促进皮肤的无疤痕伤口痊愈的siRNA组合物以及用于伤口治疗的方法

专利名称：：促进皮肤的无疤痕伤口痊愈的siRNA组合物以及用于伤口治疗的方法
技术领域：
：本发明涉及在伤口愈合过程期间，使用siRNA试剂敲减促进皮肤疤痕形成的基因表达，用于预防和最小化皮肤疤痕形成的构思，组合物和方法。siRNA试剂可以单个双链体或多个双链体(混合物)使用，其靶向单个基因或多个基因，具有或没有转染载体。当转染试剂与其他的皮肤护理材料一起应用时，它们包括，但不限于，合成聚合物，脂质体和糖，等等。siRNA试剂还可以与其他的试剂如小分子和单克隆抗体抑制剂，免疫调节剂和其它类型的低聚物一起用于同样的应用中。siRNA试剂的注射，体表和经皮给药都可用于皮肤组织创伤和皮肤移植以后的伤口愈合过程。本发明是一种增强来自由灼伤，慢性皮肤溃疡，普通外科手术，整形外科和意外割伤引起的伤口的皮肤无疤痕痊愈的新的治疗。本发明可用于药物和药用化妆品工业。
背景技术：
：皮肤的主要功能是用作对抗环境的保护屏障。由于创伤或疾病而致的大部分皮肤完整性的丧失可能导致重大残疾乃至死亡。美国每年超过125万人具有灼伤，而且65万人患有由压力，静脉淤滞或糖尿病引起的慢性皮肤溃疡。伤口治疗的主要目标是快速伤口闭合，和功能性和审美上令人满意的疤痕。细胞和分子生物学的最新发展已经大大地扩展了我们对伤口修复和组织再生中所涉及的生物过程的了解，并导致了伤口护理方面的改进。伤口愈合是一个动态的、相互作用的过程，其包括可溶性介质，血细胞，胞外基质和实质细胞。伤口愈合具有三个阶段-发炎，组织形成和组织重塑-其在时间上部分重叠(1-3)。已知皮肤伤口愈合过程在胎儿和成人皮肤之间是不同的。成人皮肤中的伤口修复开始于急性炎症期并结束于永久性疤痕形成。相反，早期妊娠胎儿伤口(妊娠头三个月和中三个月)以接近完美的方式愈合，快速而且不产生疤痕。对表征负责从无疤痕愈合转换到妊娠中三个月以后的皮肤典型的成人样，产生疤痕的表型的关键因素非常感兴趣。确定两种类型的愈合中的差异，可以鉴定促进疤痕组织生成的因素。鉴定为在无疤痕愈合中减少的因素与抑制成人伤口中的那些因素(TGF-P)。该细胞因子是被发现在无疤痕愈合中差异调节的第一介质之一，并当引入到无疤痕伤口中时，显示促进疤痕组织沉积(4-7)。由于这些发现和涉及纤维化中的TGF-P的其他发现的结果，在成人皮肤中测试了下调这种分子的影响，并发现减少了疤痕形成(8-15)。胎儿对皮肤创伤的反应与成人显著不同，仅仅发生最小程度的发炎，最小程度的成纤维细胞增殖，和仅仅必需的胶原蛋白沉积。已经研究了血小板衍生生长因子(PDGF)对胎儿伤口部位的细胞和胞外基质事件的作用，因为已知PDGF在成人伤口愈合调节中起重要作用。在1,3或5天以后，在子宫内收获硅化橡胶伤口移植物。对样本进行标准的组织学处理，并进行评估。PDGF处理的移植物具有急性炎症，成纤维细胞征集，以及胶原蛋白和透明质酸沉积的显著增加。这些差异看来是很大程度上时间依赖的和PDGF剂量依赖的，数据表明胎儿修复在缺乏PDGF的情况下进行(16)。无疤痕胎儿愈合的一个关键特征看来是缺乏对伤口事件作出反应的炎症。相反，晚期胎儿和成人皮肤中伤口愈合的早期阶段的特征在于强炎症反应，和最终在伤口区域的永久性痣痕。虽然已经在胎儿伤口修复中研究了白细胞介素IL-6(17)和IL-8(18)，但是其他典型的炎症介质在无疤痕愈合中的作用还是未知的。花生四烯酸级联的代谢产物和酶，包括环加氧酶-2(Cor-力和它的酶促产物前列腺素E2(PGE2),已知是炎症反应的关键介质(19-22)。Coi-2最近已经受到了许多关注，因为它参与与调节异常的炎症状况相关的疾病，如类风湿和骨关节炎，心血管疾病，和致癌过程。(7^-2对炎症刺激如伤口作出反应而经历立即早期上调。它通过产生前列腺素而发挥作用，该前列腺素控制产生的炎症的许多方面，包括诱导血管通透性和炎性细胞的渗入和激活。对Cojt-2途径以及炎症的其他方面在成人伤口修复过程中的作用的关注正在增加，因为这些早期事件已经显示调节修复的结果。基于Coi一与炎症有关和它有助于成人伤口修复的几个方面的最新证据，我们检验了Cor一在胎儿伤口愈合过程中的作用。这些研究证明了coat-2酶在早期和晚期妊娠胎儿伤口中的差异表达。而且，PGE2，一种显示介导皮肤中的许多过程的Cor-2产物，当引入到早期胎儿伤口中时，导致愈合的延迟和疤痕的产生。这些数据增进了我们对无疤痕愈合与正常修复之间的基本差异的了解，而且表明了Cd-2参与疤痕组织的产生(23-28)。与成人皮肤伤口修复相反，早期妊娠胎儿皮肤伤口通过再生过程愈合，几乎没有疤痕。研究表明，Hox转录因子高度保守家族的一个成员，〃0a^"蛋白的下调，在胎儿无疤痕伤口愈合期间发生(29-30)。成人伤口中没有发现下调。当评价^,6"敲除(K0)小鼠中的成人皮肤伤口愈合时，张力测量术被用于测量60天时程内切割的伤口的抗拉强度。总的说来，i9^rWJK0伤口显著地强于野生型(WT)。切割的伤口的组织学评估表明，7日龄的K0伤口显著较小，而且相较于WT伤口，60日龄的^W/JK0伤口显示更正常的胶原构造。切割的伤口在t7o^"K0小鼠中以较快的速度闭合。生化和组织学分析表明，^W"K0皮肤包含显著升高水平的乙酰透明质酸。由于较高水平的乙酰透明质酸和增强的伤口愈合是胎儿皮肤的特征，因此，结论是^;r6/J的丧失在成人皮肤中产生更胎儿样的状态(31)。5toaW蛋白参与通过转化生长因子-p超家族的成员介导细胞内信号递送，并在细胞增殖，分化，迁移，和对皮肤伤口愈合关键性的基质加工中起决定性作用。5toWJ和体外激素信号传导之间的串扰已经被建议作为一种重要的调节细胞活性的调控机制；不过，它在体内的相关性是未知的。AshcroftGS等报道了5^dJ在体内雄激素介导的伤口愈合抑制中，而不是对雌激素调节作出反应中起作用(30)。野生型和S迈aW雌性棵鼠显示卵巢切除术以后延迟的愈合，其可以通过雌激素替代而逆转。相反，阉割加快了野生型雄性小鼠中的愈合，而且是通过外源雄激素处理可逆的。引起兴趣地，在S迈a^棵鼠中，调节雄激素水平在愈合反应中没有产生可辨别的干扰。可以对突变单核细胞进行脂多糖刺激，以类似于野生型细胞的方式，产生特异性的促炎剂(巨噬细胞单核细胞抑制因子)，但是显示对雄激素介导的刺激沉默的反应，而对雌激素诱导的巨噬细胞抑制因子抑制保持正常的反应。这些数据表明，S则W在正常伤口愈合反应期间，在介导雄激素信号传导中起作用，而且使5^W牵连到雄激素对炎性细胞活性的调节中。纤连蛋白(FN)是一种多功能的粘着蛋白并参与伤口愈合过程的多个步骤。强有力的证据表明，FN蛋白多样性通过可变RNA剪接；发育，年龄和组织/细胞类型调节的协同转录和RNA加工来调控。FN基因和这种模式中不同的剪接形式的表达，调节和生物学功能是未知的。在胎儿(妊娠天数为21-23天)，刚断奶的(4-6周)和成人的(>6个月)兔子中造成气道和皮肤切割伤口。使用mRNA差别显示获得表达分布图，对目标cDNA进行克隆，测序，并通过实时PCR证实。增加水平的尸/l7和5TrW转录物在刚断奶的气道粘膜伤口中持续长达48小时。出生后的气道粘膜伤口中这两个基因的增强比皮肤伤口中的更显著，这表明和尸W基因参与出生后的气道粘膜伤口是组织特异性的(31)。文献提供了SRp20确实参与FN的可变剪接，而且胚胎的FN变体在成人伤口愈合期间再现的证据。提议了在出生后的气道粘膜伤口修复早期事件期间，增强的5TrW分子活性与通过可变剪接调节FN基因表达之间的联系。DoviJV等报道了在嗜中性白细胞耗尽的小鼠中观察到加快的伤口闭合(32)。RNA干扰(RNAi)抑制剂，即中等的短干扰RM寡核苷酸(siRNA)，提供了一种独特的益处，用于在相同的治疗中联合使用多个siRNA双链体来靶向多个致病基因，因为所有的siRNA双链体都是化学同源的，其具有相同的来源和相同的制造过程(33)。发明人相信，许多类型的人类疾病，包括癌症，炎症性不适，自身免疫疾病和传染病，能够使用这种毒性最低而且安全的有效的siRNA抑制剂治疗，而且具有好得多的临床功效。基于RNA干扰是用于沉默特定基因表达的有吸引力的技术(34)，siRNA疗法可代表一种预防外科手术或其他伤口中疤痕形成的一种吸引人的和有效的方法。发明概述本发明提供了靶向多核苷酸，如siRNA，其靶向损伤皮肤组织的细胞中存在的炎症调节或炎症效应基因。这些多核苷酸可以是单链线性，双链线性或发夹结构。这些靶向多核苷酸的序列可以来源于表1-9中所列的序列(参见下文)。本发明还提供了一种皮肤伤口愈合过程期间抑制疤痕形成的方法，是通过使受伤的组织或细胞，在外科手术，伤口治疗，损伤恢复或皮肤移植的同时，与包含本发明的靶向多核苷酸的组合物接触。在一个实施方案中，体表应用该组合物。在另一个实施方案中，定位注射该组合物。本发明的方法在伤口愈合过程期间，能有效下调或抑制炎症调节或炎症效应基因。被包含耙向多核苷酸的组合物接触的组织可以与皮肤区域有关。被该组合物接触的组织可以已经因灼烧，化学制品，激光，整形手术，皮肤移植，外科手术或物理切割而受到损伤。被该组合物接触的细胞包括，但不限于，上皮细胞，脉管内皮，血管平滑肌细胞，心肌层(心脏)和伤口愈合时存在于皮肤组织中的过客白细胞。本发明的方法可用于治疗人或非人哺乳动物。用于接触受损組织或细胞的組合物可包括本发明的许多靶向多核苷酸，而且这些多核苷酸可靶向许多基因序列。该组合物可进一步包含PolyTran聚合物溶液，TargeTran纳米颗粒溶液，小分子药物，单克隆抗体药物或其他的免疫调节剂。组合物中发现的靶向多核苷酸可靶向下列基因的序列，如表l-7中发现的Coa:-2，纤连蛋白，肋a:6/J，IL-6，IL-8，5TrW和TGF-P1(参见下文)。耙向多核苷酸可包括针对一种或多种下列基因序列的一种或多种siRNA双链体，如Cor-2/TGF-P1/IL-8,P1/IL-6，Coi—2/IL-8，^;r—2/TGF-P2/IL-6，Coz-2/^;r6"/IL-6，Cojt-2/^a^/J/IL-8，^x6"/TGF-P1/57VW，P1/纤连蛋白，P2/纤连蛋白，Cor-iyTGF-31/5^a"和三种或多种基因序列的其他组合。本发明的多核苷酸可以相同或不同比例混合。附图简述图l是一个示意图，显示了本发明的多核苷酸的某些实施方案，其具有由轻微阴影区表示的靶向序列。多核苷酸的长度可以为l到200个核香酸。A画面显示线性多核苷酸，B画面显示发夹环形多核苷酸。/>开的耙序列被标记为"SEQ"，而与这些序列互补的序列被标记为"C0MPL，，。在A，b)画面中，多核苷酸和SEQ区周围较黑的阴影上方的水平线表示完全靶向序列(TARGET)比SEQ表示的序列长并包含SEQ表示的序列。在A,c)画面中，片段>15表示靶向序列长度介于l5个核苷酸与l个核苷酸之间，而且小于公开的参考序列。在A，d)画面中，较黑的垂直条表示至多5个核苷酸可能不同于公开的参考序列。发明详述本发明公开了使用一种或多种siRNA治疗剂来抑制对外科手术和创伤皮肤伤口的炎症反应，从而促进无疤痕愈合。治疗性多核苷酸针对一个或多个下列靶TGF-P-1(GenBank登录号CR601792)，TGF-P-2(GenBank登录号Y00083)，Co,-2(GenBank登录号M90100)，IL-6(GenBank登录号M18403)，IL-8(GenBank登录号NM-QQ0584),(GenBank登录号BC070233)，纤连蛋白(U42594)，Smad3(U68019)和57VW(GenBank登录号AF107405)。如这里使用的，"寡核苷酸"和基于此的类似术语，指由天然存在的核香酸组成的短聚合物，以及由合成的或修饰的核苷酸组成的聚合物，如这里紧接的前段中所述的。寡核苷酸的长度可以为io个或更多个核苷酸，或长度为15，或16,或17，或18，或19，或20或更多个核苷酸，或长度为21，或22，或23,或24或更多个核苷酸，或长度为25，或26，或27，或28，或29，或30或更多个核苷酸，长度为35或更多，40或更多，45或更多，直到大约50个核苷酸。为siRNA的寡核苷酸可以具有15到30个核苷酸之间的任何数量的核苷酸。在许多实施方案中，siRNA可以具有19到25个核苷酸之间的任何数量的核苷酸(35)。术语"多核苷酸"和"寡核苷酸"在这里同义使用。小干扰RNA根据本发明，炎症调节或炎症效应基因靶的基因表达被RM干扰减弱。炎症调节或炎症效应基因的表达产物被特异性双链siRNA核苷酸序列靶向，该特异性双链siRNA核苷酸序列与炎症调节或炎症效应基因靶序列的至少一个片段互补，该靶序列包含15到30个之间的任何数量的核苷酸，或在很多情况下，包含21到25个核苷酸之间的任何数量的核苷酸。靶可以存在于5'非翻译(UT)区，编码序列，或3'UT区。参见，例如，PCT申请WO00/44895,W099/32619，W001/75164，W001/92513，WO01/29058，WO01/89304,W002/16620和WO02/29858,每个都以其全部内容引入这里作为参考。根据本发明的方法，使用siRNA抑制炎症调节或炎症效应基因表达，和从而由于对皮肤組织损伤的初始炎症反应的疤痕形成。本发明的靶向多核苷酸包括siRNA寡核苷酸。这种siRNA也可以通过化学合成与想要的序列相同或类似的核苷酸序列来制备(36)。作为选择，使用靶向多核苷酸序列，例如通过消化无细胞体系如，但不限于果蝇提取物中的炎症调节或炎症效应物核糖多核苷酸序列，或通过转录重组双链cRNA，获得乾向siRNA。用由同样长度的16-30nt有义链和16-30nt反义链组成的siRNA双链体，通常观察到有效的沉默。在许多实施方案中，siRNA配对双链体的每条链另外具有一个位于3'末端的突出，其可以是lnt，或2nt，或3nt，或4nt长的；通常3'突出是2nt长的。2-nt3'突出的序列对siRNA靶识别的特异性产生额外的小贡献。在一个实施方案中，3'突出中的核苷酸是核糖核苷酸。在一个供选择的实施方案中，3'突出中的核苷酸是脱氧核糖核苷酸。使用3'脱氧核苷酸提供了增强的细胞内稳定性。本发明的重组表达载体，当引入到细胞内时，进行处理以提供包括靶向细胞内的炎症调节或炎症效应基因的siRNA序列的RM。这种载体是克隆到表达载体中的DNA分子，该表达载体包括炎症调节或炎症效应基因靶向序列旁邻的，以允许表达的方式可操作连接的调节序列。从该栽体，靶RNA反义的RNA分子通过第一个启动子(例如，克隆的DNA3'的启动子序列)转录，RNA靶有义链的RNA分子通过第二个启动子(例如，克隆的DNA5'的启动子序列)转录。有义链和反义链然后体内杂交，以产生靶向炎症调节或炎症效应基因序列的siRNA构建体。作为选择，可以利用两个构建体以产生siRNA构建体的有义链和反义链。更进一步地，克隆的DNA可以编码具有二级结构的转录物，其中一个转录物同时具有来自靶基因或基因的有义序列和互补的反义序列。在这个实施方案的一个实例中，发夹RNAi产物与靶基因的全部或一部分类似。在另一个实例中，发夹RNAi产物是siRNA。炎症调节或炎症效应基因序列旁邻的调节序列可以是相同的或不同的，以便它们的表达可以独立地调节，或以瞬时或空间方式调节。在某些实施方案中，通过把炎症调节或炎症效应基因序列克隆到载体中，来细胞内转录siRNA，该载体包含，例如，来自较小核RNA(snRNA)U6或人RM酶PRNAHl的RNApolIII转录单元。栽体系统的一个实例是GeneSuppressorTMRNA干扰试剂盒(可从Imgenex购买)。U6和H1启动子是III型PolIII启动子的成员。U6样启动子的+1核苷酸总是鸟噤呤核苷，而Hl启动子的+l是腺嘌呤核苷。这些启动子的终止信号规定为5个连续胸腺嘧啶核苷。转录物一般在第二个尿嘧啶核苷后面被切割。这个位置上的切割在表达的siRNA中产生了3'UU突出，其与合成的siRNA的3，突出类似。长度小于400个核苷酸的任何序列都可以通过这些启动子转录，因此它们理论上适于在例如大约50到100个核苷酸的RM茎环转录物中，表达大约15到30个核苷酸的siRNA。已经对RNAi和影响siRM功效的因子的特性进行了研究(37)。第一个方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其长度为200或更少，和15或更多的任何数量的核苷酸。多核苷酸包括第一核苷酸序列，其耙向存在于受伤组织的皮肤细胞中，而且这里鉴定为靶的基因序列。在该多核苷酸中，任何T(胸腺嘧啶核苷)或任何U(尿嘧啶核普)任选可以被另一个置换。另外，在该多核苷酸中，第一核苷酸序列由a)长度为15到30的任何数量的核苷酸的序列，或b)a)中提供的序列的互补体。这种多核苷酸这里称为线性多核苷酸。一条链的多核苷酸经常是双链siRNA的一条链。在相关的方面中，如上所述的多核苷酸进一步包括第二核苷酸序列，其通过环序列与第一核苷酸序列隔开，以便第二核苷酸序列a)具有基本上与第一核苷酸序列相同的长度，和b)基本上与第一核苷酸序列互补。在后面的结构中，其称为发夹，第一核苷酸序列与第二核苷酸序列杂交以形成发夹，其互补序列通过环序列连接。发夹多核苷酸进行细胞内消化以形成双链siRNA。在线性多核苷酸和发夹多核苷酸的许多实施方案中，第一个是a)靶向序列，其靶向选自下面的表la到9b中提供序列的序列；b)比a)项中提供序列长的靶向序列，其中靶向序列靶向选自表la-9b的序列，c)a)或b)提供序列的片段，其中该片段由长度为至少15个核苷酸的连续碱基，而且比选择的序列至少短1个碱基的序列组成。d)其中高达5个核苷酸不同于a)-c)提供的序列的靶向序列，或e)a)到d)中提供的任何序列的互补体。表l:表la.人Coz-2(19mer):<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表6:表6a.人S/VW(19mer):<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表7:表7a.人TGF-bl(19mer):<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表7b.人TGF-bl(25mer):<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>的都提供于表la-9b中。其中公开的序列长度为19个核苷酸到25个核苷酸。靶向序列通过图1中轻微阴影区表示。图1，画面A，a)举例说明了一个实施方案，其中显示为"SEQ"的公开序列可以任选地包括在一个较大的多核苷酸中，该较大的多核苷酸的全长可以为多达200个核普酸。本发明另外提供了，在靶向多核苷酸中，针对选自表la-9b的把序列的靶向序列，可以是较长的靼向序列的部分，以便靶向多核苷酸靶向比SEQ所示的第一核苷酸序列更长的序列。这在图1，画面A，b)中进行了举例说明，其中完全乾向序列通过多核苷酸上面的水平线，和通过SEQ区周围的较深阴影表示。如同在多核苷酸的所有实施方案中，这种较长的序列可以任逸包括在长度为200或较少碱基的更长多核苷酸中(图1，画面A，b))。本发明进一步提供了一种靶向序列，其是任何上述靶向序列的片段，以便该片段靶向表la-9b中提供的序列，其长度为至少15个核苷酸(而且比参考序列短至多1个碱基；图1，画面A，c)中举例说明)，以及一种靶向序列，其中至多5个核苷酸可能不同于与表la-9b中提供的靶序列互补(图1，画面A,d)中举例说明，表明，在该实例中，3个较深的垂直条表示3个碱基变体)。本发明仍然进一步提供了一种序列，其与任何上述序列互补(图1，画面A，e)中所示，并指定为"COMPL")。任何这些序列包括在本发明的寡核苷酸或多核苷酸中。本发明的任何线性多核苷酸可以由仅仅上述a)-e)中所迷的序列组成，或者可任选地包括多达200个核苷酸极限的另外的碱基。由于RNA干扰需要双链RNA，因此靶向多核苷酸本身可以是双链的，包括与至少表la-9b提供的序列互补并与其杂交的第二条链，或可依赖于细胞内处理以产生互补链。因此，多核苷酸可以是单链的，或者它可以是双链的。仍然在进一步的实施方案中，多核苷酸仅仅包含脱氧核糖核苷酸，或它仅仅包含核糖核苷酸，或它包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。在这里描迷的多核苷酸的重要实施方案中，靶序列由长度为15个核苷酸(nt),或16nt，或17nt，或18nt，或19nt，或20nt，或21nt，或22nt，或23nt，或24nt，或25nt，或26nt,或27nt，或28nt,或29，或30nt组成。仍然在另外的有利的实施方案中，靶向序列可与靶序列的互补体有至多5个碱基不同。在本发明的几个实施方案中，多核苷酸是由靶向序列组成的siRNA，其任选包括这里描述的3'二核苷酸突出。作为选择，按照RNA干扰中双链RNA的需要，可以制备寡核普酸或多核苷酸以形成分子内发夹环双链分子。这种分子由前段任何实施方案中所述的第一个序列形成，其后面是短的环序列，然后其依次接着是与第一个序列互补的第二个序列。这种结构形成想要的分子内发夹。而且，公开的这种多核普酸还具有200个核苷酸的最大长度，以便列举的3个需要的结构可以任何寡核苷酸或多核苷酸组成，其具有高达200个核苷酸的任何全长。发夹环多核苷酸如图1,画面B中例举的。用各种制剂提高局部siRNA递送本发明提供了通过引入RNA干扰(siRNA)沉默或下调靶基因表达，预防伤口愈合过程期间由于对皮肤组织损伤的炎症反应而致的疤痕形成的方法。在本发明的一种方法中，在痊愈过程期间，应用或施用siRNA或siRNA混合物到皮肤伤口的区域。可以为人，或非人哺乳动物提供这种治疗。由于细胞和分子生物学的新发展，我们已经大大扩展我们对参与伤口修复和组织再生的生物过程的理解，而且已经获得了伤口护理方面的改善。伤口愈合是一种动态的，相互作用过程，其包括可溶性介质，血细胞，胞外基质和实质细胞，而且许多基因在那些细胞中发挥功能。我们相信，使用siRNA抑制剂调节某些炎症激活因子导致表达，如，TGF-pi，2，Coat-二IL-6，IL-8，i7oj^/J，纤连蛋白，S鹏"和W"J，等等，单独使用或組合使用，将导致理想的伤口愈合过程，同时具有较少的疤痕形成。这种最佳方式的siRNA介导的处理，将最小化炎症，增强皮肤組织形成和組织重塑，其是伤口愈合过程的3个主要步骤。药物组合物如这里使用的，"药学上可接受的载体"，涉及药物组合物，意图包括与药物施用相容的任何和所有的溶剂，分散介质，涂层，抗菌剂和抗真菌剂，等渗剂和吸收延迟剂，等等。适合的载体描述于教科书如Remington'sPharmaceuticalSciences,GennaroAR(Ed.)20thedition(2000)Williams&WilkinsPA，USA，和WilsonandGisvold'sTextbookofOrganicMedicinalandPharmaceuticalChemistry,byDelgadoandRemers，Lippincott-Raven，将其引入这里作为参考。可用于这种载体和稀释剂中的组分的优选实例包括，但不限于，水，盐水，磷酸盐，羧酸盐，氨基酸溶液，生理盐水，右旋糖(葡萄糖的同义词)溶液，和5%人血清白蛋白。作为非限制性实例，右旋糖可以5%或10%水溶液使用。脂质体和无水的载体如固定油类也可能使用。将这些介质和试剂用于药学活性物质是本领域熟知的。增补的活性化合物也可以掺入到组合物中。本发明的药物组合物配制成与它的预定给药途径相容。给药途径的实例包括肠胃外，例如，静脉内，皮内，皮下，口服，鼻，吸入，经皮(局部的)，经粘膜和直肠给药。用于肠胃外，静脉内，皮内或皮下应用的溶液或混悬液可包括下列组分无菌稀释剂如注射用水，盐溶液，固定油类，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其他的合成溶剂；抗菌剂如苯曱醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氩钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；緩冲液如醋酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐，和用于调节张力的试剂如氯化钠或右旋糖。对于通过吸入给药，化合物以来自加压容器，或分配器，其包含适合的抛射剂例如气体如二氧化碳，或喷雾器的气溶胶喷射的形式递送。在一个实施方案中，用将保护化合物以防从机体快速消除的载体，如控释制剂，包括植入物和微嚢递送系统来制备活性化合物。持续释放制品的适合的实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，该基质以成形的制品的形式，例如，薄膜或微胶嚢。持续释放基质的实例包括聚酯，水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-异丁烯酸酯)，或聚(乙烯醇)，聚交酯(美国专利3,773,919)，l-谷氨酸和y乙基-l-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯，可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-幾基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)，和聚-D-(-)-3-羟丁酸。虽然聚合物如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能释放分子超过100天，但是某些水凝胶在较短的时间周期释放药物活性剂。有利的聚合物是生物可降解的，或生物相容的。脂质体混悬液(包括靶向受感染细胞的脂质体，其具有抗病毒抗原的单克隆抗体)，也可用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法，例如，美国专利4，522，811中所述的方法制备。具有有利形式如微球的持续释放制品，可以从如上所述的那些材料制备。本发明的siRNA多核苷酸可插入到载体中，并用作基因治疗载体。基因治疗栽体可以通过任何途径，例如，如美国专利5，703，055描述的途径，递送给个体。递送因此也可以包括，例如，静脉内注射，局部施用(参见，美国专利5，328，470)或立体定向注射(参见，例如，Chenetal.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:3054-3057)。基因治疗载体的药物制品，可以包括处于可接受的稀释剂中的基因治疗栽体，或者可以包括緩释基质，其中包埋有基因递送载体。作为选择，当可以完整的从重组细胞生产完全的基因递送载体，例如，逆转录病毒栽体时，药物制品可以包括生产该基因递送系统的一个或多个细胞。药物组合物可以包括在试剂盒中，例如，容器，包装，或分配器中，与给药的说明书一起。用来制备包含siRNA抑制剂的制剂或药物组合物的各种载体可用于通过体表应用，局部注射或经皮施用，提高siRNA治疗剂的局部递送。在几个实施方案中，本发明的siRNA多核苷酸，通过脂质体介导的转染，例如通过使用商业可获得的试剂或技术，例如，Oligofectamine，LipofectAmine试剂，LipofectAmine2000(Invitrogen),以及通过电穿孔，和类似的技术，被递送到培养中的细胞中，或目的细胞中。包含siRNA的药物组合物包括另外的组分，其保护siRNA的稳定性，延长siRNA寿命，增强siRNA功能，或使siRNA靶向特定的组织/细胞。这些包括各种可生物降解的聚合物，阳离子聚合物(如聚乙烯亚胺)，阳离子共聚肽如组氨酸-赖氨酸(HK)多肽，参见，例如，Mixson等的PCT乂>开W001/47496，Biomerieux的WO02/096941,和麻省理工学院的WO99/42091)，聚乙二醇化阳离子多肽，和配体掺入的聚合物，等等。带正电荷的多肽，PolyTran溶液(HK聚合物和多糖如天然多糖的盐或水溶液，亦称为硬葡聚糖)，TargeTran(由配合的RGD-PEG-PEI聚合物組成的纳米颗粒的盐或水悬浮液，其包括靼向配体)，表面活性剂(Infasurf;ForestLaboratories,Inc.;ONYInc.),和阳离子聚合物(如聚乙烯亚胺)(37-39)。Infasurf(calfactant)是一种分离自小牛肺，用于气管内滴注的天然肺表面活性剂；它包含磷脂，中性类脂，和疏水表面活性剂締合的蛋白质B和C。聚合物可以是一维的或多维的，也可以是直径小于20微米，20到IOO微米之间，或者100微米以上的微粒或纳米颗粒(40-42)。所述的聚合物可以携带受体特异性的配体分子，或特定组织或细胞的分子，因此用于siRNA的靶向递送。siRNA多核苷酸也可通过基于阳离子脂质体的载体，如D0TAP，D0TAP/胆固醇(Qbiogene，Inc.)，及其他类型的脂质水溶液递送。包含siRNA抑制剂的天然乳剂能局部应用于伤口组织表面，以增强无疤痕伤口愈合。RT-PCR以评估siRNA介导的基因敲减为了评估siRNA抑制剂体外和体内的基因敲减效率，一种较好的方法是使用定量逆转录PCR(QRT-PCR)来测定siRNA处理之前和之后的mRNA水平。在各个实施方案中，用于QRT-PCR的引物被设计成专门用于测定来自从细胞培养实验收集的总RNA样品和小鼠，兔和猪才莫型的皮肤组织样品的TGF-P1,2，Cox-2，IL-6，IL-8，i^j^/J,纤连蛋白，5fia^和S/VW等等的mRNA水平。用于TGF-01mRNA的QRT-PCR测定的引物:逆转录引物(1289-1268):5'-CGGAGCTCTGATGTGTTGAAGA-3'上游引物(881-902):-GGCTGCGGCTGCTGCCGCTGCT-3'下游引物(118卜1160):5'-GCGTAGTAGTCGGCCTCAGGCT-3'。用于TGF-P2mRNA的QRT-PCR测定的引物逆转录引物(868-846):5'-GCAGCAGGGACAGTGTAAGCTT-3'上游引物(440-461):5'-GCCGCCTGCGAGCGCGAGAGGA-3'下游引物(742-721):5'-GCTGTCGATGTAGCGCTGGGTT-3'。用于^jt-2mRNA的QRT-PCR测定的引物逆转录引物(1012-991):5'-CTCCTGTTTMGCACATCGCAT-3'上游引物(564-585):5'-GCTTCCTGATTCAAATGAGATT-3'下游引物(835-814):5'-CTCTCCATCAATTATCTGATAT-3'。用于"ojt6"mRNA的QRT-PCR测定的引物逆转录引物(1150-1138):5'-GCTGTCACATGGGGTTCCGTCT-3'上游引物(701-722):5'-GGGCAGCACCCTCCTGACGCCT-3'下游引物(1025-1004):-CCCAGCCTGGGCTTGGCAGGTT-3'。用于纤连蛋白mRNA的QRT-PCR测定的引物逆转录引物(1032-1011):5'-GTGGTTACTCTGTAACCAGTAA-3'上游引物(561-582):5'-CTCCAGGCACAGAGTATGTGGT-3'下游引物(872-860):5'-CAGTGACAGCATACACAGTGAT-3'。用于5TrsJmRNA的QRT-PCR测定的引物逆转录引物(1060-1039):5'-GCAGCATTTCGTTTTCCCTGAT-3'上游引物(571-592):5'-GGTCAAATGAAAGGAAATAGAA-3/下游引物(880-859):5'-GGTTTATTATCAGTCTGTGCAT-3'。用于IL-6mRNA的QRT-PCR测定的引物逆转录引物(965-986):5'-CTGCATAGCCACTTTCCATTAT-3'上游引物(301-322):5'-GCAGCAAAGAGGCACTGGCAGA-3'下游引物(599-621):-CAGCTTCGTCAGCAGGCTGGCA-3'。用于IL-8mRNA的QRT-PCR测定的引物:逆转录引物(870-848):5'-GGGTTGCCAGATTTAACAGAAA-3'上游引物(428-449):5'-GAATCAGTGAAGATGCCAGTGA-3'下游引物(744-723):5'-CCTGAAATTAAAGTTCGGAT-3'。用于S则cTJmRNA的QRT-PCR测定的引物逆转录引物(910-888):5'-CTGCATTCCTGTTGACATTGGA-3'上游引物(310-332):5'-GGGCTCCCTCATGTCATCTACT-3'下游引物(781-759):5'-CGTAGTAGGAGATGGAGCACCA-3,。siRNA混合物组成除了使用siRNA双链体靶向每个特定的基因耙，如TGF-pl，2，IL-6，IL-8，^z6",纤连蛋白，^则cTJ和5TrW，等等，使用可注射的溶液或者乳剂体表或皮下局部应用，用于改善皮肤伤口愈合而没有疤痕形成，本发明提供了使用siRNA寡混合物(siRNA-0C)，选择性乾向3个或更多个那些基因的构思，方法和组合物，作为治疗剂，由于无疱痕伤口愈合的较好临床结果。这种siRM寡混合物包含乾向至少3个mRNA乾的至少3个双链体。本发明是基于两个重要方面第一，siRNA双链体是一种很有效的基因表达抑制剂，而且每个siRNA分子由具有相同化学性质的短双链RNA寡聚物(21-23nt，或24-25nt，或26-29nt)组成；第二，皮肤伤口愈合过程包括可溶性介质，血细胞，胞外基质和实质细胞，同时多个因子在炎症，组织形成向多个致病基因的siRNA-OC，代表一种有益的治疗方法，由于siRNA双链体的化学一致性，和来自多个致病基因的下调协同作用。本发明限定了，siRM-OC是靼向至少3个基因的siRNA双链体的组合，以各种比例，各种物理形式(溶液或粉末)，而且同时通过相同的途径，或不同的途径和时间(如在损伤恢复期间)应用到疾病组织中。伤口愈合过程可以表征为三个阶段-炎症，组织形成和组织重塑。组织损伤导致血管的破裂和血液组分的外渗。许多的血管活性介质和趋化因子，通过凝结和激活的补体途径，以及通过损伤的或激活的实质细胞产生。这些物质把炎性白细胞恢复到损伤部位。浸润嗜中性白细胞净化外来颗粒和细菌的受伤区域，然后与痂皮一起排出，或被巨噬细胞吞噬。在对特定趋化物，如胞外基质蛋白的片段，转化生长因子6，和单核细胞趋化蛋白1的反应中，单核细胞也浸润伤口部位，并变成释放生长因子如血小板衍生生长因子和血管内皮生长因子的活化巨噬细胞，其启动肉芽組织形成。巨噬细胞通过它们的整联蛋白受体与胞外基质的特定蛋白结合，一种通过巨噬细胞刺激微生物和胞外基质片段的吞噬作用的作用。附着到胞外基质也刺激单核细胞蜕变成炎性或修复的巨噬细胞。附着诱导单核细胞和巨噬细胞表达集落刺激因子1,一种单核细胞和巨噬细胞存活所需的细胞因子；肿瘤坏死因子a,—种有效的炎性细胞因子；和血小板衍生生长因子，一种成纤维细胞的有效趋化物和分裂素。单核细胞和巨噬细胞表达的其他重要细胞因子是转化生长因子a，白细胞介素-1，转化生长因子6，和胰岛素样生长因子I。单核细胞和巨噬细胞来源的生长因子几乎确定是起始和繁殖伤口中新组织形成所必需的，因为巨噬细胞使具有缺陷的伤口修复的动物衰竭。因此，巨噬细胞显示在炎症和修复之间的转换中具有关键的作用。明显地，最初的炎性阶段包括多种因子，特别是那些炎症前细胞因子和生长因子。因此，下调负责疤痕形成的那些炎症前细胞因子和生长因子，如TGF-P1，2，IL-6，IL-8和Cof-,使用siRNA寡混合物(在组合中)将是很有益的。组合包括，但不限于，TGF-P1/化W7J/IL-8，TGF-P2/^^rWJ/IL-8，TGF-01/57VW/IL-8,TGF-P1/Co;r-2/IL-8，TGF-p2/i7oj^/J/IL-8和TGF-P1/S鹏tfJ/IL-6。混合物可以从全部19mer，或者全部25mer，或者19或25mer寡聚物制备。混合物可以从靼向选自这里鉴定的基因耙的任何2个基因，或任何3个基因，或任何4个基因，或任何5个基因，或更多个基因制备。siRNA混合物可以与其他的药物一起应用，如抗生素，抗体，小分子，抑制剂，可的松，天然乳剂，草本乳剂及其他消炎药。除非另有说明，这里使用的所有技术和科学术语，具有与本发明所属
技术领域：
的普通技术人员通常所理解的相同的含义。示例性的方法和材料如下所述，但是与这里描述的那些方法和材料类似或等效的方法和方法，也可用于实施或检验本发明。这里提到的所有出版物及其他参考文献以其内容引入这里作为参考。在矛盾的情况中，本说明书，包括定义，将对照。虽然这里引用了许多文献，这种引用不构成任何这些文献形成本领域普通常识的部分的许可。在整个本说明书和权利要求书中，单词"comprise"，或变体如"comprises"或"comprising"应理解为包含所述的整数或整数组，但是不排除任何其他的整数或整数组。材料，方法和实例仅仅是示例性的，而不是为了限制。实施例1:TGF-&1/TGF-&2/for-2的组合下列3种靶向指定序列的寡核苷酸以等量(w/w/w)组合siRNA序列(Tl-19-1):CCCUUCCUUCGAAAUGCAA，乾向Cojt-2，siRNA序列07-19-1):CCAGAAAUACAGCAACAAU,耙向TGF-P1,siRNA序列(T8-19-1):CCUGCAGCACACUCGAUAU,耙向TGF-P2。它们在水溶液中制备，或用于局部应用或皮下注射的合适的载体中配制。作为选择，上面鉴定的3个耙向寡核苷酸以各种不同的比例在溶液中组合，或者在用于局部应用或皮下注射的合适栽体中配制，以促进疤痕形成的有益最小化。一般来说，将其他的siRNA寡核普酸(靶向相同的3个基因的其他序列)混合作为混合物用于治疗应用。这种靶向寡核苷酸包括靼向来自表l.l和表l.2的Cox2序列的siRNA;靶向来自表7.l和表7.2的TGF-pl序列的siRNA和靶向来自于表8.1和表8.2的TGF-02序列的siRNA。实施例2:TGF-&l/jy^rWJ/Co,-2组合下列3种靶向指定序列的寡核苷酸以等量(w/w/w)组合siRNA序列(Tl-19-1):CCCUUCCUUCGAAAUGCAA，耙向siRNA序列(T7-19-l):CCAGAAAUACAGCAACAAU，耙向TGF-P1，siRNA序列(T3-19-l):CCGGCAAUUAUGCCACCUU，靼向^cW又它们在水溶液中制备或在用于局部应用或皮下注射的合适的载体中配制。作为选择，上面鉴定的3个靶向寡核苷酸以各种不同的比例在溶液中组合，或者在用于局部应用或皮下注射的合适载体中配制，以促进疤痕形成的有益最小化。一般来说，将其他的siRNA寡核苷酸(靶向相同的3个基因的其他序列)混合作为混合物用于治疗应用。这种乾向寡核苷酸包括，靶向来自表1.1和表1.2的Cox2序列的siRM;靶向来自表7.1和表7.2的TGF-P1序列的siRM和靶向来自表3.1和表3.2的VorWJ序列的siRNA。实施例3:TGF-&1/^A^/J/5Tr^下列3种靶向指定序列的寡核苷酸以等量(w/w/w)組合siRNA序列(T6-19-l):GGAAAGCGGGAAGACUCAU，靼向i7VW，siRM序列(T7-19一l):CCAGAAAUACAGCAACAAU，靼向TGF-p1,siRNA序列(T3-19-1):CCGGCAAUUAUGCCACCUU，乾向i^^6/又它们在水溶液中制备或在用于局部应用或皮下注射的合适的载体中配制。作为选择，上面鉴定的3个靶向寡核苷酸以各种不同的比例在溶液中组合，或者在用于局部应用或皮下注射的合适载体中配制，以促进疤痕形成的有益最小化。一般来说，将其他的siRNA寡核苷酸(靶向相同的3个基因的其他序列)混合作为混合物用于治疗应用。这种靶向寡核苷酸包括，靶向来自表6.1和表6.2的S/VW序列的siRNAs;靶向来自表7.1和表7.2的TGF-P1序列的siRM和靼向来自表3.1和表3，2的^W"序列的siRNA。实施例4:TGF-01/^jr6/J/IL-6的组合下列3种靶向指定序列的寡核苷酸以等量(w/w/w)组合siRNA序列(T4-19-1):GCAUCUCAGCCCUGAGAAA，耙向IL-6，siRM序列(T7-19-l):CCAGAAAUACAGCAACAAU，耙向TGP-P1，siRNA序列(T3-19-l):CCGGCAAUUAUGCCACCUU,耙向肠6/又它们在水溶液中制备或在用于局部应用或皮下注射的合适的载体中配制。作为选择，上面鉴定的3个靶向寡核苷酸以各种不同的比例在溶液中组合，或者在用于局部应用或皮下注射的合适栽体中配制，以促进痣痕形成的有益最小化。一般来说，将其他的siRNA寡核苷酸(靼向相同的3个基因的其他序列)混合作为混合物用于治疗应用。这种把向寡核苷酸包括，靶向来自表4.1和表4.2的IL-6序列的siRNA;靼向来自表7.1和表7.2的TGF-p1序列的siRNA和耙向来自表3.1表3.2的^;rWJ序列的siRNA。文献I.SingerAJ,ClarkRA,'Cutaneouswoundhealing.WEnglJ"胸cf1999,341:738-746.2，MartinP;Woundhealing:aimingfoirperfects)cinregeneration.Science1997,276:75-81.3.RowlattU:Intrauterinewoundhealingina20weekhumanfetus,VirohcwsAjrahAPatholAnatHistoJL1979,381:353-361，4.LjinRY,al.Exogenoustransforminggrowthfactor-betaamplifiesitsownexp:ressionandinducesscarformationinamodelofhumanfetalskinrepair,AnnSurgr199S,222:14S-154,5.CowinAJ,e仁aJ,ExpressionofTGF-beta抑ditsreceptorsinmurinefetalandadultdermalwounds,丑urJ"Dermatol2001,11:424-431.6.Krumme工TM,e仁a二Transforminggrowthfactorbeta(TGF-beta》inducesfibrosisinafetalwou:ndmodel,J*PediatrSurgr1988,23:"7-S52.7.IianningDA,etsJI.TGF-betalaltersthehealingofcutaneousfetalexcisionalwounds.J*jPediatrSurg*1999,8.SooC,etal.Ontogenetictransitioninfetalwoundtransforminggrowthfactor*-beta:regulaticmcorrela仁eswithcollagenorganization.A/nJ"Pa仁iioi2003,163z2459-2476，S-SullivanKM,e仁ai.Amodelofscarlesshumanfetalwound:repai:risdeficientintransforminggrowthfactorbeta.J"PedistrSUrg*1995,30:198-202202—193■10.StelnickiEJ,e仁si.Anewinvivomodelforthestudyoffetalwoundhealing.AonJlastSurg1S97,39:374-380.II,Whi仁byDiTandFergusonMW:Immunohistochemicallocalizationofgrowthfactorsinfetalwoundhealing,DevBioi1991,147:207-215,12,RobertsAB,eta二Transforminggrowthfactortypebeta:jrapidinductionoffibrosissndangiogenesisinvivoamdstimulationofcollagenformationinvitro.ProcN"a仁JLAcadSci1986,83:4167-4171.13.ShahM,3>1.NeutralisingantibodytoTOF-beta1,2reducescutaneousscarringinadultrodents.JCeilSci1994,107'1137-1157.14.ShahM,e仁si.Controlofscarringinadultwoundsbyneutralisingantibodytotransforminggrowthfactorbeta,lancet339:213-214.15.ChoiBM,etal,Controlofscarringinadultwoundsusingantisensetransforminggrowthfactor-beta.1oligodeoxynucleotides.XronunoJZCellBioJ1996,74r144-150.16.HaynesJH,e仁al.Platelet-derivedgrowthfactorinducesfetalwoundfibrosis.J"PediatirSurgr1994,29z1405-1408，17.LiechtyKW,et:al,Diminishedinte:rleukiriS(IL-6)paroductionduringseamlesshumanfetalwoundirepaiar.cytoJcine2000,12:S71-676,18.LiechtyKW,e仁al，Diminishedintei:leukin-8(工]>8》p:roductioTiinthefetalwoundhealingresponse.J"Surgies1998,77:80-84.19.wuKK:Cyclooxygenase2induction:molecularmechanismandpathophysiologicroles,JLahClinWed1996,128-242-245,.20.WilgusTA,etaJTopicalapplicationofaselectivecyclooxygenaseinhibitorsuppressesUVBmediatedcutaneousinflamTueLtion，P:rost;agla:ndi;nsotijer"LijpidATediat2000,S2:367-384.21.SunWH,et:al.Cycrlooxygenase-2inhibitorssuppressepithelialcellkineticsanddelaygastricwoundhealinginrats,<Jcas仁roenterolHejpstoJ2000,15s752-761,22，GuoJS,efc.Antiangiogeniceffectofahighlyselectivecyclooxygenase-2inhibitorongastriculcerhealinginrats,r。xico1A卯JPharmacol2002,183:41-45-23,SimonAM,e仁，Cyclooxygenase2functionisessentialforbonefracturehealing*J"JBoneWiner2002,17:963-976,24,Kampfe:rH,ets_Z.Cyclococygenase-1-coupledprostaglandinbiosynthesisconstitutesanessentialprerequisiteforskinrepair.J*InvestDermatol2003,120:880-890.25,BlorameEA,etaJL,Selectivecyclooxygenase-2inhibitiondoesnoteiffec|tthehealingofcutaneousfull-thicknessincisionalwoundsinSKH-1mice.HrJDerna仁ol2003,148:211-223.26,Muller-DeckerK,etal,Theeffectsofcyclooxygena.seisozymeinhibitiononincisionalwoundhealinginmouseskin.J"JnvestDerma亡ol2002,:119:1189-1195，27,Musca:raMN,et.Woundcollagendepositioninra仁s:effectsofanNO-NTSAIDandaselectiveCOX-2inhibitor.BrJ"处armaco:i2000,129:681-686.28,FutagamiA,eta_lWoundhealinginvolvesinductionofcyclooxygenase-2expressioninratskin-LaJbinvest2002,82:1503-1513.29,WilgusTA,etaJlReductionofscarformationinfull-thicknesswoundswithtopicalcelecoxibtreatment,Wound尺印airiegren2003,11:25-34.3CKAshcroftGS,et，MicelackingSmad3showacceleratedwoundhealingandaninpairedlocalinflannnatoryresponse,胸tcTe_Z25ioJ1999,1:260-266.31,lii-KoarotkyHS,e仁Identificationofapre-mRNAsplicingfactor*,a:rgiriine/se:rine-:rich3(Sf:rs3),amiitsco-expressionwithfibronectininfetalandpostnatalrabbitairwaymucosalandskinwounds,Riochim石iojphysActa.20051762(1):34-45.32.Dovijv,.Acceleratedwoundclosureinneutrophil-depletedmice.JJDeuJcocBiol2003,73:448-455.33.Marnis,M,T.andP.A.Sharp(2002)GenesilencinginmarmmalsbysmallinterferingRNAb.J^a仁ureiev"iew,C幼etics.3(10),,737-747.34.Lu,P.Y.et:<92.(2003)siRNA-mediatedantitumorigenesisfordrugtargetvalidationandtherapeutics.CurrentOpinioninMolecxiiar*Therapeutics.5(3):225-234,35.Kim,B.etal，(2004)InhibitionofocularangiogenesisbysiRNAtargetingvascularendothelialgrowthfactor-pathwaygenes/therapeuticstrategyfor1herpeticstromalkeratitis.Am.J".PsthoJL.165(6):2177-85，36.Tuschl,Zamore,Ijehmann,BartelandSharp(1999),Genes&Dev，13:3191-37.Elbashir,LiSncieckelaindTuschl(2001).Genes&Oev,15:188-200,38.Liu,P工andM,Woodle(2005)DeliveringsiRNAinvivoForfunctionalgenomicscannoveltherapeutics,工niWAZnterfereiacereciznology.CambridgeUniversityPress-P303-317-39.IjU,P，Y-etal.(2005)ModulationofangiogenesiswithsiRNAinhibitorsfornoveltherapeutics,TRENDSinMolecularAfedici:ne.11(3),104-13.40.IiUPY,XieF,WoodleMC，(2005)InvivoapplicationofRNAinterference:fromfunctionalgenomicstotherapeutics,AdvGenet,54:117-42.41.Woodle,MCandPY*Lu,NanoparticlesforRNAiTherapy,Wanofcoday,August2005,34-41.42.Xie,Y.F,,M.WoodleandLu.HarnessinginvivosiRNAdeliveryforfunctionalgenomicsandnoveltherapeutics.DrugjDiscoveryToday,GTanuary2006.43-LiB-J,etal,2005,WatureMedicine,11,944-951.权利要求1.一种靶特异性多核苷酸(例如siRNA)，其靶向损伤皮肤组织的细胞中存在的炎症调节或炎症效应基因。2.权利要求l中所述的靶向多核苷酸，其中多核苷酸是单链线性多核苷酸，双链线性多核苷酸，或发夹多核苷酸。3.权利要求1中所述的靶向多核苷酸，其包括靶向选自表l-9中公开的序列的序列的第一核苷酸序列。4.一种抑制皮肤伤口愈合期间疤痕形成的方法，包括使受伤的组织或细胞，在外科手术，伤口处理，损伤恢复或皮肤移植时，与包含权利要求1中所述的靶向多核普酸的组合物接触。5.权利要求4中所述的方法，其中靶向多核苷酸描述于权利要求2中。6.权利要求4中所述的方法，其中靶向多核苷酸描述于权利要求3中。7.权利要求4中所述的方法，其中接触包括组合物的定位应用。8.权利要求4中所述的方法，其中接触包括组合物的定位注射。9.权利要求4中所述的方法，其中组合物包括多个权利要求1中描述的耙向多核苷酸。10.权利要求4中所述的方法，其中接触受伤的皮肤组织在处理中的伤口愈合过程期间有效下调炎症调节或炎症效应基因。11.权利要求4中所述的方法，其中多核苷酸抑制组织细胞中耙基因的表达。12.权利要求4中所述的方法，其中所述组织与皮肤区域相关。13.权利要求4中所述的方法，其中所述组织由于灼伤受伤害。14.权利要求4中所述的方法，其中所述組织由于化学制品受伤害。15.权利要求4中所述的方法，其中所迷组织由于激光受伤害。16.权利要求4中所述的方法，其中所述组织由于整形手术受伤害。17.权利要求4中所述的方法，其中所述组织为进行皮肤移植受伤害。18.权利要求4中所述的方法，其中所述组织由于外科手术受伤害。'19.权利要求4中所述的方法，其中所述组织由于物理切割受伤害。20.权利要求4中所述的方法，其中所述细胞是上皮细胞，血管内皮，血管平滑肌细胞，心肌(心脏)和伤口愈合时存在于皮肤组织中的过客白细胞。21.权利要求4中所述的方法，其中所迷处理用于人，或非人哺乳动物。22.权利要求6中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向选自表la和表lb中所列序列的Cor-2(环加氧酶-2)序列。23.权利要求6中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向选自表2a和表2b中所列序列的纤连蛋白序列。24.权利要求6中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向选自表3a和表3b中所列序列的^fWJ基因序列。25.权利要求6中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向选自表4a和表4b中所列序列的IL-6(白细胞介素-6)序列。26.权利要求6中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向选自表5a和5b中所列序列的IL-8(白细胞介素-8)序列。27.权利要求6中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向选自表6a和6b中所列序列的5TrsJ(剪接因子，富含精氨酸/丝氨酸3)序列。28.权利要求6中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向选自表7a和7b中所列序列的TGF-p1(转化生长因子Pl)序列。29.权利要求4中所述的方法，其中组合物进一步包括PolyTran聚合物溶液。30.权利要求4中所述的方法，其中組合物进一步包TargeTran纳米颗粒溶液。31.权利要求4中所述的方法，其中所述siRNA包括针对一个或多个基因序列的一个或多个siRNA双链体。32.权利要求4中所述的方法，其中靶向多核苷酸与小分子药物，单克隆抗体药物或其他的免疫调节剂一起组合应用。33.权利要求4中所述的方法，其中组合物包括多个靶向多核普酸，而且其中所述多核苷酸乾向多个基因序列。34.权利要求31中所迷的方法，其中靶向多核苷酸靶向Cw2，TGF--P1和IL-8基因序列。35.权利要求31中所述的方法，其中靼向多核苷酸靶向TGF-陽"和IL-6基因序列。36.权利要求31中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向2，TGF-和IL-8基因序列。37.权利要求31中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向TGF-和IL-6基因序列。38,权利要求31中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向V^WJ和IL-8基因序列。39.权利要求31中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向~-2，胁6/J和IL-6基因序列。40.权利要求31中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向^;rWJ,TGF-P1和WrsJ基因序列。41.权利要求31中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向TGF-P1和纤连蛋白基因序列。42.权利要求31中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向TGF-P2和纤连蛋白基因序列。43.权利要求31中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向Co7-2，TGF-P1和^a^基因序列。44.权利要求31中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向三个基因序列的其他组合。45.权利要求31中所述的方法，其中靶向多核苷酸靶向超过三个基因序列。46.权利要求31中所迷的方法，其中靶向多核苷酸可以根据治疗结杲，以相等比例或不同比例混合。全文摘要本发明描述了在疤痕形成期间，使用siRNA靶向在受伤组织的细胞中表达的各种基因以促进无疤痕伤口愈合的组合物和方法。文档编号C12N15/11GK101426914SQ200680053534公开日2009年5月6日申请日期2006年12月29日优先权日2005年12月30日发明者P·Y·卢,何为无申请人:因特拉迪格姆公司