一种检测复方依山红提取物对HepG 2.2.15细胞的药效的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及检测复方依山红药效的方法。更具体地说，本发明涉及一种检测复方 依山红提取物对IfepG2.2.15细胞的药效的方法
【背景技术】
[0002] 乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)引起的一种严重的世界范 围内危害人类健康的疾病，在我国感染率高达10%-20%，HBV持续感染会导致肝硬化和原 发性肝细胞肝癌等肝脏疾病，现有的抗病毒药物如干扰索和拉米夫定的疗效仍然不能令 人满意，因此寻找安全有效的抗HBV药物已成为当今医药学界一项迫切任务。中医药治疗慢 性乙型肝炎在我国具有悠久的历史，近几十年有学者陆续对一些中草药进行抗HBV筛查，发 现确实存在一些高效、低毒抑制HBV的中草药。复方依山红是从壮族民间挖掘出来的治疗乙 型肝炎的经验方，对慢性乙型肝炎具有较好的治疗效果。该方由壮药材满山红、毛鸡骨草、 田基黄、牛大力等组成，具有祛邪排毒、清利散瘀、疏通道路、扶助正气的作用（李常伟，李 兵，卢汝梅，庞宇舟.复方依山红组方药材的化学成分研究进展[J].广西中医药，2014,（5): 7-8)。但是目前复方依山红的药理机制还未清楚，为了更好地促进复方依山红制剂的研制， 本发检测评价复方依山红提取物对IfepG2.2.15细胞的药效。
【发明内容】
[0003]本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供一种评价复方依山红药效的方 法。目前复方依山红的药理机制还未清楚，为了更好地促进复方依山红制剂的研制，本发明 通过测试所述溶液b的吸光值A及所述上清液a的吸光值&，所述溶液d的吸光值如及所述上 清液c的吸光值A3来计算HepG2.2.15细胞的存活率及不同浓度复方依山红提取物对HepG 2.2. 15细胞分泌的HBsAg与HBeAg的抑制率；确定不同浓度复方依山红提取物对HepG 2.2.15细胞的药效，能客观灵敏的反应复方依山红药效，且本发明的检测方法简单易操作。
[0004] 本发明提供的技术方案为：
[0005] -种检测复方依山红提取物对HepG2.2.15细胞的药效的方法，所述检测方法包 括以下步骤：
[0006] 1)、配置不同浓度的复方依山红提取物溶液；
[0007] 2)、将HepG2.2.15细胞接种到RPM1-1640培养基中培养形成细胞悬浮液；
[0008] 3)、依次将步骤1)中所述的不同浓度复方依山红提取物溶液分别加入到所述细胞 悬浮液中，其中设有不加复方依山红提取物溶液的细胞悬浮液作为对照；
[0009] 4)、将步骤3)中加入了不同浓度复方依山红提取物的细胞悬浮液进行离心，分离 上清液a后，加入染色剂染色，染色后用醋酸清洗，再加入碱缓冲溶液后成溶液b，最后测试 所述溶液b的吸光值A及测试所述上清液a的吸光值A1;将步骤3)中不加复方依山红提取物 的细胞悬浮液进行离心，分离上清液c后，加入染色剂染色，染色后用醋酸清洗，再加入碱缓 冲溶液后成溶液d，测试所述溶液d的吸光值知及测试所述上清液c的吸光值A3;
[0010] 5)、通过测试所述溶液b的吸光值A及所述上清液a的吸光值^，所述溶液d的吸光 值知及所述上清液c的吸光值A3来计算HepG2.2.15细胞的存活率及不同浓度复方依山红提 取物对HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg与HBeAg的抑制率;确定不同浓度复方依山红提取物 对HepG2.2.15细胞的药效，其中所述HepG2.2.15细胞的存活率=(A/A2)X100 %，不同浓 度复方依山红提取物对ifepG2.2.15细胞分泌的HBsAg与HBeAg的抑制率=^/%)X100%。 [0011]优选的是，所述配置不同浓度的复方依山红提取物溶液为:取复方依山红提取物， 溶于无菌去离子水，制成浓度为 0 · 00032mg/L、0 · 0016mg/L、0 · 08mg/L、0 · 04mg/L、0 · 2mg/L、 lmg/L的复方依山红提取物溶液。
[0012] 优选的是，所述复方依山红提取物制备方法:复方依山红由重量份的壮药材满山 红20、毛鸡骨草20、牛大力10、田基黄10、黄根5组成，分别取4份所述复方依山红，每份65g， 将所述4份复方依山红分别用95wt%乙醇、60wt%乙醇、30wt%乙醇、水作为提取溶剂，每种 溶剂回流提取三次，合并提取液，减压干燥后分别得四种复方依山红提取物，不同浓度的醇 萃取复方依山红提取物，能够更好的确定复方依山红提取物对HepG2.2.15细胞作用的有 效部位。
[0013] 优选的是，所述RPM11640培养基含有遗传霉素浓度为360-400mg/L、胎牛血清的重 量百分比为8-12 %、谷氨酰胺的浓度为l-3mmol/L、青链霉的重量百分比为0.5-2 %和 NaHC03的重量百分比为2-8 %，所述RPM11640培养基的PH值为7.4-7.6，适合HepG2.2.15细 胞培养，能快速高效培养出ifepG2.2.15细胞，并且活细胞数大于90%。
[0014] 优选的是，步骤2)中所述形成细胞悬液后计算细胞总数，活细胞数量不少于细胞 总数的90%，所述Η印G2.2.15细胞浓度为0.5X105个/mL-1.5X105个/mL。
[0015] 优选的是，采用自动酶标仪在吸收波长为515nm条件下测试所述溶液b的吸光值A 及所述溶液d的吸光值A2,在吸收波长为450nm条件下测试所述上清液a的吸光值^及所述上 清液c的吸光值A3。
[0016] 本发明至少包括以下有益效果：
[0017] (1)本发明通过测试并计算HepG2.2.15细胞的存活率及不同浓度复方依山红提 取物对HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg与HBeAg的抑制率;确定不同浓度复方依山红提取物 对HepG2.2.15细胞的药效;能客观灵敏的反应复方依山红药效，且本发明的检测方法简单 易操作，有利于检测的规范化。
[0018] (2)本发明提供了一种检测复方依山红提取物对HepG2.2.15细胞的药效的方法， 通过复方依山红提取物对HepG2.2.15细胞的药效，能客观地确定复方依山红提取物的质 量及通过不同浓度醇提取的复方依山红提取物测试其对HepG2.2.15细胞的药效，能够更 好的确定复方依山红提取物对ifepG2.2.15细胞作用的有效部位。
[0019] 本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本 发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
【具体实施方式】
[0020] 结合下面实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书 文字能够据以实施。
[0021] 实施例1
[0022] 一种检测复方依山红提取物对HepG2.2.15细胞的药效的方法，所述检测方法包 括以下步骤：
[0023] 1)、配置不同浓度的复方依山红提取物溶液；
[0024] 2)、将HepG2.2.15细胞接种到RPM1-1640培养基中培养形成细胞悬浮液；
[0025] 3)、依次将步骤1)中所述的不同浓度复方依山红提取物溶液分别加入到所述细胞 悬浮液中，其中设有不加复方依山红提取物溶液的细胞悬浮液作为对照；
[0026] 4)、将步骤3)中加入了不同浓度复方依山红提取物的细胞悬浮液进行离心，分离 上清液a后，加入染色剂染色，染色后用醋酸清洗，再加入碱缓冲溶液后成溶液b，最后测试 所述溶液b的吸光值A及测试所述上清液a的吸光值A1;将步骤3)中不加复方依山红提取物 的细胞悬浮液进行离心，分离上清液c后，加入染色剂染色，染色后用醋酸清洗，再加入碱缓 冲溶液后成溶液d，测试所述溶液d的吸光值知及测试所述上清液c的吸光值A3;
[0027] 5)、通过测试所述溶液b的吸光值A及所述上清液a的吸光值^，所述溶液d的吸光 值知及所述上清液c的吸光值A3来计算HepG2.2.15细胞的存活率及不同浓度复方依山红提 取物对HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg与HBeAg的抑制率;确定不同浓度复方依山红提取物 对HepG2.2.15细胞的药效，其中所述HepG2.2.15细胞的存活率=(A/A2)X100 %，不同