专利名称：肝细胞生长因子激活剂的抑制剂－1的抗体和其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及定量测定肝细胞生长因子激活剂的抑制剂-1(下文中，有时缩写为“HAI-1”)的抗体或单克隆抗体，以及涉及利用该抗体的方法，和涉及测量它的试剂盒。同时，本发明还涉及检测和测量患有疾病，特别是器官炎症，肾炎，癌症，肝疾病，血液疾病，心肌梗死，心绞痛，脑梗塞或血栓形成的病人的状态。
背景技术：
已知肝细胞生长因子激活剂的抑制剂-1(HAI-1)是肝细胞生长因子抑制剂的控制试剂，和一类Kuniz型的丝氨酸蛋白酶抑制剂(Shimomura等人，生物化学杂志，272卷6370-6376(1997))。HAI-1被认为是具有穿透细胞膜的部分的蛋白质(下文中称为“细胞质膜穿透部分”)，并且据报道具有的分子量约为66,000(电泳)(Shimomura等人，生物化学杂志，126卷821-828页(1999))。同时，已知HAI-1存在于HAI-1生产培养细胞例如MKN45的培养物上清液中，处于没有细胞质膜穿透部分的状态。已经有报道，通过在还原条件下的SDS-PAGE方法的测量，这些可溶的HAI-1分子包括，分子量约为58,000的分子，分子量约为48,000的分子，分子量约为40,000的分子，分子量约为39,000的分子，这些都称为“HAI的可溶形式”(Shimomura等人，生物化学杂志，126卷821-828(1999年))；本文中，这些称为“可溶HAI-1”。
已经知道HAI-1具有蛋白酶抑制剂的作用，如抑制肝细胞生长因子激活因子[这是作用于肝细胞生长因子(下文中称为“HGF”(Naka等人，生物化学杂志，267卷20114-20119(1992年)的因子)，和将它进行特定的限制降解而激活它的作用(Shimomura等人，细胞技术，8卷219-229页(1992)))。HAI-1的已知的抗体包括鼠单克隆抗体C76-18和1N7(Shimomura等人，JP11-295309 AC76-18，Kataoka等人，组织化学细胞化学杂志，47卷673-682页(1999年)1N7)。利用这一抗体的组织染色已经显示HAI-1在正常人的胰，肝，小肠和子宫中表达。对患有肝癌的病人已经利用上面的抗体进行了组织染色，并且已经检测了HAI-1的表达(Kataoka等人，癌症研究，60卷6148-6159页，2000年)。但是，在人的病理学中，HAI-1的作用和功能还没有阐明。另外，在生物成分如血液中可溶的HAI-1的浓度和病理学之间的关系还未知。
为了分析生物成分如血液中可溶HAI-1的浓度和病理学之间的关系，需要定量测定存在于生物成分如人的组织，体液，尿或血液中的可溶HAI-1。然后，为了定量测定可溶的HAI-1，获得识别可溶HAI-1的高亲和力抗体是必不可少的，特别理想的是高亲和力的单克隆抗体。
已知HAI-1的抗体包括鼠单克隆抗体C76-18和1N7(Shimomura等人，JP11-295309AC76-18，Kataoka等人，组织化学细胞化学杂志，47卷673-682页(1999年)1N7)。但是，仍没有具有适当特性，用于定量测定可溶HAI-1的抗可溶HAI-1抗体或仍没有用于检测或定量测定存在于生物成分如人血液中的可溶HAI-1的方法或其试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供利用识别可溶HAI-1的高亲和力抗体检测可溶的HAI-1的方法，定量测定它的方法和检测与可溶HAI-1相关的疾病的方法，定量测定它的方法和试剂盒。
上面所述的HAI-1鼠单克隆抗体，即C76-18和1N7(Shimomura等人，JP11-295309 AC76-18，Kataoka等人，组织化学细胞化学杂志，47卷673-682页(1999年)1N7)是不适于定量测定生物成分中的可溶HAI-1的。事实上，利用得到的现存的抗体构建检测可溶HAI-1的测量系统的努力还没有实现允许确定血液中可溶HAI-1的浓度的系统的构建。其原因如下。即，虽然现存的抗体能够识别细胞表面的HAI-1，但不能识别可溶的HAI-1，如存在于生物成分如血液或尿中的HAI-1。或者，因为现存的抗体可能对HAI-1的亲和力低，并且不能与生物成分中的可溶HAI-1充分结合。事实上，所测量HAI-1的现存抗体的离解常数是C76-18Kd＝1.48×10-9M，和1N7Kd＝1.68×10-8M，这对应于测量人生物成分中可溶HAI-1浓度的不充分亲和力。
另一方面，作为广泛的研究的结果，本发明的发明人成功地得到了可溶HAI-1的高亲和力鼠单克隆抗体。发明人已经得到的可溶HAI-1的高亲和力鼠单克隆抗体HAI-1A-1-1-3-4具有的抗原-抗体反应的离解常数Kd＝2.67×10-10M，这比常规抗体的亲和力高很多，同时它还具有足够的确定人生物成分中可溶HAI-1的浓度的亲和力。所以，发明人成功地利用这样的抗体构建了定量测定系统。另外，发现本发明的抗体具有足够分析人病理学中可溶HAI-1的浓度和各种人类疾病之间的关系的亲和力。
因此，为了分析人病理学中的血液中可溶的HAI-1的浓度和各种人疾病之间的关系，本发明人考虑构建利用高亲和力的抗体HAI-1A-1-1-3-4确定人血液中HAI-1的高敏感定量测定系统。即采取了利用可溶HAI-1的鼠单克隆抗体HAI-1A-1-1-3-4的双抗体三明治方法的酶联免疫吸附测定(下文中，缩写为“ELISA测定系统”)，并且构建了兔多克隆抗体，测量了健康人和患有各种疾病如器官疾病的病人的血液(血浆或血清)中可溶HAI-1的浓度。
结果是，通过使用本发明的可溶HAI-1特异高敏感测量方法和其试剂盒，本发明人第一次阐明了健康人中可溶HAI-1的血液水平范围，发现在患有肾小球性肾炎等器官疾病、癌症、或血栓形成的病人的血液中存在的可溶HAI-1的量增加得相当大。
基于这些发现，本发明已经完成，并且提供如下内容。
(1)识别和定量结合可溶肝细胞生长因子激活剂的抑制剂-1(可溶HAI-1)的抗体。
(2)(1)所述的抗体，其中还原条件下SDS-PAGE测量得到的可溶HAI-1的分子量约为39,000到58,000道尔顿。
(3)(1)或(2)所述的抗体，其中抗体具有的对可溶HAI-1的离解常数是2×10-9M或更少。
(4)(1)到(3)的任何一项所述的抗体，其中抗体是单克隆抗体。
(5)(4)所述的单克隆抗体，其中抗体是利用登记号为FERM BP-8022的杂交瘤生产的。
(6)生产(4)所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
(7)(6)所述的杂交瘤细胞系，其中细胞系是登记号为FERM BP-8022的杂交瘤。
(8)定量测定可溶HAI-1的方法，包括利用一个或多个(1)到(5)的任意一项所述的抗体免疫测量可溶HAI-1。
(9)(8)所述的方法，其中含有待测量的可溶HAI-1的样品是从怀疑有病的受试者或动物中收集的生物成分。
(10)(9)所述的方法，其中疾病选自器官炎症，肾炎，癌症，肝疾病，血液疾病，心肌梗死，心绞痛，脑梗塞和血栓形成。
(11)据(9)所述的方法，其中疾病是肝细胞癌或胰胰癌。
(12)检测疾病的方法，包括检测或测量从怀疑患病的受试者收集的生物样品中的可溶HAI-1。
(13)根据(12)所述的方法，其中疾病选自器官炎症，肾炎，癌症，肝疾病，血液疾病，血液疾病，心肌梗死，心绞痛，脑梗塞和血栓形成。
(14)根据(12)所述的方法，其中疾病选自肝细胞癌和胰腺癌。
(15)根据(9)或(12)的方法，其中生物成分是血液或它的分级分离产物或处理产物。
(16)根据(9)或(12)所述的方法，其中生物成分是血浆或血清。
(17)根据(9)或(12)所述的方法，其中生物成分是尿。
(18)检测或定量测定可溶HAI-1的试剂盒，包括一个或几个(1)所述的抗体。
(19)根据(18)所述的试剂盒，其中试剂盒是用于诊断至少一种选自器官炎症，肾炎，癌症，肝疾病，血液疾病，血液疾病，心肌梗死，心绞痛，脑梗塞和血栓形成的疾病。
(20)根据(18)所述的试剂盒，其中该试剂盒是用于测量从怀疑患病的病人收集的生物成分中的可溶HAI-1。
(21)根据(18)所述的试剂盒，其中通过免疫学染色进行可溶HAI-1的检测或测量。
在本说明书中，识别可溶HAI-1的单克隆抗体有时称为“可溶HAI-1特异高亲和力单克隆抗体”，识别可溶HAI-1的多克隆抗体有时称为“可溶HAI-1特异多克隆抗体”。另外，这些抗体可以总称为“可溶HAI-1特异高亲和力抗体”。另外，短语“识别可溶HAI-1”指“通过抗原-抗体反应结合可溶HAI-1”的抗体。在这种情况下，本发明的可溶HAI-1特异高亲和力抗体可以与全长HAI-1或其部分结合。
如本文所用，短语“定量结合”指抗体结合的程度可使与可溶HAI-1浓度相关的本发明的可溶HAI-1特异高亲和力抗体和可溶HAI-1之间的结合的检测成为可能。具体地，是指抗体结合的程度使通过免疫学方法如酶免疫测定，放射免疫测定，荧光免疫测定，化学发光免疫测定，免疫印迹，免疫层析，或乳胶凝集实验定量测定可溶HAI-1成为可能。例如，含量为10纳克/毫升或更多，优选1纳克/毫升或更多，或更优选0.5纳克/毫升或更多的能够定量测定可溶HAI-1的抗体可以用作本发明的可溶HAI-1特异高亲和力抗体。
根据本发明，可以提供特异地结合可溶HAI-1的单克隆抗体和多克隆抗体。本发明的抗体可以用于特异地和高度敏感地测量和检测可溶HAI-1。
本发明的测定可溶HAI-1的方法可以用于通过可溶HAI-1的血液水平反映的各种疾病的诊断。
图1A说明HAI-1的浓度范围是0到49纳克/毫升的HAI-1测定系统中标准HAI-1和各个单克隆抗体之间的反应性。
图1B是说明HAI-1的浓度范围是出自图1A所示范围中的0到2.5纳克/毫升的HAI-1测定系统中标准HAI-1和各个单克隆抗体之间的反应性的放大图，其中实心菱形表示HAI-1A-1-1-3-4；空心方块表示C76-18；三角表示IN7；且图2是表示健康人的血清中HAI-1的量的柱形图。
具体实施例方式
在下文中，将详细叙述本发明。
<1>制备可溶HAI-1特异高亲和力抗体的免疫原和筛选抗体用作免疫原的HAI-1可以是全长的HAI-1或可溶的HAI-1，即HAI-1的细胞外区或它的部分肽。为了有效地得到可溶HAI-1特异高亲和力抗体，优选使用可溶HAI-1或它的部分肽。用于筛选单克隆抗体的至少一个免疫原和HAI-1优选是可溶HAI-1或其部分肽。
作为可溶HAI-1，可以利用例如，根据Shimomura等人的方法(生化杂志，272卷7370-6370(1997年))得到的HAI-1生产细胞系如，MKN45的培养物的纯化上清液。同样，利用JP 9-95497A(US 6,225,081)所述的HAI-1cDNA，通过微生物如大肠杆菌，昆虫细胞，酵母和动物生产的重组蛋白质HAI-1也可以被利用。另外，具有化学合成制备的HAI-1的部分序列的肽也可以被利用。
特别是，为了得到HAI-1特异高亲和力抗体，优选制备高纯度的HAI-1。为了达到这一目的，需要本文所用的HAI-1，即利用HAI-1cDNA制备的重组蛋白质。例如，可以通过在适当的表达载体中插入全长或部分的JP 9-95497(US6,225,081)中所述的编码HAI-1的HAI-1cDNA，在微生物如大肠杆菌，昆虫细胞，酵母，动物细胞或动物中导入表达载体，将表达HAI-1的这种转基因细胞或细胞内部分、组织或体液进行纯化来得到重组HAI-1。在利用适于作为表达上面所述的cDNA的宿主的动物细胞，例如CHO细胞的情况中，可溶HAI-1是释放在培养物上清液中的。另一方面，在利用微生物细胞作为宿主的情况中，可以表达HAI-1cDNA中编码细胞外区域的部分。另外，如果需要可以利用适当的分泌信号。
利用具有快速翻译系统RTS500(Roche Diagnostics Co.)的体外转录/翻译系统而不利用任何细胞系统制备靶HAI-1也是可能的。
作为特别的例子，通过在动物细胞中导入在动物细胞表达载体的启动子的下游插入JP 9-95497 A(US 6,225,081)的HAI-1 cDNA的表达载体，选择表达HAI-1 cDNA的细胞，从培养物的上清液纯化可溶HAI-1来得到可溶HAI-1是可能的。通过蛋白质的普通纯化方法如，利用HPLC的凝胶过滤或亲和层析可以进行可溶HAI-1的纯化。
高纯度的可溶HAI-1不仅作为免疫原是重要的，而且作为通过亲和纯化分离可溶HAI-1特异多克隆抗体和筛选可溶HAI-1特异高亲和力单克隆抗体的材料也是非常重要的。同样，作为在定量测定时的可溶HAI-1的标准制剂也是重要的。
<2>可溶HAI-1特异高亲和力单克隆抗体的制备为了得到可溶HAI-1特异高亲和力单克隆抗体，可以利用上面所述的HAI-1，优选可溶HAI-1作为免疫的抗原执行常用免疫学方法。
用于免疫的动物不受特别的限制，兔，山羊，绵羊，小鼠，大鼠，豚鼠和鸡中的任何一种都可以利用。用于免疫的抗原的接种是在将用于免疫的抗原与完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂完全混合后在皮下，肌肉内，或腹膜内进行的。接种是每2星期到5星期进行一次，直到免疫动物中所接种抗原的抗体效价充分增加(即，在高亲和力抗体的情况中，通过ELISA方法测定优选具有1,000,000倍稀释或更多的效价)并且至少持续一个预定的时期(即，在高亲和力抗体的情况中至少2个月)。然后，对表现出抗体效价充分增加的免疫动物在静脉内只注射抗原，在注射后3天，收集被认为含有抗体生产细胞的脾，淋巴结，将脾细胞或淋巴细胞与肿瘤细胞融合。然后，分离通过细胞融合永生的抗体生产细胞(杂交瘤)。通常，需要从与已经进行免疫的动物和已经从中制备脾细胞或淋巴细胞的动物的同种动物中获得本文所使用的肿瘤细胞。但是，也可以利用不同种动物的肿瘤细胞。
可以利用的肿瘤细胞的例子包括骨髓瘤细胞，如p3(p3/x63-Ag8)，P3U1，NS-1，MPC-11，SP2/0，FO，x63.5.3，S194和R210。根据常用的方法，例如“单克隆抗体实验手册”(Kodansha Scientific，1987)中所述的方法可以进行细胞融合。通过在悬浮待融合细胞的融合培养基中加入细胞融合加速剂可以进行细胞融合。细胞融合加速剂包括仙台病毒，平均分子量为1,000到6,000的聚乙二醇等等。在这种情况下，为了进一步增强融合的效力，可以在融合培养基中加入佐剂如二甲亚砜或细胞因子如IL-6。肿瘤细胞与免疫的脾细胞或淋巴细胞的混合比例例如可以是脾细胞或淋巴细胞是肿瘤细胞的约1到10倍。
可以利用的融合培养基包括各种常用的培养基，如ERDF培养基，RPMI-1649培养基，和MEM培养基。在融合时，通常建议从培养基中去除胎牛血清(FBS)或其它血清等等。在上面所述的培养基中将预定量的免疫脾细胞或淋巴细胞和肿瘤细胞相互完全混合，加入预先加热到约37度的约20％到约50％的聚乙二醇溶液，允许混合物优选在30到37度反应约1到10分钟进行融合。随后，连续加入适当的培养基，离心混合物，除去上清液。重复这一过程。
在普通的选择培养基，例如，HAT培养基中(含有次黄嘌呤，氨基蝶蛉和胸腺嘧啶)培养靶杂交瘤。在HAT培养基中的培养通常可以进行几天到几星期，这对于待杀死的靶杂交瘤以外的细胞(未融合的细胞等)，时间是足够的。在得到可溶性HAI-1特异高亲和力单克隆抗体上的技术重要措施是它的筛选。通过分析可溶HAI-1或通过利用各种免疫化学方法的上述方法得到的类似物质可以筛选产生可溶HAI-1特异高亲和力单克隆抗体的杂交瘤。例如，用作筛选抗原的可溶HAI-1与杂交瘤培养物的上清液中分泌的单克隆抗体的结合可以通过酶免疫测定如ELISA方法或选择靶杂交瘤的蛋白印迹方法来分析。
具体地，将上面所述的杂交瘤的培养物上清液加到粘附于例如筛选平板的可溶HAI-1，并用BSA或类似物封闭，选择能够识别可溶HAI-1的抗体的杂交瘤。将选定的杂交瘤培养物上清液加到可溶HAI-1粘附的ELISA方法使用的平板，并允许反应，在充分洗涤后，在其中加入标记的抗鼠IgG多克隆抗体，接着进一步反应。在一次洗涤操作后，检测标记，选择培养物上清液与粘附于平板的可溶HAI-1反应的杂交瘤。可以利用的标记包括各种酶，荧光物质，化学发光物质，放射性同位素，生物素，抗生物素蛋白和后面将要叙述的等等。
上面所述的筛选可以生成产生识别可溶HAI-1的单克隆抗体的杂交瘤。另一方面，在筛选这样的杂交瘤的基础上，与上面所述的部分序列肽的反应性也可以用作指标。如果与可溶HAI-1反应，通过这样的方法选择的杂交瘤产生的抗体优选可以进一步检测。
虽然已经有报道，可溶HAI-1包括具有分子量约为58,000，约48,000，约40,000和约39,000的分子种类，不管分子量，只要本发明的HAI-1特异高亲和力单克隆抗体对没有细胞质膜穿透部分的可溶HAI-1具有高亲和力，则其不受特别限制。但是，本发明的单克隆抗体优选结合具有各个分子量的任何上面所述的可溶HAI-1。
本发明的可溶HAI-1特异高亲和力单克隆抗体对于可溶HAI-1的理想离解常数是2×10-9M或更小，优选1×10-9M或更小，更优选5×10-10M或更小。
生产上面所述的可溶HAI-1特异高亲和力单克隆抗体的杂交瘤克隆明确包括下面的实施例中所述的HAI-1A-1-1-3-4。除了HAI-1A-1-1-3-4，产生本发明的可溶HAI-1特异高亲和力单克隆抗体的杂交瘤可以容易地参考本文的叙述和利用本领域技术人员已知的方法来得到。
通过有限稀释方法克隆得到的杂交瘤，可以得到产生单克隆抗体的单个杂交瘤克隆。在含有约1％到约5％的FBS的培养基中培养这一杂交瘤克隆，在这一培养基中，牛抗体(IgG)已经预先除去，或在无血清培养基中培养这一杂交瘤克隆，并且得到的培养物上清液被提供作为纯化靶单克隆抗体的原材料。另一方面，可以将得到的杂交瘤克隆转移到预先给予降植烷的Balb/C小鼠或Balb/c(nu/nu)小鼠的腹腔，在10到14天后，可以收集含有高浓度的单克隆抗体的腹水以提供纯化靶单克隆抗体的原材料。利用普通纯化免疫球蛋白的方法可以纯化单克隆抗体。例如，通过硫酸铵分级分离方法，聚乙二醇分级分离方法，乙醇分级分离方法，阴离子交换层析，结合蛋白质A或蛋白质G的亲和层析等等可以进行纯化。
<3>可溶HAI-1特异多克隆抗体的制备通过利用HAI-1，优选可溶的HAI-1或其部分肽作为用于免疫的抗原在从免疫的动物中派生得到的多克隆抗体中纯化识别可溶HAI-1的抗体的方法可以得到可溶HAI-1特异高亲和力多克隆抗体。作为得到多克隆抗体的免疫抗原，也可以利用由上面所述的HAI-1部分序列肽和载体组成的融合形式。
用于免疫的动物是不受特别限制的，兔，山羊，绵羊，小鼠，大鼠，豚鼠，鸡等等中的任何一个都可以利用。在将免疫用的抗原与完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂完全混合后，将免疫的抗原对动物在皮下，肌肉内，或腹膜内接种。接种以每2星期到5星期进行一次，直到免疫动物对接种抗原的抗体效价足够提高。然后，给免疫动物在静脉内只注射抗原，在注射后3到5天获取抗血清。
利用普通免疫球蛋白纯化方法，例如硫酸铵分级分离方法，聚乙二醇分级分离方法，乙醇分级分离方法，阴离子交换层析，结合与蛋白质A或蛋白质G的亲和层析等等可以从得到的抗血清纯化多克隆抗体。
得到可溶HAI-1特异多克隆抗体的纯化方法可以是分级分离或纯化识别可溶HAI-1的多克隆抗体的任何方法，其例子包括离子交换层析，疏水层析，分子筛层析，逆相层析，羟磷灰石层析，亲和层析，凝胶电泳，免疫电泳等等。它的一个特定的例子是利用了上面固定了可溶HAI-1的树脂的亲和柱层析。例如，利用固定可溶HAI-1的树脂，将上面所述的方法得到的用作材料的多克隆抗体进行亲和层析。通过这一方法，回收与可溶HAI-1结合的存在于吸附组分中的多克隆抗体。
通过这些方法，可以得到可溶HAI-1特异多克隆抗体。在亲和层析的方法中，可以利用可溶HAI-1的部分序列的肽。固定肽的树脂可以用作亲和层析中的固定载体，用于纯化可溶HAI-1特异多克隆抗体。
在严格意义上说，多克隆抗体没有离解常数。但是，通过与用于单克隆抗体相似的方法，即下面的实施例4中所述的方法可以得到与可溶HAI-1的离解常数相似的值。以这样的方法测量，本发明的可溶HAI-1特异多克隆抗体具有的值为2×10-9M或更少，优选地1×10-9M或更少，更优选地为5×10-10M或更少是需要的。
<4>特异和定量测定可溶HAI-1的方法本方法是利用本发明的可溶HAI-1特异高亲和抗体定量测定可溶HAI-1的方法。本发明的方法可以可以用于在生物样品中定量测定HAI-1的各种诊断方法，测量方法，测定方法。只要打算用于可溶HAI-1的定量测定，本方法不受特别限制。本方法包括例如，特异性检测可溶HAI-1的组织染色方法或免疫沉淀方法，特定地检测可溶HAI-1的竞争结合测定，或直接或间接的三明治测定；二抗体三明治测定等等。检测方法包括酶免疫测定，放射免疫测定，荧光免疫测定，化学发光免疫测定，免疫印迹，免疫层析，乳胶凝集实验等等。
免疫印迹的应用的例子包括利用已经加入或固定了可溶HAI-1特异高亲和抗体的微阵列或芯片。在检测与可溶HAI-1的反应的荧光偏斜溶液方法或荧光相关变异方法中，利用具有荧光标记的可溶HAI-1特异高亲和抗体是可能的。另外，利用表面等离子体共振器测量可溶HAI-1特异高亲和抗体和可溶HAI-1之间的反应是可能的。例如，允许含有可溶HAI-1的生物样品流过装备了已经结合了可溶HAI-1特异高亲和抗体的传感器芯片的表面等离子体共振器，和跟踪应答信号随时间的变化可以定量测定生物成分中的可溶HAI-1。
在特异性测定可溶HAI-1的方法中利用的抗体例如HAI-1特异高亲和抗体可以利用，因为它是或可能是利用木瓜蛋白酶处理时得到的Fab形式的抗体或用胃蛋白酶处理时得到的F(ab’)2或F(ab’)形式的抗体。两种处理是已确定的方法。可溶HAI-1特异高亲和抗体的片段也包括在本发明中。这样的片段例如包括在H链和L链的可变区或可溶HAI-1特异高亲和抗体的超变区中含有互补决定区(CDR)的片段。
定量测定生物成分中的可溶HAI-1的双抗体三明治实验包括特异地测定可溶HAI-1的方法，包括步骤(1)将含有一个或多个可溶HAI-1特异高亲和力抗体的试剂与样品中的可溶HAI-1反应产生免疫反应产物，(2)在分离免疫反应产物后，将免疫反应产物与识别免疫反应产物中的可溶HAI-1的标记抗体反应，和(3)测定与免疫反应产物结合的标记抗体；或特异地测定可溶HAI-1的方法，包括步骤(1)将含有可溶HAI-1和包括一个或多个可溶HAI-1特异高亲和抗体的原初抗体的试剂与样品中的可溶HAI-1反应，产生免疫反应产物，(2)在分离免疫产物后，将免疫反应产物与识别免疫反应产物中的可溶HAI-1的二级抗体反应产生免疫反应产物，(3)在分离免疫反应产物后，使识别免疫反应产物中的二级抗体的标记抗体反应，和(4)测定结合于免疫反应产物的标记抗体。
具体地，将作为一级抗体的可溶HAI-1特异多克隆抗体或可溶HAI-1特异高亲和力多克隆抗体通过常规方法固定于固相，如微量滴定孔或微磁珠。然后，将固相表面上的过量的蛋白质结合位点用牛血清白蛋白，脱脂乳，明胶等等封闭。然后，在固相表面上加入含有可溶HAI-1的生物成分，在固相表面形成免疫反应产物，接着洗涤。然后，加入作为二级抗体的标记多克隆抗体或标记的单克隆抗体，并使其反应。这时，在单克隆抗体用作一级抗体的情况中，具有与一级抗体不同的表位的标记的可溶HAI-1特异高亲和力单克隆抗体可以用作二级抗体。另外，在洗涤后，测定标记抗体的量，给出了生物成分中可溶HAI-1的测定量。
本文所用的多克隆抗体或单克隆抗体的标记可能包括如碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶，脲酶，和葡萄糖氧化酶，和荧光物质如荧光素衍生物和罗丹明衍生物。另外，标记可以是允许时间分辨荧光测定的稀土元素或稀土元素复合物，如铕或铕复合物。另外，标记可以是化学发光物质如丫啶酯或放射性同位素如125I，3H，14C，和32P。即本发明包括利用测定颜色，荧光，时间分辨荧光，化学发光，电化学荧光，或放射性而定量测定生物成分中的可溶HAI-1。同样，本发明包括用生物素标记二级抗体并检测碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶，脲酶，或葡萄糖氧化酶，荧光素衍生物，罗丹明衍生物，稀土元素复合物，化学发光物质如丫啶酯，放射性同位素，如125I，3H，14C，和32P，形成含有抗生物素蛋白的复合物。
<5>特异地和定量地测定或染色可溶HAI-1的试剂盒特异地测定可溶HAI-1的试剂盒或特异地染色可溶HAI-1的试剂盒是诊断通过测定或检测可溶HAI-1而鉴定的疾病的试剂盒。本发明已经首次发现，测定可溶HAI-1能够诊断疾病状态下的病人，例如患有器官疾病包括肾小球性肾炎，肾炎，肝炎，胰腺炎，肺炎，肠炎，和胃炎的病人，患有癌症的病人，患有肝病的病人，患有血液病的病人，患有血栓形成包括心绞痛，心肌梗死，和脑梗死的病人。所以，测量或检测可溶HAI-1能够检测如上所述的各种疾病。在本发明中，只要设计成特异地测定靶可溶HAI-1，对于构成的物质和方法，特异地测定可溶HAI-1的试剂盒是不受特别限制的。
具体地，本发明的试剂盒包括利用电泳，HPLC方法，各种柱层析方法，各种阵列，芯片，或表面等离子体共振器等测定或检测可溶HAI-1而诊断疾病的那些试剂盒。更具体地说，本发明的试剂盒包括使用利用抗体的免疫学方法测定或检测可溶HAI-1的试剂盒。可以利用的抗体至少包括上述识别可溶HAI-1的抗体。
例如，在本发明的试剂盒基于双抗体三明治方法的情况中，它包括特异地测定可溶HAI-1的试剂盒，方法包括步骤(1)将含有可溶HAI-1和一个或多个可溶HAI-1特异高亲和力抗体的试剂与样品中的可溶HAI-1反应产生免疫反应产物，(2)在分离免疫反应产物后，将免疫反应产物与识别免疫反应产物中的可溶HAI-1的标记抗体反应，和(3)测定与免疫反应产物结合的标记抗体；或特异地测定可溶HAI-1的试剂盒，测定方法包括步骤(1)将包含可溶HAI-1和由一个或多个可溶HAI-1特异高亲和力抗体组成的一级抗体的试剂与样品中的可溶HAI-1反应产生免疫反应产物，(2)在分离免疫反应产物后，将免疫反应产物与识别免疫反应产物中的可溶HAI-1的二级抗体反应，产生免疫反应产物，(3)在分离免疫反应产物后，使识别免疫反应中二级抗体的标记抗体进行反应，和(4)测定结合于免疫反应产物的标记抗体。
试剂盒至少包括可溶HAI-1特异高亲和力单克隆抗体或可溶HAI-1特异多克隆抗体，并且可以进一步包括进行检测或测定可溶HAI-1所必需的构成元件，构成元件的例子包括作为标准蛋白，酶，底物等等的可溶性HAI-1。试剂盒可以含有处于结合到标记物质如酶的状态中的单克隆抗体或多克隆抗体，或者可以含有识别抗体的标记抗体。另外，试剂盒可以含有各种类型的适当缓冲液，抗原稀释液，反应稀释液，底物溶液，反应终止溶液等。本发明的试剂盒可以包括检测和定量检测可溶HAI-1所必须的具有标记和包囊物质的容器。适当的容器的例子包括玻璃或各种塑料物质如聚丙烯，聚苯乙烯，聚碳酸酯，尼龙，聚四氟乙烯等等制成的容器。除了上面所述检测测量可溶HAI-1必需的物质和容器外，试剂盒优选地含有叙述检测或测量可溶HAI-1的方法的手册。
<6>与人的疾病有关的可溶HAI-1特异高亲和力抗体和利用它的方法通过利用本发明的可溶HAI-1特异高亲和力抗体和其试剂盒的方法，在疾病状态的病人中收集的生物成分中的可溶HAI-1是可以检测的或定量地测定的。检测可溶HAI-1的生物物质是不受特别限制的，在进行适当的预处理后，任何生物物质如组织，血清，血浆，尿，血清，脑脊液，组织提取液等等是可以利用的。检测或定量测定疾病状态的病人的生物物质中存在的可溶HAI-1能够诊断，预测或评估疾病的进程。疾病的例子包括器官疾病，包括肾小球性肾炎，肾炎，肝炎，胰腺炎，肺炎，肠炎，和胃炎，癌症，肝病，血液疾病，血栓形成，包括心绞痛，心肌梗死，和脑梗死等等。
具体地，肾炎的例子包括系膜增生性肾炎，IgA肾炎，膜性增生性肾炎，膜性肾炎，多发性硬化肾小球肾炎，急性肾衰竭，链球菌急性肾小球肾炎，慢性/急性间质肾炎，肾病综合症等等。心绞痛和心肌梗死的例子包括劳力性心绞痛，不稳定心绞痛，急性心肌梗死，慢性顽固性心肌梗死，和稳定性心绞痛。了解接受冠状动脉介入手术，跨食管的超声心动图，下肢动脉旁路手术，或主动脉气球泵手术的病人或患有急性主动脉分离的病人的疾病状态和预后是可能的。癌症的例子包括肝细胞癌和胰腺癌。
因为期望的是具有特异地抑制可溶HAI-1的活性的效力，所以可溶的HAI-1特异高亲和力抗体可以用于治疗可溶HAI-1引起的疾病也是合理的期望。
例如，可溶HAI-1具有作用于失活型HGFA从而抑制它的激活作用的特性。所以，抑制可溶HAI-1的抑制活性的抗体将增加活生物体中出现的有活性型HGFA的数量，并且进一步引起有活隆型HGF的增加。因为有活性型HGF是一个血管化因子(HGF的分子医学，医学评论公司(1998))，这样的抗体可以用于血管病如，动脉粥样硬化的治疗或预防。用于这一目的的抗体优选地通过遗传工程技术人源化。通过JP 11-506327A中所述的本领域技术人员已知的方法进行抗体的人源化。
通过测量病人的生物成分中的可溶HAI-1，可以对药物的有效性作出判断，并对治疗的方案作出决定。因为存在个体差异，通常对一种疾病有效的药物并不总是对所有病人有效或产生副作用。所以，在给药之前或之后测量可溶HAI-1能够让实施者证明药物对个别病人的效力和副作用，从而给他们关于是否给予有关的药物继续治疗方面的指导。
实施例下文中，本发明将通过实施例详细叙述。但是，本发明不应该限制于实施例的范围。
实施例1可溶HAI-1特异高亲和力单克隆抗体的制备通过利用HAI-1 cDNA产生的重组CHO细胞的表达和分泌得到在可溶HAI-1测定系统中作为免疫原筛选抗原和标准可溶HAI-1的可溶HAI-1，并且通过柱层析纯化。
用含有100微克可溶HAI-1和相同体积的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂的溶液对Balb/c小鼠进行内皮和皮下给药，总共3次，每次间隔4周。在证明小鼠血清中产生可溶HAI-1特异高亲和力抗体后，通过尾静脉给予含有30微克可溶HAI-1的溶液。在3天后，取出脾脏，根据“分子克隆抗体实验手册(kodansha Scientific(1987))”中所述的方法，利用聚乙二醇将脾细胞与骨髓瘤细胞P3U1进行细胞融合，将融合的细胞分散到96板的加样孔中，接着加入HAT培养基，温育细胞14天。
然后，在培养基中筛选生产可溶HAI-1的特异性单克隆抗体的杂交瘤。即，在已经固定了可溶HAI-1并且用BSA封闭的筛选可溶HAI-1特异高亲和力抗体的ELISA平板中加入待筛选的杂交瘤培养物上清液，分析存在于培养物上清液中的单克隆抗体的反应性。在将待筛选的杂交瘤培养物上清液以100微升/孔的量加入ELISA板中后，继续反应1小时或更长时间。
然后，用含有0.05％吐温20的PBS(-)溶液(下文中缩写为“PBST溶液”)彻底洗涤平板的孔，然后，在孔中加入含有1微克/毫升HRP(辣根过氧化物酶)标记的山羊抗鼠IgG Fc多克隆抗体(从ICN公司得到)和1％的BSA的PBS(-)，量为100微升/孔，允许在室温下反应1小时。在用PBST溶液彻底洗涤后，加入含有0.4毫克/毫升邻-苯二胺(OPD，P-9029，商标，Sigma AB生产)的柠檬酸磷酸缓冲液(pH5.0)和0.015-0.03％的过氧化氢溶液，允许在室温下反应，产生颜色。然后，加入1N H2SO4溶液终止反应，在测定波长为490纳米和对照波长为650纳米下进行反应混合物的测定。
然后，通过有限稀释，将各个得到的与可溶HAI-1反应的杂交瘤克隆3次，然后回收培养物上清液，利用固定蛋白质A的柱(Amersham Pharmacia BiotechAB生产)进行亲和层析，纯化单克隆抗体。
将这样克隆的杂交瘤克隆株命名为HAI-1A-1-1-3-4。将HAI-1A-1-1-3-4于2001年10月19日，以登记号FERM P-18565保藏在国家现代工业科学和技术研究院(Chuo 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，邮编305-8566，日本)，国际专利生物体保藏处(IPOD)，然后根据布达佩斯条约，于2002年4月17日从原初保藏单位转移到国际保藏单位，登记号为FERM BP-8022。
实施例2制备可溶HAI-1的多克隆抗体和它的标记形式按如下方法制备可溶HAI-1的多克隆抗体。即，每间隔2星期对免子进行皮下给予作为抗原的含有100微克的可溶HAI-1和同体积的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂的溶液的混合物共7次。在证明血清中产生抗体后，再在静脉内给予10微克抗原，在5天后，获取抗血清。另外，在用硫酸铵沉淀处理后，利用蛋白质A柱纯化抗血清，得到抗可溶HAI-1多克隆抗体。然后，用生物素标记得到的抗可溶HAI-1多克隆抗体，得到生物素标记的抗可溶HAI-1多克隆抗体。
实施例3构建可溶HAI-1定量测定系统将实施例1中制备的杂交瘤克隆HAI-1A-1-1-34产生的单克隆抗体和常规单克隆抗体C76-1 8和1N7用作一级抗体。将各个单克隆抗体溶解于0.05M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中(pH9.6)，直到浓度为20微克/毫升，以50微升/孔的量加入96孔板的孔中，将该板保留在4度过夜(约12小时或更长)，或在37度保留2小时或更长。在从一级抗体附着的平板中除去一级抗体溶液后，在孔中加入250-300微升/孔的含有1％BSA的PBS(-)，在4度下保留平板过夜(约12小时或更长)，或在37度下保留2小时或更长，达到封闭。在从平板除去封闭溶液后，每次在孔中加入溶解于含有0.15M NaCl，0.05％吐温20，和1％BSA的20mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)中的浓度变化为(0，0.625，1.25，2.50，5.00，10.0，20.0，或40.0ng/ml)的可溶HAI-1，50微升/孔，允许在室温下反应1小时。
然后，用含有包含500毫摩尔/毫升的NaCl，0.05％Tween 20和20毫摩尔/毫升的Tris-HCl的组合物的洗涤溶液彻底洗涤，然后，以100微升/孔的量在孔中加入含有10微克/毫升的实施例3中制备的生物素标记的抗可溶HAI-1多克隆抗体和1％的BSA，允许在室温下反应1小时。
在用上面所述的洗涤溶液彻底洗涤孔后，在孔中加入100微升/孔的含有1％的BSA与2000倍稀释的HRP-标记的链霉素抗生物素蛋白(Amersham PharmaciaBiotech AB，Code RPN1231)的PBS(-)，并且允许在室温下反应1小时。在用上面所述的洗涤溶液彻底洗涤后，在孔中加入含有0.4mg/ml邻苯二胺(OPD，P-9029，Sigma AB生产)和0.015％-0.03％的过氧化氢溶液的柠檬酸缓冲液(pH5.0)，量为100微升/孔，允许在室温下反应，产生颜色。
然后，在孔中加入100微升/孔的1N H2SO4溶液，终止反应，在测定波长为490纳米和对照波长为650纳米下进行测定。图1A和1B表示了结果。图1A说明了各个单克隆抗体与浓度范围为0到40纳克/毫升的可溶HAI-1的反应性。图1B是图1A所示的范围中的0到2.5纳克/毫升的范围的反应性的放大图。只有杂交瘤克隆HAI-1A-1-1-34得到了浓度依赖的反应曲线，常规抗体C76-18和1N6没有显示反应性。
实施例4测定HAI-1特异高亲和力单克隆抗体的离解常数测定出自实施例1中制备和纯化的可溶HAI-1特异高亲和力单克隆抗体的杂交瘤克隆HAI-1A-1-1-3-4得到的单克隆抗体和常规抗体C76-18和1N7的离解常数。在用固定可溶HAI-1到平板和用BSA封闭得到的可溶HAI-1固定平板中加入各个不同浓度的抗体，允许反应直到平衡(2小时或更多)。
然后，用含有0.05％吐温20的PBS(-)溶液(下文中缩写为“PBST溶液”)彻底洗涤平板的孔，在孔中加入含有1微克/毫升的HRP(辣根过氧化物酶)标记的山羊抗鼠IgG Fc多克隆抗体(从ICN公司得到)，量为100微升/孔，并且在孔中加入1％的BSA，允许在室温下反应1小时。在用PBST溶液彻底洗涤后，加入含有0.4毫克/毫升邻苯二胺(OPD，P-9029，Sigma AB)生产的柠檬酸磷酸缓冲液(pH5.0)和0.015-0.03％的过氧化氢溶液，允许在室温下反应，产生颜色。
然后，加入1N H2SO4溶液终止反应，在测定波长为490纳米和对照波长为650纳米下测定反应混合物。从测定的结果，进行分散画图得到离解常数。结果表示在表1。本发明得到的单克隆抗体显示了最小的离解常数，即最高的亲和力。表1抗体 离解常数HAI-1A-1-1-3-4 2.67×10-10C76-18 1.48×10-9IN7 1.68×10-8实施例5测定健康人的血液中的HAI-1利用实施例3制备的HAI-1特异高敏感度的测定系统，测定来自56个健康人的血清的可溶HAI-1。在提取后，将来自健康人的血清储藏在冷冻条件下，并且在实验之前，解冻使用。首先，在96孔板的孔中加入50微升/的20毫摩尔/毫升磷酸钠缓冲液(pH7.5)，其中含有0.15M氯化钠，0.05％吐温20，和1％的BSA，孔中粘附了一级抗体，并且按实施例3中的方法封闭，然后在孔中加入50微升/孔来自于健康人的血清或浓度变化(0，0.625，2.50，5.00，10.0或40.0ng/ml)的标准可溶HAI-1，接着允许在室温下反应1小时。然后用组成为500毫摩尔/毫升NaCl，0.05％吐温20和20毫摩尔/毫升Tris-HCl(pH7.5)的洗涤溶液洗涤孔。然后在孔中加入100微升/孔的含有10微克/毫升实施例3中制备的生物素标记的抗可溶HAI-1多克隆抗体和1％BSA的PBS，并且允许在室温下反应1小时。在用上面所述的洗涤溶液彻底洗涤后，在孔中加入100微升/孔的含有1％的BSA和2,000倍稀释的HRP标记的链霉素抗生物素蛋白(Amersham Pharmacia Biotech AB，Code RPN 1231)的PBS(-)，并且允许在室温下反应1小时。
在用上面所述的洗涤溶液彻底洗涤孔后，在孔中加入含有0.4mg/ml邻苯二胺(OPD，P9029，Sigma AB生产)的柠檬酸磷酸缓冲液(pH5.0)和0.015-0.03％过氧化氢溶液，允许在室温下反应，产生颜色。然后，在孔中加入100微升/孔的1N H2SO4溶液终止反应，在测定波长为490纳米和对照波长为650纳米下进行测定。然后，用标准可溶HAI-1的浓度和显色量制备校准曲线，计算健康人血清中可溶HAI-1的浓度。图2表示了得到的结果。在健康人的血清中(样品数56)，可溶HAI-1的浓度是在0到13.5ng/ml的范围内，平均是7.5ng/ml。
实施例6在患有各种疾病的病人中测定HAI-1利用实施例3制备的HAI-1特异高敏感测定系统，通过实施例5中所述的方法测定患有各种疾病的病人血清中的可溶HAI-1。病人的数目是每种疾病5人。在提取后将每种血清冷冻储藏，在实验之前解冻使用。表2表示得到的结果。发现，在患有肾炎，肝炎，胰腺炎，肺癌，肝细胞癌，心肌梗死，脑梗死，肝癌和胰腺癌的病人的血液中，可溶HAI-1存在的浓度比健康人的血液中的浓度高(样品数目56，平均值7.5ng/ml)。
表2病例病人1 病人2 病人3 病人4 病人5肾炎67.0 43.3 31.7 28.1 25.7肝炎85.6 75.8 67.7 61.8 60.6胰腺炎 40.8 29.4 24.9 23.8 23.4肺癌60.2 49.7 45.7 38.0 37.4肝癌53.7 50.9 47.4 32.8 28.3心肌梗死20.7 19.9 17.8 15.8 15.4脑梗死 48.5 38.8 35.1 30.0 17.5肝细胞癌29.5 30.9 73.6 42.0 33.3胰腺癌 22.0 61.3 24.4 27.7 74.1数值表示可溶HAI-1的浓度(纳克/毫升)。
本申请是基于2001年5月25日递交的日本专利申请No.2001-157082和2002年1月16日递交的日本专利申请No.2002-7443。
权利要求
1.识别和定量结合可溶肝细胞生长因子激活剂的抑制剂-1(可溶HAI-1)的抗体。
2.权利要求1的抗体，其中可溶HAI-1通过还原条件下的SDS-PAGE所测定的分子量为约39,000到58,000道尔顿。
3.权利要求1或2的抗体，其中抗体对可溶HAI-1的离解常数为2×10-9M或更小。
4.权利要求1到3的任何一项的抗体，其中抗体是单克隆抗体。
5.权利要求4的单克隆抗体，其中抗体是由登记号为FERM BP-8022的杂交瘤生产的。
6.产生权利要求4的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
7.权利要求6的杂交瘤细胞系，其中细胞系是登记号为FERM BP-8022的杂交瘤。
8.定量测定可溶HAI-1的方法，其中包括利用权利要求1到5的任何一项的一个或多个抗体免疫测定可溶HAI-1。
9.权利要求8的方法，其中待测定可溶HAI-1的样品是从怀疑患病的受试者或动物收集的生物成分。
10.权利要求9的方法，其中疾病选自器官炎症，肾炎，癌症，肝病，血液疾病，心肌梗死，心绞痛，脑梗死，和血栓形成。
11.权利要求9的方法，其中疾病选自肝细胞癌和胰腺癌。
12.检测疾病的方法，包括检测或测量从怀疑患病的受试者中收集的生物成分中的可溶HAI-1。
13.权利要求12的方法，其中疾病选自器官炎症，肾炎，癌症，肝病，血液疾病，心肌梗死，心绞痛，脑梗死和血栓形成。
14.权利要求12的方法，其中疾病是肝细胞癌或胰腺癌。
15.权利要求9或12的方法，其中生物成分是血液或它的分级分离产物或处理产物。
16.权利要求9或12的方法，其中生物成分是血浆或血清。
17.权利要求9或12的方法，其中生物成分是尿液。
18.检测或定量测定可溶HAI-1的试剂盒，包含一种或多种权利要求1的抗体。
19.权利要求18的试剂盒，其中试剂盒用于诊断至少一种选自器官炎症，肾炎，癌症，肝病，血液疾病，心肌梗死，心绞痛，脑梗死，和血栓形成的疾病。
20.权利要求18的试剂盒，其中用试剂盒测定从怀疑患病的病人收集的生物成分中的可溶HAI-1。
21.权利要求18的试剂盒，其中可溶HAI-1的检测或测量是通过免疫染色进行的。
全文摘要
本发明筛选了产生与可溶肝细胞生长因子激活剂的抑制剂－1(可溶HAI－1)具有高反应性的单克隆抗体的杂交瘤，从获得的杂交瘤培养物上清液制备靶单克隆抗体，并利用该抗体测定可溶HAI－1。
文档编号C07K16/38GK1395104SQ0214108
公开日2003年2月5日 申请日期2002年5月25日 优先权日2001年5月25日
发明者山岸俊哉, 仲大地, 长池一博 申请人:三菱化学株式会社