专利名称：中药卷柏的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药卷柏的新用途，即卷柏在制备雌激素药物中的应用。
背景技术：
卷柏为蕨类植物门卷柏科卷柏属植物，历代名家对其均有论述和研究，认为其性辛平，有破血散瘀，活血止血，主治腹痛、闭经、癥瘕淋结，以及吐血、便血、尿血等症的功能。现代药理及临床研究表明卷柏具有防癌治癌、治疗妇科病、抗炎抗病毒、镇痛、降血压、降血糖、增强人体免疫功能等作用。在治疗闭经、崩漏、引产、输卵管阻塞、祛瘀调经、祛瘀止血方面也有作用，它在逐瘀缩宫下胎、清热除湿解毒、胎死不下等临床难症中发挥了重要的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供卷柏在制备雌激素药物的新用途。
本发明目的是通过以下技术方案实现的卷柏在制备雌激素药物中的应用。
卷柏的总提取物在制备雌激素药物中的应用。
卷柏中的水部位和正丁醇部位在制备雌激素药物中的应用。
发明人已通过实验证明了本发明药物在雌激素中的新用途一、采用动物实验结合报告基因技术，对五种中药进行植物雌激素活性的实验1、药物选用中药卷柏(Selaginella tamariscina)、松针(Pinus Massoniana Lamb)、石胆草(Corallodiscus flabellata)、贯众(Dryopteris sublaeta Ching et Hsu)、益母草(Leonurusheterophyllus Sweet)。各药材分别用10倍量水煮提两次，过滤，合并滤液并减压浓缩，真空干燥即为各药材水提物。
各药材水提物用双蒸水溶解，其剂量见表1。阳性药为尼尔雌醇片，上海华联制药有限公司生产，制成蒸馏水悬浊液，按1.7mg·kg-1·d-1给药。
表1五种中药的动物给药量
2、实验动物与细胞株及质粒昆明种小鼠，雌性，出生21天(刚断乳)，体重9-12g，购于河南省实验动物中心。HEK293细胞株和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-gal)对照质粒pβgal-Control、重组报告基因载体pERE-TAL-luc由军事医学科学院生物工程研究所叶棋浓博士惠赠。重组人ERα(humanERα，hERα)表达载体pCXN2-hERα和重组人ERβ(humanERβ，hERβ)表达载体pCXN2-hERβ由东京大学医学系Satoshi Inoue博士惠赠。
3、主要试剂RPMI1640培养基、无酚红RPMI1640培养基及脂质体LipofectamineTM2000 Reagent购自Gibco Invitrogen公司；荧光素酶荧光检测试剂盒购自Promega公司；邻-硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷(O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG)由军事医学科学院生物工程研究所叶棋浓博士惠赠；17β-雌二醇(17β-estradiol，E2)购自Sigma公司作为报告基因检测法中的阳性对照；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自北京鼎国生物技术有限公司；无雌激素胎牛血清为HyClong公司产品；其余试剂均为国产分析纯。
4、所用主要仪器电子读数分析天平(日本Shimadzu公司制造)；普通手术器械；二氧化碳培养箱(日本SANYO公司)；水浴振荡器(哈尔滨市东联电子技术开发公司)；倒置显微镜(日本Olympus)；台式高速低温冷冻离心机(北京四环科学仪器厂)；UV-7504PC型紫外-可见分光光度计(福州健洋科技仪器有限公司)；1250荧光检测仪(芬兰Wallac公司)。
5、实验方法小鼠子宫增重法将小鼠按体重均衡和随机的原则分组。给药持续7天。空白对照组每日蒸馏水0.3ml·10g-1灌胃；阳性对照组每日尼尔雌醇悬浊液0.3ml·10g-1灌胃；中药各组每日0.3ml·10g-1灌胃。最后一次给药后24h，脱颈处死小鼠，立即切取子宫称重，计算子宫系数(子宫湿重·(体重)-1·100％)。结果与空白组相比，计算P值考察有无统计学意义。
6、ERE调控的报告基因瞬时表达检测转染前24h将HEK293细胞用含10％无雌激素的FBS、无庆大霉素和酚红的RPMI1640培养基接种于12孔板，细胞密度为8×104cells·ml-1·孔-1。每块板均设置不同浓度的中药孔、同时设置阳性药对照孔、溶媒对照孔。转染当天用消毒PBS漂洗细胞一次，加入800μl含10％无雌激素的FBS、无庆大霉素和酚红的RPMI1640培养基，用pCXN2-hERα或pCXN2-hERβ、pERE-TAL-luc和pβgal-Control共转染HEK293细胞株，6h后用E2(4×10-6mol·1-1)、中药总提物(饱和溶液)干预，24h后，收集细胞上清液和细胞裂解液，分别检测荧光素酶和βgal的活性，计算标准化荧光素酶活性，从而筛选出对ERα或ERβ有作用的中药。
7、统计处理实验数据用SPSS软件进行统计处理。
8、实验结果结果显示，大剂量和小剂量卷柏组小鼠子宫系数与空白对照组相比均有特别显著性差异(P＜0.01)。其余各组子宫系数与空白对照组相比无统计学意义。见表2，图1。
表2 卷柏、益母草、贯众、石胆草、松针对性未成熟小鼠子宫湿重的影响
注与空白对照组比较，☆表示P＜0.05；★表示P＜0.01；与阳性对照组比较，▲表示P＜0.019、卷柏对报告基因载体pTAL-ERE-luc瞬时表达的诱导作用结果显示，不论由ERα或ERβ介导，E2孔标准化后的荧光素酶活性都高于溶剂对照孔(P＜0.01)，卷柏孔标准化后的荧光素酶活性也都高于溶剂对照孔(P＜0.01)，但仍低于E2孔(P＜0.01)。见表3，图2。
表3 卷柏对报告基因载体pTAL-ERE-luc瞬时表达的诱导作用(n＝10)
注与空白对照组比较，☆表示P＜0.05；★表示P＜0.01；与阳性对照组比较，▲表示P＜0.01二、采用动物实验证明卷柏中所筛选出的水部位和正丁醇部位的雌激素作用选用从卷柏中筛选的乙醚部位、醋酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位，再采用小鼠子宫增重法实验。
结果显示，大剂量和小剂量卷柏水部位组小鼠子宫系数与空白对照组相比均有特别显著性差异(P＜0.01)，大剂量和小剂量卷柏正丁醇部位组小鼠子宫系数与空白对照组相比也均有显著性差异(P＜0.05)，但仍远远低于阳性对照组(P＜0.01)。其余各组与空白对照组相比无统计学意义。见表4，图3。
表4 卷柏不同部位对性未成熟小鼠子宫湿重的影响
注与空白对照组比较，☆表示P＜0.05；★表示P＜0.01；与阳性对照组比较，▲表示P＜0.01
三、结论1、子宫增重实验是是最早建立的检测雌激素活性的经典方法，在评价物质的雌激素活性时，子宫实验考虑了物质的吸收、代谢、与血浆蛋白结合以及药代动力学等多方面因素，直接反映受试药物经体内代谢后的总体生物学效应，通过上述实验，证明卷柏具有植物雌激素作用，从卷柏中筛选出的水部位和正丁醇部位为有效部位。
2、报告基因技术是根据体内的雌激素信号转导途径构建的报告基因载体，细胞水平的药物筛选模型除具备整体动物所具有的活细胞的结构和功能上的复杂性外，同时在实验上比整体动物更易于操作、易于推断实验结果，特异性强。在卷柏对报告基因载体pTAL-ERE-luc瞬时表达的诱导作用实验研究中，能大致推断出卷柏的活性成分与何种雌激素受体结合，并作用于雌激素应答元件(ERE)来调控基因的表达。本实验结果显示卷柏与ERβ的亲和力比与ERα的亲和力大，说明卷柏激活基因转录主要是通过ERβ介导的；证明了卷柏的雌激素作用。
另外还对四组患有绝经期综合症的病人进行了临床观察每组患者30人；这30人均有潮热、头晕、耳鸣、夜里盗汗症状，其中还有16人同时还患有关节疼痛症状。
第一组患者服用卷柏总提取液；服用量和方法为取卷柏15重量份，加150重量份的水，煮沸20-30分钟，过滤；在药渣中再加入150重量份的水，煮沸15分钟，过滤，合并滤液并在真空无菌的情况下保存，每次服合并滤液200毫升，早晚各一次。连续服用12周后有18人的潮热症状和夜晚盗汗症状消失，耳鸣及头晕症状减少，有8人关节疼痛现象减少。
第二组患者服用从卷柏中提取的水部位，每次服用量相当于从10克新鲜卷柏中提取的量，每天早晚各服用一次，连续服用12周后有23人的潮热症状和夜晚盗汗症状消失，耳鸣及头晕症状减少，有12人关节疼痛现象减少。
第三组患者服用从卷柏中提取的正丁醇部位，每次服用量相当于从10克新鲜卷柏中提取的量，每天早晚各服用一次，连续服用12周后有20人的潮热症状和夜晚盗汗症状消失，耳鸣及头晕症状减少，有11人关节疼痛现象减少。
第四组患者服用由卷柏15重量份、知母12重量份、茯苓30重量份、菊花10重量份、山药30重量份、白芍12重量份、山萸肉30重量份、节菖蒲12重量份、合欢12重量份、炒枣仁12重量份、川断15重量份，加入总药重量6倍的水，煮沸30分钟，过滤；药渣中再加入总药重量4倍的煮沸20分钟，过滤，合并滤液，每次服上述合并滤液250毫升，每天早晚各服用一次，连续服用12周后有20人的潮热症状和夜晚盗汗症状消失，耳鸣及头晕症状减少，有13人关节疼痛现象减少。
从对上述患者的临床观察中，也证明了卷柏的雌激素作用。
图1为卷柏、益母草、贯众、石胆草、松针对性未成熟小鼠子宫湿重的影响的示图；图2为卷柏对报告基因载体pTAL-ERE-luc瞬时表达的诱导作用的示图；图3为卷柏不同部位对性未成熟小鼠子宫湿重的影响的示图。
具体实施例方式
实施例1取卷柏15重量份，加150重量份的水，煮沸20-30分钟，过滤；在药渣中再加入150重量份的水，煮沸15分钟，过滤，合并滤液为卷柏的总提取物，把其在真空无菌的情况下保存，每次服合并滤液200毫升。
实施例2称取由卷柏15重量份、知母12重量份、茯苓30重量份、菊花10重量份、山药30重量份、白芍12重量份、山萸肉30重量份、节菖蒲12重量份、合欢12重量份、炒枣仁12重量份、川断15重量份，加入总药重量6倍的水，煮沸30分钟，过滤；药渣中再加入总药重量4倍量的水，煮沸20分钟，过滤，合并滤液并将其在真空无菌的情况下保存，每次服合并滤液200毫升。
实施例3称取卷柏50重量份，加入药物重10倍量的水，煮沸30分钟，过滤，药渣中再加入药材重8倍量的水，煮沸25分钟，过滤，合并滤液，在温度为10-30℃，压力为0.5～0.7MPa的条件下浓缩，得浓缩液备用。
实施例4称取新鲜卷柏20克，用65-70％的含水丙酮组织破碎提取后，置200克该含水丙酮液中浸泡三天，过滤，取滤液，在温度为45℃，压力为0.6MPa条件下浓缩至膏状，在稠膏中加适量水，依次用乙醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，得乙醚、醋酸乙酯、正丁醇和水四个部位。
把正丁醇部位或水部位再进行Diaion HP-20、ToyoPearl HW-40、MCI Gel CHP-20、Sephadex LH-20、Silica Gel等柱层析及制备薄层层析，可分离得单体化合物。
以上所得水部位或正丁醇部位可供制药用或直接服用，每个部位分两次服用。
本实施例中所得的水部位及正丁醇部位也可与其它药物配伍使用，用于制作增加雌激素的药物。
实施例5取卷柏100重量份粉碎，过120-140目筛，过筛后的粉末加入炼蜜80-90重量份，制成每粒3重量份的蜜丸，每次服用2-3粒，每日3次。
本实施例是卷柏直接用作雌激素药物。
实施例6取卷柏35重量份，加入药材重10倍量的水，煮沸30分钟，过滤，药渣内再加入药材重8倍量的水，煮沸25分钟，过滤，合并滤液，在压力为0.75～0.95MPa，温度为35-60℃的条件下浓缩，得浓缩液备用；另取卷柏65重量份粉碎，过120-140目筛，过筛后的粉末与上述浓缩液泛制成丸，每次服用3-4重量份，每日2次。
权利要求
1.卷柏在制备雌激素药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征是卷柏的总提取物在制备雌激素药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征是卷柏中的水部位和正丁醇部位在制备雌激素药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及卷柏的新用途，即卷柏在制备雌激素药物中的应用；同时还涉及卷柏的总提取液及其中的水部位和正丁醇部位在制备雌激素药物中的应用。
文档编号A61P5/00GK101028311SQ20061001749
公开日2007年9月5日 申请日期2006年3月3日 优先权日2006年3月3日
发明者郑晓珂, 冯卫生, 王继峰, 牛建昭 申请人:河南中医学院