专利名称：新的人kunitz型抑制剂和其相关方法
血液凝固是一由各种血液成分或因子的复杂相互作用组成的过程，其最终产生血纤维蛋白凝块。一般说来，参与称为凝血“级联”的血液成分是酶原，即在激活剂作用下转化成蛋白水解酶和无酶促活性的蛋白质，所说的激活剂本身则是活化的凝血因子。已受到这种转化的凝血因子一般称为“活性因子”，并可在其符号后下方加“a”表示之(如因子VIIa)。
两系统促进血液凝固并因而参与正常止血。这些系统已被称为“内在性”和“外在性”凝血途径。现在认为，内在性途径在血纤维蛋白形成的生长和维持中起作用，“外在性”途径是一个对于血纤维蛋白形成的起始起重要作用的交迭机制。这些途径旨在将因子X活化成Xa，并通过一共同途径导致血纤维蛋白生成。在血管损伤后，组织因子以一种钙依赖性方式与因子VII复合而启动“外在性”凝血途径，以有利于因子VII转化成VIIa。因子VIIa-组织因子复合物可直接将因子X活化成Xa。可通过凝血酶或因子XIIa的产生激活内在性途径，其中因子XIIa裂解因子XI以产生因子XIa，即启动“内在性”凝血级联所需的酶。
通过“外在性”途径生成血纤维蛋白的过程因组织因子途径抑制蛋白(TFPI)的存在而受到控制，后者因子Xa依赖性方式调节该途径。据信多价Kunitz型抑制剂TFPI通过与因子Xa、组织因子和因子VIIa形成四元复合物，进而抑制游离因子Xa和因子VIIa的生成来调节外在性途径(Broze et al.，Biochemistry 297539-7546，1990；该文献全文列入本文作为参考文献)。
在某些情况下，例如肾透析、深静脉血栓形成及弥散性血管内凝血(DIC)情况下，有必要使用肝素、香豆素、香豆素衍生物、2，3-二氢-1，3-茚二酮衍生物等抗凝剂阻断凝血级联。例如可在透析治疗中进行肝素处理或用柠檬酸盐离子进行体外处理(美国专利4,500,309)以防止治疗过程中发生凝血。对进行外科手术的病人也使用肝素防心深部静脉血栓形成。但既使使用低剂量的肝素也可引起严重出血。另外，因为肝素半寿期仅大约80分钟，所以可迅速从血液中清除。由于肝素是作为抗凝血酶III(ATIII)的辅助因子起作用的，并且在DIC治疗中抗凝血酶III被迅速耗尽，所以常常难以维持为连续监测ATIII和肝素水平所必需的适当肝素剂量。如果ATIII极端耗竭，肝素也是无效的。此外，长期使用可增加血小板聚集，降低血小板计数，并卷入骨质疏松的发展过程。2，3-二氢-1，3-茚二酮衍生物还可能具有毒付作用。
除了上文简述的抗凝剂外，本领域内还公开了各种据说有抗凝剂活性的组合物。Rutelingsperger等人(Eur.J.biochem.1S1625-629，1985)公开了一种这样的组合物，即他们从人脐带动脉中分离的一种32,000道尔顿多肽。Warn-Cramer等人(Circulation suppl.，Part 2，742-408 ii，Abstract#1630，1986)公开了第一种组合物。他们从血浆中检测到一种表观分子量34，500道尔顿的因子VIIa抑制剂。
根据蛋白质抑制剂家族成员的广泛序列同源性和链内二硫桥键的保守性而将其分为一系列家族(参见Laskowski and Kato，Ann.Rev.Biochem.49593-626，1980)。Kunitz家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂的特征是它们与抑蛋白酶肽(牛胰蛋白酶抑制剂)同源。已知抑蛋白酶肽抑制包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、纤溶酶和激肽释放酶在内的多种丝氨酸蛋白酶。已报导了较大蛋白质如内-2-胰蛋白酶抑制剂(Huchstrasser et al.，Hoppe-Seylers ZPhysiol.Chem.3571659-1661，1969和Tschersche et al.，Eur.J.Biochem.16187-198，1970)、β-淀粉样蛋白前体及α3-胶原蛋白VI型(Chu et al.，EMBO J.9385-393，1990)中的Kunitz型抑制剂区域。TFPI(也称为外在性途径抑制剂(EPI)或脂蛋白相关凝血抑制剂(LACI))是由三个串联的Kunitz型抑制剂组成的侧翼有带负电荷氨基末端和带正电荷羧基末端的血浆蛋白酶抑制剂。已显示第一和第二个Kunitz型区域分别抑制因子VIIa和因子Xa活性。
本领域仍要求具有抗凝血剂活性的，并且不产生与传统抗凝组合物相关联之不良付作用的改良组合物。本发明满足了这一需要，并进一步提供了其他相关优点。
因此本发明的目的是提供与用作抗凝剂的并用于治疗深静脉血栓形成和DIC的抑制剂有相似特征的，Kunitz家族的新的人蛋白酶抑制剂。
简单地说，本发明提供包含编码Kunitz型抑制剂之DNA序列的DNA分子，其中该DNA片段含有SEQ ID NO1 4中核苷酸1至165的序列，其中各核苷酸三联体1-3、4-6、160-162和163-165分别编码除半胱氨酸外的任何氨基酸。在本发明的一个方面，Kunitz型抑制剂包含SEQ ID NO1中核苷酸138至305的核苷酸序列。在本发明的另一个方面，Kunitz型抑制剂包含SEQ ID NO1中核苷酸39至743的核苷酸序列。再一个方面，Kunitz型抑制剂包含SEQ ID NO1中核苷酸138至493的核苷酸序列。本发明的另一个方面，Kunitz型抑制剂包含SEQ ID NO1中核苷酸138至671的核苷酸序列。
在本发明的一个方面，DNA片段编码包括SEQ ID NO15所示之氨基酸序列的Kunitz型抑制剂，所说的序列中各Xaa分别是除半胱氨酸外的氨基酸。在本发明的一个方面，DNA片段编号包含SEQ ID NO2中所示从氨基酸编号34即谷氨酸到氨基酸编号89即异亮氨酸之氨基酸序列的Kunitz型抑制剂。在本发明的另一个方面，DNA片段编号包含SEQ ID NO2中从氨酸1的Met到氨基酸235的Phe之氨基酸序列的Kunitz型抑制剂。在本发明的另一个方面，DNA序列编号包含SEQ ID NO2中从氨基酸编号34的谷氨酸到氨基酸编号152的赖氨酸之氨基酸序列的Kunitz型抑制剂。在本发明另一个方面，DNA序列编号包含从SEQ ID NO2中氨基酸编号34的谷氨酸到氨基酸编号211的丙氨酸之氨基酸序列的Kunitz型抑制剂。
本发明还提供包含编码人Kunitz型抑制剂之第一DNA片段的DNA构建体，其中所说的第一DNA片段可操作地连接到为表达第一DNA片段所必需的附加DNA片段上，并提供含有这样的DNA构建体的宿主细胞，以及生产人Kunitz型抑制剂的方法，该方法包括培养宿主细胞及分离所说的Kunitz型抑制剂的步骤。
在本发明的另一个方面，提供了分离的Kunitz型抑制剂。在另一个实施方案中，分离的人Kunitz型抑制剂包含SEQ ID NO15的氨基酸序列，其中各Xaa分别是除半胱氨酸外的任何氨基酸。在本发明的一个方面，Kunitz型抑制剂包含SEQ ID NO2中从氨基酸编号1之Met到氨基酸编号235之Phe的氨基酸序列；SEQ ID NO2中从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号89之异亮氨酸的氨基酸序列；SEQ ID NO2中从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号152之赖氨酸的氨基酸序列或SEQ ID NO2中从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号211之丙氨酸的氨基酸序列。在本发明的另一个方面，Kunitz型抑制剂进一步在其氨基末端包含SEQ ID NO12或SEQ ID NO13的氨基酸序列。
在本发明的另一个方面，提供了分离的与人Kunitz型抑制剂特异结合的抗体。在一个实施方案中，该抗体是单克隆抗体。
在本发明的另一个方面，提供了包括SEQ ID NO15之氨基酸序列的药物组合物，所说的序列中各Xaa分别是除半胱氨酸外的任何氨基酸。在本发明的一个方面中，药物组合物包含人Kunitz型抑制剂，所说的抑制剂含有SEQ ID NO2中从氨基酸编号1之Met到氨基酸编号235之Phe的氨基酸序列；SEQ IDNO2中从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号89之异亮氨酸的氨基酸序列；SEQ ID NO2中从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号152之赖氨酸的氨基酸序列或SEQ ID NO2中从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号211之丙氨酸的氨基酸序列。
在本发明的另一个方面，公开了抑制哺乳动物血液凝集的方法，该方法包括以足以抑制血液凝固的量，投用包括SEQ ID NO15之氨基酸序列的人Kunitz抑制剂，所说的序列中各Xaa分别是除半胱氨酸外的任何氨基酸。在本发明的另一个方面，公开了抑制哺乳动物血液凝固的方法，该方法包括以足以抑制血液凝固的量投用其中包含SEQ ID NO2中从氨基酸编号1之蛋氨酸到氨基酸编号235之苯丙氨酸的氨基酸序列、SEQ ID NO2中从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号89之异亮氨酸的氨基酸序列、SEQ ID NO2中从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号152之赖氨酸的氨基酸序列或SEQ ID NO2中从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号211之丙氨酸的氨基酸序列的Kunitz型抑制剂。在本发明另一个方面，提供了抑哺乳动物血液凝固的方法，该方法包括以足以抑制血液凝固的量投用其中进一步在其氨基末端包括SEQ ID NO12或SEQ ID NO13之氨基酸序列的Kunitz型抑制剂。
在本发明的另一个方面。提供了至少有12个核苷酸的探针，其中探针能够与编码Kunitz型抑制剂区域的核酸或编码与SEQID NO1或其变体互补之DNA序列的DNA片段杂交，其中所说的核酸包括SEQ ID NO1的核苷酸序列、SEQ ID NO1的核苷酸变体。
参见下列详述描述后将会更加明显地了解本发明的这些及其他方面。
本发明提供了新的人Kunitz型抑制剂。本发明抑制剂的一个优点是它们在没有因子Xa的情况下抑制因子VIIa，因此不需要通过内在或外在性途径产生因子Xa更具体地说，本发明提供了新的、以前不知道的Kunitz型抑制剂，该抑制剂与组织因子途径抑制剂(TFPI)共享氨基酸序列同源性及所有区域组织。已将此新的Kunitz型抑制剂定名的TFPI-2。
本发明的特征包括分离的编码新的人Kunitz型抑制剂的DNA分子。这些分离的分子是从其天然环境中分离的分子并包括cDNA和基因组克隆。所提出的本发明的分离的DNA分子没有天然与之联系的其他基因并可包含代表调节区域如启动子和终止子的天然存在的5’和3’非翻译序列。有关天然存在之5’和3’非翻译区内调节区域的鉴定是本领域普通技术人员显而易见的(如参见Dynan and Tiian，Nature 316774-778，1985；Birnstiel et al.，Cell 41349-359，1985；Proudfoot，Trends in biochem.Sci.14105-110，1989；和Sambrook et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，second Ed.，Cold Spring Harbor，NY，1989；这些文献均列入本文作为参考文献)。
本发明的分离的DNA分子可用于生产重组人Kunitz型抑制剂。因此，本发明提供了可以大量生产并可很容易地用本领域已知方法纯化人Kunitz型抑制剂的优点(参见Scopes，ProteinPurification，springer-Verlag，NY，1982)。另外，也可以使用常规合成方法如Barany和Merrifield(The Peptides.Analysis，Synthesis，Biology，Vol.2，Gross and Meienhofer，eds，AcadernicPress，NY，PP.1-284，1980)所述固相合成法、部分固相合成技术、片段综合法或传统溶液加入法合成本发明的蛋白质。
因此，本发明另一特征是分离的人Kunitz型抑制剂。本发明的分离的蛋白质和肽是与一种特别适于作药物使用的蛋白质制剂至少有大约50％同源性，更好有70-80％同源性，最好有95-99％同源性的蛋白质。
可以基本上按照Norris等人(Biol.Chem.，Hoppe-Seyler37137-42，1990)所述的方法检测Kunitz型抑制剂活性。简单地说，在100mM NaCl、50mM Tris-HCl、0.01％Tween 80(聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯)(PH 7.4)中，于0.24μg/ml猎胰蛋白酶(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Penmark)、12.8CU/L人血浆(Kabi，Stockholm，sweden)或0.16nKat/ml人血浆激肽释放酶(Kabi)存在下，25℃保温各种固定浓度的Kunitz型抑制剂。30分钟保温后，经裂解含有溶于检测缓冲液中之0.6mM产色肽酰硝基酰苯胺胰蛋白酶/纤溶酶底物S2251(D-Val-Leu-Lys-Nan；Kabi)或S2302(D-Pro-Phe-Arg-Nan；Kabi)的溶液，以检测残留品酶促活性，之后将样品保温30分钟，于405nm处检测各样品的吸光率。根据405nm吸光率或460nm荧光Em的降低检测酶活性的抑制率。根据检测结果计算表观抑制常数Ki。
可按已公开的治疗深静脉血栓形成、弥散性血管内凝血、肺栓塞及预防手术后血栓形成的方法使用本发明的Kunitz型抑制剂。
本发明涉及新的人Kunitz型抑制剂，其包含由包括SEQ IDNO14、SEQ ID NO1的核苷酸序列或其部分编码的SEQ IDNO15、SEQ ID NO2中所示的氨基酸序或其部分。将SEQID NO2所示TFPI-2的氨基酸序列与其他Kunitz型抑制剂特别是与TFPI相比较，显示该蛋白质包含三个推测的Kunitz型抑制剂区域。本领域技术人员可知道，用于每个各别区域或区域组合均可用化学方法或本发明中使用的重组DNA技术制得。推测的Kunitz型抑制剂区域包括SEQ ID NO2所示从氨基酸编号36之半胱氨酸到氨基酸编号86之半胱氨酸、从氨基酸编号96之半胱氨酸到氨基酸编号149之半胱氨酸，和从氨基酸编号158之半胱氨酸到氨基酸编号208之半胱氨酸的氨基酸序列。更具体地说，本发明的Kunitz型抑制剂包括SEQ ID NO2中从氨基酸编号36之半胱氨酸到氨基酸编号86之半胱氨酸的氨基酸序列。Kunitz区域是由据信形成二硫桥键的六个有特定位置之半胱氨酸酸基的定位限定的(参见Laskowski and Kato，出处同上；Brozeet al.，Biochemistry 297539-7546，1990)。第一和第六个半胱氨酸残基限定各Kunitz区域的边界。因此就TFPI-2来说，Kunitz区域是由残基36和89、96和149、158和208为边界的(按照SEQ ID NO2的氨基酸编号)。为了提供适当的二硫键形成和蛋白质构象，期望在限定Kunitz区域之各半胱氨酸侧冀包括至少两个氨基酸。然而，这些侧翼残基的同一性并不是严格的。因此有可能制备包括上述“核心”Kunitz序列之个别Kunitz区域的变体，其中在其氨基或羧基末端上间隔除半胱氨酸残基外的2-4个或多个氨基酸残基而侧接多肽核心。此外，如本领域技术人员可以看出的，可以使用化学合成或重组DNA技术制备Kunitz型抑制剂的氨基末端和/或羧基末端延伸部分并试验抑制活性。
在使用与抑制剂编织序列的一部分互补的反义寡核苷酸探针筛选相当于相关但不同的Kunitz型抑制剂之基因组克隆的cDNA期间，意外地鉴定了编码本发明蛋白质的DNA序列。分析cDNA克隆后揭示，这些克隆编码称为TFPI-2的独特的，以前未知的Kunitz型抑制剂。本发明的蛋白质可由实质上相似于本文公开之DNA序列的DNA序列编码。本文中所说的“实质上相似的”DNA序列包括含有保守氨基酸取代和/或小的氨基酸加入、取代或缺失的，TFPI-2的等位基因变体及基因工程改造的或合成的变体。DNA序列变体也包括DNA密码的简并，其中宿主偏爱密码子取代了人序列中的类似密码子。另外，基本上相似的DNA序列是能够在高或低严格条件下(参见Sambrook et al.，31文同上)与本发明的DNA序列杂交的序列，以及例如由于遗传密码的结果而与本发明的氨基酸序列简并的序列。可以使用寡核苷酸定点特异性诱变、使用限制性核酸内切酶消化及接头连接，或使用文献中已确定的其他方法(例如参见Sambrook et al.，出处同上；Smith et al.，Genetic EngineeringPrinciples and methods，Plenum Press，1981；其列入本文作为参考文献)制得基因工程改造的变体。
可使用例如Maniatis等人(Molecular Cloning A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor，NY，1982；列为本文参考文献)、Sambrook等人(Molecular cloningA Laboratory Manual，Second Ed.，Cold Spring Harbor，NY，1989；列为本文参考文献)或Mullis等人(美国专利No.4,683,195；列为本文参考文献)所述的标准克隆方法分离本发明的DNA分子。或者，可以使用本领域已知的标准技术例如在自动DNA合成仪上合成本发明的编码序列。如将在下文中更详细讨论的，一种新的，以前未知的人Kunitz型抑制剂被鉴定为1.0 Kb cDNA插入段并包含SEQ ID NO1所示的DNA片段。在本发明的一个实施方案中，使用根据SEQ IDNO1或其互补序列设计的引物，以PCR扩增法制得编码本发明Kunitz型抑制剂的DNA序列。
也可以使用本文所述的DNA序列和方法，筛选胎盘、肝或脐带静脉细胞cDNA或基因组文库，从非人动物如狗、兔、鸡、猪，小鼠、大鼠和牛得到编码TFPI-2的DNA分子。
例如，可以使用本发明的DNA分子或其部分作为探针，以直接检测细胞中的TFPI-2序列。这样的DNA分子一般是合成寡核苷酸，但可从克隆的cDNA或基因组序列产生，并且一般将至少包含12个核苷酸，更常见包括大约14到25个或更多个，有时是40到60个核苷酸，在某些情况下包括一个实质性部分，甚或是整个TFPI-2基因或cDNA。本发明的合成寡核苷酸与相应TFPI-2DNA序列(SEQ ID NO1)或其互补序列至少有85％同一性。为了用作探针，标记这些分子以提供可检测信号，例如按本领域已知方法用酶、生物素、放射性核素、荧光染料、化学发光剂、顺磁颗粒等标记所说的分子。
可使用本发明的探针，以诊断方法检测细胞代谢紊乱如血栓形成紊乱。
可以标记本发明中使用的DNA分子并用于与Southern或点印迹相似的杂交程序中。如本领域技术人员将会理解到的。可以使用本领域已知的并且例如由Sambrook等人(MolecularCloningA Laboratory Manual，2th Ed.，Cold Spring Harbor，NY，1989；其被列入本文作为参考文献)综述的方法，确定本发明的DNA分子与TFPI-2序列杂交的条件。本领域技术人员可以用文献中公开的方法(例如参见Sambrook et al.，出处同上，pp.11.45-11.53)改变DNA分子的杂交条件(即杂交的严格性)以适用于各种杂交程序。杂交的严格性较高，检测出的错配序列的数目越少。另外，较低的严格性可充许鉴定相关序列。
或者，可以使用本发明的DNA分子鉴定TFPI-2蛋白质序列变体，并且使用经聚合酶链反应(PCR)(由Saiki et al.，Science239487，1987；Mullis et al.，U.S.Paten 4,686,195；和Mullis et al.，U.S.Patent 4,683,202公开的)扩增DNA序列，然后根据其在琼脂糖凝胶上的特征性大小检测之，或者进行序列分析的检测序列异常性。
可以将本发明的编码Kunitz型抑制剂的DNA分子插入到DNA构建体中。本文中使用的术语“DNA构建体”(也称为表态载体)是指单链或双链的DNA分子或这种分子的克隆，其已通过人类干预受到修饰而含有的一种另外存在于自然界中的方式组合的拼接的DNA片段。本发明的DNA构建体包含编码Kunitz型抑制剂的第一DNA片段，该片段则可通过人工操作连接到为表达该第一DNA片段所需要的附加DNA片段上。在本发明的内容中，附加DNA片段一般将包括启动子和转录终止子，并可进一步包括增强子和其他元件。还可包括一个或多个可选择标记。可以用很容易得到的组分或者可从商业途径购得商品制备在各种原核和真核宿主细胞中表达已克隆之DNA片段所需的DNA构建体。
在一个实施方案中，该DNA序列编码包括SEQ ID NO15中所示氨基酸序列的Kunitz型抑制剂，所说的序列中各Xaa分别是除半胱氨酸外的任何氨基酸。在另一个实施方案中，该DNA序列编码包括SEQ ID NO2中从氨基酸编号1之蛋氨酸到氨基酸编码235之苯丙氨酸的氨基酸序列的Kunitz型抑制剂。在另一个实施方案中，第一DNA序列编码包括从SEQ ID NO2中氨基酸编码34之谷氨酸到氨基酸编号89之异亮氨酸的氨基酸序列的Kunitz型抑制剂。在另一个实施方案中Kunitz型抑制剂包括SEQID NO2中从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号152之赖氨酸的氨基酸序列。在本发明的另一个实施方案中，Kunitz型抑制剂包括SEQ ID NO2中从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号211之丙氨酸的氨基酸序列。
DNA构建体也可含有指导感兴趣多肽或蛋白质的分泌所必需的DNA片段。这样的DNA片段可包括至少一个分泌信号序列。也称为前导序列、早前序列和/或前序列的分泌信号序列是起指导成熟多肽或蛋白质从细胞中分泌作用的氨基酸序列。这样的序列是以一个疏水氨基酸核心为特征是，并通常(但不是绝对地)见于所合成之蛋白质的氨基末端。在分泌期间分泌肽常常从成熟蛋白质上被裂解掉。这种分泌肽含有当其通过分泌途径时充许从成熟蛋白质上裂解分泌肽的加工位点。一个优选的加工位点是例如由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)KEX2基因识别的二碱基裂解位点。一个特别优选的加工位点是Lys-Arg加工位点。加工位点可能编码在分泌肽内或者可以例如经体外诱变加到该肽上。
优选的分泌信号包括α因子信号序列(早前序列Kurjan andHerskowitz，Cell 30933-943，1982；Kurjan et al.，U.S.Patent No.4,546,082；Brake，EP 116，201)、PH05信号序列(Beck et al.，WO 86/00637)、BARI分泌信号序列(Mackay et al.，U.S.PatentNo.4,613,572；Mackay，wo 87/002670)SUC2信号序列(Carlsonet al.，Molecular and cellular biology 3439-447，1983)，α-1-抗胰蛋白酶信号序列(Kurachi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 786826-6830，1981)、α-2血浆抑制剂信号序列(Tone etal.，J.Biochem.(Tokyo)1021033-1042，1987)，和组织血纤维蛋白溶酶原激活剂信号序列(Pennica et al.，Nature 301214-221，1983)。或者，可以按照已确定的例如由von Heinje确定的规则(European Journal of Biochemistry 13317-21，1983；J.ofMolecular Biology 18499-105，1985；Nucleic Acids Research 144683-4690，1986)合成分泌信号。一个特别优选的信号序列是WO90/10075(该文献全文列入本文作为参考文献)中所述的合成信号Lac ZR spx(1-47)-ERLE。
可以单一地或组合使用分泌信号序列。例如，可将第一分泌信号序列与编码第三屏障区域的序列组合使用(参见U.S.PatentNo.5,037,243，该文献列入本文作为参考)。第三屏障区域可定位在感兴趣DAN片段的适当阅读框架3’端或该DNA片段的5’端，并在有分泌信号序列和感兴趣DNA片段的适当阅读框架中。
适当启动子、终止子和分泌信号的选择是本领域普通技术人员已知的。在酿酒酵母中表达已克隆基因的方法总地说来是本领域已知的(参见“Gene Expression TechNology”，Methods inEnzymology，vol.185，Goeddel(ed.)，academic Press，San Diego，CA 1990和“Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology”，Methods in Enzymology Guthrie and Fink(eds.)，Academic Press，San Diego，CA，1991；这些文献均列入本文作为参考文献)。也可以在丝状真菌例如曲霉质真菌的菌株(Mcknight et al.，V.S.Patent No.4,935,349，该文献列入本文作为参考文献)中表达本发明的蛋白质。例如Sambrook等人(Molecular CleningALaboratory Mamcal，2th Eds.Cold spring Harbor，NY，1989)详细讨论了在培养的哺乳动物细胞中和大肠杆菌中表达已克隆基因的方法。本领域技术人员可以理解到，可使用文献中确认为调节序列、载体和方法，在其他宿主细胞和鸟、昆虫和植物细胞中表达本发明的蛋白质。
在酵母中，用于本发明的适当酵母载体包括YRp 7(struhl etal.，proc.Natl.Acad.Sci.USA 761035-1039，1978)、YEp 13(Broach et al.，Gene 8121-133，1979)、POT载体(Kawasakiet al.，U.S.Patent No.4,931,373，该文献列入本文参考文献)、pJDB 249和pJDB 219(Beggs，Nature 275104-108；1978)及其衍生物。用于酵母中的优选启动子包括得自酵母糖酵解基因(Hitzeman et al.，J.Biol.Chem.25512073-80，1980；Alber andKawasaki，J.Mol.Appl.Genet.1419-434，1982；Kawasaki，U.S.Patent No.4,599,311)或醇脱氢酶基因(Young et al.，GeneticEngineering of Midroorganisms for Chemicals，Mollaender et al.，(eds)，pp.355，Plenum，N.Y.1982；Ammerer，Meth.Enzymol.101192-201，1983)的启动子。其中特别优选的启动子是TPI1启动子(Kawasaki，U.S.Patent No.4,599,311,1986)和ADH2-4c启动子(Russell et al.，Nature 304652-654，1983；Irani andKilgore，U.S.Patent Application Serial No.07/784,683、CA1,304,020和EP 284 044)。表达单位也可包括转录终止子。一个优选的转录终止子是TPI1终止子(Alber and kawasaki，引文同上)。
然后培养含有本发明DNA构建体的宿主细胞以产生Kunitz型抑制剂。按照标准方法在含有特定宿主细胞生长所需营养素的培养基中培养细胞。多种适当培养基都本领域中已知的并且一般都含有碳源、氮源、必需氨基酸、维生素、矿物质及生长因子。生长培养基一般是例如借助药物选择或基于必需营养素的缺陷来选择含DNA构建体的细胞，其中所说的缺陷则由DNA构建体上的可选择标志或用DNA构建体共转染得以补偿。
例如，较好将酵母细胞培养在含有非氨基酸氮源、无机盐、维生素及必需氨基酸添加物的化学上限定的培养基中。培养基的pH较好保持在大于2和小于8的pH范围内，更好是pH6.5。保持适当PH的方法包括缓冲的恒定PH控制，较好是通过加入氢氧化钠。优选缓冲剂包括琥珀酸和Bis-Tris(Sigma Chemical co.，St.Louis，MO)。较好将天冬酰胺连接的糖基化所需基因有缺陷的酵母细胞培养在含有渗透稳定剂的培养基中。优选的渗透稳定剂是以0.1M至1.5M，较好0.5M到1.0M的浓度添加到培养基中的山梨醇。哺乳动物细胞一般是培养在商业上可购得的含血清或无血清培养基中。对用于培养特定宿主细胞之培养基的选择是本领域普通技术人员已知的。
在本发明的一个实施方案中，本发明的蛋白质是在哺乳动物细胞中表达的。将外源DNA导入哺乳动物宿主细胞中的方法包括磷酸钙介导的转染法(Wigler et al.，Ceu 14725，1978；Corsaroand Pearsou，somatic Cell Genetics 7603，1981Graham and Vander Eb，Virology 52456，1973)、电穿孔法(Neumann et al.，EMBO J.1841-845，1982)及DEAE-葡聚糖介导的转染法(Ausubel et al.，eds.Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，NY，1987)(上述文献均列入本文参考文献)。也可以按照制造商提供的说明书，使用包括BoehringerMannheim转染试剂(N-〔1-(2，3-二油酰氧基)丙基〕-N，N，N-三甲基甲基硫酸铵、Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)或LIPOFECT试剂(N-〔1-(2，3-二油酰氧基)丙基〕-N，N，N-三甲基氨化铵和二甲酰氧基磷酯酰乙胺；GIBCO-BRL，Gaithersburg，MD)在内的商品试剂进行阴离子脂质转染。例如，美国专利No.4,713,339 Kevinso等人、美国专利No 4,784,950 Hagen等人、美国专利No 4,579,821(Palmiter等人)和美国专利No.4,656,134(Ringold)中公开了在培养的哺乳动物细胞内生产重组蛋白质的方法。优选的培养的哺乳动物细胞包括COS-1(ATCC No.CRL 1650)、COS-F(ATCC No.CRL 1651)、BHK(ATCC No.CRL 1632)、BHK 570(ATCC No.CRL 10314)和293(ATCC No.CRL1573；Graham et al.，J.Gen.Virol.3659-72，1977)细胞系。其他适用细胞系是本领域已知的并可从美国典型培养物保藏中心(American Type culture collection，Rockville，Maryland)等公共保藏机构得到之。
用常规方法分离和纯化按本文所述方法表述的重组Kunitz型抑制剂，这些方法包括经离心和过滤从培养基中分离细胞，借助盐如硫酸铵沉淀上清液或滤液中的蛋白质成分、以各种层析方法如离子交换层析或亲和层析等进行纯化。蛋白质纯化方法是本领域中已知的(总地参见Swpes，R.，Rrotein Purification，springer-Verlag，NY(1982)，该文献列为本文参考文献)并可用于纯化本发明的重组蛋白质。
本发明的Kunitz型抑制剂可以利用抑制剂的能力与胰蛋白酶结合。简单地说，加入固体Tris-HCL至终浓度50mM并用4同NaOH滴定，将总共约1升发酵上清液调到pH 8.0。过滤后除去细胞碎片，将上清液加样到吸附于CNBr活化之Sepharose上之牛胰蛋白酶柱上(每35ml凝胶350mg牛胰蛋白酶)。相继用150ml0.1M Tris-HCl(pH 8.0)、0.5 M NaCl、150ml 0.01MTris-HCL(pH 8.0)洗柱，然后用200ml 0.2M甘氨盐-HCL(pH 3.0)洗脱结合的材料。以10ml一管收集洗脱物并用反相HPLC分析之。合并含蛋白质的部分。
将合并加样于已用5％B(溶于乙腈的7％TFA)和95％A(加于水中的0.1％TFA)平衡过的制备性反相HPLC柱上。流速保持在4ml/分钟。上样后，用5％B洗柱直至达到214nm吸光率基线。在80分钟内用5-85％B进行梯度洗脱并收集洗脱物。用反相HPLC(Vydac)柱分析含UV吸收材料的各管，合并得到层析纯材料。真空离心从合并的部分中除去溶剂。经反相HPLC分析并与抑蛋白酶肽标准品比较。以估计主合并洗脱物中抑制剂的浓度和总产率。用电子喷射质谱法(SCIEX API III)等方法定性终制剂。
当存在蛋白水解裂解Kunitz型抑制剂的潜在问题时，也可使用基本如Norris等人(Biol.Chem.Hoppe-Seyler 37137-42，1992，该文献全文列为本文参考文献)所述的方法纯化本发明的抑制剂。简单地说，使选择的转化株于30℃在10升YEPD中生长约40小时，直至OD 600达到大约25。离心培养物，并弃去上清。上300-1000ml等份的上清液调到pH 2.3，并加样于装有已用20mM Bicine，pH 8.7(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)平衡过的珠状琼脂糖基质如-Sepharaose(Pharmacia-LKBBiotechNology AS，Alleroed，Denmark)等的层析柱上。用20mMBicine(pH 8.7)彻底洗涤后，用30ml含有1M NaCl的20mM Bicine(pH 8.7)洗脱Kunitz型抑制剂。将洗脱的材料加于已用20mMNH4HCO3，pH 7.8平衡过的Sephadex G-25柱(小珠状葡聚糖基质，Pharmacia-LKB BiotechNology AS，Alleroed，Denmark；2.5×30cm)或其他脱盐层析柱上进行脱盐。用20mM NH4HCO3(pH 7.8)洗脱Kunitz型抑制剂。
在含有偶联于小珠状亲水树脂上之有带电荷磺酸基团的阳离子交换剂的柱上，如已用20mM Bicine(pH 8.7)平衡过的MONO S柱(Pharmacia-LKB BiotechNology AS，Alleroed，Denmark；0.5×5cm)上，进一步层析纯化和浓缩Kunitz型抑制剂。用平衡缓冲液以2ml/分钟的流速洗10分钟后，用加在平衡缓冲液中的0-0.6M NaCl，在12分钟时间以1ml/分钟流速梯度洗脱Kunitz型抑制剂。合并峰值部分的样品，并在例如Vydac 214 TP 510柱(Mikro-lab，Aarhus，Denmark；1.0×25cm)上使用反相HPLC纯化Kunitz型抑制剂，其中用从5％A(溶于水的0.1％三氟乙酸(TFA))到45％B(加在乙腈中的0.7％TFA)的梯度在20分钟内以4ml/分钟流速进行洗脱。在水中冻干纯化的产物，并检测抑制剂活性。
或者，可使用肝素-琼脂糖、带有交联到珠状亲水树脂如NONO Q(Pharmacia)等上的季胺基团的阴离子交换剂、有与珠状亲水树脂如NONO S(Pharmacia)等交换之带电荷磺酸基团的阳离子交换剂及具有用于制备1×103到1×105MW蛋白质之不同孔隙度的交换琼脂糖凝胶过滤基质如SUPEROSE 12(Pharmacia)等进行系列层析，以从条件培养基中纯化TFPI-2。简单地说，将用1N NaOH调到pH 7.5并通过0.22μm滤器过滤的无血清条件培养基加到例如已用缓冲液A(50mMTris-HCl(pH 7.5)、10％甘油)于4℃下平衡过的肝素-Sepharose柱(Pharmacia biotech Inc.，Piscataway，NJ)上。将过滤的培养基于3ml/分钟的流速过柱。用含有0.2M NaCl的缓冲液A洗柱。用含有1M NaCl的缓冲液A从柱上洗脱根据其抑制胰蛋白酶之能力(实施例4A)判定的TFPI-2活性。在4℃对25mM Tris-HCl(pH7.5)、10％甘油透析从肝素-Sepharose柱上得到的洗脱物。在含有阴离子交换剂的5×50mm柱上对保留物进行HPLC(Pharmacia Biotech Inc.)，其中所说的交换剂具有与已在室温下用25mM Tris-HCl(pH7.5)、10％甘油平衡过的水珠状亲水树脂如MONO Q(MONO Q HR 5/5；Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，NJ)上的季胺基团。以1ml/分钟的流速用线性NaCl梯度(从0到0.5M NaCl)从柱上洗脱TFPI-2。合并TPPI-2活性部分并对25mM柠檬酸钠(pH 5.0)、10％甘油透析。然后在具有与小珠状疏水树脂如MONO S(MONO S HR 5/5，Pharmacia Biotech Inc.)上之带电荷磺酸基团的阳离子交换剂上，以0.5ml/分钟的流速对滞留物进行FPLC层析。用从25ml柠檬酸钠(pH5.0)、10％甘油至25mM Tris-HCl(pH7.5)、10％甘油、1M NaCl的梯度从MONO S柱上洗脱TFPI-2活性。合并合TFPI-2活性的部分并经超滤浓缩到1ml。通过已过室温下在50mM Tris-HCl(pH7.5)100mM NaCl中平衡的具有适于分离1×103至3×105MW之蛋白质的孔隙度的交联琼脂糖凝胶过滤基质如SUPEROSER(Pharmacia Bitech Inc.，Piscataway，NJ)，对浓缩的样品进行FPLC。对从FPLC上洗脱的具有TFPI-2活性的部分进行SDS-PAGE，并合纯的TFPI-2部分并于-80℃下贮存之。
本发明还涉及含有本发明Kunitz型抑制剂连同药学上可接受之载体的药物组合物。在本发明的组合物中，可按照已建立的配制药物组合物的方法(如参见Remington’s PharmacecuticalSciences，1985)配制Kunitz型抑制剂。该组合物一般可以是适于全身注射或输注形式的，并可以用无菌水或等渗盐水或葡萄糖溶液进行配制。
因此，预想本发明的Kunitz型抑制剂可有利地用于需要使用组织因子途径抑制剂的治疗目的。这些应用目的包括治疗弥散性血管内凝血、深静脉血栓形成，肺栓塞及用于预防外科创伤后血栓形成。如本领域技术人员将会了解到的，本发明的Kunitz型抑制剂可以与其他治疗剂合用以增强这些药剂的抗血栓或抗凝血活性。例如，TFPI-2可以与组织血纤维蛋白溶酶原激活剂联合用于溶栓治疗。由于它们能够抑制因子VIIa/组织因子复合物而适用使用本发明的这些Kunitz型抑制剂。
因此本发明的Kunitz型抑制剂可用于抑制哺乳动物血液凝固的方法中。这些方法一般包括以足以抑制血液凝固的量投用Kunitz型抑制剂。可根据被治疗之病理状态的严重程度确定用量，并可在大约10μg/kg到10mg/kg体重范围内有所变化。投用的优选Kunitz型抑制剂剂量为每公斤体重100mg和5mg范围内，最佳范围为每公斤体重100mg和1mg范围内。
除了如上文指出的药用目的外，还可使用上文指定的Kunitz型抑制剂，例如用筛选检测法或亲和层析法从直接或间接与Kunitz型抑制剂结合的人材料中分离有用的天然物质，例如蛋白酶或受体。
在本发明的一个方面，利用Kunitz型抑制剂，包括其衍生物及这些蛋白质的部分或片段制备与Kunitz型抑制剂特异结合的抗体。本文所述的术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、其抗原结合片段如F(ab’)和Fab片段，以及重组产生的结合对象。这些结合对象掺入了来自编码特异性结合单克隆抗体的可变区。如果抗体以大于或等于107/M的Ka值与Kunitz型抑制剂结合，则它们即被限定为特异性结合。可以使用本领域普通技术人员已知的方法(参Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.51660-672，1949)很容易地检测单克隆抗体或结合对象的亲和性。分离的抗体是那些实质上没有其他血液成分的抗体。
文献中已充分描述了制备单克隆和多克隆抗体的方法(例如参见Sambrook et al.，引文同上；Hurrell.J.G.R.，Ed.，MoNoclonal Mybridoma AntibodiesTechniques and Applications，CrE Press，Inc.，Boca Raton，FL，1982)。如本领域普通技术人员可会看出的，可以从马、牛、山羊、绵羊、狗、鸡、免、小鼠或大鼠等多种温血动物体内产生多克隆抗体。可通过使用佐剂如弗氏完全估剂或不完全佐剂来提高Kunitz型抑制剂的免疫原性。可利用本领域技术人员已知的多种检测法检测与Kunitz型抑制剂特异结合的抗体。文献(AntibodiesA Laboratory Manual，Harlowand Lane(Eds.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988)中已详细描述了这些检测法。这些检测法的有代表性的例子包括并行免疫电泳法、放射免疫法、放射免疫沉淀法、酶联免疫吸附法、点印迹法、抑制或竞争法及夹心法。
可利用制备单克隆抗体的其他技术构建和表述重组单克隆坑体。简单地说，从B细胞群体中分离mRNA并用以在适当载体如可得自Stratocyte(La Jolla，CA)的λIMMUNOZAP(H)和λIMMUNOZAP(L)载体中产生重和轻链免疫球蛋白cDNA表达文库。然后个别筛选共表达这些载体，以生成Fab或抗体(Huseet al.，Science 2461275-1281，1989；Sastry et al.，Proc.Natl.Acad.sci.USA 865728-5732，1989)。然后将阳性噬斑转变为可以在大肠杆菌中高水平表达单克隆抗体片段的非裂解质粒。
也可以利用重组DNA技术构建如上文所述的结合对象，以掺入编码特异性结合抗体之基因的可变区。本领域普通技术人员可以很容易地完成这些蛋白质的构建(例如参见Larrick et al.，BiotechNology 7934-938，1989；Reichmann et al.，Nature 322323-327，1988和Roberts et al.，Nature 328731-734，1987)。一旦制得了适当的抗体或结合对象，即可用文献中充分描述的许多技术分离或纯化之(例如参见AntibodiesA Laboratory Manual，引文同上)。适用的技术包括蛋白质或肽亲和柱层析、HPLC或RP-HPLC、在蛋白A或蛋白G柱上层析纯化或这些技术的组合使用。本发明中用以限定抗体或结合对象的术语“分离的”是指“实质上没有其他血液成分”。
可以按多种方法使用本发明的抗体或结合对象。例如可以将组织切片与特异性结合Kunitz型抑制剂的标记的单克隆抗体一起保温，然后检测已结合之抗体的存在，以确定Kunitz型抑制剂的组织分布，本发明中适用的标记物是本领域已知的，并包括但不只限于荧光素、异硫氰酸盐、藻红蛋白、辣根过氧化物酶及胶体金。也可以使用本发明的抗体纯化本发明的Kunitz型抑制剂。文献中已公开了抗体与固相载体偶联的方法以及它们在纯化蛋白质中的应用(例如参见Methods in Molecular Biology，Vol.1，Wallker(Ed.)，Humana Press，New Jersey，1984；该文献全文列为本文参考文献)。
以举例说明而不是限制的方式提供下列实施例。
实施例限制性核酸内切酶及其他DNA修饰酶(如T4多聚核苷酸激酶、小牛碱性磷酸酶、DNA聚合酶I(KleNoW片段)、T4多聚核苷酸连接酶)得自GIBCO BRL Life TechNologies，Inc.(GIBCOBRL)和New Fngland Biolabs，并且除另有说明者外，并按制造者的指导使用之。
在Applied Biosysterms Model 380A DNA合成仪上合成寡核苷酸，并在变性凝胶上经聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化之。按照Maniatis等人(Molecular ClomingA Laboratory Manual，Coldspring Harbor Laboratory，1982)或Sambrook等人(MolecularClomingA Laboratory Manual，2th ed.，Cold Spring Harbor，New York，1989)所述的方法转化大肠杆菌细胞。基本上按照Sambrook等人(文献出处同上)所述的方法制备放射标记的探针及杂交溶液。
实施例1新的人Kunitz押制剂cDNA的克隆使用30mer反义寡核苷酸(ZC4 792；SEQ ID NO3)筛选自各人组织来源的poly(A)+RNA。从Clontech Laboratories，Inc.(Palo Alto，CA)得到心脏、脑、胎盘、肝脏、肺、骨骼肌、肾脏和胰脏中人ploly(A)+RNA的印迹(HUMAN MTN BLOT)。使印迹在预杂交溶液(5×SSPE(表1)、2×Denhardt’s(表1)、0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)、100μg/ml超声处理的硅鱼精子DNA)中55℃预杂交4小时。预杂交后，除去预杂交溶液并换成含有4.7×106cpm/ml32p标记之ZC 4792(SEQ ID NO3)的预杂交溶液。55℃保温过夜后除去预杂交溶液，室温下将印迹在2×SSC(表1)、0.05％SDS中洗20分钟，再于55℃在2×SSC(表1)、0.1％SDS中洗20分钟。使印迹对胶片曝光2.5小时。所得到的放射自显影显示在大多数泳道中有多条带，表明呈现于印迹中的大多数组织中存在有相关序列。在2×SSC(表1)中，于60℃-65℃温度下以高严格性条件将印迹洗30分钟，然后使印迹对胶片曝光过夜。第二次射自显影显示胎盘和肝组织中存在1.6Kb带，并且在胰脏组织中存在约1.2Kb的明显较小的带。
表1
20×SSPE175.3g NaCl27.6g NaH2PO4·H2O7.4g EDTA将固体物溶解在800ml蒸馏水中。用NaOH(约6.5ml 10N溶液)将pH调到7.4。用蒸馏水将体积调到1升。经高压除菌。
50×Denhardt’s5g Ficoll5g聚乙烯吡咯烷硐5g牛血清白蛋白(部分V)将固体物溶解到500ml终体积。将溶液过滤除菌并贮存于-20℃。
20×SSCE175.3g NaCl88.2g柠檬酸钠将固体物溶解在800ml蒸馏水中。添加10N NaOH将pH调到7.0。用蒸馏水调整体积至1升。进行高压灭菌。
预杂交溶液#15×SSPF5×Denhardt’s0.5％SDS100μg/ml剪切的鲑精子DNA预杂交溶液#25×SSC
5×Denhardt’s0.5％SDS100μg/ml剪切的鲑精子DNA生长培养基含有5％胎牛血清、2mM L-谷氨酸、1×PSN(50μg/ml青霉素、50μg/ml链霉素、100μg/ml新霉素；GIBCO BRL)、10μM氨甲蝶呤的Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM)。
无血清培养基500ml Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM)0.29mg/ml L-谷氨酰胺10mg/L运铁蛋白5mg/L胎球蛋白(Aldrich，Milwaukee，WI)5mg/L胰岛素(GIBCO BRL，Grrand Island，NY)2μg/L硒(Aldrich，Milwaukee，WI)除了上述成分外，培养基中还添加有10μM氨甲蝶呤、25-50mM HEPES缓冲溶液(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(pH 7.2)；JRH Biosciences，Lenxa，KS)和IXPSN(GIBCOBRL)。
磷酸盐缓冲盐水(PBS)8g氯化钠0.2g氯化钾1g磷酸钠2g磷酸钾将固体物溶解在蒸馏水中。将溶液体积调到1升。高压灭菌。
为了得到编码来自Kunitz家族之人胎盘蛋白质抑制剂的DNA，使用基本上如上文所述的放射标记的ZC 4792(SEQ IDNO3)筛选λgt11中的人胎盘cDNA库(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)。滴定文库，并以2×105pfn/平板铺盖在总共12个平板上，以得到2.4×106个独立的噬斑。使用ICNBIOTRANS尼龙膜(ICN，Irvine，CA)制备复制噬斑。在5×SSC(表1)、0.5％SDS中50℃预洗涤膜1小时，然后在预杂交溶液#1(表1)中55℃预杂交过夜。除去预杂交溶液并换成含有7.2×107cpm ZC 4792探针(SEQ ID NO3)的新鲜预杂交溶液#1(表1)。在与预杂交相同的条件下进行杂交。除于杂交溶液，于60℃在2×SSC(表1)、0.1％SDS中洗印迹。鉴定出14个阳性噬斑并使用放射标记的ZC 4792(SEQ ID NO3)纯化噬斑。
用ZGKI 13的特异性片段探查对14个克隆进行噬斑纯化所得到的三重滤膜，以鉴定并除去与淀粉样前体蛋白类似物有同源性的克隆，其中ZGKI 13为含有淀粉样前体蛋白类似物编码序列的克隆(已作为大肠杆菌转化体于1992年10月14日保藏在American Type Culture Collection，12301 Parklawn Dr.，Rockville，MD，保藏登记号为ATCC 69090)。使用ZGKI 13的随机引导的880bp Pst I-Xho I片段作为探针。滤膜在含有2×106cpm/ml标记探针的预杂交溶液#2中65℃杂交过夜。杂交后，除去溶液，并在0.2×SSC(表1)、0.1％SDS中65℃洗滤膜。14个噬斑中有4个显示编码ZGKI13淀粉样蛋白前体。弃去这4个克隆。
从称为J-2-11的10个保留之纯化噬菌体克隆之一中制备双链DNA。用EcoRI消化质粒DNA以分离约1kb cDNA插入段。将EcoRI亚克隆到用EcoRI切成线性的pUC 19中。对克隆之片段的序列分析证明了三个显示与蛋白酶押制剂的Kunitz家族有强同源性的区域。使用对J-2-11克隆特异的标记探针筛选9个其余噬菌体克隆(如上文所述)的三重滤膜。将三重滤膜在含有2×106cpm/ml激酶处理的寡核苷酸ZC 6281探针(SEQ IDNO4)的预杂交溶液#2(表1)中55℃杂交过夜。杂交后除去探针，并在2×SSC(表1)、0.1％SDS中60℃洗滤膜。滤膜的放射自显影显示，所有9个候选克隆均含有与J-2-11同源的序列。选择一个克隆并定名为J-2-11/pUC 19。
质粒J-2-11/pUC 19作为大肠杆菌转化体于1993年9月17日保藏于American type Culture Collection(12301 Parklawn D.，Rockville，MD)，登记号为69425。质粒含有SEQ ID NO1中所示的序列分析序列显示有36核苷酸的5’非编码区、编码235氨基酸的705核苷酸开放阅读框架，和235核苷酸3’非编码区。推测的氨基酸序列(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)与其他Kunitz型抑制剂相比较，显示与TFPI的氨基酸同源性和区域结构相似性。
使用32P末端标记的相当于TEPI-2序列(ZC 6281；SEQID NO4)的寡核苷酸筛选人组织之poly(A)+mRNA的印迹，以确定转录物的组织分布。使印迹在含有5×SSPE(表1)、2×Denhardt’s(表1)、0.5％SDS、100μg/ml鲑精子DNA的预杂交溶液中于55℃预杂交几个小时。预杂交后，除去溶液，并使印迹在含有激酶化ZC 6281(SEQ ID NO4)的新鲜预杂交溶液中55℃杂交过夜。在0.2×SSC(表1)、0.1％SDS中65℃洗印迹并对胶片曝光。分析放射自显影显示TFPI-2在胎盘和肝脏中转录。继后的Northern分析证明人脐带静脉内皮细胞中存在TEPI-2转录物。一个转录物表现为1.4kb，同时有一个可能的约2kb的小的转录物。基于最长TFPI-2克隆的大小，因为没看到多腺苷酸化序列，故有可能是该克隆代表了丢失某些3’非编码序列的转录物。因为在3’末端未见有接头序列，所以该末端的EcoRI位点似乎是一个内部位点。因此，该mRNA大小预示全长转录物中有一个附加的400bp 3’(或5’)非编码序列。
实施例2在培养的哺乳动物细胞中表达新的人Kunitz型抑制剂在哺乳动物表达载体Zem 229R中表达由克隆J-2-11编码的新的人Kunitz型抑制剂。载体Zem 229R已作为大肠杆菌转化体于1993年9月28日保藏在American Type Culture Collection(12301 Partlawn Dr.Rockville，MD 20852)，登记号为69447。将J-2-11/pUC 19中的约1kb EcoRI片段连接到已用EcoRI切成线性的Zem 229R中。根据在与启动子相关之适当与向上含有插入段的质粒的存在筛选转化体。鉴定阳性克隆并制备质粒DNA。使用磷酸钙介导的转染法(Wigler et al.，Cell 14725，1978；Corsaro and Pearson，Somatic Cell Genetics 7603，1981；Grraham and Van der Eb，Virology 52456，1973)，用质粒DNA转染BHK 570细胞。BHK细胞已于1989年12月20日保藏在American Type Culture Collection(ATCC，12301 Parklawn Dr.，Pockville，MD，20852，USA)，登记号为CRL 10314。首先在含1μM氨甲蝶呤培养基中选择转染的细胞，然后在含10μM氨甲蝶呤的培养基中进行更严格的选择。在10μM氨甲蝶呤中选择后，使随机选择的克隆的含生长培养基(表1)的6孔平皿中生长至细胞汇合。达到细胞汇合后，弃去已用过的培养基，用磷酸盐缓冲盐(PBS，表1)洗细胞以除掉残留的血清。向细胞内加入无血清培养基(表1)，并使细胞生长24-48小时。收集条件培养基并使用实施例4A中详细描述的检测法检测胰蛋白酶抑制剂活性。
选择具有最高胰蛋白酶抑制剂活性的克隆进行大批量培养。扩充该克隆的细胞并接种到小的大的细胞工厂中，使之在含有10mg/L抑蛋白酶肽(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)的生长培养基(表1)中生长到细胞汇合。达到汇合后除去培养基，用PBS洗细胞并加入含有10mg/L抑蛋白酶肽的无血清培养基(表1)。每2-4天收集一次培养基并贮存于-20℃下。
实施例3在酿酒酵母中表达Kunitz型抑制剂区域A.表达含有SEQ ID NO2中氨酸34到89之TFPI-2的Kunitz型抑制剂区域在酿酒酵母的菌株中从PCR产生的序列开始表达在质粒pJ-2-11/pUC 19中编码的并含有SEQ ID NO2所示从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号89之异亮氨酸的氨基酸序列的Kunitz型抑制剂区域。扩增从pJ-2-11/pUC 19得到的编码Kunitz型抑制剂区域的DNA序列。设计作为PCR扩增引物的合成的寡核苷酸引物M-2161和M-2177(分别见SEQ ID NO5和NO6)。合成的寡核苷酸M-2177互补于SEQ ID NO1的核苷酸288-305，还携带含有翻译终止密码及其后XbaI位点的5’延伸部分。寡核苷酸M-2161含有与SEQ ID NO7中所示合成前导序列之核苷酸215-235相同的序列，其后是SEQID NO1的核苷酸138-154。按照制造商提供的说明书，使用1μg质粒pJ-2-11/pVC 19，各100pmole寡核苷酸M-21 61和M-2177(SEQ ID NO5和NO6)、及GENEAMP试剂盒(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)中提供的试剂，以100μl终体积进行PCR反应。反应扩增19次循环(94℃/20秒，50℃/20秒和72℃/30秒)，然后于72℃保温10分钟。经琼脂糖凝胶电泳分离205bp片段。
经PCR扩增质粒pKFN-1000的一个片段得到编码合成之信号序列(SEQ ID NO7)的DNA序列。质粒pKFN-1000是含有编码一合成的酵母信号前导肽之DNA序列的质粒pTZ 19R(Meacl et al.，Prot.Engin.，167-74，1986)的衍生物。WO90/10075(该文献全文列为本文参考文献)中描述了质粒pKFN-1000。SEQ ID NO7和8中显示了质粒pKFN-1000之EcoRI位点下游235碱基对的并编码氨基酸序列的DNA序列。使用质粒pKFN-1000的0.7kb Pvu II片段作为模板。合成的寡核苷酸NOR-1478(SEQ ID NO9)相同于恰在EcoRI位点之上游的序列(SEQ ID NO7的核苷酸1-6)。合成的寡核苷酸NOR-2523(SEQ ID NO10)互补于SEQ ID NO7中所示的编码序列的核苷酸215-235。按照制造商的说明书，使用0.1μg 0.7kb Pvu II片段、各100pmole寡核苷酸NOR-1478和NOR-2523(分别见SEQ ID NO9和NO10)及GENEAMP商品试剂盒(Perkin Elmer Cetus)中的试剂，以100μl终体积进行PCR反应。按上述程序完成PCR反应。以琼脂糖凝胶电泳法分离257bp PCR产物。
按上述方法扩增两个PCR片段，得到可操作地连接到Kunitz型抑制剂区域序列上的编码完整合成信号序列上的DNA序列。使用的各100pmole引物NOR-1478(SEQ ID NO9)和M-2177(SEQ ID NO6)及各0.1μg上述两PCR片段，按上述方法进行PCR反应。PCR反应扩增16次循环(94℃/1分钟，50℃/2分钟，71℃/3分钟)，然后于72℃保温10分钟。经琼脂糖凝胶电泳分离437bp片段。然后用EcoRI和XbaI消化该片段，并将该所得408bp片段与已用EcoRI和XbaI切成线性的质粒PTZ 19R连接。用连接混合物转化感受态限制-、修饰+大肠杆菌菌株，并在氨苄青霉素存在下选择转化体。测定由选择之转化体制备的质粒DNA，并鉴定含有与Kunitz型抑制剂区域融合之合成酵母信号序列的DNA序列的质粒。
然后分离编码分泌信号-Kunitz型抑制剂区域的EcoRI-XhaI片段，并亚克隆到质粒pMT-636中。质粒pMT-636衍生于穿梭载体pCPOT(质粒pCPOT已于1984年5月9日保藏在American Type Culture Collection，12301 Parklawn Dr.，Rockville，MD；登记号为No.39685)其中已删除含酿酒酵母LEU2基因的0.4kb Hpa I-Hru I片段，另外含有酿酒酵母TPI1启动子和侧接EcoRI-XbaI定向克隆位点的TPI1终止子，从而使DNA插入段以与Schizosaccharomyces Pombe POT 1基因(Norris et al.，引文同上)相同的方向转录。WO 89/01968和WO90/10075(全文列为本文参考文献)中已描述过质粒pMT-636。用NcoI和XbaI消化质粒pMT-636以分离9.3kb片段。还用NcoI和EcoRI消化质粒pMT-636以分离1.6kb片段。将得自pMT-636的这两个片段与EcoRI-XbaI片段连接。将以正确方向令信号序列-Kunitz型抑制剂区域片段的质粒转化到酿酒酵母MT-663(a/aΔtpi/Atpi pep 4-3/pep 4-3)中。根据其在以葡萄糖为唯一碳源之培养基上生长的情况选择转化株并在YEPD培养基中培养之。按实施例4中所述方法检测转化株的活性产物。按实施例5中所述方法纯化Kunitz型抑制剂。
B.表达含有SEQ ID NO2中氨基酸34到152之TFPI-2Kunitz型抑制剂区域。
使用寡核苷酸引物M-2161和M-2162(SEQ ID NO5和NO11)，按实施例1中所述的方法，从人基因组DNA扩增含有从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号152之赖氨酸的氨基酸序列的编码TFPI-2之Kunitz型抑制剂区域的DNA构建体。凝胶电泳纯化所得到的PCR产生的片段，并连接到上述信号序列上。使用含有载体pTZ 19R中之合成信号序列及TFPI-2编码序列的质粒中间体，获得用于构建酵母表达载体的信号序列-TFPI-2片段。将编码信号序列-TFPI-2之质粒中间体的EcoRI-Xba片段亚克隆到上述酵母表达载体MT-636中。按上述方法将带有正确插入段的候选质粒转化到酿酒酵母菌株MT-663中。
按实施例4中所述检测所选择之转化体表达产物的活性。按实施例5中所述纯化Kunitz型抑制剂。
C.表达含有SEQ ID NO2所示氨基酸34到211之TFPI-2的Kunitz型抑制剂区域。
首先用BglII和HindIII消化质粒pJ-2-11/pUC 19。得到编码三个Kunitz型区域的528bp BglII-HindIII片段，以构建编码TFPI-2之Kunitz型抑制剂区域的DNA构建体，所说的区域包含从SEQ ID NO2中氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号211之丙氨酸的氨基酸序列。通过置换实施例3B中所述质粒中间体内的TFPI-2编码序列，将来自pJ-2-11/pUC19的Kunitz型抑制剂区域编码序列连接到合成的信号序列(SEQ IDNO7)上。用BglII和XbaI消化质粒中间体以分离含载体片段。将含BglII-XbaI载体的片段与来自PJ-2-11/pUC 19的BglII-HindIII片段和含有翻译终止密码子的HindIII-XbaI接头相连接。鉴定含有以适当方向与TFPI-2编码序列连接之合成信号序列的质粒。
将来自编码信号序列-TFPI-2之质粒中间体的EcoRI-XbaI片段亚克隆到上述酵母表达载体MT-636中。按上述方法将带有正确插入段的候选质粒转化到酿酒酵母菌株MT-663中。
按实施例4中所述方法检测选择的转化体的活性产物。按实施例5中所述方法纯化Kunitz型抑制剂。
实施例4活性检测法A.对哺乳动物细胞培养物上清液的胰蛋白酶抑制活性检测法。
检测表达Kunitz型抑制剂之细胞的条件培养基中的胰蛋白质抑制剂活性。对于各个克隆，均在含有2.4μg/ml胰蛋白酶(Worthington Biochemical，Frreehold，NJ)、100mM NaCl、50mM Tris(pH7.4)的溶液中加条件培养基达到终体积300μl。将反应混合物于23℃保温30分钟，然后加入20μl 10mM产色底物S-2251(D-Val-Leu-Lys-Nan；Chromogenix，AB，Molndal，Sweden)至终浓度0.6mM。测405nm处吸光率以检测残留的胰蛋白酶活性。
B.对酵母培养物上清液的活性检测法用80μl检测缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.4)、100mMNaCl、2mM CaCl2、0.1％(W/V)PEG 20,000)稀释各3.2μl用过的培养基样品，检测来自上述酵母转化体培养物之耗竭培养基中的胰蛋白酶抑制活性。将此稀释的上清液加到在检测缓冲液中稀释的80μl 133nM牛胰蛋白酶(Novo Nordisk A/S)中，将在室温下将混合物保温10分钟。保温后，向各样品中加入100μl在检测缓冲液中稀释的1.8mM肽酰硝基酰苯胺底物S2251(D-Val-Leu-Lys-Nan；Kabi)，并将样品与底物保温30分钟。由无色溶液指示胰蛋白酶抑制活性。由酵母菌株培养上清产生的形成黄色溶液的对照反应不表达任何Kunitz型抑制剂。
实施例5Kunitz型抑制剂的纯化A.从转染的哺乳动物细胞培养物上清液中纯化Kunitz型抑制剂按下文详细描述的方法相继使用肝素-琼脂糖、NONO Q、MONO S和SUPEROSE 12层析柱从条件培养基中纯化重组TFPI-2。用1N NaOH将大约5升无血清条件培养基调到pH 7.5，并通过0.22μm滤膜过滤之。4℃下用缓冲液A(50mM Tris-HCl(pH7.5)、10％甘油)平衡2.6×35cm肝素-Sepharose柱(Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，NJ)。将经过过滤的培养基以3ml/分钟的流速上样到经过平衡的柱上。上样之后，用含有NaCl的缓冲液A洗柱。用含有1M NaCl的缓冲液A从柱上洗脱根据其抑制胰蛋白酶的能力判定的TFPI-2活性(实施例4A)。4℃下将从肝素-Sepharose柱上得到的洗脱物对25mMTris-HCl(pH 7.5)、10％甘油透析。在含有阴离子交换剂的5×50mm柱上对滞留物进行FPLC(Pharmacia Biotech Inc.)，所说的交换剂带有交联到已用25mM Tris-HCl(pH 7.5)、10％甘油中室温下平衡过的小珠状亲水树脂如MONO Q(MONO Q HR 5/5；Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，NJ)上的季胺基团。以1ml/分钟的流速用线性NaCl梯度(0-0.5M NaCl)从柱上洗脱TFPI-2。合并TFPI-2部分并对25mM柠檬酸钠(pH 5.0)、10％甘油透析。然后于室温下在含有阳离子交换剂的5×50mm柱上以0.5ml/分钟的流速对滞留物进行FPLC，其中所说的阳离子交换剂带有与小珠状亲水树脂和MONO S(MONO S HR 5/5，Pharmacia Biotech Inc.)偶联的带电荷磺酸基团。用从25mM柠檬酸钠(pH5.0)、10％甘油到25mM Tris-HCl(pH7.5)、10％甘油、1M NaCl的梯度从MONO S柱上洗脱TFPI-2活性。合并含有TFPI-2活性的各管并经超离心浓缩到大约1ml。使浓缩的样品通过琼脂糖凝胶过滤基质进行FPLC，所说的凝胶过滤基质具有适于分离×103至3×105MW之蛋白质的孔隙度，例如为在室温下于50mM Tris-HCl(pH 7.5)、100mM NaCl中平衡过的WUPEROSE 12(Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，NJ)。对从FPLC柱上洗脱的有TFPI-2活性的部分进行SDS-PAGE，合并纯的部分并贮存于-80℃。
B.从酵母培养物上清液中纯化Kunitz型抑制剂基本上按照Norris等人(引文同上，列为本文参考文献)所述的方法从酵母培养物上清中纯化Kunitz型抑制剂。使选择的转化体在10升YEPD中30℃生长约40小时，直到OD600达到约25。离心培养物分离上清液。
将300-1000ml等分的上清液调到pH2.3并加样于装有已用20mM Bicine，pH8.7(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)平衡过之8ml S-Sepharaose(Pharmacia-LKB biotechNology AS，Alleroed，Denmark)的柱上。用20mM Bicine，pH8.7彻底洗柱后，用30ml含有1M NaCl的20mM Bicine，pH8.7洗脱Kunitz型抑制剂。将洗脱的材料加样于已用20mM NH4HCO3，pH 7.8平衡过的Sephadex G-25柱(Pharmacia-LKB BiotechNology AS，Alleroed，Denmark；2.5×30cm)上进行脱盐。用20mMNH4HCO3，pH7.8洗脱Kunitz型抑制剂。
在已用20mM Bicine，pH 8.7平衡过的MONO S柱(Pharmacia-LKB BiotechNology AS，Alleroed，Denmark；0.5×5cm)上层析，以进一步纯化和浓缩Kunitz型抑制剂。以2ml/分钟的流速用平衡缓冲液洗10分钟后，用加在平衡缓冲液中的0-0.6M NaCl在12分钟内梯度洗脱Kunitz型抑制剂。合并峰值样品，在Vydac 214 TP 510柱(Mikro-lab，Aarhus，Denmark；1.0×25cm)上经反相HPLC纯化Kunitz型抑制剂，其中以4ml/分钟的流速用从5％A(0.1％三氟乙酸(TFA)，加在水中)到45％B(0.7％TFA，加在乙腈中)的梯度洗脱液在20分钟进行洗脱。冻干纯化的产物，并检测抑制剂活性。
基本上按照Norries等人(引文同上)所述的方法检测Kunitz抑制活性。简单地说，在0.25μg/ml猪胰蛋白酶(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd.Denmart)、12.8W/L人纤溶酶(Kabi，Stockholm，Sweden)或0.16nKat/ml人血浆激肽释放酶(Kabi)(加于100mMNaCl，50mM Tris-HCl，pH 7.4中)存在下，保温不同固定浓度的Kunitz型抑制剂。保温30分钟后，经分割含有溶于检测缓冲液内之0.6mM产色肽酰硝基酰苯胺胰蛋白酶/纤溶酶底物S2251(D-Val-Leu-Lys-Nan；Kabi)或S 2302(D-Pro-Phe-Arg-Nan；Kabi)的底物溶液检测残留的酶促活性。将样品保温30分钟之后检测405nm处各样品的吸光率。根据405nm吸光率的降低测定纤溶酶或胰蛋白酶活性。根据测得的结果计算表观抑制常数Ki。
实施例6重组TFPI-2对人凝血酶、人因子XA和人因子VIIa/组织因子复合物之酰胺水解活性的影响A.凝血酶酰胺水解活性检测使用人凝血酶(按照Pedersen，et al.，J.Biol.Chem.26516786-16793，1990；其全文列为本文参考文献)以及各种浓度的重组TFPI-2以比色检测法确定重组TFPI-2抑制人凝血酶之酰胺水解活性的能力。以微量滴定板规格建立检测法。在微量滴定板的小孔中制备200μl反应混合物。反应混合物含有加在50mMTris-HCl(pH 7.5)、0.1％BSA、5mM CaCl2中的各种不同浓度的重组TFPI-2和20nM人凝血酶。37℃保温反应15分钟。保温后，向各小孔内加入50μl的10mM产色底物S-2238(H-D-Phe-Pip-Arg-对位硝基酰苯胺，Chromogenix，AB，Molndal，Sweden)。在动力学微量板读数器(Model UVMAX，Molecular Devices)硝定405nm吸光率。重组TFPI-2没有显示对人凝血酶的酰胺水解活性(水解底物S-2238)有影响。
B.人因子Xa酰胺水解检测使用20nM人因子Xa(按Kondo，and Kisiel，Blood 701947-1954，1987所述方法制备的；该文献列为本文参考文献)代替上述20nM人凝血酶，以上述比色检测法确定重组TFPI-2抑制因子Xa之酰胺水解活性的能力。按上述方法反应并保温(用人因子Xa代替人凝血酶)。保温后，向各小孔内加入10μl的10mM产色底物S-L222(苄氧基-Ile-Glu-Gly-Arg-对硝基酰苯胺，Chromogenix，AB，Molndal，Sweden)。在动力学微量板计数器(model UVMAX，Molecular Devices)中测得405nm吸光率。显示重组TFPI-2以剂量依赖方式对20nM因子Xa的酰胺水解活性(针对产物底物S-2222的)有微弱的抑制作用。
C.人因子VIIa/组织因子酰胺水解检测使用70nM由Gordon Vehar(Genentech Inc.，South SanFrancisco，CA)提供的由219氨基酸细胞外区域组成的重组的、剪短的人组织因子抑蛋白酶肽(TFI-219(按Paborsky et al.，J.Biol.Chem.26621911-21916，1991；其列为本文参考文献)，和20nM由Peter Wildgoose(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark)提供的重组人因子VIIa(按Pedersen，et al.，Biochemistry 289331-9336，1989；其列为本文参考文献)代替上述的20nM人凝血酶，以比色检测法检测重组TFPI-2抑制因子VIIa/组织因子复合物之酰胺解活性的能力。建立该检测法并用人因子VIIa和TF1-219代替上述人凝血酶按上述方法保温。保温后，向各孔内加入50μl的10mM产色底物S-2288(H-D-Ile-Pro-Arg-对硝基酰苯胺，Chromogenix，AB)。在动力学微量板读数器(Model UVMAX，Molecular Devices)中测405nm吸光率。显示重组TFPI-2以剂量依赖方式抑制20nm因子VIIa-组织因子对产色底物S-2288的酰胺水解活性。
实施例7氨基酸序列分析在配有乙内酰苯硫脲分析器的气体蒸气序列仪(BeclemanInstruments；Model LF 3000或其他厂家的产品)中进行自动氨基酸序列分析。使用配有测序仪的SYSTEM GOLD软件乙内酰苯硫脲峰。对大约100pmole蛋白质进行序列分析。单一重组TFPI-2制剂的氨基末端氨基酸序列分析显示出主序列(～70％)Asp-Ala-Ala-Gln-Glu-Pro-Thr-Gly-Asn-Asn(SEQID NO12)和次序列(～30％)Ala-Glu-Glu-Pro-Thr-Gly-Asn-Asn(SEQ ID NO13)，提示存在信号肽酶的其他裂解位点，或者可能在其纯化期间由外肽酶的作用导致氨基末端降解。
从上面描述可以看出，虽然为举例说明目的描述了本发明的特定实施方案，但可以在不背离本发明精神和范围的情况进行多种修饰。因此，除待批权利要求外，这些描述并不构成对本发明的限制。
序列表(1)一般信息(i)APPLICANTZymoGenetics， Inc.
1201 Eastlake Avenue EastSeattleWAUS98102University of New MexicoScholes Hall 102AlbuquerqueNMUS87131(ii)TITLE OF INVENTIONNOVEL HUMAN KUNITZ-TYPE INHIBITORS ANDMETHODS RELATING THERETO(iii)NUMBER OF SEQUENCES15(iv)CORRESPONDENCE ADDRESS(A)ADDRESSEEZymoGenetics，Inc.
(B)STREET1201 Eastlake Avenue East(C)CITYSeattle(D)STATEWA(E)COUNTRYUSA(F)ZIP98102(v)COMPUTER READABLE FORM(A)MEDIUM TYPEFloppy disk(B)COMPUTERIBM PC compatible(C)OPERATING SYSTEMPC-DOS/MS-DOS(D)SOFTWAREPatentIn Release #1.0，Version #1.25(vi)CURRENT APPLICATION DATA(A)APPLICATION NUMBER(B)FILING DATE(C)CLASSIFICATION(viii)ATTORNEY/AGENT INFORMATION(A)NAMEParker，Gary E(B)REGISTRATION NUMBER31-648(C)REFERENCE/DOCKET NUMBER93-14PC(ix)TELECOMMUNICATION INFORMATION(A)TELEPHONE206-442-6673(B)TELEFAX206-442-6678(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度979碱基对(B)类型核酸(C)链型双股(D)拓扑结构线性(ii)分子类型CDNA(vi)原始来源(A)生物体Homo sapiens(F)组织类型胎盘(vii)中间来源(B)克隆J-2-11(ix)特征(A)名称/键CDS(B)定位39..746(xi)序列描述SEQ ID NO1GGACGCCTTG CCCAGCGGGC CGCCCGACCC CCTGCACC ATG GAC CCC GCT CGC 53Met Asp Pro Ala Arg1 5CCC CTG GGG CTG TCG ATT CTG CTG CTT TTC CTG ACG GAG GCT GCA CTG 101Pro Leu Gly Leu Ser Ile Leu Leu Leu Phe Leu Thr Glu Ala Ala Leu10 15 20GGC GAT GCT GCT CAG GAG CCA ACA GGA AAT AAC GCG GAG ATC TGT CTC 149Gly Asp Ala Ala Gln Glu Pro 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CAAATGTGAG TCTACCATTT TTAATTTATG 953GTTCAACTGT TTGTGAGACT GAATTC 979(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度235氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Asp Pro Ala Arg Pro Leu Gly Leu Ser Ile Leu Leu Leu Phe Leu1 5 10 15Thr Glu Ala Ala Leu Gly Asp Ala Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn20 25 30Ala Glu Ile Cys Leu Leu Pro Leu Asp Tyr Gly Pro Cys Arg Ala Leu35 40 45Leu Leu Arg Tyr Tyr Tyr Asp Arg Tyr Thr Gln Ser Cys Arg Gln Phe50 55 60Leu Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Ala Asn Asn Phe Tyr Thr Trp Glu65 70 75 80Ala Cys Asp Asp Ala Cys Trp Arg Ile Glu Lys Val Pro Lys Val Cys85 90 95Arg Leu Gln Val Ser Val Asp Asp Gln Cys Glu Gly Ser Thr Glu Lys100 105 110Tyr Phe Phe Asn Leu Ser Ser Met Thr Cys Glu Lys Phe Phe Ser Gly115 120 125Gly Cys His Arg Asn Arg Ile Glu Asn Arg Phe Pro Asp Glu Ala Thr130 135 140Cys Met Gly Phe Cys Ala Pro Lys Lys Ile Pro Ser Phe Cys Tyr Ser145 150 155 160Pro Lys Asp Glu Gly Leu Cys Ser Ala Asn Val Thr Arg Tyr Tyr Phe165 170 175Asn Pro Arg Tyr Arg Thr Cys Asp Ala Phe Thr Tyr Thr Gly Cys Gly180 185 190Gly Asn Asp Asn Asn Phe Val Ser Arg Glu Asp Cys Lys Arg Ala Cys195 200 205Ala Lys Ala Leu Lys Lys Lys Lys Lys Met Pro Lys Leu Arg Phe Ala210 215 220Ser Arg Ile Arg Lys Ile Arg Lys Lys Gln Phe225 230 235(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链型单股(D)拓扑结构线性(vii)中间来源(B)克隆ZC4792(xi)序列描述SEQ ID NO3GTTGTTGCTG TTGCCTCCGC AGCCTCCGTA(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链型单股(D)拓扑结构线性(vii)中间来源(B)克隆ZC6281(xi)序列描述SEQ ID NO4ACAGATCTCC GCGTTATTTC CTGTTGGCTC(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度38碱基对(B)类型核酸(C)链型单股(D)拓扑结构线性(vii)中间来源(B)克隆M-2161(xi)序列描述SEQ ID NO5GCTGAGAGAT TGGAGAAGAG AGAGATCTGT CTCCTGCC(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度34碱基对(B)类型核酸(C)链型单股(D)拓扑结构线性(vii)中间来源(B)克隆M-2177(xi)序列描述SEQ ID NO6GAAACCTCTA GACTTATATC CTCCAGCAAG CATC(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度235碱基对(B)类型核酸(C)链型单股(D)拓扑结构线性(ix)特征(A)名称/键CDS(B)定位77..235(xi)序列描述SEQ ID NO7GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT CATACACAAT 60ATAAACGACC AAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG GTT TTG TCC TTG ATC 109Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile1 5 10GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG 157Gly Phe Cys Trp Ala Gln Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu15 20 25ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC 205Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn30 35 40GTC GCC ATG GCT GAG AGA TTG GAG AAG AGA 235Val Ala Met Ala Glu Arg Leu Glu Lys Arg45 50(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度53碱基对(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO8Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cys Trp Ala1 5 10 15Gln Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu Ile Pro Glu Glu Ser20 25 30Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Val Ala Met Ala Glu35 40 45Arg Leu Glu Lys Arg50(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核酸(C)链型单股(D)拓扑结构线性(vii)中间来源(B)克隆NOR-1478
(xi)序列描述SEQ ID NO9GTAAAACGAC GGCCAGT(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度21碱基对(B)类型核酸(C)链型单股(D)拓扑结构线性(vii)中间来源(B)克隆NOR-2523(xi)序列描述SEQ ID NO10TCTCTTCTCC AATCTCTCAG C(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度35碱基对(B)类型核酸(C)链型单股(D)拓扑结构线性(vii)中间来源(B)克隆M-2162
(xi)序列描述SEQ ID NO11CTTTTACTCT AGACTTACTT TGGTGCGCAG AAGCC(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度10氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(v)片段类型N末端(xi)序列描述SEQ ID NO12Asp Ala Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn1 5 10(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度8氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(v)片段类型N末端(xi)序列描述SEQ ID NO13Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn1 5(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)长度165碱基对(B)类型核酸(C)链型单股(D)拓扑结构线性(ix)特征(A)名称/键CDS(B)定位1..165(ix)名称(A)名称/键-(B)定位1..3(D)其他信息/标记＝密码子-1/注＝“其中核苷酸三联体1-3编码除半胱氨酸外的任何氨基酸”(ix)特征(A)名称/键(B)定位4..6(D)其他信息/标记＝密码子-2/注＝“其中核苷酸三联体4-6编码除半胱氨酸外的任何氨基酸”(ix)特征(A)名称/键-(B)定位160-162(D)其他信息/标记＝密码子-54/注＝“其中核苷酸三联体160..162编码除半胱氨酸外的任何氨基酸”(ix)特征(A)名称/键-(B)定位163..165(D)其他信息/标记＝密码子-55/注＝“其中核苷酸三联体112-114编码除半胱氨酸外的任何氨基酸”(xi)序列描述SEQ ID NO14NNNNNNTGTC TCCTGCCCCT AGACTACGGA CCCTGCCGGG CCCTACTTCT CCGTTACTAC 60TACGACAGGT ACACGCAGAG CTGCCGCCAG TTCCTGTACG GGGGCTGCGA GGGCAACGCC 120AACAATTTCT ACACCTGGGA GGCTTGCGAC GATGCTTGCN NNNNN 165(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)长度55氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性
(v)片段类型内部(xi)特征(A)名称/键区域(B)定位1..2(D)其他信息/标记＝aa1-2/注＝“其中从位置1至2的各氨基酸分别是除半胱氨酸外的任何氨基酸”(ix)特征(A)名称/键区域(B)定位54..55(D)其他信息/标记＝aa54-55/注＝“其中从位置54到55的各氨基酸分别是除半胱氨酸外的任何氨基酸”(xi)序列描述SEQ ID NO15Xaa Xaa Cys Leu Leu Pro Leu Asp Tyr Gly Pro Cys Arg Ala Leu Leu1 5 10 15Leu Arg Tyr Tyr Tyr Asp Arg Tyr Thr Gln Ser Cys Arg Gln Phe Leu20 25 30Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Ala Asn Asn Phe Tyr Thr Trp Glu Ala35 40 45Cys Asp Asp Ala Cys Xaa Xaa50 5权利要求
1.包含编码人Kunitz型抑制剂之DNA片段的分离的DNA分子，其中所说Kunitz型抑制剂含有SEQ ID NO15的氨基酸序列，其中各Xaa分别是除半胱氨酸以外的任何氨基酸。
2.根据权利要求1的分离的DNA分子，其中所说的DNA片段含有SEQ ID NO2中从氨基酸编号1之蛋氨酸到氨基酸编号235之苯丙氨酸的氨基酸序列，SEQ ID NO2中从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号89之异亮氨酸的氨基酸序列、SEQ IDNO2中从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号152之赖氨酸的氨基酸序列或SEQ ID NO2中从氨基酸编号34至谷氨酸到氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号211之丙氨酸的氨基酸序列。
3.根据权利要求1的分离的DNA分子，其中所说的DNA片段含有SEQ ID NO14中从1到165的核苷酸序列，其中各核苷酸三联体1至3、4至6、160至162和163至165分别编码除半胱氨酸以外的任何氨基酸。
4.根据权利要求3的分离的DNA分子，其中所说的DNA片段含有SEQ ID NO1中从核苷酸39到核苷酸743的核苷酸序列、SEQ ID NO1中从核苷酸138到核苷酸305的核苷酸序列、SEQ ID NO1中从核苷酸138到核苷酸493的核苷酸序列或SEQ ID NO1中从核苷酸138到核苷酸671的核苷酸序列。
5.包含编码人Kunitz型抑制剂之第一DNA片段的DNA构建体，所说的第一DNA片段可操作地连接到为表达该DNA片段所需的附加DNA片段上，其中所说的Kunitz型抑制剂包括SEQ IDNO15的氨基酸序列，其中各Xaa分别是除半胱氨酸外的任何氨基酸。
6.根据权利要求5的DNA构建体，其中所说的第一DNA片段包括SEQ ID NO2中从氨基酸编号1之蛋氨酸到氨基酸编号235之苯丙氨酸的氨基酸序列、从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号89之异亮酸的氨基酸序列、从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号152之赖氨酸的氨基酸序列或氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号211之丙氨酸的氨基酸序列。
7.根据权利要求5的DNA构建体，其中所说的第一DNA片段包括SEQ ID NO14中从1到165的核苷酸序列，其中各核苷酸三联体1至3、4至6、160至162和163至165分别编码除半胱氨酸外的任何氨基酸。
8.根据权利要求5的DNA构建体，其中所说的第一DNA片段包括SEQ ID NO1中从核苷酸39到核苷酸743的核苷酸序列，SEQ ID NO1中从核苷酸138到核苷酸305的核苷酸序列、SEQ ID NO1中从核苷酸138到核苷酸493的核苷酸序列或SEQ ID NO1中的核苷酸138到核苷酸671的核苷酸序列。
9.含有包括编码人Kunitz型抑制剂之第一DNA片段的DNA构建体的宿主细胞，所说的第一DNA片段可操作地连接到为表达该片段所需的附加DNA片段上，其中所说的Kunitz型抑制剂包括SEQ ID NO15的氨基酸序列，其中各Xaa分别是除半胱氨酸外的任何氨基酸。
10.根据权利要求9的宿主细胞，其中所说的第一DNA片段包括SEQ ID NO2中从氨基酸编号1之蛋氨酸到氨基酸编号235之苯丙氨酸的氨基酸序列、SEQ ID NO2中从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号89之异亮氨酸的氨基酸序列、SEQ IDNO2中从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号152之赖氨酸的氨基酸序列或SEQ ID NO2中从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号211之丙氨酸的氨基酸序列。
11.根据权利要求9的宿主细胞，其中所说的第一DNA片段包括SEQ ID NO14中从核苷酸1到核苷酸165的核苷酸序列，其中各核苷酸三联体1至3、4至6、160至162和163-165分别编码除半胱氨酸外的任何氨基酸。
12.根据权利要求9的宿主细胞，其中所说的第一DNA片段包括SEQ ID NO1中所示从核苷酸39至核苷酸743的核苷酸序列、SEQ ID NO1中所示从核苷酸138到核苷酸305的核苷酸序列、SEQ ID NO1中所示从核苷酸138到核苷酸493的核苷酸序列或SEQ ID NO1中所示从核苷酸138到核苷酸671的核苷酸序列。
13.生产人Kunitz型抑制剂的方法，其包括以下步骤培养包含DNA构建体的宿主细胞，所说的DNA构建体包括与表达第一DNA片段所需附加DNA片段可操作地连接的编码人Kunitz型抑制剂的第一DNA片段，其中所说的Kunitz型抑制剂包括SEQ ID NO15的氨基酸序列，其中各Xaa分别是除半胱氨酸外的任何氨基酸；以及分离所说的Kunitz型抑制剂。
14.根据权利要求13的生产人Kunitz型抑制剂的方法，其中所说的第一DNA片段包括SEQ ID NO2中所示从氨基酸编号1之蛋氨酸到氨基酸编号235之苯为氨酸的氨基酸序列、SEQ IDNO2中所示从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号89之异亮氨酸的氨基酸序列、SEQ ID NO2中所示从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号152之赖酸的氨基酸序列或SEQ ID NO2中所示从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号211之丙氨酸的氨基酸序列。
15.根据权利要求13的生产人Kunitz型抑制剂的方法，其中所说的第一DNA片段包括SEQ ID NO14中所示从核苷酸1到核苷酸165的核苷酸序列，其中各核苷酸三联体1-3、4-6、160-162和163-165分别编码除半胱氨酸外的任何氨基酸。
16.根据权利要求13的生产人Kunitz型抑制剂的方法，其中的所说的第一DNA片段包括SEQ ID NO1中从核苷酸39到核苷酸743的核苷酸序列、SEQ ID NO1中从核苷酸138到核苷酸305的核苷酸序列、SEQ ID NO1中从核苷酸138到核苷酸493的核苷酸序列或SEQ ID NO1中从核苷酸138到核苷酸671的核苷酸序列。
17.具有氨基末端和羧基末端的分离的人Kunitz型抑制剂，其包括SEQ ID NO15所示的氨基酸序列，其中各Xaa分别编码除半胱氨酸外的任何氨基酸。
18.根据权利要求17的分离的人Kunitz型抑制剂，其中所说的抑制剂包括SEQ ID NO2中所示从氨基酸编号1之蛋氨酸到氨基酸编号235之苯为氨酸的氨基酸序列、SEQ ID NO2中所示从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号89之异亮氨酸的氨基酸序列、SEQ ID NO2中所示从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号152之赖酸的氨基酸序列或SEQ ID NO2中所示从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号211之丙氨酸的氨基酸序列。
19.根据权利要求17的分离的人Kunitz型抑制剂，其中所说的抑制剂进一步在其氨基末端包括SEQ ID NO12或SEQ IDNO13的氨基酸序列。
20.含有根据权利要求17之人Kunitz型抑制剂并加有药学上可接受之载体的药物组合物。
21.根据权利要求20的药物组合物，其中所说的Kunitz型抑制剂包括SEQ ID NO2中所示从氨基酸编号1之蛋氨酸到氨基酸编号235之苯为氨酸的氨基酸序列、SEQ ID NO2中所示从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号89之异亮氨酸的氨基酸序列、SEQ ID NO2中所示从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号152之赖酸的氨基酸序列或SEQ ID NO2中所示从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号211之为丙氨酸的氨基酸序列。
22.根据权利要求20的药物组合物，其中所说的人Kunitz型抑制剂进一步在其氨基末端包括SEQ ID NO12或SEQ IDNO13的氨基酸序列。
23.与人Kunitz型抑制剂特异结合的分离的抗体，所说的抑制剂包括SEQ ID NO15的氨基酸序列，其中各Xaa分别是除半胱氨酸外的任何氨基酸。
24.根据权利要求23的分离的抗体，其中所说的抗体是单克隆抗体。
25.产生与人Kunitz型抑制剂特异结合之单克隆抗体的杂交瘤，所说的抑制剂包括SEQ ID NO15的氨基酸序列，其中各Xaa分别是除半胱氨酸外的任何氨基酸。
26.至少有12个核苷酸的探针，所说的探针能够与编码人Kunitz型抑制剂的核酸杂交，所说的核酸包括SEQ ID NO1的核苷酸序列，SEQ ID NO1的核苷酸变体、或编码与SEQ IDNO1或其变体互补之DNA序列的DNA片段。
27.包含质粒J-2-11/PUC19的大肠杆菌宿主细胞(ATCC登记号69425)。
28.抑制哺乳动物体内血液凝固的方法，其包括以足以抑制血液凝固的量投用根据权利要求17的人Kunitz型抑制剂。
29.根据权利要求28的抑制哺乳动物体内血液凝固的方法，其中所说的Kunitz型抑制剂包括SEQ ID NO2中所示从氨基酸编号1之蛋氨酸到氨基酸编号235之苯为氨酸的氨基酸序列、SEQ ID NO2中所示从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号89之异亮氨酸的氨基酸序列、SEQ ID NO2中所示从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号152之赖酸的氨基酸序列或SEQ IDNO2中所示从氨基酸编号34之谷氨酸到氨基酸编号211之丙氨酸的氨基酸序列。
30.根据权利要求28的抑制哺乳动物体内血液凝固的方法，其中所说的Kunitz型抑制剂进一步在其氨基末端包括SEQ IDNO12或SEQ ID NO13的氨基酸序列。
全文摘要
本发明提供分离的DNA分子，该分子包括编码新的人Kunita型抑制剂的DNA片段。还提供包括第一DNA片段的DNA构建体，以及含有这些DNA构建体的宿主细胞和由所说的宿主细胞生产蛋白质的方法，其中所说的编码新的人Kunitz型抑制剂的第一DNA片段可操作地连接到表达该第一DNA片段所需的附加DNA片段上。
文档编号A61K38/55GK1139955SQ94194406
公开日1997年1月8日 申请日期1994年11月2日 优先权日1993年11月5日
发明者C·A·斯普里尔, W·凯瑟尔, D·C·佛斯特 申请人:津莫吉尼蒂克斯公司, 新墨西哥大学