专利名称：一种从卷柏中连续提取降血糖活性成分和雌激素活性成分的方法
技术领域：
本发明涉及从天然药物中提取有效成分的方法，尤其涉及一种从卷柏中连续提取降血糖活性成分和雌激素活性成分的方法。
背景技术：
卷柏Gelaginella tamariscina (Beauv.) Spring)为多年生草本植物,是蕨类卷柏科(klaginellaceae)卷柏属(klaginella)植物卷柏的全草。《神农本草经》记载，卷柏“主五脏邪气，女子阴中寒热痛、癥瘕、血闭、绝子”，将其列为上品。历代医家认为其性辛平，具有破血散瘀、活血止血之功效，生用治经闭、癥瘕，跌打损伤、腹痛、哮喘，炒炭用治吐血，便血，尿血，脱肛。目前国内外对卷柏的研究主要集中在抗辐射、抗氧化、降血糖、雌激素、抗菌、抗病毒、抗真菌等方面。本实验室前期对卷柏进行大量药理活性研究，结果显示，卷柏具有较好的降糖活性及雌激素样作用。进一步的成分研究结果表明，卷柏发挥降血糖作用的物质基础是黄酮类成分，并且黄酮类成分也是卷柏的主含成分；卷柏发挥雌激素样作用的有效成分为极性较大的物质。因此，如何将卷柏中发挥降血糖作用和雌激素样作用的活性成分分别提取出来，是需要认真解决的技术问题。目前国内企业或科研单位对卷柏有效成分的提取多为针对单一产品的提取方法， 该方法虽可使目标成分得率最大化，却使卷柏中其他有效成分白白流失，加之提取过程溶剂用量大，劳动强度大，造成资源浪费、目标产品成本过高。如何研制出一种从卷柏中连续提取活性成分的方法，提高卷柏药材的综合利用率，节省生产成本，是需要认真解决的问题。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明的目的就是提供一种从卷柏中连续提取降血糖活性成分和雌激素活性成分的方法，可有效解决多、快、好、省地连续获得卷柏降血糖活性成分和雌激素活性成分，有效降低药物成本、简化提取工艺，有利于提高卷柏综合利用率和节约卷柏药材资源的问题。本发明解决的技术方案是该方法是由下列步骤实现的(1)将卷柏干燥全草以10倍重量体积(重量体积计为v/m，即固体以g计，液体以ml计)的质量浓度为95 %的乙醇回流提取2次，每次2h，过滤、合并滤液，在温度为 40-50°C，压力0. 09-0. IMI^a浓缩，干燥，得卷柏醇提物，即本发明的卷柏降血糖活性成分；(2)步骤(1)中提取后剩余药渣加入卷柏干燥全草重量体积(v/m)的10倍量的水，煎煮2次，每次池，过滤、合并水煎液，在温度为40-50°C，压力0. 09-0. IMPa浓缩，干燥， 得药渣水提物；
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(3)药渣水提物加水后，经水浴加热至完全溶解，加入质量浓度为95%的乙醇，使乙醇终浓度为30%，搅拌，4°C静置12-24h过夜，6000r/min离心lOmin，得第一次上清液和沉淀1 ；(4)第一次上清液加入质量浓度为95%的乙醇，使其乙醇终浓度为50%，搅拌， 4°C静置12-24h过夜，6000r/min离心lOmin，得第二次上清液和沉淀2 ；(5)第二次上清液加入质量浓度为95%的乙醇，使乙醇终浓度为80%，搅拌，4°C 静置12-24h过夜，6000r/min离心lOmin，得第三次上清液和沉淀3 ；(6)合并沉淀1、沉淀2和沉淀3，干燥，得卷柏药渣水提醇沉物，备做他用；将第三次上清液在温度为40-50°C，压力0. 09-0. IMI^a浓缩，干燥，得卷柏药渣水提去醇沉物，即本发明卷柏雌激素活性成分。本发明与现有技术相比具有以下优点(1)工艺简单采用95%乙醇回流提取得到卷柏降血糖活性成分后，直接对药渣进行水煎和醇沉及除杂处理得到雌激素活性成分，过程简单，操作方便。(2)工艺安全性强本发明整个工艺所用溶剂均为蒸馏水和乙醇，无毒，高效，环保， 避免使用有毒有机试剂，提高了生产安全性。(3)生产成本低，适合工业生产本发明从一种药材中连续提取两种活性成分，节省了原药材、工业原料以及劳动力资源，进一步降低了生产成本，适用于工业大规模生产。(4)交叉成分少95%乙醇和水的极性相差较大，且卷柏经95%乙醇回流后，再对药渣水煎，从提取材料来源上保证了提取物成分之间的无交叉或交叉较少，从而避免了极性相近化合物在不同部位的大量交叉和流失，适合于对无法明确极性范围或极性范围较大的中药活性成分的筛选研究。(5)药效明确本发明中得到的成分已经过活性验证，结果显示其作用显著，安全有效。
图1为本发明工艺流程图。图2为本发明卷柏乙醇提取物对糖尿病小鼠摄食量的影响图。图3为本发明卷柏乙醇提取物对糖尿病小鼠饮水量的影响图。
具体实施例方式以下结合实施例和有关试验资料对本发明的具体实施方式
作详细说明。本发明在实施中，具体是由以下步骤实现的实施例一首先将卷柏120g用1200ml质量浓度为95%的乙醇回流提取2次，每次池，过滤、合并滤液，在温度为40°C，压力0. 09MPa浓缩，干燥，得卷柏醇提物5. 76g，即本发明卷柏降血糖活性成分；然后将乙醇提取后的药渣加水1200ml煎煮2次，每次池，过滤、合并滤液，在温度为40°C，压力0. 09MI^浓缩，干燥，得到卷柏药渣水提物9. 39g ；卷柏药渣水提物 9. 39g置入80°C水浴，使其完全溶解，再加入95%乙醇，使其含乙醇浓度为30%，搅拌，4°C 静置1 !过夜，6000r/min离心lOmin，得第一次上清液；第一次上清液再加入95%乙醇，使其乙醇浓度为50%，搅拌，4°C静置Ia1过夜，6000r/min离心lOmin，得第二次上清液；第二次上清液再加入95%乙醇，使乙醇浓度为80%，搅拌，4°C静置12h过夜，6000r/min离心 lOmin，得第三次上清液；将第三次上清液在温度为40°C，压力0. 09MI^浓缩，干燥，得卷柏药渣水提去醇沉物1. 43g，即本发明卷柏雌激素活性成分。实施例二 首先将卷柏MOg用MOOml质量浓度为95%的乙醇回流提取2次，每次池，过滤、 合并滤液，在温度为45°C，压力0. 095MI^浓缩，干燥，得卷柏醇提物11. 56g，即本发明卷柏降血糖活性成分；然后将乙醇提取后的药渣加水MOOml煎煮2次，每次2h，过滤、合并滤液，在温度为45°C，压力0. 095MI^浓缩，干燥得到卷柏药渣水提物19. 44g ；卷柏药渣水提物 19. 44g置入80°C水浴，使其完全溶解，再加入95%乙醇，使其含乙醇浓度为30%，搅拌，4°C 静置20h过夜，6000r/min离心lOmin，得第一次上清液；第一次上清液再加入95%乙醇，使其乙醇浓度为50%，搅拌，4°C静置20h过夜，6000r/min离心lOmin，得第二次上清液；第二次上清液再加入95%乙醇，使乙醇浓度为80%，搅拌，4°C静置20h过夜，6000r/min离心 lOmin，得第三次上清液；然后，将第三次上清液在温度为45°C，压力0. 095MI^浓缩，干燥， 得卷柏药渣水提去醇沉物3. 23g，即本发明卷柏雌激素活性成分。实施例三首先将卷柏360g用3600ml质量浓度为95%的乙醇回流提取2次，每次池，过滤、 合并滤液，在温度为50°C，压力0. IMI^a浓缩，干燥，得卷柏醇提物17. 21g，即本发明卷柏降血糖活性成分；然后将乙醇提取后的药渣加水3600ml煎煮2次，每次2h，过滤、合并滤液， 在温度为50°C，压力0. IMPa浓缩，干燥得到水提物27. 15g ；药渣水提物27. 15g置入80°C 水浴，使其完全溶解，再加入95 %乙醇，使其含乙醇浓度为30 %，搅拌，4°C静置24h过夜， 6000r/min离心lOmin，得第一次上清液；第一次上清液再加入95%乙醇，使其乙醇浓度为 50%，搅拌，4°C静置24h过夜，6000r/min离心lOmin，得第二次上清液；第二次上清液再加入95%乙醇，使乙醇浓度为80%，搅拌，4°C静置24h过夜，6000r/min离心lOmin，得第三次上清液；将第三次上清液在温度为50°C，压力0. IMI^a浓缩，干燥，得卷柏药渣水提去醇沉物 4. 31g，即本发明卷柏雌激素活性成分。上述三次试验的95%的乙醇提取物平均得率为4.8%，水提物平均得率为 7. 82%，卷柏药渣水提物去醇沉成分的平均得率为15. 9%，上述制备过程经过多次、多种剂量的制备，其得率均取得了相近似的结果，证明该制备方法稳定可靠，有实际的应用意义。本发明对上述提取方法进行了活性实验验证。通过糖尿病小鼠模型对卷柏95 %乙醇提取物的降血糖作用进行了确认，通过小鼠子宫增重实验和报告基因实验对卷柏药渣水提物去醇沉成分的雌激素作用进行了确认。降血糖实验研究本发明方法中卷柏95%醇提物具有显著的降血糖活性，经实验验证取得了满意的效果，有关实验资料如下1. 1实验方法1. 1. 1糖尿病模型建立18_22g雄性昆明种小鼠80只，随机选取10只作为正常对照组，其余小鼠禁食14h后，腹腔注射STZ180mg/kg (采用冰浴PH4. 2柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制成18mg/ml溶液，以0. lml/10g剂量注射)，正常对照组腹腔注射同剂量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。7 后，禁食4h，尾静脉采血，葡萄糖氧化酶法测定血糖值，血糖值≥16. 7mmol/L视为成模。 1. 1. 2分组及给药取40只造模成功的小鼠，按血糖均衡原则分为4组，每组10 只。正常对照组及模型对照组给予蒸镏水；阳性对照组给予二甲双胍500mg/kg ；卷柏95% 低、高剂量组分别给予卷柏95% 92. 5mg/kg、185mg/kg，每天清晨给药1次，连续给药4周。 实验期间自由进食、饮水。1. 1. 3检测指标1. 1. 3. 1体重、摄食量、饮水量的测定记录腹腔注射STZ 72h及给药治疗2周末各组小鼠体重、平均日摄食量、平均日饮水量。1. 1. 3. 2空腹血糖(FBG)及口服葡萄糖耐量(OGTT)的测定分别于腹腔注射STZ 72h及给药治疗第2周末禁食4h，给药池后尾静脉采血，葡萄糖氧化酶法检测FBG。末次给药前一日进行OGTT实验。将各组小鼠禁食4h，给药池后尾静脉采血测定血糖即为OGTT Omin血糖值。然后给予2. Og/kg葡萄糖溶液，分别于30、 60、120min尾静脉采血，3500r/min离心IOmin分离血清，葡萄糖氧化酶法检测血糖值。1. 1.4统计处理实验数据以表示，SPSS13. 0进行单因素方差分析(One-Way AN0VA)统计处理。1. 2实验结果与讨论1. 2. 1卷柏95%醇提物对糖尿病小鼠体重、摄食量和饮水量的影响多饮、多食、多尿和体重减轻即俗称的“三多一少”症状，它是糖尿病的典型症状。 本实验测定小鼠体重、摄食量和饮水量，以研究卷柏95%醇提物对糖尿病症状的改善作用。 所有造模组小鼠体重从注射STZ后就持续显著性低于正常组小鼠(ρ < 0. 05，ρ < 0. 01)。 随着实验时间延长，正常组小鼠体重稳定增加，模型组小鼠体重呈下降趋势，各给药组小鼠给药后体重稳定增加，见表1。正常组小鼠摄食量在给药期间无明显变化，模型组小鼠摄食量上升，95%低剂量组摄食量呈下降趋势，其它各给药组小鼠摄食量也呈上升趋势，见图1。 所有造模组小鼠饮水量从注射STZ后均高于正常组小鼠。正常组小鼠饮水量在给药期间无明显变化，模型组小鼠饮水量呈上升趋势，各给药组小鼠饮水量也呈下降趋势，见图2。表1卷柏95%乙醇提取物对糖尿病小鼠体重的影响( ±s, η = 10)
体重/g
权利要求
1.一种从卷柏中连续提取降血糖活性成分和雌激素活性成分的方法，其特征在于，由下列步骤实现(1)将卷柏干燥全草以10倍重量体积的质量浓度为95%的乙醇回流提取2次，每次池，过滤、合并滤液，在温度为40-50°C，压力0. 09-0. IMI^a浓缩，干燥，得卷柏降血糖活性成分；(2)步骤(1)中提取后剩余药渣加入卷柏干燥全草重量体积的10倍量的水，煎煮2次， 每次池，过滤、合并水煎液，在温度为40-50°C，压力0. 09-0. IMI^a浓缩，干燥，得药渣水提物；(3)药渣水提物加水后，经水浴加热至完全溶解，加入质量浓度为95%的乙醇，使乙醇终浓度为30%，搅拌，4°C静置12-24h过夜，6000r/min离心lOmin，得第一次上清液和沉淀 1 ；(4)第一次上清液加入质量浓度为95%的乙醇，使其乙醇终浓度为50 %，搅拌，4°C静置12-24h过夜，6000r/min离心lOmin，得第二次上清液和沉淀2 ；(5)第二次上清液加入质量浓度为95%的乙醇，使乙醇终浓度为80 %，搅拌，4°C静置 12-24h过夜，6000r/min离心lOmin，得第三次上清液和沉淀3 ；(6)合并沉淀1、沉淀2和沉淀3，干燥，得卷柏药渣水提醇沉物，备做他用；将第三次上清液在温度为40-50°C，压力0. 09-0. IMI^a浓缩，干燥，得卷柏雌激素活性成分。
2.根据权利要求1所述的从卷柏中连续提取降血糖活性成分和雌激素活性成分的方法，其特征在于，首先将卷柏120g用1200ml质量浓度为95%的乙醇回流提取2次，每次2h， 过滤、合并滤液，在温度为40°C，压力0. 09MPa浓缩，干燥，得卷柏95%醇提物5. 76g，即卷柏降血糖活性成分；然后将乙醇提取后的药渣加水1200ml煎煮2次，每次池，过滤、合并滤液，在温度为40°C，压力0. 09MPa浓缩，干燥，得到卷柏药渣水提物9. 39g ；卷柏药渣水提物 9. 39g置入80°C水浴，使其完全溶解，再加入95%乙醇，使其含乙醇浓度为30%，搅拌，4°C 静置1 !过夜，6000r/min离心lOmin，得第一次上清液；第一次上清液再加入95%乙醇，使其乙醇浓度为50%，搅拌，4°C静置1 过夜，6000r/min离心lOmin，得第二次上清液；第二次上清液再加入95%乙醇，使乙醇浓度为80%，搅拌，4°C静置12h过夜，6000r/min离心 lOmin，得第三次上清液；将第三次上清液在温度为40°C，压力0. 09MI^浓缩，干燥，得卷柏药渣水提去醇沉物1. 43g，即卷柏雌激素活性成分。
3.根据权利要求1所述的从卷柏中连续提取降血糖活性成分和雌激素活性成分的方法，其特征在于，首先将卷柏MOg用MOOml质量浓度为95%的乙醇回流提取2次，每次2h， 过滤、合并滤液，在温度为45°C，压力0. 095ΜΙ^浓缩，干燥，得卷柏95%醇提物11. 56g，即卷柏降血糖活性成分；然后将乙醇提取后的药渣加水MOOml煎煮2次，每次池，过滤、合并滤液，在温度为45°C，压力0. 095MPa浓缩，干燥得到卷柏药渣水提物19. 44g ；卷柏药渣水提物19. 44g置入80°C水浴，使其完全溶解，再加入95 %乙醇，使其含乙醇浓度为30 %，搅拌，4°C静置20h过夜，6000r/min离心lOmin，得第一次上清液；第一次上清液再加入95% 乙醇，使其乙醇浓度为50%，搅拌，4°C静置20h过夜，6000r/min离心lOmin，得第二次上清液；第二次上清液再加入95%乙醇，使乙醇浓度为80%，搅拌，4°C静置20h过夜，6000r/min 离心lOmin，得第三次上清液；然后，将第三次上清液在温度为45°C，压力0. 095MPa浓缩，干燥，得卷柏药渣水提去醇沉物3. 23g，即卷柏雌激素活性成分。
4.根据权利要求1所述的从卷柏中连续提取降血糖活性成分和雌激素活性成分的方法，其特征在于，首先将卷柏360g用3600ml质量浓度为95%的乙醇回流提取2次，每次池，过滤、合并滤液，在温度为50°C，压力0. IMPa浓缩，干燥，得卷柏95%醇提物17. 21g，即卷柏降血糖活性成分；然后将乙醇提取后的药渣加水3600ml煎煮2次，每次池，过滤、合并滤液，在温度为50°C，压力0. IMPa浓缩，干燥得到水提物27. 15g ；药渣水提物27. 15g置入 80°C水浴，使其完全溶解，再加入95 %乙醇，使其含乙醇浓度为30%，搅拌，4°C静置24h过夜，6000r/min离心lOmin，得第一次上清液；第一次上清液再加入95%乙醇，使其乙醇浓度为50%，搅拌，4°C静置24h过夜，6000r/min离心lOmin，得第二次上清液；第二次上清液再加入95%乙醇，使乙醇浓度为80%，搅拌，4°C静置24h过夜，6000r/min离心lOmin，得第三次上清液；将第三次上清液在温度为50°C，压力0. IMI^a浓缩，干燥，得卷柏药渣水提去醇沉物4. 31g，即卷柏雌激素活性成分。
全文摘要
本发明涉及从卷柏中连续提取降血糖活性成分和雌激素活性成分的方法，可有效解决获得卷柏降血糖活性成分和雌激素活性成分，降低药物成本、简化提取工艺的问题，其解决的技术方案是将卷柏干燥用乙醇回流提取，过滤，干燥，得卷柏醇提物；将提取后剩余药渣加入水，煎煮，过滤，浓缩，干燥，得药渣水提物，药渣水提物加水后，加热至完全溶解，加入乙醇，搅拌，静置，离心，上清液和沉淀，干燥沉淀，得卷柏药渣水提醇沉物，备做他用；将上清液浓缩，干燥，得卷柏药渣水提去醇沉物，本发明工艺简单，安全性强，生产成本低，适合工业生产，交叉成分少，药效明确，安全有效。
文档编号A61P5/30GK102266359SQ20111021120
公开日2011年12月7日 申请日期2011年7月26日 优先权日2010年10月8日
发明者冯卫生, 张莉, 李冬梅, 王小兰, 王玮玮, 苏成福, 郑晓珂 申请人:河南中医学院