专利名称：作为新MDM2－p53抑制剂的取代的哌啶类的制作方法
技术领域：
本发明提供了通式(I)表示的具有顺式-3，4-二烷氧基取代的一系列新哌啶类及其药学上可接受的盐 其中n为独立地选自1或2的整数；X为卤素；R1选自由氢，羰基，磺酰基，低级烷基和被羰基、磺酰基或羟基取代的低级烷基组成的组；R12选自由下列基团组成的组具有1至约5个碳原子的烷基或链烯基，和 其中R7-R11独立地选自由氢、卤素、-CN、-NO2、CF3、-OCH3、-COOCH3和-C6H5组成的组；R2-R6独立地选自由氢、卤素、低级烷基、-C(CH3)3、CF3、-OCH3、-NO2和-CN组成的组；且如果R12为具有1至约5个碳原子的烷基或链烯基，R2-R6为氢。
通式I的化合物为MDM2-p53相互作用的小分子抑制剂。这些化合物用于治疗或控制癌症。
p53是在防止癌症发展中起重要作用的肿瘤抑制蛋白。p53保护细胞的完整性并防止因诱导生长抑制或编程性细胞死亡导致的受损细胞克隆持久性增殖。在分子水平上，p53是可以活化一组涉及细胞周期和编程性细胞死亡调节的基因的转录因子。p53是有效的细胞周期抑制剂，它在细胞水平上受到MDM2紧密调节。MDM2和p53形成反馈控制环路。MDM2可以结合p53并抑制其反式激活p53-调节的基因的能力。此外，MDM2介导p53的遍在蛋白质依赖性降解。p53可以激活MDM2基因的表达，由此提高MDM2蛋白的细胞水平。这种反馈控制环路确保了MDM2和p53在正常增殖细胞中保持低水平。MDM2还是在细胞周期调节中起重要作用的E2F的辅因子。
MDM2与p53(E2F)之比在许多癌症中失调。例如，已经证实在p16INK4/p19ARF基因座上通常发生的分子缺陷影响MDM2蛋白降解。抑制带有野生型p53的肿瘤细胞中MDM2-p53相互作用应导致p53累积、细胞周期抑制和/或编程性细胞死亡。因此，MDM2拮抗剂可以作为单一活性剂或与广泛其它抗肿瘤疗法联用为癌症疗法提供新手段。已经证实通过使用抑制MDM2-p53相互作用的不同大分子工具(例如抗体、反义寡核苷酸、肽类)证实了这种策略的可行性。MDM2还通过作为p53的保守结合区结合E2F并激活细胞周期蛋白A的E2F-依赖性转录，提示MDM2拮抗剂可能在p53突变细胞中具有作用。
本发明提供了通式(II)表示的化合物及其药学上可接受的盐
其中n为独立地选自1或2的整数；X为卤素；R1选自由氢，羰基，磺酰基，低级烷基和被羰基、磺酰基或羟基取代的低级烷基组成的组；R2-R6独立地选自由氢、卤素、低级烷基、-C(CH3)3、CF3、-OCH3、-NO2和-CN组成的组；且R7-R11独立地选自由氢、卤素、-CN、-NO2、-CF3、-OCH3、-COOCH3和-C6H5组成的组。
本发明还提供了通式(III)表示的化合物及其药学上可接受的盐 其中n为1-2的整数；X为卤素；R1选自由氢，羰基，磺酰基，低级烷基和被羰基、磺酰基或羟基取代的低级烷基组成的组；且R12选自由具有1至约5个碳原子的烷基和链烯基组成的组。
本发明还提供了包含治疗有效量的通式(II)或(III)表示的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。本发明进一步提供了治疗癌症的方法，包括对需要这类治疗的患者给予治疗有效量的通式(II)或(III)表示的化合物。此外，本发明提供了通式(II)或(III)表示的化合物在制备治疗癌症的药物中的应用。
本发明提供了属于具有顺式-3，4-二烷氧基取代的哌啶类的一系列新的MDM2-p53相互作用的小分子抑制剂，已经在ELISA测定中测试了它们。已经证实在该系列中大部分有效的化合物抑制MDM2蛋白与p53-类肽的相互作用，其中p53-类肽的效力与p53-衍生的肽近似相同。已经通过对该系列中选择的化合物和这些化合物的碎片的NMR研究证实这些化合物与MDM2蛋白的p53-结合袋结合。已经证实这些化合物结合与顺式-咪唑啉类相同的结合袋，它们已经表现出在基于细胞的试验中具有明显的机械活性并对体外和体内含有野生型-p53的肿瘤细胞具有抗增殖活性。因此，这些化合物用作抗癌药。
本文所用的如下术语具有下列含义″烷基″或″低级烷基″指的是含有1-10个，优选1-6个碳原子且更优选1-4个碳原子的直链或支链饱和脂族烃。典型的低级烷基包括甲基、乙基、丙基和异丙基。
″链烯基″指的是含有2-10个，优选2-6个碳原子和至少一个碳-碳双键的直链或支链脂族烃，例如乙烯基、2-丁烯基和3-甲基-2-丁烯基。
″羰基″指的是二价-CO-基团。
″有效量″指的是有效预防、缓解或改善疾病症状或延长所治疗受试者存活的用量。
″卤素″指的是氟、氯、溴或碘。
″羟基″指的是一价-OH基团。
作为取代的烷基中的″取代的″指的是可以在一个或多个位置上发生的取代，且除非另有说明，在各取代位置上的取代基独立地选自具体的选择。
″磺酰基″指的是二价基团-SO2-。
″IC50″指的是抑制50％具体测定的活性所需的特定化合物浓度。特别可以如下文所述测定IC50。
″药学上可接受的盐″指的是保持本发明化合物的生物有效性和特性且由合适的非毒性有机或无机酸或有机或无机碱形成的常用酸加成盐或碱加成盐。酸加成盐的实例包括那些来源于无机酸和那些来源于有机酸的盐，所述的无机酸诸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸；所述的有机酸诸如对甲苯磺酸、水杨酸、甲磺酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸、马来酸、乳酸、富马酸等。碱加成盐的实例包括那些来源于铵、钾、钠的盐和季铵氢氧化物，诸如氢氧化四甲基铵。将药物化合物(例如药物)化学修饰成盐是药剂师为获得化合物改善的物理和化学稳定性、吸湿性、流动性和溶解性而众所周知的技术。例如，参见H.Ansel等，《药物剂型和递药系统》(Pharmaceutical Dosage Forms和Drug DeliverySystems)(6th Ed.1995)，196和1456-1457页。
″药学上可接受的″，诸如药学上可接受的载体、赋形剂等指的是药学上可接受的且对给予特定化合物的受试者而言基本上无毒性的。
″治疗有效量″指的是通式(II)或(III)中至少一种化合物或其药学上可接受的盐显著抑制人肿瘤细胞，包括人肿瘤细胞系增殖和/或预防其分化的用量。
作为典型的本发明化合物有利地表现出约3μM-约100μM的IC50值。
本发明的化合物用于治疗或控制细胞增殖性疾病，特别是肿瘤疾病。这些化合物和含有这些化合物的制剂可以用于治疗或控制实体瘤，诸如乳腺、结肠、肺和前列腺肿瘤。
本发明化合物的治疗有效量指的是有效预防、缓解或改善疾病症状或延长所治疗受试者存活的用量。治疗有效量的测定属于本领域技术的范围。
本发明化合物的治疗有效量或剂量可以在宽限内改变可以按照本领域公知的方式测定。可以在每种特定情况中根据个体需要调整这类剂量，包括所给予的具体化合物、给药途径、所治疗的疾病和所治疗的患者。一般来说，就对体重约为70Kg的成年人的口服或非肠道给药而言，约10mg-约10,000mg，优选约200mg-约1,000mg的每日剂量应是合适的，不过，当指示时，可以超过上限。可以将每日剂量作为单剂量或分剂量给药，或就非肠道给药而言，可以作为连续输注给药。
本发明提供了通式(II)表示的化合物及其药学上可接受的盐
其中n为独立地选自1或2的整数；X为卤素；R1选自由氢，羰基，磺酰基，低级烷基和被羰基、磺酰基或羟基取代的低级烷基组成的组；R2-R6独立地选自由氢、卤素、低级烷基、-C(CH3)3、CF3、-OCH3、-NO2和-CN组成的组；且R7-R11独立地选自由氢、卤素、-CN、-NO2、CF3、-OCH3、-COOCH3和-C6H5组成的组。
在本发明优选的实施方案中，n为1。
在本发明另一个优选的实施方案中，X为氯或氟；更优选氯。在本发明另一个优选的实施方案中，X为对位取代基。
在本发明另一个优选的实施方案中，R1选自由氢、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-COCH3、-COCH2CH3、-CH2CHOHCH2OH和-SO2CH3组成的组；更优选R1为氢。
在本发明另一个优选的实施方案中，R2和R6独立地选自由氢和卤素组成的组；更优选氢、氟、氯和溴。
在本发明另一个优选的实施方案中，R3和R5独立地选自氢、氟、氯、溴、-CH3、-OCH3、-CN和-NO2；更优选R3和R5独立地选自由氢、氟、氯和溴组成的组。
在本发明另一个优选的实施方案中，R4选自由氢、氟、氯、溴、-C(CH3)3、-CH3、-CN和-CF3组成的组；更优选R4选自由氢、氟、氯和溴组成的组。
在本发明另一个优选的实施方案中，R7和R11独立地选自由氢、卤素、-CN、-NO2和-C6H5组成的组；更优选R7和R11独立地选自由氢、氟、氯和溴组成的组。
在本发明另一个优选的实施方案中，R8和R10独立地选自氢、氟、氯、溴、-CN、-NO2和-OCH3；更优选R8和R10独立地选自由氢、氟、氯和溴组成的组。
在本发明另一个优选的实施方案中，R9选自由氢、氟、氯、溴、-OCH3、-CN、-CF3和-COOCH3组成的组；更优选R9选自由氢、氟、氯和溴组成的组。
具有通式(II)的优选化合物包括顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，6-二氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-3-(联苯基-2-基甲氧基)-4-(4-氯-苯基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-哌啶-3-基氧基甲基]-苄腈；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3-硝基-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-3-(3-溴-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，4-二氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-3-(2-氯-4-氟-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-哌啶-3-基氧基甲基]-苯甲酸甲酯；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3，5-二氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-3-(3-氯-2-氟-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，5-二氯-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，3-二氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(4-三氟甲基-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(4-氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-3-(4-溴-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3-氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-2-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-哌啶-3-基氧基甲基]-苄腈；顺式-[外消旋]-3-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-哌啶-3-基氧基甲基]-苄腈；
顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(4，5-二甲氧基-2-硝基-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-3-丁-2-烯氧基-4-(4-氯-苯基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-戊-2-烯氧基-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，3，6-三氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-3-丁氧基-4-(4-氯-苯基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-3-(4-氯-2-氟-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-3-(4-溴-2-氟-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，4，6-三氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，4，5-三氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，3，4-三氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-3-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-4-(2，4，6-三氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-3-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-4-(2，5-二氯-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-3-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-4-(2，6-二氯-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-3-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-4-(2，6-二氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-3-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-4-(3-甲氧基-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-3-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-4-(2，3，6-三氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-3-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-4-(2-氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-3-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-4-(2-氟-3-甲基-苄氧基)-哌啶顺式-[外消旋]-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-4-(4-氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-(4-溴-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-4-(2，4-二氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-(2-氯-4-氟-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-(2-溴-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-(4-叔丁基-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-[4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-哌啶-4-基氧基甲基]-苄腈；顺式-[外消旋]-4-(3-氯-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-(3-溴-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-4-(2-氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-4-(3，5-二氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-(3-氯-2-氟-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-4-(2，3-二氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-4-(4-三氟甲基-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-4-(3-氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-3-[4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-哌啶-4-基氧基甲基]-苄腈；顺式-[外消旋]-4-(2-氯-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-4-(4-甲基-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-(4-氯-苯基)-3，4-双-(2，4-二氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-(4-氯-苯基)-3，4-双-(3-硝基-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，4-二氟-苄氧基)-哌啶-1-基]-乙酮；顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-3-(3-溴-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-哌啶-1-基]-乙酮；顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-3-(2-氯-4-氟-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-哌啶-1-基]-乙酮；顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3，5-二氟-苄氧基)-哌啶-1-基]-乙酮；顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-3-(3-氯-2-氟-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-哌啶-1-基]-乙酮；顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-哌啶-1-基]-乙酮；顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(4-氟-苄氧基)-哌啶-1-基]-乙酮；顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-3-(4-溴-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-哌啶-1-基]-乙酮；顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3-氟-苄氧基)-哌啶-1-基]-乙酮；顺式-[外消旋]-3-[1-乙酰基-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-哌啶-3-基氧基甲基]-苄腈；顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，6-二氟-苄氧基)-哌啶-1-基]-乙酮；顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3-硝基-苄氧基)-哌啶-1-基]-乙酮；顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，3，4-三氟-苄氧基)-哌啶-1-基]-乙酮；顺式-[外消旋]-1-[4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-4-(2-氟-苄氧基)-哌啶-1-基]-乙酮；顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，3，4-三氟-苄氧基)-哌啶-1-基]-丙-1-酮；顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-哌啶-1-基]-丙-1-酮；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-3-(4-溴-苄氧基)-4-(4-氟-苯基)-哌啶；
顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-1-乙基-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-1-丙基-哌啶；顺式-[外消旋]-3-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，3，4-三氟-苄氧基)哌啶-1-基]-丙-1，2-二醇；顺式-[外消旋]-3-[4-苄氧基-3-(4-溴-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-哌啶-1-基]-丙-1，2-二醇；和顺式-[外消旋]-3-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，3，4-三氟-苄氧基)-哌啶-1-基]-甲磺酰基。
本发明还提供了通式(III)表示的化合物及其药学上可接受的盐 其中n为1-2的整数；X为卤素；R1选自由氢，羰基，磺酰基，低级烷基和被羰基、磺酰基或羟基取代的低级烷基组成的组；且R12选自由具有1至约5个碳原子的烷基和链烯基组成的组。
在本发明优选的实施方案中，n为1。
在本发明另一个优选的实施方案中，X为氯或氟；更优选氯。在本发明另一个优选的实施方案中，X为对位取代基。
在本发明另一个优选的实施方案中，R1选自由氢、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-COCH3、-COCH2CH3、-CH2CHOHCH2OH和-SO2CH3组成的组；更优选R1为氢。
在本发明另一个优选的实施方案中，R12选自由-(CH2)3CH3、-(CH2)4CH3、-CH2CH＝CHCH3和-CH2CH＝CHCH2CH3组成的组。
具有通式(III)的优选化合物包括顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氟-苯基)-3-丁氧基-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氟-苯基)-3-戊氧基-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氟-苯基)-3-(丁-2-烯)基氧基-哌啶；和顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氟-苯基)-3-(戊-2-烯基)氧基-哌啶。
具有通式(II)的其它优选化合物包括顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-丁氧基-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-戊氧基-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(丁-2-烯)基氧基-哌啶；和顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(戊-2-烯基)氧基-哌啶。
本发明还提供了包含治疗有效量的通式(II)或(III)表示的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。本发明进一步提供了治疗癌症的方法，包括对需要这类治疗的患者给予治疗有效量的通式(II)或(III)表示的化合物。优选所述的癌症为乳腺癌或结肠癌。
此外，本发明提供了制备权利要求1的通式I化合物的方法，该方法包括a)使通式IV的化合物与合适的连接基偶联至固相上，其中通式IV化合物的结构式如下 其中R2-R6、X和n如上文所定义，从而得到通式V的化合物
其中 表示固相；b)使用叔丁醇钾产生阴离子并使用通式R12X的烷基卤使通式V的化合物烷基化而得到通式VI的化合物 其中R12如上文所定义；c)从连接基上裂解产物而得到通式Ia的化合物 其中R1为H；且如果需要d)使通式Ia的化合物与酰基卤、烷基卤或磺酰氯反应而得到通式I的化合物，其中R1为羰基，磺酰基，低级烷基或被羰基、磺酰基或羟基取代的低级烷基。
可以按照下列反应路线制备本发明的化合物及其中间体。使用公知方法或如所述制备原料。描述反应路线、制备和实施例中所用的原料如下所列。
ACE-Cl＝氯甲酸1-氯乙酯(Aldrich)BEMP＝2-叔丁基亚氨基-2-二乙氨基-1，3-二甲基-全氢-1，3，2-二氮杂磷杂环己烯(Fluka)Boc＝叔丁氧基羰基t-BuOK＝叔丁醇钾CH2C12＝二氯甲烷DCE＝1，2-二氯乙烷DMF＝N，N-二甲基甲酰胺Et2O＝乙醚EtOH＝乙醇H2SO4＝硫酸HCl＝氯化氢H2O＝水MeOH＝甲醇NaH＝氢化钠NMO＝N-甲基吗啉-N-氧化物NMP＝1-甲基-2-吡咯烷酮OsO4＝四氧化锇聚合物(支持的)BEMP＝聚苯乙烯树脂支持的2-叔丁基亚氨基-2-二乙氨基-1，3-二甲基-全氢-1，3，2-二氮杂磷杂环己烯(Fluka)i-Pr2NEt＝N，N-二异丙基乙胺TEA＝三乙胺TFA＝三氟乙酸THF＝四氢呋喃反应路线1-3概括了使用新固相合成制备具有通式(II)和(III)的本发明化合物的一般方法。反应路线4概括了在液相中制备所述化合物的一般方法。反应路线5解释了使用新聚合物支持的试剂修饰R1基团的不同方法。
在反应路线1中，概括了对商购4-芳基-1，2，3，6-四氢吡啶的仲胺的保护。优选的保护基为可以由已知方法合成的叔-丁氧羰基(Greene，T.W.和Wuts，P.G.M，第2版，John Wiley & Sons，N.Y.1991)。就液相合成而言，可以用OsO4/NMO处理所得的叔丁酯而形成二羟基中间体A。可以使用NaH和4-甲氧基苄基氯在中间体A的C3上进行选择性o-烷基化。可以按照公知方法使所得中间体苄化。使用50％TFA/CH2Cl2使4-甲氧基苄基和叔-丁氧羰基脱保护而得到4-芳基-4-苄氧基-3-羟基哌啶B。就固相合成而言，可以使所得哌啶B与合适的连接基，诸如氯甲基衍生物ArgoPore-Cl连接基(linker)(Argonaut)偶联。使用t-BuOK在固相上进行烷基化而生成阴离子，随后与不同烷基卤(RX)偶联。可以使用氯甲酸α-氯乙酯(ACE-Cl)/MeOH从N-苄基连接的叔胺连接基上裂解最终的反应产物而得到本发明的哌啶化合物(Leysen，D.等《四面体通讯》(Tetrahedron Lett.)1997，2915-2918)。
反应路线1 在反应路线2中，概括了用于制备通式(II)化合物的一般方法，这些化合物的特征在于来源于反应路线1中中间体A的官能化R基团。可以使用NaH和苄基溴通过在C3上烷基化，随后对叔丁氧羰基进行酸性脱保护而将中间体A转化成4-芳基-3-苄氧基-3-羟基哌啶。随后按照反应路线1中展示的所述反应在固相上进行合成而得到本发明的哌啶化合物。
反应路线2 在反应路线3中，可以使用50％TFA/CH2Cl2使来自中间体A的叔-丁氧羰基脱保护。通过使所得4-芳基-3，4-二羟基哌啶与ArgoPore-Cl连接基偶联开始固相合成。使用t-BuOK和烷基卤(RX)二烷基化，随后按照所述条件裂解聚合物支持物而得到本发明的哌啶化合物。
反应路线3 在反应路线4中，概括了在液相制备制备通式(II)和(III)化合物的一般合成方法。依次使用NaH和烷基卤对中间体A进行烷基化，随后对叔-丁氧羰基进行酸性脱保护而得到本发明的哌啶化合物。
反应路线4 在反应路线5中，概括了用于中间体C后修饰的一般方法。可以使用各种试剂，诸如酰基氯、烷基卤和磺酰氯处理中间体C的仲胺而形成相应的酰胺、叔胺或磺酰胺。还可以使用聚合物支持物BEMP和烯丙基碘使中间体C烯丙基化而形成N-烯丙基取代的中间体，将其进一步用OsO4/NMO处理而形成本发明的3-丙-1，2-二醇-取代的哌啶类。
反应路线5 可以按照下列实施例制备本发明的化合物。提供这些实施例用于证实本发明化合物和组合物制备的目的，而非限定它们。
实施例按照下列实施例制备且由通式(II)或(III)表示的化合物的抑制活性(IC50)在3μM-100μM的范围。
实施例1
顺式-[外消旋]-4-(4-氯苯基)-3，4-二羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯 将4-(4-氯苯基)-1，2，3，6-四氢吡啶盐酸盐(Lancaster，1.00g，4.35mmol)、三乙胺(0.92g，9.13mmol)和碳酸二叔丁酯(Aldrich，1.04g，4.78mmol)在二氯甲烷(100mL)中合并并在室温下搅拌14小时。用饱和氯化铵水溶液(30mL)、水(30mL)、饱和氯化钠溶液(30mL)洗涤该混合物并用无水硫酸镁干燥。过滤该混合物并在真空中浓缩而得到4-(4-氯苯基)-3，6-二氢-2H-吡啶-1-甲酸叔丁酯(1.41g，100％)，为粘性黄色油状物，将其不经进一步纯化使用。将4-(4-氯苯基)-3，6-二氢-2H-吡啶-1-甲酸叔丁酯(334mg，1.14mmoL)溶于丙酮/水(1∶1，10mL)并加入N-甲基吗啉-N-氧化物(Aldrich，462mg，3.42mmoL)和催化量的四氧化锇(Aldrich)。将该混合物在室温下搅拌3小时。加入饱和亚硫酸氢钠水溶液(2mL)并将该混合物在室温下搅拌30分钟。用乙酸乙酯(10mL)和水(5mL)稀释该混合物。分离有机层并用乙酸乙酯(2×10mL)提取水层。用盐水洗涤合并的有机层并用无水硫酸镁干燥。过滤该混合物并在真空中浓缩而得到顺式-[外消旋]-4-(4-氯苯基)-3，4-二羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯(364mg，1.11mmol，97％)，为黄色油状物。
实施例2顺式-[外消旋]-4-(4-氯苯基)-3-(3，4-二氯苄氧基)-4-羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯
向冰冷的氢化钠(62mg，2.6mmoL)在四氢呋喃/N，N-二甲基甲酰胺(4/1，4mL)的混合物中的混悬液中滴加顺式-[外消旋]-4-(4-氯苯基)-3，4-二羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯(实施例1，340mg，1.04mmol)在四氢呋喃/N，N-二甲基甲酰胺(1mL，4/1)中的溶液。在添加完成后，在冰冷却的同时将该混合物搅拌15分钟。然后加入3，4-二氯苄基氯(Aldrich，239mg，1.14mmol)并将该混合物温至室温且搅拌20小时。将该混合物倾入饱和氯化铵水溶液(30mL)并用乙酸乙酯(3×15mL)提取该混合物。用水(2×20mL)、饱和氯化钠水溶液(1×20mL)洗涤合并的有机层并用无水硫酸镁干燥。过滤该混合物并在真空中浓缩而得到粘性油状物(500mg)，将其通过快速硅胶色谱法纯化(Merck硅胶60，230-400目)而得到顺式-[外消旋]-4-(4-氯苯基)-3-(3，4-二氯苄氧基)-4-羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯(310mg，61％)，为无色油状物。
实施例3顺式-[外消旋]-4-(苄氧基)-4-(4-氯苯基)-3-(3，4-二氯苄氧基)-哌啶-1-甲酸叔丁酯
向冰冷的顺式-[外消旋]-4-(4-氯苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-4-羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯(实施例2，224mg，0.46mmol)在四氢呋喃(1.5mL)中的溶液中逐滴加入氢化钠(22mg，0.92mmol)。在冰冷却的同时搅拌10分钟后，加入苄基溴(86mg，0.51mmol)，随后加入N，N-二甲基甲酰胺(0.5mL)。除去冷却浴并将该混合物温至室温且搅拌3小时。加入几滴甲醇并在室温下将该混合物搅拌1小时。使该混合物分配在乙酸乙酯(30mL)与饱和氯化钠水溶液(15mL)之间。分离有机层并用乙酸乙酯(3×15mL)提取水层。用水(3×30mL)、饱和氯化钠水溶液(15mL)洗涤合并的有机层并用无水硫酸镁干燥。过滤该混合物并在真空中浓缩而得到顺式-[外消旋]-4-(苄氧基)-4-(4-氯苯基)-3-(3，4-二氯苄氧基)-哌啶-1-甲酸叔丁酯(240mg)，将其不经进一步纯化使用。
实施例4顺式-[外消旋]-4-(苄氧基)-4-(4-氯苯基)-3-(3，4-二氯苄氧基)-哌啶盐酸盐 将顺式-[外消旋]-4-(苄氧基)-4-(4-氯苯基)-3-(3，4-二氯苄氧基)-哌啶-1-甲酸叔丁酯粗品(实施例3，240mg)溶于无水乙醚(10mL)。将该混合物在冰浴中冷却并使氯化氢气体通过该溶液10分钟。紧密塞紧反应容器并储存在0℃下24小时。收集沉淀的固体并用乙醚洗涤而得到顺式-[外消旋]-4-(苄氧基)-4-(4-氯苯基)-3-(3，4-二氯苄氧基)-哌啶盐酸盐，为白色固体(130mg，55％)。
HR-FAB m/e C24H24NO2Cl的计算值[M+H]+476.0952；测定值476.0931。
实施例5顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(4-甲氧基-苄氧基)-哌啶-1-甲酸叔丁酯 按照实施例2和3中所用的步骤由顺式-[外消旋]-4-(4-氯苯基)-3，4-二羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯(实施例1)和4-甲氧基苄基氯(Aldrich)制备顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(4-甲氧基-苄氧基)-哌啶-1-甲酸叔丁酯，将其不经进一步纯化使用。
实施例6顺式-[外消旋]-4，4-[苄氧基-(4-氯苯基)]-3-羟基哌啶 分子量＝317.81将顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(4-甲氧基-苄氧基)-哌啶-1-甲酸叔丁酯(实施例5，550mg，1.02mmol)溶于50％三氟乙酸/二氯甲烷(10mL)。搅拌1.5小时后，在真空中蒸发该溶液。将残余物在1∶1乙酸乙酯/己烷中研磨而得到顺式-[外消旋]-4，4-[苄氧基-(4-氯苯基)]-3-羟基哌啶(150mg)，为白色粉末。质谱(ES)[M+CH3CN]+＝359。
实施例7树脂-结合的顺式-[外消旋]-4，4-[苄氧基-(4-氯苯基)]-3-羟基哌啶 将顺式-[外消旋]-4，4-[苄氧基-(4-氯苯基)]-3-羟基哌啶(实施例6，7.3g，23mmol)、ArgoPore-Cl树脂(16g，15.3mmol，负载能力0.96mmol，来自Argonaut Inc.)和N，N-二异丙基乙胺(13mL，76.7mmol)在N-甲基吡咯啉酮(12mL)中的混合物在60℃下加热过夜。过滤树脂并依次用CH2Cl2和MeOH洗涤。在40℃/高度真空下干燥树脂而得到树脂-结合的4，4-[苄氧基-(4-氯苯基)]-3-羟基哌啶。
实施例8顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-取代的哌啶库一般步骤 向树脂-结合的顺式-[外消旋]-4，4-[苄氧基-(4-氯苯基)]-3-羟基哌啶(实施例7，200mg，0.192mmol，负载能力0.96mmol/g)和烷基卤(RX，0.58mmol)在4∶1 THF∶DMF溶液(2mL)中的混悬液中加入叔丁醇钾(在THF中0.77M；1mL，0.77mmol)。在室温下搅拌过夜后，过滤树脂并依次用N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、甲醇、二氯甲烷和乙醚洗涤。在40℃/高度真空下将树脂干燥过夜。向在1，2-二氯乙烷(2mL)中的树脂中加入氯甲酸1-氯乙酯(0.2mL，1.9mmol)。在室温下振摇4小时后，过滤树脂并用1，2-二氯乙烷(3×2mL)洗涤。在真空中蒸发滤液。向残余物中加入干甲醇(2mL)并将该溶液在60℃下加热3小时。在真空中蒸发该溶液而得到所需产物。
按照上述方式制备下列化合物。
在实施例28中所述的试验中，实施例8O的化合物表现出19，8μM的IC50。
实施例9顺式-[外消旋]-3-苄氧基-4，4-[(4-氯苯基)-羟基]哌啶 按照实施例2和6中所用的步骤由顺式-[外消旋]-4-(4-氯苯基)-3，4-二羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯(实施例1)和苄基溴(Aldrich)制备顺式-[外消旋]-3-苄氧基-4，4-[(4-氯苯基)-羟基]哌啶。
实施例10树脂-结合的顺式-[外消旋]-3-苄氧基-4，4-[(4-氯苯基)-羟基]哌啶
按照实施例7中所用的步骤由顺式-[外消旋]-3-苄氧基-4，4-[(4-氯苯基)-羟基]哌啶(实施例9)制备这种树脂-结合的化合物。
实施例11顺式-[外消旋]-3-苄氧基-4-(4-氯苯基)-4-取代的哌啶库一般步骤 按照实施例8中所用的步骤由树脂-结合的顺式-[外消旋]-3-苄氧基-4，4-[(4-氯苯基)-羟基]哌啶(实施例10)和烷基溴制备顺式-[外消旋]-3-苄氧基-4-(4-氯苯基)-4-取代的哌啶。
按照上述方式制备下列化合物。
实施例12树脂-结合的3-(3，4-二氯苄氧基)-4，4-[(4-氯苯基)-羟基]哌啶 按照实施例2、6和7中所用的步骤制备这种树脂结合的化合物。
实施例134-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-4-取代的哌啶一般步骤 按照实施例8中所用的步骤由树脂-结合的3-(3，4-二氯苄氧基)-4，4-[(4-氯苯基)-羟基]哌啶(实施例12)和烷基溴制备4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-4-取代的哌啶。
按照上述方式制备下列化合物。
实施例14树脂-结合的顺式-[外消旋]-4-(4-氯-苯基)-哌啶-3，4-二醇
按照实施例6和7中所用的步骤由顺式-[外消旋]-4-(4-氯苯基)-3，4二羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯(实施例1)制备这种树脂-结合的化合物。
实施例15顺式-[外消旋]-4-(4-氯-苯基)-3，4-双-(2，4-二氟-苄氧基)-哌啶 分子量＝479.90向树脂-结合的4-(4-氯-苯基)-哌啶-3，4-二醇(实施例14，200mg，0.192mmol，负载能力0.96mmol/g)和2，4-二氟苄基溴(Lancaster，1.54mmol)在4∶1 THF∶DMF溶液(2mL)中的混悬液中加入叔丁醇钾(在THF中0.77M；1mL，0.77mmol)。在室温下搅拌过夜后，过滤树脂并依次用N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、甲醇、二氯甲烷和乙醚洗涤。在40℃/高度真空下将树脂干燥过夜。向在1，2-二氯乙烷(2mL)中的树脂中加入氯甲酸1-氯乙酯(0.2mL，1.9mmol)。在室温下振摇4小时后，过滤出树脂并用1，2-二氯乙烷(3×2mL)洗涤。在真空中蒸发滤液。向残余物中加入无水甲醇(2mL)并将该溶液在60℃下加热3小时。在真空中蒸发该溶液而得到所需产物。质谱(ES)M+＝480。
实施例16顺式-[外消旋]-4-(4-氯-苯基)-3，4-双-(3-硝基-苄氧基)-哌啶
分子量＝497.93按照实施例15中所用的步骤由树脂-结合的4-(4-氯-苯基)-哌啶-3，4-二醇(实施例14)和3-硝基苄基溴(Lancaster)制备顺式-[外消旋]-4-(4-氯-苯基)-3，4-双-(3-硝基-苄氧基)-哌啶。质谱(ES)M+＝498。
实施例17顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-取代的-哌啶-1-基]-乙酮库一般步骤 将4，4-[苄氧基-(4-氯苯基)]-3-芳氧基哌啶(实施例8，0.012mmol)、聚合物-支持的BEMP(10mg，0.023mmol，负载能力2.3mmol/g，来自FlukaInc.)和乙酰氯(0.01mL，0.14mmol)在四氢呋喃(1mL)中的混合物在室温下振摇过夜。过滤树脂并依次用CH2Cl2和MeOH洗涤。在真空中蒸发滤液而得到所需产物。
按照上述方式制备下列化合物。
实施例17K具有实施例28所述试验中的5.5μMIC50。
实施例18顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，3，4-三氟-苄氧基)-哌啶-1-基]-丙-1-酮
分子重＝517.97按照实施例17中所用的步骤由4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，3，4-三氟-苄氧基)-哌啶(实施例8Ad)和丙酰氯(Aldrich)制备顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，3，4-三氟-苄氧基)-哌啶-1-基]-丙-1-酮。质谱(ES)M+＝518。
实施例19顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-哌啶-1-基]-丙-1-酮 分子量＝532.89按照实施例18中所用的步骤由顺式-[外消旋]-4-(苄氧基)-4-(4-氯苯基)-3-(3，4-二氯苄氧基)-哌啶(实施例4)制备顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-哌啶-1-基]-丙-1-酮。质谱(ES)M+＝533。
实施例20树脂-结合的顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氟-苯基)-哌啶-3-醇 按照实施例1、5、6和7中所用的步骤由4-(4-氟苯基)-1，2，3，6-四氢吡啶盐酸盐(Acros)制备这种树脂-结合的化合物。
实施例21顺式-[外消旋]-4-苄氧基-3-(4-溴-苄氧基)-4-(4-氟-苯基)-哌啶 分子量＝470.38按照实施例8中所用的步骤由树脂-结合的顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氟-苯基)-哌啶-3-醇(实施例20)和4-溴苄基溴(Aldrich)制备顺式-[外消旋]-4-苄氧基-3-(4-溴-苄氧基)-4-(4-氟-苯基)-哌啶。质谱(ES)M+＝471。
实施例22顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氟-苯基)-3-戊氧基-哌啶 分子量＝371.49按照实施例8中所用的步骤由树脂-结合的顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氟-苯基)-哌啶-3-醇(实施例20)和1-碘戊烷(Aldrich)制备顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氟-苯基)-3-戊氧基-哌啶。质谱(ES)M+＝372。IC50＝56μM(实施例28中所述的试验中)。
实施例23顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-1-乙基-哌啶
分子量＝504.88将4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-哌啶(实施例4，0.01mmol)、聚合物-支持的BEMP(6.5mg，0.015mmol，负载能力2.3mmol/g，来自Fluka Inc.)、碘乙烷(Aldrich，0.015mmol)在四氢呋喃(1mL)中的混合物在室温下振摇过夜。过滤树脂并依次用CH2Cl2和MeOH洗涤。在真空中蒸发滤液而得到所需产物。质谱(ES)MH+＝506。IC50＝4.9μM(实施例28中所述的试验中)。
实施例24顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-1-丙基-哌啶 分子量＝518.91按照实施例23中所用的步骤由4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-哌啶(实施例4)和1-碘丙烷(Aldrich)制备顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-1-丙基-哌啶。质谱(ES)M+＝519。
实施例25顺式-[外消旋]-3-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，3，4-三氟-苄氧基)-哌啶-1-基]-丙-1，2-二醇 分子量＝535.99将4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，3，4-三氟-苄氧基)-哌啶(实施例8Ac，6mg，0.013mmol)、聚合物-支持的BEMP(10mg，0.023mmol，负载能力2.3mmol/g，来自Fluka Inc.)、烯丙基碘(Aldrich，3uL，0.003mmol)在四氢呋喃(1mL)中的混合物在室温下振摇2小时。过滤树脂并依次用CH2Cl2和MeOH洗涤。在真空中蒸发滤液。不需纯化将残余物溶于9∶1丙酮/水溶液(1mL)。向该溶液中加入四氧化锇(Aldrich，10uL，0.008mmol)和4-甲基吗啉N-氧化物(Aldrich，12mg，0.1mmol)。将该混合物搅拌过夜并加入Na2SO3。在搅拌2小时后，将该混合物通过硅胶垫过滤。在真空中蒸发滤液而得到所需产物。质谱(ES)M+＝536。
实施例26顺式-[外消旋]-3-[4-苄氧基-3-(4-溴-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-哌啶-1-基]-丙-1，2-二醇 分子量＝560.91按照实施例25中所用的步骤由4-苄氧基-3-(4-溴-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-哌啶(实施例8P)制备该化合物。质谱(ES)MH+＝562。IC50＝25.8μM(实施例28中所述的试验中)。
实施例27顺式-[外消旋]-3-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，3，4-三氟-苄氧基)-哌啶-1-基]-甲磺酰基 分子量＝540.00向在0℃下4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，3，4-三氟-苄氧基)-哌啶(实施例8Ac，4mg，0.008mmol)和三乙胺(6uL，0.08mmol)在二氯甲烷(0.5mL)中的溶液中滴加甲磺酰氯(Aldrich，2.5uL，0.015mmol)。在搅拌2小时后，将该混合物通过氨基硅胶垫(Silicycle)过滤。在真空中蒸发滤液而得到所需产物。质谱(ES)MH+＝541。
实施例28体外活性试验通过ELISA(酶联免疫吸附测定)测定本发明取代的哌啶化合物抑制p53与MDM2蛋白相互作用的能力，其中重组GST-标记的MDM2结合与p53的MDM2-相互作用区类似的肽(Bttger等，《分子生物学杂志》(J.Mol.Bio.)1997，269卷，744-756页)。通过与链霉抗生物素包被的孔结合的N-末端生物素使这种肽与96孔平板表面固定。将MDM2加入到有抗-MDM2小鼠单克隆抗体(SMP-14，Santa Cruz Biotech)存在下的各孔中。在除去未结合的MDM2蛋白后，通过添加过氧化物酶底物(MTB Microwell过氧化物酶底物系统，Kirkegaard & Perry Labs)经比色法测定过氧化物酶连接的二次抗体(抗-小鼠IgG，Roche Molecular Biochemicals)和肽结合的MDM2的量。
通过用链霉抗生物素(在PBS中5mg/ml)包被，随后进行PBS(磷酸缓冲盐水)洗涤并在4℃下用含有在PBS中的2mg/ml血清清蛋白(Sigma)和0.05％Tween 20(Sigma)的150μl封闭缓冲液封闭过夜来制备测试平板。将生物素化肽(1uM)加入到各孔内的50μl封闭缓冲液中并在1小时温育后充分洗涤。在单独的96孔平板中稀释测试化合物并按一式三份加入到含有MDM2蛋白质和抗-MDM2抗体的混合物的化合物温育平板中。20分钟温育后，将平板内含物转入测试平板并再温育1小时。将二次抗-小鼠IgG抗体加入到上述测试平板中且随后用0.05％在PBS中的Tween 20进行三次洗涤。最后将过氧化物酶底物加入到各孔中并使用平板读出器(MR7000，Dynatech)在450nm处读取吸收。将测试化合物的抑制活性测定为处理与未处理孔中结合MDM2之比的百分比并计算IC50。
上述实施例中制备的且由通式(I)或(II)表示的化合物的抑制活性(IC50)在3μM-100μM的范围。
尽管已经描述了本发明的许多实施方案，但是显然可以对所述的基本构成进行改变以提供其它实施方案，它们应用了本发明，但不脱离本发明的实质和范围。所有这类修改和改变均包括在如待批权利要求而非通过实施例描述的具体实施方案所定义的本发明范围内。
权利要求
1.通式(I)表示的化合物及其药学上可接受的盐 其中n为独立地选自1或2的整数；X为卤素；R1选自由氢，羰基，磺酰基，低级烷基和被羰基、磺酰基或羟基取代的低级烷基组成的组；R12选自由下列基团组成的组具有1至约5个碳原子的烷基或链烯基；和 其中R7-R11独立地选自由氢、卤素、-CN、-NO2、CF3、-OCH3、-COOCH3和-C6H5组成的组；R2-R6独立地选自由氢、卤素、低级烷基、-C(CH3)3、CF3、-OCH3、-NO2和-CN组成的组；且如果R12为具有1至约5个碳原子的烷基或链烯基，R2-R6为氢。
2.通式(II)表示的权利要求1的通式I的化合物及其药学上可接受的盐 其中n为独立地选自1或2的整数；X为卤素；R1选自由氢，羰基，磺酰基，低级烷基和被羰基、磺酰基或羟基取代的低级烷基组成的组；R2-R6独立地选自由氢、卤素、低级烷基、-C(CH3)3、CF3、-OCH3、-NO2和-CN组成的组；且R7-R11独立地选自由氢、卤素、-CN、-NO2、CF3、-OCH3、-COOCH3和-C6H5组成的组。
3.权利要求2的通式II的化合物，其中n为1。
4.权利要求2的通式II的化合物，其中X为氯。
5.权利要求2的通式II的化合物，其中X为对位取代基。
6.权利要求2的通式II的化合物，其中R1选自由氢、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-COCH3、-COCH2CH3、-CH2CHOHCH2OH和-SO2CH3组成的组。
7.权利要求2的通式II的化合物，其中R2和R6独立地选自由氢、氟、氯和溴组成的组。
8.权利要求2的通式II的化合物，其中R3和R5独立地选自由氢、氟、氯、溴、-CH3、-OCH3、-CN和-NO2组成的组。
9.权利要求2的通式II的化合物，其中R4选自由氢、氟、氯、溴、-C(CH3)3、-CH3、-CN和-CF3组成的组。
10.权利要求2的通式II的化合物，其中R7和R11独立地选自由氢、氟、氯、-CN、-NO2和-C6H5组成的组。
11.权利要求2的通式II的化合物，其中R8和R10独立地选自由氢、氟、氯、溴、-CN、-NO2-OCH3组成的组。
12.权利要求2的通式II的化合物，其中R9选自由氢、氟、氯、溴、-OCH3、-CN、-CF3和-COOCH3组成的组。
13.权利要求2的通式II的化合物，其中该化合物选自由下列各项组成的组顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，6-二氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-3-(联苯基-2-基甲氧基)-4-(4-氯-苯基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-哌啶-3-基氧基甲基]-苄腈；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3-硝基-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-3-(3-溴-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，4-二氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-3-(2-氯-4-氟-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-哌啶-3-基氧基甲基]-苯甲酸甲酯；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3，5-二氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-3-(3-氯-2-氟-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，5-二氯-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，3-二氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(4-三氟甲基-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(4-氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-3-(4-溴-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3-氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-2-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-哌啶-3-基氧基甲基]-苄腈；顺式-[外消旋]-3-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-哌啶-3-基氧基甲基]-苄腈；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(4，5-二甲氧基-2-硝基-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-3-丁-2-烯氧基-4-(4-氯-苯基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-戊-2-烯氧基-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，3，6-三氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-3-丁氧基-4-(4-氯-苯基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-3-(4-氯-2-氟-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-3-(4-溴-2-氟-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，4，6-三氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，4，5-三氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，3，4-三氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-3-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-4-(2，4，6-三氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-3-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-4-(2，5-二氯-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-3-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-4-(2，6-二氯-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-3-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-4-(2，6-二氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-3-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-4-(3-甲氧基-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-3-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-4-(2，3，6-三氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-3-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-4-(2-氟-苄氧基)-哌啶；和顺式-[外消旋]-3-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-4-(2-氟-3-甲基-苄氧基)-哌啶。
14.权利要求2的通式II的化合物，其中该化合物选自由下列化合物组成的组顺式-[外消旋]-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-4-(4-氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-(4-溴-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-4-(2，4-二氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-(2-氯-4-氟-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-(2-溴-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-(4-叔丁基-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧墨)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-[4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-哌啶-4-基氧基甲基]-苄腈；顺式-[外消旋]-4-(3-氯-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-(3-溴-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-4-(2-氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-4-(3，5-二氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-(3-氯-2-氟-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-4-(2，3-二氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-4-(4-三氟甲基-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-4-(3-氟-苄氧基)-哌啶；顺式-[外消旋]-3-[4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-哌啶-4-基氧基甲基]-苄腈；顺式-[外消旋]-4-(2-氯-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-哌啶；和顺式-[外消旋]-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-4-(4-甲基-苄氧基)-哌啶。
15.权利要求2的通式II的化合物，其中该化合物选自由下列化合物组成的组顺式-[外消旋]-4-(4-氯-苯基)-3，4-双-(2，4-二氟-苄氧基)-哌啶；和顺式-[外消旋]-4-(4-氯-苯基)-3，4-双-(3-硝基-苄氧基)-哌啶。
16.权利要求2的通式II的化合物，其中该化合物选自由下列化合物组成的组顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，4-二氟-苄氧基)-哌啶-1-基]-乙酮；顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-3-(3-溴-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-哌啶-1-基]-乙酮；顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-3-(2-氯-4-氟-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-哌啶-1-基]-乙酮；顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3，5-二氟-苄氧基)-哌啶-1-基]-乙酮；顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-3-(3-氯-2-氟-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-哌啶-1-基]-乙酮；顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-哌啶-1-基]-乙酮；顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(4-氟-苄氧基)-哌啶-1-基]-乙酮；顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-3-(4-溴-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-哌啶-1-基]-乙酮；顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3-氟-苄氧基)-哌啶-1-基]-乙酮；顺式-[外消旋]-3-[1-乙酰基-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-哌啶-3-基氧基甲基]-苄腈；顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，6-二氟-苄氧基)-哌啶-1-基]-乙酮；顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3-硝基-苄氧基)-哌啶-1-基]-乙酮；顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，3，4-三氟-苄氧基)-哌啶-1-基]-乙酮；顺式-[外消旋]-1-[4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-4-(2-氟-苄氧基)-哌啶-1-基]-乙酮；顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，3，4-三氟-苄氧基)-哌啶-1-基]-丙-1-酮；顺式-[外消旋]-1-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-哌啶-1-基]-丙-1-酮；和顺式-[外消旋]-4-苄氧基-3-(4-溴-苄氧基)-4-(4-氟-苯基)-哌啶。
17.权利要求2的通式II的化合物，其中该化合物选自由下列化合物组成的组顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-1-乙基-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(3，4-二氯-苄氧基)-1-丙基-哌啶；顺式-[外消旋]-3-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，3，4-三氟-苄氧基)-哌啶-1-基]-丙-1，2-二醇；顺式-[外消旋]-3-[4-苄氧基-3-(4-溴-苄氧基)-4-(4-氯-苯基)-哌啶-1-基]-丙-1，2-二醇；和顺式-[外消旋]-3-[4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(2，3，4-三氟-苄氧基)-哌啶-1-基]-磺酰基甲烷。
18.通式(III)表示的权利要求1的通式I的化合物及其药学上可接受的盐 其中n为1-2的整数；X为卤素；R1选自由氢，羰基，磺酰基，低级烷基和被羰基、磺酰基或羟基取代的低级烷基组成的组；且R12选自由具有1至约5个碳原子的烷基和链烯基组成的组。
19.权利要求18的通式III的化合物，其中n为1。
20.权利要求18的通式III的化合物，其中X为氯。
21.权利要求18的通式III的化合物，其中X为对位取代基。
22.权利要求18的通式III的化合物，其中R1选自由氢、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-COCH3、-COCH2CH3、-CH2CHOHCH2OH和-SO2CH3组成的组。
23.权利要求18的通式III的化合物，其中R12选自由-(CH2)3CH3、-(CH2)4CH3、-CH2CH＝CHCH3和-CH2CH＝CH-CH2CH3组成的组。
24.权利要求18的通式III的化合物，其中该化合物选自由下列化合物组成的组顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氟-苯基)-3-丁氧基-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氟-苯基)-3-戊氧基-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氟-苯基)-3-(丁-2-烯)基氧基-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氟-苯基)-3-(戊-2-烯基)氧基-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-丁氧基-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-戊氧基-哌啶；顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(丁-2-烯)基氧基-哌啶；和顺式-[外消旋]-4-苄氧基-4-(4-氯-苯基)-3-(戊-2-烯基)氧基-哌啶。
25.药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1的通式I的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
26.权利要求25所述的药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求2的通式II的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
27.权利要求25所述的药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求18的通式III的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
28.权利要求25所述的药物组合物，其中所述的化合物适合于对患有癌症的患者给药。
29.权利要求1-24中任意一项的化合物，其用作药物。
30.一种制备权利要求1的通式I化合物的方法，该方法包括a)使通式IV的化合物与合适的连接基偶联至固相上，其中通式IV化合物的结构式如下 其中R2-R6、X和n如权利要求1中所定义，从而得到通式V的化合物 其中 表示固相；b)使用叔丁醇钾产生阴离子并使用通式R12X的烷基卤使通式V的化合物烷基化而得到通式VI的化合物 其中R12如权利要求1中所定义；c)从连接基上裂解产物而得到通式Ia的化合物 其中R1为H；且如果需要d)使通式Ia的化合物与酰基卤、烷基卤或磺酰氯反应而得到通式I的化合物，其中R1为羰基，磺酰基，低级烷基或被羰基、磺酰基或羟基取代的低级烷基。
31.通过权利要求30的方法制备的权利要求1-24中任意一项的通式I的化合物。
32.权利要求1-24中任意一项的通式I的化合物在制备用于治疗和控制癌症的药物中的应用。
33.权利要求32所述的应用，用于治疗和控制乳腺癌或结肠癌。
34.如上文所述的新化合物、药物组合物、方法和应用。
全文摘要
本发明提供了具有通式(II)或通式(III)的化合物及其药学上可接受的盐，其中X、n和R
文档编号C07D211/52GK1758909SQ200480006687
公开日2006年4月12日 申请日期2004年3月8日 优先权日2003年3月13日
发明者金庆镇, 埃米莉·爱军·刘, S·G·米施克 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司