卷柏提取物及其提取方法和应用的制作方法

专利名称：：卷柏提取物及其提取方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及了一种巻柏提取物，同时还涉及一种从巻柏中提取制备穗花衫双黄酮的方法，以及巻柏及该巻柏提取物穗花衫双黄酮在制备保肝降酶药物方面的应用。
背景技术：
：巻柏为蕨类植物门巻柏科(Selaginellaceae)巻柏属(&/flg/"e//")植物，约有700种，广泛分布于全世界。我国约有50种，产于全国各地。2005年版《中华人民共和国药典》收载了两个品种巻柏5W"g/"e〃atow"W"/wa(Beauv.)Spring;垫装巻柏S.pulvinata(Hook.etGrev.)Maxim.。巻柏是我国传统中药材，早在《本经》中就有记载，列为上品，功能为活血通经，破血散结。穗花衫双黄酮(Amentoflavone)又名阿曼托双黄酮，是一种从天然植物中分离纯化得到的双黄酮类化合物，分子式为C3。H1801Q，分子量538，植物来源广泛，药理活性明显。在很多种中草药如银杏叶、贯叶连翘中均存在，而巻柏(包括巻柏、垫装巻柏、中华巻柏和江南巻柏等)中穗花衫双黄酮的含量又远远高于其他中草药。文献报道穗花衫双黄酮具有抗病毒、抗炎、抗癫痫、神经细胞保护、促<^2+释放活性等活性。OH穗花衫双黄酮Amentoflavone临床上造成急性肝损伤的原因主要有病毒感染、服用药物不当、食物添加剂、酒精摄入过量、误服有毒食物如毒蕈、放射线损伤，除此之外肝外组织器官功能障碍间接造成其损伤的也不少见，这些因素还与患者的身体对导致损伤因素的反应性不同而呈现出很大差异。如不同基因型导致的病人个体药物生物转化的差异，称为遗传多态性药物性肝病也不容忽视。肝损伤最常出现的是肝细胞损伤导致的各种生物酶的增高，其中以谷丙转氨酶(GPT)和3谷草转氨酶(GOT)升高最为显著。临床中对肝损伤的治疗也主要以降低谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)为指标。
发明内容本发明的目的在于提供一种巻柏提取物。同时，本发明的目的还在于提供一种该巻柏提取物的提取方法。进一步地，本发明的目的还在于提供一种巻柏及巻柏提取物穗花衫双黄酮保肝降酶方面的应用，以及其在制备保肝降酶药物方面的应用。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种巻柏提取物，由以下方法提取而得，将巻柏全草用溶剂重复冷浸2_4次，每次6—8天，过滤，合并滤液，用萃取剂萃取2—4次，得有效部位；将有效部位进行硅胶常压柱(200-300目)层析，经洗脱，TLC检测合并含有穗花衫双黄酮部分，在SephadexLH-20柱色谱以丙酮进行洗脱，得到单体化合物穗花衫双黄酮。巻柏的来源包括巻柏属植物巻柏&/ag7>7e〃atowan;sc/"a(Beauv.)Spring、塾装巻柏S.pulvinata(Hook.etGrev.)Maxim.、中华巻柏iSe/ag/"g〃as/"gm^(Desv.)Spring、江南巻柏S.moe〃e"^^//Hieron等具有高含量穗花衫双黄酮的巻柏属植物。所述的溶剂由丙酮与水组成，其中，丙酮与水体积比为(6—8):(2—4)。所述的萃取剂为乙酸乙酯。所述的洗脱为石油醚-丙酮以10:1—7:3进行梯度洗脱。本发明的技术方案还提供了一种巻柏提取物的提取方法，包括以下提取方法，将巻柏全草用溶剂重复冷浸2—4次，每次6—8天，过滤，合并滤液，用萃取剂乙酸乙酯萃取2—4次，得乙酸乙酯部位；将乙酸乙酯部位进行硅胶常压柱(200-300目)层析，经石油醚-丙酮以10:1—7:3进行梯度洗脱，TLC检测合并含有穗花衫双黄酮部分，在SephadexLH-20柱色谱以丙酮进行洗脱，得到单体化合物穗花衫双黄酮。所述的溶剂由丙酮与水组成，其中，丙酮与水体积比为(6—8):(2—4)。进一步，本发明的技术方案提供一种巻柏在保肝降酶方面的应用。还提供一种巻柏提取物在保肝降酶方面的应用。更进一步，本发明的技术方案提供一种穗花衫双黄酮在保肝降酶方面的应用。还提供一种巻柏提取物穗花衫双黄酮在制备保肝降酶方面的应用。本发明以巻柏为原料进行提取，巻柏是我国传统中药材，原料来源丰富，以巻柏为原料提取得到具有保肝降酶作用的化合物穗花衫双黄酮，大大拓展了中药巻柏的应用范围。体内实验表明穗花衫双黄酮能降低CCU小鼠肝损伤模型小鼠的血清谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)水平，达到保肝降酶的作用。具体实施例方式实施例1本实施例的巻柏提取物由以下方法制备而得取干燥巻柏全草，用丙酮与水按体积比为7:3冷浸3次，每次7天，过滤，合并滤液减压回收溶剂得浓縮物，将浓縮的提取物分散在水中，用乙酸乙酯萃取三次，得乙酸乙酯部位；制得的乙酸乙酯部位，进行硅胶常压柱(200-300目)层析，石油醚-丙酮10:1~7:3梯度洗脱，TLC检测合并含有穗花衫双黄酮部分，在SephadexLH-20柱色谱以丙酮进行洗脱，得到穗花衫双黄酮纯品。结构鉴定化合物穗花衫双黄酮，EIMSw/z:538(M+),270,121;'H-NMR(DMSO-^)S:13.10(1H，s,5-OH),13.00(1H，s,5"-OH),6.83(1H,s,H-3),6.21(1H,d,J=2.0Hz，H-6)，6.48(1H,d,/=2.0Hz，H腸8)，8.03(1H,s,H-2')，7.17(1H,d,J=9.3Hz，H-5'),8.01(1H,d，《/=9.3Hz,H-6')，6.80(1H,s,H-3")，6.42(1H,s，H-6"),7.59(2H，d，J=8.8Hz,H-2"',6"'),6.74(2H,d,/=8.8Hz,H画3"',5"').13C-NMR(DMSOOS:163.8(C-2)，102.9(C-3),181.7(C陽4)，161.5(C國5),98.9(C-6),164.1(C-7),94.0(C-8)，157.4(C-9),103.7CC-10),121.0(C-1132.3(C-1'),127.8(C-2'),120.0(C画4')，116.2(C-5'),131.4(C-6'),163.7(C-2"),102.6(C曙3")，182.1(C-4")，160.5(C-5")，98.6(C-6"),161.9(C-7"),104.0(C-8")，154.5(C-9")，103.7(C-10")，121.4(C-l'"),128.2(C-2"'),115.8(C-3'"),161.0(C-4"')，115.8(C隱5'"),128.2(C-6'")。实施例2本实施例为巻柏提取物穗花衫双黄酮在保肝降酶方面应用实例，具体为体内保肝降酶试验1仪器和材料1.1样品穗花衫双黄酮单体1.2仪器UV-2000型紫外可见分光光度计(尤尼可上海仪器有限公司)；AE24型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；磁力(加热)搅拌器；985370-395型组织匀桨机(BIOSREC，Mexico)1.3试剂谷草转氨酶(GOT)试剂盒和谷丙转氨酶测定(GPT)试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、超氧化歧化酶(SOD)测定试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；联苯双酯滴丸(浙江万邦药业有限公司，批号080210);四氯化碳分析纯(开封化学试剂总厂，批号030221)。1.4实验动物昆明雄性小鼠体重20-25g，由河南省实验动物中心提供。2.2实验方法2.2.1动物模型的建立采用腹腔注射建立四氯化碳急性肝损伤，经过预试采用配制0.4%四氯化碳油溶液进行造模，配制方法如下用移液管精密量取大豆油放入洁净棕色玻璃瓶中，再用移液器精密量取四氯化碳液放入棕色玻璃瓶中，临用前利用磁力搅拌器搅拌4h。2.2.2实验方法取健康昆明小鼠若干只，全部雄性，随机分为若干组，分别为空白组、模型组、阳性对照组和穗花衫双黄酮组。给药组每天按照0.2ml/10g灌胃相应的药物，空白组和模型组按照0.2ml/1Og灌胃蒸馏水，给药8天，末次给药2h后各组按照体重0.1ml/10g腹腔注射四氯化碳油溶液，禁食不禁水16h，取血处死，分离血清检测GPT和GOT，离体肝脏称重，以生理盐水做溶剂制备肝脏组织匀浆，分别检测SOD和MDA。2.3实验结果2.3.1初筛结果2.3丄1穗花衫双黄酮对肝损伤小鼠血清GPT和GOT的影响表1:穗花衫双黄酮对肝损伤小鼠血清GPT和GOT的影响的初筛实验结果Table1:EffectofamentoflavneonserumGPTandGOTinthefirsttrial组别药物剂量GPTGOT空白组一22.1254±4.415240.2149±7.5031模型组一4455.425±700.4070###1474.254±314.8276絲#联苯双酯组200mg/kg259.4061±96.5831***290.3393±153.5467***穗花衫双黄酮组200mg/kg369.3987±253.1379***248.1584±94.2322***6与空白组比较#P<0.05;##P<0.01;#絲PO.OOl与模型组比较*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001表1显示(1)模型组与空白组相比血清中GPT和GOT含量显著性增高，提示模型的建立是成功的。(2)给药组与模型组相比，联苯双脂组和穗花衫双黄酮组小鼠血清中GPT和GOT含量均显著性降低，表明穗花衫双黄酮能够降低转氨酶，对CCU所致肝损伤有保护作用。但并没有降低到与空白组相同的水平。2.3.1.2穗花衫双黄酮对肝损伤小鼠肝脏匀浆蛋白中SOD和MDA的影响表2:穗花衫双黄酮对肝损伤小鼠肝脏组织匀浆中SOD和MDA的影响的初筛实验结果Table2:EffectofamentoflavneonliverSODandMDAinthefirsttrial组别MDASOD空白组1.9650±0.6130274.7568±46.8513模型组3.7191±0.8231###83.8830±57.7781###联苯双酯组2.4717±0.5506**142.9988士30.8201**穗花衫双黄酮组1.0476±0.7612***168.1605±59.2095*与空白组比较#P<0.05;絲PO.01;麵P<0.001与模型组比较*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001从表2可知与空白组相比，模型组MDA含量显著性升高，表明CCU所致肝损伤能够引起肝组织中MDA含量的增加。联苯双脂组和穗花衫双黄酮均能够显著性地降低肝损伤小鼠肝组织匀浆蛋白中MDA含量。有初筛结果可知在200mg/kg剂量条件下，穗花衫双黄酮表现出很好的降低肝损伤小鼠血清中GPT、GOT和肝脏匀浆蛋白中MDA含量，而升高肝脏匀浆蛋白中SOD含量的作用，为了进一步考察穗花衫双黄酮对肝脏保护作用的是否有剂量依赖性，进行了高中低三个剂量的筛选。2.3.2复筛结果2.3.2.1穗花衫双黄酮不同剂量对肝损伤小鼠血清GPT和GOT的影响表3:穗花衫双黄酮不同剂量对肝损伤小鼠血清GPT和GOT的影响Table3:EffectofdifferentdoseofamentoflavneonserumGPTandGOT<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>与空白组比较#P<0.05;##P<0.01;###PO.001与模型组比较*P<0.05;**P<0.01;***PO.001表3显示模型组与空白组相比血清中GPT和GOT含量均显著性的增高，说明此次模型是成功的。阳性对照组与模型组相比能够显著地降低血清中GPT和GOT含量。穗花衫双黄酮高剂量组与模型组相比也能显著性地降低血清中的GPT禾QGOT含量。2.3.2.2穗花衫双黄酮不同剂量对肝损伤小鼠肝脏匀浆蛋白中SOD和MDA的影响表4:穗花衫双黄酮不同剂量对肝损伤小鼠肝脏匀浆蛋白中MDA和SOD的影响Table4:EffectofdifferentdoseofamentoflavneonliverMDAandSOD组别MDASOD空白组0.4801±0.3017149.8931±22.5606模型组1.5829±0.8818###124.7190±2.2146###联苯双酯组0.3471±0細1***136.8188±21.1332穗花衫双黄酮高剂量组0.38172±0.0246***207.5105±71.4256**穗花衫双黄酮中剂量组0.4349±0.0542***130.柳0±30.2643穗花衫双黄酮低剂量组0.4567±0.1918***129.7856±40.7032与空白组比较#P<0.05;##P<0.01;,PO.001与模型组比较*P<0.05;**P<0.01;***PO.001从表4可知模型组与空白组相比，肝脏匀浆蛋白中MDA显著性升高，SOD含量显著性下降。与模型组相比，联苯双脂组和穗花衫双黄酮高中低三个剂量组均能显著性地降低匀浆蛋白中MDA的含量，而对于SOD含量只有穗花衫双黄酮高剂量组显著性的升高。复筛结果显示，穗花衫双黄酮高剂量组对肝损伤所致的GPT和GOT升高具有显著性的降低作用，三个剂量组对两种转氨酶的降低作用整体来看具有明显的剂量依赖性，随着剂量的降低，这种降低作用也逐渐减弱。2.3.3穗花衫双黄酮单体对正常小鼠肝脏作用结果2.3.3.1试验方法取30只健康昆明小鼠，随机分成3组分别为空白组、联苯双酯组和穗花衫双黄酮组，每天按照0.2mL/10g灌胃相应的药物，空白组灌胃等体积蒸馏水，灌胃8天，第8天灌药后禁食不禁水16h后，取血和离体肝脏，测定血清GPT和GOT，做肝脏组织匀浆分别测定组织匀浆液的MDA含量和SOD2.3.3.2穗花衫双黄酮对正常小鼠血清中GPT和GOT的影响表5:穗花衫双黄酮对正常小鼠血清中GPT和GOT的影响Table5:EffectofamentoflavneonserumGPTandGOTinnormalmice<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>与空白组比较*P<0.05;**P<0.01;***PO.001与联苯双酯组比较#P<0.05;##P<0.01;腳PO.001表5显示与空白组相比，联苯双脂组能够显著性升高小鼠血清中GPT和GOT含量，穗花衫双黄酮组升高则没有显著性，表明联苯双脂对正常小鼠的肝脏有一定的损伤作用，而穗花衫双黄酮则表现不明显。穗花衫双黄酮组与联苯双脂组相比，血清中GPT和GOT含量明显较低。2.3.3.3穗花衫双黄酮对正常小鼠肝脏匀浆蛋白中MDA和SOD的影响表6:穗花衫双黄酮对正常小鼠肝脏匀桨蛋白中MDA和SOD的影响Table6:EffectofamentoflavneonliverMDAandSODinnormalmice<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>与联苯双酯组比较#P<0.05;##P<0.01;■PO.001表6显示与模型组相比，联苯双脂组和穗花衫双黄酮组均能显著性地升高肝脏匀浆蛋白中MDA含量，显著性地降低SOD含量；穗花衫双黄酮组和联苯双脂组相比，肝脏匀浆蛋白中MDA和SOD含量之间没有统计学上的差别。急性四氯化碳肝损伤动物模型是最经典的试验性肝损伤模型。四氯化碳(CC14)进入体内后，在肝细胞内质网中经细胞色素P450依赖性混合功能氧化酶的代谢，生成活泼的三氯甲基自由基和氯自由基。这些自由基可与细胞内和细胞膜的大分子共价结合,使酶的功能丧失，细胞膜脂质过氧化，胞浆C^+浓度升高,导致肝细胞损伤，胞浆内转氨酶渗入血液，使血清中转氨酶升高。本发明的巻柏提取物穗花衫双黄酮具有很好的降低ccu所致小鼠肝脏损伤引起的血清中升高的GPT和GOT水平，并有明显的剂量依赖性，高剂量组作用最强，随着剂量下降，对转氨酶的降低作用也逐渐下降。通过观察穗花衫双黄酮对正常小鼠肝脏作用，发现在采用剂量组中高剂量时，穗花衫双黄酮表现较小的影响肝脏转氨酶的作用，即在此剂量下，穗花衫双黄酮并没有肝损伤作用。试验结果表明穗花衫双黄酮有很好的肝损伤保护作用，降低肝损伤引起的转氨酶升高，而对正常肝脏没有明显的影响。单体化合物穗花衫双黄酮对CCU所致小鼠肝脏损伤的保护作用，穗花衫双黄酮有很好的降低CCU所致小鼠肝脏损伤引起的血清中升高的GPT和GOT水平，并有明显的剂量依赖性，高剂量组作用最强，随着剂量下降，对转氨酶的降低作用也逐渐下降，对正常肝脏没有明显的作用。实施例3本实施例为穗花衫双黄酮保肝片的制备方法，具体步骤如下取穗花衫双黄酮100重量份，加入淀粉355重量份，羟甲基纤维素25重量份，交联聚维酮15重量份，用适量乙醇润湿后混匀制成软材，将混匀的软材过50-200目尼龙筛制粒，70-8(TC烘干30分钟，过50-200目铁筛整粒，加入交联聚维酮8重量份和滑石粉5重量份，压片，制成1000片。最后所应说明的是以上实施例仅用以说明,而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。权利要求1、一种卷柏提取物，其特征在于由以下方法提取而得，将卷柏全草用溶剂重复冷浸2—4次，每次6—8天，过滤，合并滤液，用萃取剂萃取2—4次，得有效部位；将有效部位进行硅胶常压柱(200-300目)层析，经洗脱，TLC检测合并含有穗花衫双黄酮部分，在SephadexLH-20柱色谱以丙酮进行洗脱，得到单体化合物穗花衫双黄酮。2、根据权利要求1所述的巻柏提取物，其特征在于所述的溶剂由丙酮与水组成，其中，丙酮与水体积比为(6—8):(2_4)。3、根据权利要求1所述的巻柏提取物，其特征在于..所述的萃取剂为乙酸乙酯。4、根据权利要求1所述的巻柏提取物，其特征在于所述的洗脱为石油醚-丙酮以10:l—7:3进行梯度洗脱。5、一种如权利要求1所述的巻柏提取物的提取方法，其特征在于包括以下提取方法，将巻柏全草用溶剂重复冷浸2—4次，每次6—8天，过滤，合并滤液，用萃取剂乙酸乙酯萃取2—4次，得乙酸乙酯部位；将乙酸乙酯部位进行硅胶常压柱(200-300目)层析，经石油醚-丙酮以10:l—7:3进行梯度洗脱，TLC检测合并含有穗花衫双黄酮部分，在SephadexLH-20柱色谱以丙酮进行洗脱，得到单体化合物穗花衫双黄酮。6、根据权利要求5所述的巻柏提取物，其特征在于所述的溶剂由丙酮与水组成，其中，丙酮与水体积比为(6—8):(2—4)。7、巻柏在保肝降酶方面的应用。8、巻柏提取物在保肝降酶方面的应用。9、穗花衫双黄酮在保肝降酶方面的应用。10、巻柏提取物穗花衫双黄酮在制备保肝降酶方面的应用。全文摘要本发明公开了一种卷柏提取物及其提取方法和应用，提取物由以下方法提取而得，将卷柏全草用溶剂重复冷浸2-4次，每次6-8天，过滤，合并滤液，用萃取剂萃取2-4次，得有效部位；将有效部位进行硅胶常压柱(200-300目)层析，经洗脱，TLC检测合并含有穗花衫双黄酮部分，在SephadexLH-20柱色谱以丙酮进行洗脱，得到单体化合物穗花衫双黄酮。本发明以卷柏为原料进行提取，卷柏是我国传统中药材，原料来源丰富，以卷柏为原料提取得到具有保肝降酶作用的化合物穗花衫双黄酮，大大拓展了中药卷柏的应用范围。体内实验表明穗花衫双黄酮能降低CCl₄小鼠肝损伤模型小鼠的血清谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)水平，达到保肝降酶的作用。文档编号A61K36/11GK101461829SQ200910064058公开日2009年6月24日申请日期2009年1月12日优先权日2009年1月12日发明者刘瑜新,宋艳丽,康文艺申请人:河南大学