一种从杜松果粕中提取竹柏双黄酮的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域，具体涉及一种从杜松果柏中提取竹柏双黄酮的方法。
【背景技术】
[0002]双黄酮类属于黄酮类化合物，是由2分子黄酮衍生物聚合生成的二聚物，可由不同类型的黄酮单体化合物组成。天然双黄酮类化合物存在于银杏和卷柏等各种维管植物中，也可通过化学方法合成新型双黄酮类化合物。随着国内外研究的不断深入，双黄酮类化合物具有的细胞毒和抗肿瘤、抗病毒、抑菌抗炎、抗氧化和舒张血管等多种药理活性越来越引起人们的高度重视，在化妆品、保健品和医药领域也有着广阔的应用前景。
[0003]竹柏双黄酮是一类重要的双黄酮类化合物，已分离获得的竹柏双黄酮包括竹柏双黄酮A和竹柏双黄酮B。其中，竹柏双黄酮A是由张玉梅等(张玉梅，谭宁华，黄火强，等.墨西哥落羽杉中三个活性双黄酮研究.[J].云南植物研究，2005,27(1):107-110.)从墨西哥落羽杉枝叶中分离得到的:将墨西哥落羽杉枝叶干燥粉碎后分别用工业石油醚、丙酮及甲醇各加热回流提取3次，过滤后减压浓缩，将得到的丙酮提取物用硅胶层析柱以氯仿、氯仿-甲醇(9:1?1:1)和甲醇梯度洗脱，得到组分A-L，其中组分H(22g)再分别用硅胶柱(氯仿-甲醇(6:1)、氯仿-丙酮(3.5:1))和Sephadex LH-20凝胶柱(甲醇-水(1:1))反复层析，分离纯化得到竹柏双黄酮A。竹柏双黄酮A对肿瘤细胞株HT-29的IC5q值为11.16ymol/L，有望成为新型组织蛋白酶B(CatB)的天然抑制剂。
[0004]杜松在我国华北地区及辽宁、吉林和黑龙江省的南部均有分布，杜松果为柏科植物杜松(Juniperus rigida)的成熟球果。目前杜松果常用来提取挥发油和酿酒，有发汗利尿和镇痛的功效，主治风湿性关节炎。但杜松果经目前常规提取后剩余的大量杜松果柏却被直接舍弃，不仅是资源的极大浪费，也污染了环境。
[0005]如何有效利用杜松果柏、变废为宝是值得深思的重大问题。经申请人检测发现，杜松果的竹柏双黄酮含量很高，目前还未见利用杜松果或杜松果柏提取竹柏双黄酮的相关报道，而如上述从墨西哥落羽杉枝叶提取竹柏双黄酮的方法的不足之处在于:提取过程中用到众多种类的有机溶剂(工业石油醚、丙酮、甲醇、氯仿)，不仅使得整个提取过程较为繁琐，而且这些有机溶剂成本高、对操作人员和环境刺激性强、毒性大。
[0006]而行业内常规的提取方法获得的粗提物中杂质多，目标化合物(竹柏双黄酮)的含量却较低，仅为约10%，提取效率低。
【发明内容】
[0007]本发明提供了一种从杜松果柏中提取竹柏双黄酮的方法，该方法解决了现有技术中竹柏双黄酮提取率低的问题。
[0008]—种从杜松果柏中提取竹柏双黄酮的方法，包括以下步骤:
[0009](I)用体积分数为70?80 %的乙醇溶液回流提取杜松果柏，得提取液，将所述提取液减压浓缩，得浓缩物；
[0010](2)将所述浓缩物加水稀释，静置后固液分离，取上清液；
[0011](3)用乙醇调节所述上清液的乙醇度至20?30%，静置后固液分离，取沉淀；
[0012](4)将所述沉淀用稀盐酸溶液溶解后加入到大孔吸附树脂柱中，先用水洗脱至流出液PH值为中性，再用乙醇溶液解吸，收集解吸液，解吸液经减压浓缩、干燥后得到含有竹柏双黄酮的杜松果柏提取物。
[0013]如未作特殊说明，本发明中所指的竹柏双黄酮均为竹柏双黄酮A。
[0014]本发明的提取方法步骤简便，操作简单，适合工业化生产;采用的溶剂仅为水和乙醇，不仅大大降低了提取成本，而且水和乙醇对操作人员和环境基本无刺激、无毒性，提取过程更为环保。
[0015]采用体积分数为70?80%的乙醇溶液进行回流提取，能够有效提高浓缩物中有效成分的含量;在减压浓缩过程中，提取液中的蛋白质和多糖等杂质会迅速沉淀，当用水稀释浓缩物后这些杂质会沉淀分离，而有效成分则溶解在上清液中；由于竹柏双黄酮在低浓度乙醇溶液中的溶解度较低，因此当调节上清液的乙醇度至20?30%时，上清液中的竹柏双黄酮则会析出并沉淀下来；当用稀盐酸溶液溶解沉淀并上大孔吸附树脂柱后，酸性溶液使得其中含有的强极性杂质无法吸附到大孔吸附树脂上，从而最大可能地去除杂质，有效提高杜松果柏提取物中竹柏双黄酮的含量，获得的杜松果柏提取物中竹柏双黄酮的含量高达30?40%，提取效率高。
[0016]作为优选，步骤(I)中，杜松果柏的粒度小于0.5cm。对杜松果柏进行适当细化，有利于提高乙醇溶液的回流提取效率。
[0017]杜松果柏与乙醇溶液的重量体积比优选为:lkg:8?10L;回流提取的次数较多能够提高回流提取效率，优选为重复提取两次，每次提取时间为至少I小时。
[0018]作为优选，步骤(2)中，将所述浓缩物加水稀释至固形物质量分数占5?10%。适当的稀释比例既避免上清液体积过大、增加后续调节乙醇度时的乙醇用量，也能够保证浓缩物中的蛋白质和多糖等杂质充分地沉淀分离。
[0019]作为优选，步骤(3)中，调节所述上清液的乙醇度至30%。当上清液的乙醇度为30%时，竹柏双黄酮的溶解度最低，有利于提高提取效率。
[0020]作为优选，步骤(4)中，所述大孔吸附树脂柱内填装弱极性大孔吸附树脂;可选用LSAlO大孔吸附树脂。由于竹柏双黄酮的极性为中等极性，因此使用弱极性大孔吸附树脂时，大孔吸附树脂对竹柏双黄酮的吸附效率较高，解吸附完全。
[0021 ]作为优选，步骤(4)中，所述稀盐酸溶液的浓度为0.01?0.03%。此时上柱液的pH为3-4，上柱效率高，对强极性杂质去除较为完全。
[0022]作为进一步优选，所述稀盐酸溶液的浓度为0.01%。
[0023]作为优选，步骤(4)中，用体积分数为60?70%的乙醇溶液解吸。竹柏双黄酮在此浓度的乙醇溶液中溶解性较高，采用该乙醇溶液洗脱时，洗脱效率高。
[0024]步骤(I)或(4)中，所述减压浓缩的温度为60?65°C。
[0025]步骤(4)中，所述干燥为真空干燥或喷雾干燥，干燥至所述杜松果柏提取物的水分含量不超过5%。在此水分含量下，微生物不容易繁殖，有助于延长杜松果柏提取物的保质期。
[0026]本发明还提供了一种杜松果柏提取物，该杜松果柏提取物由本发明所述方法制备而成，含有至少30%的竹柏双黄酮，是常规提取方法的3倍以上。与现有技术相比，本发明的有益效果为:
[0027](I)本发明的提取方法步骤简便，操作简单，适合工业化生产；
[0028](2)本发明的提取方法中采用的溶剂仅为水和乙醇，不仅大大降低了提取成本，而且水和乙醇对操作人员和环境基本无刺激、无毒性，提取过程更为环保；
[0029](3)本发明的提取方法能有效提高杜松果柏提取物中竹柏双黄酮的含量，获得的杜松果柏提取物中竹柏双黄酮的含量高达30?40%，含量稳定，提取效率高。
【附图说明】
[0030]图1为竹柏双黄酮纯品的HPLC检测图；
[0031 ]图2为实施例1中杜松果柏提取物的HPLC检测图；
[0032]图3为实施例2中杜松果柏提取物的HPLC检测图；
[0033]图4为实施例3中杜松果柏提取物的HPLC检测图；
[0034]图5为实施例4中杜松果柏提取物的HPLC检测图；
[0035]图6为对比例I中杜松果柏提取物的HPLC检测图；
[0036]图7为实施例5中杜松果柏提取物的HPLC检测图；
[0037]图8为对比例2中杜松果柏提取物的HPLC检测图；
[0038]图9为对比例3中杜松果柏提取物的HPLC检测图；
[0039]图10为对比例4中杜松果柏提取物的HPLC检测图；
[0040]图11为对比例5中杜松果柏提取物的HPLC检测图。
【具体实施方式】
[0041]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明的技术方案作进一步的详细说明。
[0042]实施例1
[0043]本实施例一种从杜松果柏中提取竹柏双黄酮的方法，包括以下步骤:
[0044](I)用体积分数为70 %的乙醇溶液回流提取杜松果柏，得提取液，将提取液减压浓缩，得浓缩物；
[0045]具体为:①称取干燥杜松果柏碎(粒度小于0.5cm)1kg，投入到200L提取罐中，并加入体积分数为70%的乙醇溶液100L，搅拌均匀；
[0046]②打开夹套蒸汽，加热至有乙醇回流时，开始计时，回流提取Ih;
[0047]③回流提取完毕后，将料液过400目滤袋，取滤液备用，并向滤渣中再次投入体积分数为70%的乙醇溶液100L，重复回流提取Ih;
[0048]④回流提取完毕后，将二次料液过400目滤袋，取二次滤液与③中的滤液合并，得提取液；
[0049]⑤将提取液吸入100L外循环，打开外循环