蛋白激酶b抑制剂的新用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及蛋白激酶B抑制剂的新用途。
【背景技术】
[0002]疼痛分为生理性疼痛和病理性疼痛。前者是机体保护机制，而病理性疼痛通常发病机制复杂，病程长，恢复慢，往往长期持续，因此也可称为慢性痛，可由外伤、感染、炎症和肿瘤等各种病因引起，导致患者机体功能失调、康复困难以及精神抑郁，已成为当前危害人们健康和影响人们生活质量的重要原因。其临床症状表现为自发痛(Spontaneouspain)，痛觉过敏(Hyperalgesia)和异常疼痛(Allodynia)等。自发痛指无外来刺激自发产生的疼痛；痛觉过敏为机体对伤害性刺激产生夸大的痛反应；而异常疼痛则指非伤害性刺激(如轻触)便可产生强烈的疼痛感受。此外，发生于损伤区的痛敏称为原发性痛敏(Primary hyperalgesia),包括机械和热痛敏；发生于邻近损伤区的痛敏称为继发性痛敏(Sencondery hyperalgesia);机体损伤对侧的痛觉过敏称为镜像痛敏(Mirror imagehyperalgesia)。炎症是引起慢性痛的最主要的病因之一，导致损伤区红(redness)、月中(swelling)、热(warmth)、痛(pain)等表征，有时病灶去除或损伤疫愈后疼痛依然存在。目前慢性痛在临床上仍然缺乏有效的缓解策略，现有的药物如吗啡、非留体类抗炎药等存在成瘾、镇痛效果不佳及毒副作用等问题。然而，当前镇痛新药的开发存在新药物分子发现困难，分子机理难以阐述及临床前评估推进缓慢等问题，使得开发现有药物库，利用已知药物寻求新的镇痛策略成为亟待之策。
[0003]为了模拟人类慢性痛的临床症状，前人建立了若干不同类型的炎症痛和神经病理痛实验动物模型。虽然不同动物模型所模拟的临床症状有所不同，其致病机制也可能有着天壤之别。但其临床症状主要都表现为自发痛、痛觉过敏和触诱发痛。我们从东亚钳蝎粗毒中分离纯化得到单一成份BmK I，经大鼠足底皮下注射可剂量依赖性地诱发大鼠产生痛反应。经长期研宄积累，已成为国内外认可的经典炎症痛模型。利用这一炎症痛模型，可同时模拟诸多临床病征，并为理解致病机制，筛选新型抗炎镇痛药物提供良好的研宄载体。
[0004]Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，又被称为蛋白激酶B (protein kinase B，PKB)? Akt是PI3K/Akt信号通路的重要因子，在细胞生长与存活中起着关键作用，与多种肿瘤的发生密切相关。临床上已经将阻断该通路作为治疗癌症的新策略，因此已筛选出多个有效的小分子Akt抑制剂。辉瑞、默克公司等公司均有报道已经展开Akt抑制剂作为治疗药物的临床前实验，虽然还未有此类药物上市，但是其已是药物开发的重点方向。Akt IV一种具有细胞渗透性的脂类小分子，能够可逆性地结合于Akt上的ATP结合位点，阻止Akt与PI3K (磷脂酸肌醇-3-激酶，phosphatidylinositol-3_kinase，PI3K)的结合，从而阻断Akt彳目号通路。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一在于提供蛋白激酶B抑制剂在制备缓解炎性疼痛药物中的应用。
[0006]目前报道表明Akt激酶在多种疼痛动物模型中存在异常表达的现象。由此我们认识到Akt信号通路除了参与肿瘤发生，其在痛觉的中枢调控中也有关键性的作用。我们的研宄已经证实了 Akt信号通路参与BmK I诱导的炎症痛，Akt IV作为Akt激酶的抑制剂可以有效抑制BmK I诱导炎症痛动物模型的疼痛反应。表明Akt IV能够为制备治疗炎症痛药物中的应用。
[0007]上述的炎症痛模型涉及实验性自发痛相关反应、实验性镜像机械痛敏和热痛敏。
[0008]本发明将Akt抑制剂Akt IV在BmK I注射前30分钟鞘内注入大鼠脊髓L5-L6间隙，观察Akt IV对大鼠自发痛行为、双侧机械痛敏和热痛敏的缓解情况。实验表明，5 μ g/10 μ I和1yg /10 μ I浓度剂量的Akt IV均可显著抑制大鼠的每5分钟自发缩足反射次数，2小时总的缩足反射次数，2小时总的添咬抬足时间以及2小时内的痛觉大发作次数。且Akt IV对大鼠自发痛行为的抑制作用可持续至少2小时。而lyg/10yl浓度的Akt IV对上述痛行为无明显抑制效应。诱发痛方面，5yg/10yl和10 μ g/ΙΟ μ I的Akt IV均可剂量依赖性地抑制BmK I诱导的镜像机械痛敏和单侧热痛敏，而不影响对侧热痛敏。I μ g/10 μ I的Akt IV对诱发痛的抑制差异不显著。
[0009]本发明中采用天然蝎毒素BmK I构建的诱导实验性炎症痛模型，新颖之处在于该模型不仅能够稳定的模拟临床常见的自发痛、热痛敏、机械痛敏等症状，更能很好的模拟临床镜像机械痛症状和阵发性痛觉大发作症状，较其他模型的镇痛研宄有着更高的研宄价值。
【附图说明】
[0010]图1为大鼠鞘内注射不同剂量Akt IV后缓解自发缩足反应持续时程。
[0011]图2为大鼠鞘内注射不同剂量Akt IV后减少痛觉大发作总次数。
[0012]图3为大鼠鞘内注射不同剂量Akt IV后减少自发缩足总次数。
[0013]图4为大鼠鞘内注射不同剂量Akt IV后减少抬足舔咬总时间。
[0014]图5为大鼠鞘内注射不同剂量Akt IV后缓解损伤侧机械痛敏。
[0015]图6为大鼠鞘内注射不同剂量Akt IV后缓解对侧机械痛敏。
[0016]图7为大鼠鞘内注射不同剂量Akt IV后缓解损伤侧热痛敏。
[0017]图8为大鼠鞘内注射不同剂量Akt IV后不影响对侧正常热痛敏。
【具体实施方式】
[0018]BmK I诱导炎症痛模型建立实验请参见Bai ZT, Liu T, Jiang F，Cheng M, PangXYj Hua LMj Shi Jj Zhou JJj Shu XQj Zhang JWj Ji YH.Phenotypes and peripheralmechanisms underlying inflammatory pain-related behav1rs induced by BmK I， amodulator of sodium channels.Exp.Neurol.，226 (2010) 159 - 172.实施例一:不同剂量Akt IV缓解大鼠自发痛觉相关反应的观察在铺有一面玻璃镜的桌上放一高75 cm支架，架上置一 20 X 20 X 30cm3透明有机玻璃盒子，自桌上的镜中观察大鼠足底给药后的反应。药物注射前，将大鼠提前30分钟置于盒中适应实验环境。足底注射BmK I后，动物放回检测盒，持续观测自发痛行为。以每5分钟自发抬足次数、痛觉大发作(如撕叫等)次数、抬脚总次数、舔咬抬足时间来评价伤害性自发痛反应。Akt IV给药方式为BmK I注射前30分钟分别在大鼠鞘内L5-L6间隙注射剂量分别为I μ g、5 μ g、10 μ g的10 μ I药品体系。Akt IV对大鼠每5分钟自发抬足次数、痛觉大发作行为、抬脚总次数以及抬足添咬总时间的缓解情况详见图1~图4。
[0019]结果表明，5 yg /10 μ I和1yg /10 μ I浓度剂量的Akt IV均可显著抑制大鼠的自发缩足反射次数，抬脚总次数、舔咬抬足时间以及痛觉大发作次数。Akt IV对大鼠自发痛行为的抑制作用可持续至少2小时。I μ g/ΙΟ μ I浓度的Akt IV对上述痛行为无明显抑制效应。自发痛相关反应可很好的模拟临床急性痛症状，阵发性痛觉大发作行为可以很好的模拟临床阵发性痛觉发作症状。
[0020]实施例二:不同剂量Akt IV缓解大鼠双侧机械痛的观察
实例一中自发痛基本消失后，将大鼠置于在钢丝网格(Icm2)上的有机玻璃盒(20X20X30 cm3)中。用一系列 Von Frey 纤维(58011，Stoelting C0., USA)(从 0.6 到26 g)来测量机械缩足反射阈值。当大鼠注射侧后足接触地面并正常负重时即可测量。从网格下刺激动物注射侧后肢足底中心皮肤，每根纤维弯曲至适当程度停留2-3秒，两次测量间隔10秒。Von Frey纤维的刺激强度由小到大。如果没有缩足反射，使用更大克数的纤维继续测量，测量最大值为26 go取能引起50%缩足反应的最小克数值为机械缩足反射阈值。机械痛阈值取毒素注射后4小时、8小时的时间点进行采集。Akt IV对大鼠双侧机械痛敏的缓解情况详见图5?图6。
[0021]结果表明，5 μ g/10 μ I和10 μ g/10 μ I浓度剂量的Akt IV均可有效抑制BmK I诱导的双侧机械痛敏。iyg/ιθμ?的Akt IV对双侧机械痛敏的抑制差异不显著。诱发的双侧机械痛敏可有效模拟临床镜像痛症状。
[0022]实施例三:不同剂量Akt缓解大鼠热痛敏的观察
将一个20X20X30 cm3的有机玻璃罩放置在一块厚度为2毫米的玻璃板上，大鼠置于其中，玻璃下方是热痛刺激仪的卤素灯照射头(150 W，24 V，西安风岚器械厂出品，RTY-3型)。照射头距玻璃板的下表面调至3 cm，照射光圈直径调至3 mm照射在玻璃板下方。热刺激直接施加在大鼠后足足心。测量自动切断时间为15秒，以免损伤组织。同一位点重复测量5次。同一位点测量每两次间隔至少10分钟，不同位点测量每两次间隔5分钟。测三次，取平均值作为热缩足反射阈值。热痛阈值取毒素注射后4小时、8小时的时间点进行采集。Akt IV对大鼠热痛敏的缓解情况详见图7?图8。
[0023]结果表明，5 μ g/10 μ I和10 μ g/10 μ I浓度剂量的Akt均可有效抑制BmK I诱导的单侧热痛敏，并且不影响对侧热痛阈值。I μ g/1 μ I的Akt IV对双侧热痛敏的抑制差异不显著。诱发的热痛敏可有效模拟临床热痛觉过敏症状。
【主权项】
1.在蛋白激酶B抑制剂在制备缓解炎症疼痛药物中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种蛋白激酶B抑制剂在制备缓解炎症疼痛药物中的应用。本发明将三个剂量的Akt IV在BmK I注射前30分钟注入大鼠鞘内L5-L6骶骨间隙，研究不同剂量Akt IV在实验性自发痛、阵发性痛觉大发作、双侧机械痛敏和单侧热痛敏等现象中的缓解作用。该项发明建立在实验性动物炎症痛模型上，为研究Akt信号途径相关的镇痛分子机制及研发新型镇痛药物提供了依据。
【IPC分类】A61K45-00, A61P29-00
【公开号】CN104784693
【申请号】CN201510206822
【发明人】叶品, 焦云露, 陈孝明, 王子逸, 姜南, 朱红艳
【申请人】上海大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月28日