 使用PP中空纤维盒(cartridge)的溶液自由基枝接用IOwt % APS水溶液填充CelImax PP中空纤维盒(孔径:0· 5μπι，外径:630ym), 室温放置24小时。然后排放该APS溶液，换用由氮气预起泡30分钟的10wt% NIPAm水溶 液。然后将该盒放入70°C水浴5小时。通过蠕动泵，使用冷的去离子水灌注该枝接后的中 空纤维2天。通过用190-400nm的UV-VIS光谱监测水洗涤物和检查45°C时洗涤物的混浊 度，查证枝接后的盒的纯度。在进行细胞培养(参见实施例6)前，将该枝接后的盒在120°C 条件下高压灭菌15分钟。实施例5图3记载了根据本发明的细胞增殖装置10的部件。而且记载了细胞增殖装置10 的操作。通过容积式泵14将液槽(reservoir) 12中的缓冲后的细胞培养基输送到温度和 /或氧合器单元16，该温度和/或氧合器单元16用于控制温度和/或氧合该接种了细胞的生物反应器18中所含的细胞。该生物反应器包括一刺激-反应三维(3D)细胞支架。该生物反应器18中的温度_反应基材被温度变化所激发，从而释放附着在支架上 的细胞。然后这些细胞由细胞分离器20回收并贮存在存储设备22中。在细胞生长过程中，来自液槽的含有培养基的细胞经过2个三路阀24和26，回到 该液槽12。在中空纤维膜生物反应器16的特定具体实施方式
中，在准确地控制培养基的温 度以维持细胞生长时，氧合作用可在生物反应器中直接发生。然后经由中空纤维的内腔进 行氧合作用。在此实施方式中，该温度释放机制直接在沿着纤维的细胞随着点处启动，没有 显著改变细胞培养基的温度，这在无纺布基材的实施方式中是必要的。本领域技术普通人员可知，该细胞增殖装置10的不同配置和部件可产生相似的 结果，因此本发明不仅限于上述实施例。实施例6 在Cellmax PP-g-PNIPAm中空纤维生物反应器中培养Ifep3G细胞实施例4描述了用MPAm枝接中空纤维支架/盒的技术方案。在枝接后的盒的内 腔培养ifep3B肝细胞。该细胞培养基由补充有10 % FBS和1 % Pen/Strep抗生素的EMEM (有 L-谷氨酰胺)组成。在细胞接种前，将用PNIPAm枝接的聚丙烯盒用培养基在恒温箱中37°C 预培养一天。然后在恒温箱中、在37°C及5% CO2,20% O2和75% N2条件下，将细胞接种在 内腔中，细胞密度为2X106。使细胞静态附着1小时，通过旋转30分钟扩散细胞在整个纤 维上的附着。通过外毛细管空间连续灌注培养基，并且在2天的培养期内一天换一次培养 基。对于第二天的细胞释放，当预热到37°C的培养基穿过内腔时，温度约为4°C的培养基经 由ECS灌注30分钟。然后收集所有释放的细胞到一单独的液槽中，用于进一步分析。图4所示为释放的细胞的形态特征。可以看到释放出来许多颗粒和细胞片。还可 以发现，当将所回收的细胞保持在最佳温度37°C时，间接温度释放法使得细胞有效释放。实施例7-在PP-g-PNIPAm无纺布支架上培养Ifep3G细胞根据实施例1，将直径为4cm的PNIPAm枝接后的聚丙烯(PP)的无纺布进行枝接和 灭菌。在细胞接种前，在与实施例7类似的条件下用培养基预培养该枝接后的盘1天。然 后进行细胞接种，接种3X IO5细胞/ml到无纺布盘的一个小区域上。逐滴加入细胞，使之 附着1小时。恒温箱中37°C静态培养细胞2天，1天换一次培养基。为了启动细胞释放，将 培养基换为冷培养基(4°C)并且随后收集所释放的细胞，用于进一步分析。可观察到出现 许多颗粒和细胞片。该实施例阐明了通过引起培养基温度变化而从无纺布支架释放细胞的 机理。本发明的发明人认为其所发明的一种自动化细胞增殖装置和方法，相对于传统的 细胞培养技术具有很多优势。这些优势包括本发明提供了一种有益的、具有热_反应支架 以用于高生产能力的细胞培养的自动化细胞增殖装置，使用者不需使用任何侵入性技术。 因此本发明的装置适用于高生产能力的细胞培养并且降低了传统细胞培养技术所要求的 时间损耗。本发明还可以显著降低污染的风险。同样地，本装置具有3D热-反应支架，可能 够无需使用酶如胰蛋白酶或其他积极的细胞移除方法而释放细胞。该装置具有3D热-反 应支架可能制备的细胞培养物，与单层培养物相比，能够更好地保持的细胞分化和功能。此 外，该装置提供一种温和的细胞释放触发器，使得细胞不会经受细胞培养基中强烈的温度 变化。
此外，在某些具体实施方式
中，考虑到在制作该装置过程中会采用生物化学品或 化学品及进行取样，该非侵入性细胞增殖装置便利地在生物反应器的一边或两边上提供了 注入/提取口。其目的可是用化学品调整或改变细胞的习性和/或功能和/或生存能力， 监控细胞的功能和/或生存能力，或确定这些化学品对细胞的功能和/或生存能力的作用 效果。为了完成生物反应器系统，包括该生物反应器外壳、细胞支架、管道、液槽等等，可 由可消毒的塑料成分制成。此外，本发明的装置是一种紧凑的、模块化的、便于使用的、低成 本的用于细胞增殖和收获的装置。
1权利要求
一种用于自动培养细胞的细胞增殖装置，所述增殖装置包括生物反应器，所述生物反应器包含刺激 反应三维(3D)细胞支架。
2.根据权利要求1所述的细胞增殖装置，其特征在于，所述刺激-反应三维(3D)细胞 支架将其表面性质在亲水状态和疏水状态之间进行可逆的改变。
3.根据权利要求1或2所述的细胞增殖装置，其特征在于，所述支架材料可由一种基质 制成，所述基质选自纤维、半渗透或非渗透中空纤维、水凝胶、颗粒和由聚合物或陶瓷制成 的单片多孔支架中的任一种或多种。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的细胞增殖装置，其特征在于，所述支架包括半渗 透中空纤维基质。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的细胞增殖装置，其特征在于，所述支架选自聚苯 乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚酯、聚酰胺及天然聚合物中任一种。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的细胞增殖装置，其特征在于，所述支架通过枝接 用热_反应聚合物的表面层修饰。
7.根据权利要求6所述的细胞增殖装置，其特征在于，所述枝接技术选自下列任一项 或多项溶液自由基聚合；伽玛辐射；等离子体辐射；电子束辐射；及紫外辐射。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的细胞增殖装置，其特征在于，所述支架通过物理 吸附或附着技术用热_反应聚合物的表面层修饰。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的细胞增殖装置，其特征在于，所述热-反应聚合物 选自聚N-取代的丙烯酰胺、聚乙烯-氧化物及其各自的共聚物中的任一项或多项。
10.根据权利要求9所述的细胞增殖装置，其特征在于，所述热_反应聚合物是 聚-N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAm)。
11.根据权利要求10所述的细胞增殖装置，其特征在于，所述PNIPAm链配置在支架上， 其层厚度为0. Inm至100 μ m。
12.根据权利要求11所述的细胞增殖装置，其特征在于，所述PNIPAm链配置在支架上， 其层厚度为0. Inm至lOOnm。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的细胞增殖装置，其特征在于，包括用于存储所 述生物反应器上游的细胞培养基的储蓄槽，所述储蓄槽与所述生物反应器通过流体流动联 系。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的细胞增殖装置，其特征在于，包括排代设备，用 于将细胞培养基从所述储蓄槽转移到所述生物反应器。
15.根据权利要求14所述的细胞增殖装置，其特征在于，所述排代设备为正排量泵。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的细胞增殖装置，其特征在于，包括一个或多个 温度传感器，用于监测所述细胞培养基、生物反应器及支架中任一项或多项的温度。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的细胞增殖装置，其特征在于，包括一个或多个 氧合器，用于氧合所述生物反应器中所含有的细胞培养基或细胞。
18.根据权利要求1-15中任一项所述的细胞增殖装置，其特征在于，包括组合的温度/ 氧合器单元。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的细胞增殖装置，其特征在于，包括可编程序逻 辑控制器(PLC)，用于所述系统操作程序的自动化。
20.根据权利要求12-19中任一项所述的细胞增殖装置，其特征在于，包括细胞回收单 元，其与所述生物反应器流动联系，并且其是所述生物反应器的下游，用于分离从细胞培养 基释放的细胞。
21.根据权利要求20所述的细胞增殖装置，其特征在于，所述细胞回收单元的出口与 细胞培养基储蓄槽通过流体流动相联，以便所述细胞培养基的再利用。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的细胞增殖装置，其特征在于，所述生物反应器 的一边或两边上包括至少一个注入/提取口，以便于在操作所述装置过程中添加生物化学 品或化学品及进行取样。
23.根据权利要求7所述的细胞增殖装置，其特征在于，使用溶液自由基聚合的枝接技 术，所述溶液自由基聚合是通过使用氧化还原剂、过硫酸盐及热引发剂中任一种完成的。
24.根据权利要求23所述的细胞增殖装置，其特征在于，使用多价阳离子还原形成均 聚物。
25.根据权利要求24所述的细胞增殖装置，其特征在于，使用硫酸亚铁铵还原形成均 聚物。
26.一种非侵入的持续培养细胞的方法，所述方法包括以下步骤提供在其中包括刺激-反应三维(3D)支架的生物反应器；接种细胞到所述支架上；提供适宜来源的细胞培养基；使细胞在适宜细胞附着和增殖的温度增殖，直到达到期望的细胞密度；及通过将所述刺激_反应支架的表面性质从疏水状态改变为亲水状态，收获所述细胞， 从而释放所附着的细胞。
27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，根据预设程序，控制系统自动调控所述 系统参数，用于细胞增殖和收获。
28.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，通过选自温度、pH、流速、压力降及耗氧 量中的一种或多种参数的实时测量，调控所述控制系统。
29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，包括所述控制系统的输入参数，其选自 特定基材的代谢活动、耗氧量、PH、压力降及温度中的任一种或多种。
30.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，使细胞充分增殖以填充所述生物反应 器支架的期望区域或达到期望密度，所述方法包括降低或升高所述系统温度的步骤，以影 响支架表面疏水性的可逆变化，然后使细胞从所述支架上分离。
31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，所述细胞被从所述生物反应器或支架 的某些部分选择性地释放。
32.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，还包括将所述培养基与细胞混合物分 离的步骤。
33.根据权利要求32所述的方法，其特征在于，所述多余的培养基被反向循环到培养 基储蓄槽用于细胞培养基的再利用。
34.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，收获所述细胞包括降低通过中空纤维 支架的内腔的氧气温度，以致所述支架温度降至温度为或低于最低临界溶解温度(LCST) 从而影响细胞释放。
35.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，收获细胞包括逐渐将进料培养基的温 度降低至低于最低临界溶解温度。
36.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，包括氧合所述细胞。
37.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，经由所述中空纤维基质的内腔或外毛 细管空间氧合所述细胞。
38.根据权利要求1所述的细胞增殖装置，如于此所充分记载和表明的。
39.根据权利要求26所述的方法，如于此所充分记载和表明的。
40.一种细胞增殖装置及一种新的方法，如于此所充分记载的。
全文摘要
一种用于自动培养细胞的细胞增殖装置，所述增殖装置包括在其中包含刺激-反应三维(3D)细胞支架的生物反应器，所述刺激-反应三维(3D)细胞支架可被可逆地操作以将其表面性质在亲水状态和疏水状态之间改变。
文档编号C12N5/00GK101960004SQ200880115050
公开日2011年1月26日 申请日期2008年9月5日 优先权日2007年9月7日
发明者弗朗西斯·肖恩·穆尔曼, 科舍·奈度, 艾德兰·雅各布斯·凡威克 申请人:Csir