来自冷冻的脐带组织的活细胞的制作方法

专利名称：来自冷冻的脐带组织的活细胞的制作方法
技术领域：
本发明聚焦于从脐带(UC)结締组织中收获一群快速增殖的人细
胞；处于成骨、软骨形成、生脂和生肌条件中的这样的细胞的培养物； 如它们缺少细胞表面组织相容性抗原所示的，证明了在这些细胞群中 高百分比的细胞是无免疫能力的；以及这些细胞用作多能祖细胞的来 源用于多种基于细胞的治疗的能力。更特别地，本发明涉及冷冻的组 织作为上述有价值的祖细胞来源的应用。
背景技术：
UC是在原肠胚形成(三胚层形成)后所最初形成的一种结构。当折 叠开始时，胚盘经卵黄和尿嚢血管通过原始中肠(胚胎起源)与原始卵黄 嚢(胚胎外起源)相连接，所述血管接着发育形成脐血管(Haynesworth 等，1998; Pereda和Motta, 2002; Tuchmann-Duplessis等，1972)。 这些血管被称为脐带胶质(WJ)的通常被认为是主要由胚外来源的原始 间充质组织所支持并被其环绕(Weiss， 1983)。在妊娠期间，从该早期 开始UC生长直至变成在分娩中所见的30-50cm的脐带。因此，预计 WJ不仅含有已在文献(参见下文)中描述的成纤维细胞样或肌成纤维细 胞样细胞，还含有能产生在胚胎和胎儿发育期间为支持脐带生长所必 需的扩增体积的WJ的细胞的祖细胞群。
Thomas Wharton首次描述了 WJ，其在1656年出版了他的论文 Adenographia (Wharton TW. Adenographia. Freer S.译(1996). Oxford, U.K.: Oxford University Press, 1656; 242-248)。随后，其被定义为由 分散于由包括透明质酸在内的蛋白聚糖(Schoenberg等，1960)和不同 类型的胶原(Nanaev等，1997)组成的无定形基质中的细胞所组成的胶 状的、松散的粘液性结締组织。分散于该基质中的细胞已被描迷为是 在萎陷的脐带中呈星状以及在扩张的脐带中拉长的"成纤维细胞样" (Parry, 1970)。最初在基质中观察到平滑肌细胞(Chacko和Reynolds, 1954),尽管Parry(1970)对此有争议，他将它们描述为在表面上类似于 平滑肌细胞的有些"不寻常的成纤维细胞"。此后，在1993年Takechi等(1993)对这些细胞进行免疫组织化学研究之前，4艮少进行鉴定这些细 胞的工作。他们将这些细胞描述为是"在无定形基质中"具有长胞质 突的纺锤状或星状以及胶原纤维波形网络"的"成纤维细胞样"(Takechi 等，1993)。为了免疫组织化学染色，他们使用了针对肌动蛋白和肌球 蛋白(胞质可收缩蛋白)、波形蛋白(胚胎间充质起源的成纤维细胞特有 的)以及结蛋白(特异于肌原性起源的细胞)的第 一抗体，以便确定哪些 类型的肌球蛋白与WJ成纤维细胞相关。他们观察到高水平的化学上可 提取的肌动球蛋白；尽管成纤维细胞含有胞质肌动球蛋白，但是它们 对肌动蛋白或肌球蛋白没有染色，而WJ成纤维细胞则对两者染色阳 性。此外，观察到对于波形蛋白和结蛋白两者染色阳性，得出WJ中这 些改变的成纤维细胞来源于原始间充质组织的结论(Takechi等，1993)。 随后，Nanaev等(1997)更近一些的研究证实了在早产脐带中增殖的间 充质细胞祖细胞的五步分化。他们的发现支持了肌成纤维细胞存在于 WJ基质中的提议。WJ细胞的免疫组织化学鉴定表明非常类似于已知 是骨形态发生中成骨细胞主要来源的周细胞，并且还可以在培养物中 形成称为集落形成单位-成骨细胞(CFU-O)(Aubin, 1998)的骨小结(bone nodules) (Canfield等，2000)。
等(Mitchell等，2003)描述了一种方法，其中他们首次取出并弃去脐血 管以收获残留的组织。然后将包括残留的WJ(由于脐血管完整地包裹在 WJ中，因此WJ中的一部分已与血管一起丟弃)和羊膜上皮的残留的组 织切块以产生被转移到组织培养i中的小的组织碎片。接着将这些组 织碎片用作为细胞从中迁移到培养基上的原始外植体。
在另 一篇出版物中，Romanov等(2003)指出他们成功地从脐带血管 系统中分离了间充质干细胞样细胞，尽管他们还指出他们的培养物不 含有来自WJ的细胞。具体来说，自脐静脉内部他们使用了单次15分 钟的胶原酶消化，其产生了混合的一群血管内皮和内皮下细胞。 Romanov等表明在7天后少量成纤维细胞样细胞出现在该细胞收获物 中。
同样，美国专利5，919,702描述了一种从人UC的WJ中分离"前 软骨细胞"的方法，以及它们用于产生软骨的用途。具体来说，该方 法包括沿纵向在脐带上切开1英寸的切口，剥离血管并'拉出，，然后弃去，并将WJ收集在无菌容器中，在其中切成2-3mi^切片供培养 用。在一种优选的方法中，通过将WJ的2-3mn^切片放置于培养亚底 部的载玻片上，用另一片载玻片覆盖，并培养10-12天以便使'前软骨 细胞，迁移到培养亚表面，从而分离细胞。
在2005年7月7日公开的美国专利申请US2005/0148074中,Davies 等描述了从被称为血管周围区的特定区中的脐带胶质分离独特的祖细 胞群。在该区中的脐带胶质位于脐带血管外壁上或与之结合，当血管 从脐带切离时仍保持与它们结合。该祖细胞群具有非常短的倍增时间， 并包含具有多种有价值的特性的祖细胞，包括多能细胞以及产生包括 脂肪、骨、软骨、肌肉和内皮組织在内的多种间充质组织的细胞；自 发分化为骨形成成骨细胞的细胞；和缺少MHC I类和II类标记的细胞。 获得自人脐带血管系统的血管周围区中脐带胶质的祖细胞在此称为 HUCPVCs。
因此，预示脐带组织是祖细胞以及用于组织工程学和其他医学方 法的其他细胞的重要来源。当前实践容许脐带来源的细胞在低温条件 下得以更长时间的保存，并从其中回收活细胞。然而，迄今所开发的
脐带细胞自身。因::在需要从脐4组织中回:活细胞情况下，、:脐 带组织是新鲜时，通常在脐带提取24小时之内，技术人员必须迅速行 动来处理脐带组织，使得所需的组织能被提取，并且所需的细胞亦能 分离、培养并冷冻保存，期间那些细胞仍有活性。显然，提供一种容
发明概述
现已证实活细胞可回收自已冷冻的脐带组织。因此，本发明考虑 到在分娩后的基础上低温"储藏"上述组织的习惯，提供了一种用于 从冷冻的脐带组织中按需提取活细胞的稳定方法。
更特别地，并根据其的一个方面，本发明包括获得分娩后脐带组 织，以及冷冻分娩后脐带组织的步骤。在一个优选的方面中，使用一 种包括获得包含活细胞的脐带组织，将脐带组织与含有含血清细胞培 养基和低温防护剂的低温防护溶液组合，并对组合物进行冷冻处理， 其中组合物首先在容许低温防护剂渗入组织的时间和温度下作为液体冷却，然后冷冻该冷却的组合物，并接着在低温条件下保存冷冻的组合物的步骤的方法，本发明适用于保持存在于脐带组织中细胞的存活力。
根据其的另 一 个方面，本发明提供了 一种用于从脐带组织中获得活细胞的方法，包括以冷冻形式获得上述组织，解冻所冷冻的组织并从解冻的组织中提取活细万包的步骤。在一个优选的方面中，^吏用一种包括获得冷冻的脐带组织，并任选地低温保存，特别是通过本发明的方法低温保存，解冻所冷冻的组织，洗涤解冻的组织以除去低温防护剂并从所得到的组织中提取活细胞的步骤的方法，本发明适用于从脐带组织中回收活细胞。
因此，在其的另一个方面中，本发明提供了一种用于从脐带组织中获得活细胞的方法，其中该细胞提取自之前冷冻的脐带组织。
在 一 个进 一 步的方面中，本发明提供了以冷冻状态及任选地以低温保存状态存在的脐带组织，所述脐带组织包含只要是通过本发明的方法制备就能以存活状态回收的祖细胞。
在本发明的一个相关方面中，提供了以包含多个容器和注明每个容器内含物的目录的组织库形式存在的脐带组织，其中每个容器包含所述冷冻的脐带组织的样品。在一个特定的实施方案中，容器为适合于低温保存的容器。
在一个进一步的方面中，本发明提供了 一种包括从之前冷冻的脐带组织中获得活细胞，并从那些活细胞中选择是祖细胞的细胞的步骤
的方法。在一个特定的方面中，祖细胞为HUCPVCs，并且本发明提供了一种用于从冷冻的脐带组织中回收活HUCPVCs的方法，包括步骤1)获得冷冻的脐带组织，该冷冻的脐带组织任选地为低温保存的脐带组织，其中脐带组织为具有締合的血管周围脐带胶质的新鲜的、分离的人脐带血管或其片段，并已通过包括下述步骤的方法得以制备
a) 获得所述脐带组织，
b) 将脐带组织与含有含血清细胞培养基和DMSO的^氐温防护溶液组合，
c) 对组合物进行冷却处理，其中组合物在容许DMSO渗入组织的时间和温度下作为液体^皮冷却，
d) 冷冻所冷却的组合物以提供冷冻的脐带组织，并任选地，
8e)在低温条件下保存所冷冻的脐带组织一段时间；并接着
2) 使冷冻的脐带组织解冻；
3) 处理解冻的脐带组织以用水置换DMSO;以及
4) 消化与保存的血管締合的脐带胶质(Wharton's jelly)以释放活HUCPVCs。
参考附图本发明的方面现将得到更详细的描述，其中附图简述


图1是一张呈现人UC中三种不同的组织区域的光学显微照片；
图2是一张胶原酶溶液中环状血管的典型例图3是一张已粘附于聚苯乙烯组织培养表面上的分离自WJ的细胞
的光学显微照片；
图4是一张图解说明CFU-0最初形成的光学显微照片；
图5是一张图解说明成熟的CFU-0的光学显微照片；
图6显示在35mm聚苯乙烯组织培养皿上于UV荧光下的四环素
标记的CFU-O;
图7图解说明了并排放置的相同的四环素标记的CFU-0的相差光学显微照片和荧光显微照片；
图8是一张在组织培养聚苯乙烯表面上的成熟的CFU-O的扫描电镜照片；
图9是一张暴露作为基础的基质的CFU-0横切面的扫描电镜照
片；
图10是一张位于CFU-0前缘的轻度矿化的胶原纤维的扫描电镜
照片；
图11是一张通过分化成骨细胞铺在聚苯乙烯界面上的非胶原基质
(被视为小球状体)的扫描电镜照片；
图12是一张包含成熟的CFU-0中心的重度矿化的胶原的扫描电镜照片；
图13图解说明了流式细胞术数据，显示WJ来源的细胞有77.4°/0是MHCI和MHC II阴性；图14是一张骨小结横切片的Masson三色染色的黑白复制图，显示了已陷入胶原中的细胞(骨细胞)的分布，以及多层周围细胞，其中的一部分为复杂的(elaborated)细胞外基质所包围；
图15显示了与定向骨祖细胞亚群和总的骨祖细胞亚群扩增有关的粘附的血管周围WJ群的潜在扩增；
图16显示了从0至144小时的血管周围WJ细胞的增殖，图解说明了具有从0至24小时的延滞期、从24至72小时的对数期以及/人72至120小时的平台期的正常生长曲线。在整个培养期内倍增时间为24小时，期间在对数期内倍增时间为16小时；
图17显示了超过5次传代的WJ细胞的主要组织相容性复合体(MHC)的表达，它们表达的改变归因于冻融，而随后的表达则归因于再培养；
图18显示了 HUCPVCs的CFU-F频率；
图19显示了从PO至P9的HUCPVCs的倍增时间。HUCPVCs显示从P2至P8有20小时的相对稳定且快速的倍增时间；以及
图20显示了 HUCPVCs的增殖，显示在30天的培养中可产生〉1014个细胞。随着该快速扩增，可在24天的培养中产生1,000个治疗剂量(TDs);
图21显示了胶原酶浓度和消化时间对细胞收获的影响；以及图22提供了显示从低温保存中回收并在含青霉素G(167单位/ml)、庆大霉素(50^ig/ml)和两性霉素B(0.3吗/ml)的5% FBS和a-MEM中于组织培养处理的表面上培养后第4天(图A)和第9天(图B),通过台盼蓝排除确定为活的细胞的存在的光学显微照片。图C是一张显示用于比较当之前没有冷却、在浸没于10。/。DMSO后冷冻脐带时所获得结果的光学显微照片。
发明详述
在一个方面中，本发明涉及用于保存脐带组织的方法。该实践使与其来源对象组织相容的细胞的未来利用得以可能，例如由于医学原因如细胞或组织修复或再生所产生的未来需要。
在本发明中，脐带组织是分娩后获得的，并进行了冷冻，然后将冷冻的脐带组织保存作为活细胞的未来来源。为从该冷冻的组织中获得活细胞，使组织得以解冻，然后提取以提供当培养时显示存活力的细胞。
本发明的方法可应用于多种脐带组织，如包括血管壁和内皮的血管系统、脐带胶质、羊膜上皮等。获得上述組织所的脐带可以是来自任何哺乳动物的脐带，并优选获得自人脐带。在本发明的一个实施方案中，脐带组织是脐带胶质。在一个优选的实施方案中，该组织是与脐带血管系统(优选人脐带血管系统)的血管周围区締合的脐带胶质。在
本发明的另一个实施方案中，脐带组织是血管组织。在一个优选的实施方案中，该组织为具结合了与血管周围区締合的脐带胶质的血管组织。在一个特别优选的实施方案中，待冷冻的脐带组织为血管系统(即血管)以及締合的脐带胶质，当该血管系统从切除的脐带中除去时该脐带胶质仍与之締合。上述脐带组织包括全长的完整血管系统、单根血管、血液已任选地除去的其纵切片形式以及上述组织的横切片。
因此，在本发明的所有方面中，优选的脐带组织为具有位于其外壁上或与之締合的脐带胶质(即位于脐带血管周围区中的脐带胶质)的人脐带组织中的血管。位于该特定区中的脐带胶质是上述并进一步详述于下的祖细胞的丰富来源。该脐带胶质与血管壁如此紧密地締合，以致于在操作上难以将其与血管壁分离。尽管如此，该血管周围脐带胶质自身以及不带有締合的血管的回收在技术上仍是可行的，本发明因此进一步包括上述分离的血管周围脐带胶质作为脐带组织用作用于随后的活祖细胞收获的待冷冻的以及任选地低温保存的源材料的应用。
脐带组织被期望作为分娩后组织，并在任选解剖以提供具有上述特性的组织后新鲜获得，然后以备冷冻。期望地，脐带组织从收获起
约24小时内进行加工，如此提取的组织从收获起至少约72小时之内、更优选48小时之内以及特别是24小时之内被冷冻并期望地进入低温保存。在此期间可冷却该新鲜组织，并按照标准操作期望地进行洗涤以及任选地进行消毒灭菌，但不应在此期间进行如本文中所指明要求的冷冻，使得细胞存活力不受不利影响。
在优选的实施方案中，其中要被保存的脐带组织为具有締合的血管周围脐带胶质的脐带血管，可如下文所详述的以及Davies等在US2005/0148074中所描述的对该血管进行提取。简言之，通过轻轻地
ii将血管从已纵向开口的脐带中拉出获得具有締合的脐带胶质的完整脐
带血管，并横向切割以产生1-3英寸(如约4cm)长的血管片段。该处理去除了脐带中大部分的脐带胶质，但在与所提取的血管締合的血管周围区中留下了脐带胶质。例如使用夹钳、缝合线等将血管末端打结以防止血管中残留的任何血液漏出。此外或在备选方案中，可通过在适合的载体如盐水或緩冲盐水(如PBS)中反复漂洗除去血管中的血液。
染物存在。在除去血液的情况下,i当理解可用于保存的脐带血管片
段不仅包括通过横向切割血管所产生的片段，还包括通过纵向切割所产生的片段，尤其是横向切割，会产生作为原本是管状片段的条带的片段。具有血管周围脐带胶质的所有形式的脐带血管片段都能用于本发明的方法中。
为了在活细胞可以回收的条件下保存组织，将脐带组织置于适合于冷冻处理的载体中，例如任何适合于低温保存的载体中。任选地，载体进一步包含适合于细胞培养的补充物。在一个实施方案中，载体包括二曱亚砜(DMSO),如10-30% DMSO,如15-25% DMSO,包括20%DMSO。在另一个实施方案中，其中载体包括细胞培养补充物，DMSO以载体体积的1-25%,如5-20°/。，如8-15°/。，即约10%存在。在另一个实施方案中，补充物为基于血清的补充物，如胎牛血清。在一个特定的实施方案中，按体积自身包含有5-20%(如10%或15%)的FBS的胎牛血清培养基以载体体积的75-99%,如80-95%,即约90%的存在。在一个更进一步的特定实施方案中，按体积载体包含90%的10Q/qFBS溶液和10% DMSO。
在本发明的 一个特别优选的方面中，用于冷冻以及任选的低温保存的组织制备通过分阶段的、过渡的冷却处理得以进行，该冷却处理
#:特别设计以使低温防护剂能渗入组织，从而在保存过程中充分地保护组织以及存在于其中的细胞，并能置换在冷冻下会损伤组织和细胞的水。特别是，优选的冷冻/低温保存方法使用了如上所述包含低温防护剂和细胞营养培养基如补充有血清的细胞培养基的低温防护溶液。低温防护剂可以是任何保护组织以及存在于其中的细胞免于冷冻及结水所造成的破坏作用的液体试剂或试剂溶液。最优选地，低温防护剂
为二甲亚砜(DMSO)。在备选方案中，低温防护剂可以是甘油或甘油和DMSO的混合物。甘油可以与关于DMSO在本文中所列的相同的方式 及相同的浓度使用。DMSO的特性使之特别适合用于本发明的低温保 存方法中。
存在于低温防护溶液中优选的补充血清的培养基为胎牛血清 (FBS)。可选地，该培养基可包含任何适合于细胞培养的营养培养基， 如DMEM、 M 199、 RPMI 1640等，其添加有血清补充物如FBS、人血 清等。 一般来说，仅仅取决于所选择的营养培养基的类型，该培养基 的血清成分应包含约5-30%血清，如10-20%血清。如上所述，优选的 低温防护溶液按体积包含约10% DMSO和约90%的培养基，如FBS。
为制备用于冷冻及随后低温保存的组织，可将组织与低温防护溶 液组合，并在对于低温防护剂渗入组织从而期望地置换了締合水有效 的一段时间和温度下作为液体冷却。为了该目的，在此组织为具有血 管周围脐带胶质的脐带血管片段时，该组织适合于在约4C的温度下保 持约15-60分钟，例如20-40分钟以及优选30分钟。更低的温度是4支 不理想，因为在低于该温度下DMSO会凝固并且减少组织渗入。更高 的温度是适合的，但还是期望使用较低的温度以便在操作期间减緩脐 带中的代谢过程。冷却期可以改变。期望权衡轻重使得给予低温防护 剂足以渗入组织的时间，同时减少脐带操作过程时间。 一般而言，冷 却时间应当不少于约10分钟并且可接近于最高达60分钟或更久。
在冷却处理期间，根据标准操作，组织可温育于任何合适的容器 中，例如离心管，如50mL体积的离心管。当组织为具有血管周脐带胶 质的脐带血管时，每一容器可容纳约5-10个血管片段。不让容器塞满 是有用的，能使得DMSO渗入不受阻碍。
在冷却后，对血管进行冷冻处理。期望地，在将冷却的组织转移 到低温容器之后进行该处理，使得冷冻的组织能随后易于转移至低温 保存。在一个实施方案中，容器由可被消毒的不易碎的聚合物(例如聚 丙烯等)制成，并以管或其他可接受的形式提供，所述其他可接受的形 式适合于容纳可移除的盖子以使在保存期间该容器能驻留样品并使该 样品在其后能放出。最值得期望的是，每一低温容器包含一份组织样
品，如在组织为具有血管周围脐带胶质的脐带血管的情况下每一容器 包含一个血管片段。所谓的低温管是适合的，如聚乙烯袋。如此，将冷却的血管转移到低温容器中，并与体积足以优选完全浸没组织的新 鲜的^f氐温防护溶液组合。
接着，通过将样品置于冷冻单元中冷冻所制备的組织，其中冷冻 单元的温度可控制在冷冻该組织所必需的低温下。在一个实施方案中，
将包含组织和溶液的容器置于冷冻机中以将温度降低至约-70C,如在 约-40C下，持续至少约6小时，如至少约8-12小时。最优选地，使用 控速-70C冷冻才几进4亍冷冻。
应当理解冷冻的组织能直接用作为从中回收活细胞的起始材料。 这样的冷冻材料当保持在-70C下时，可显示出至少某些细胞活性，并 因此应可相对迅速地得到使用，从而避免了在该温度下随时间过去可 能发生的细胞死亡。更优选地，根据本发明的方法，将冷冻的组织置 于低温保存中，即在细胞代谢处于停滞的温度下保存。
因此，在组织冷冻后，优选以业已开发用于保存类似细胞和组织 的方法将含有冷冻的组织的容器转移至低温保存。适宜地，在约-180C 至-200C下将容器保存于液氮的气相中。在备选方案中，冷冻的细胞可 低温保存于除液氮之外的介质中，如液态二氧化碳或液态卣化碳。
组织样品可在该低温状态中驻留几天、几周、几个月或几年的一 |殳长时间用于当需要祖细胞来源时从中取出祖细胞。
需要时，可利用根据本发明的回收方法获得驻留在保存的组织中 的活细胞。更特别地，首先获得处于低温保存的容器中的组织并解冻 以使得随后低温防护剂的除去得以进行。该组织可例如在温度通常不 超过40C的温水浴中解冻。10C-40C的温度是适合的，以及37C的温 度是所期望的。 一旦解冻，在37C下约5-15分钟，如IO分钟，就可 将组织转移至例如50mL管的容器中，并洗涤组织以稀释或除去 DMSO。期望地通过将组织浸没于冷的液体中，利用冷的(如冷却的， 例如4。C)液体如水或緩冲盐水如PBS进行该洗涤。期望地，避免对该 组织的过分洗涤，使得对细胞的沖击或损伤最小化。浸没的组织可在 冷冻机中保持又一段时间以使通过水对低温防护剂进行进一步的稀释 和置换得以进行，并接着通过添加更多的冷的液体进行进一步的稀释。
接着，利用与为从新鲜的脐带组织中回收活细胞所建立的实践操 作相同的实践操作，所得到的恢复的组织可用于回收驻留在该组织中 的活细胞。因此，本发明的方法能从已冷冻并低温保存的脐带组织中回收活细胞。可利用任何一种为该目的所建立的技术来证实这样的细 胞的存活力。便利地，可通过台盼蓝排除(一种鉴定不能排除该染料的
死细^^的方法)简单地或以一种更复杂的方法通过^r测BrdU的掺入以 证实发生DNA合成来证实所回收的细胞的存活力。因此，关于细胞在 本文中使用的术语"活的"指细胞具有活性代谢，以及对于基于粘附 培养的细胞所进一步期望地显示的，对培养基质的粘附特性和随后的 播散和增殖。上述存活力的一个例子示于图22中，特别是图A和B 中，其显示了活HUCPVCs的播散和增殖现象特性。
在本发明的特定实施方案中，回收自保存的脐带组织的活细胞为 祖细胞。在其他特定的实施方案中，如本文中所举例说明的，活的右L 细胞回收自与保存的脐带血管或其片段締合的血管周围脐带胶质。
应当理解本发明的保存和回收方法使包含多个容器(每一容器都包 含脐带组织样品)的保存收集物或"库"中脐带组织的组构变成可能。 这样的脐带组织样品的收集物或库构成了本发明的另一个实施方案。 每一组织库都会附有关于每种样品的目录指示，任何与每种样品相关 的有用信息如样品来源，例如关于供者个体以及可能的其遗传史或病 史，保存日期，生产该样品的机构或个人的身份等。利用该手段，组 织库可作为储库(repository)用于组织及其内在细胞的未来使用，并且该 目录可用于选择供特定患者或为治疗特定医学状况使用的特定的组织 和细力包。
在保存的组织为具有血管周脐带胶质的脐带血管或血管片段的情 况下，为回收活的祖细胞，可参考在我们共同未决的国际专利申请 WO04/072273(公开于2004年8月26日)和US 2005/0148074中所描述 的方法，上述专利文献在此并入作为参考。更特别地，这样的祖细胞 从新鲜的脐带组织中的分离以及它们的特性和最终用途描述如下。这 些祖细胞称为人脐带血管周围细胞或"HUCPVCs"。
所提到的参考文献教导了一种从人脐带的脐带胶质中提取细胞的 方法，其产生了以快速增殖、存在骨祖细胞和包括不显示两种主要组 织相容性标志中任何一种(人白细胞抗原(HLA)双阴性)的细胞在内的其 他人祖细胞为特征的独特细胞群。该细胞群是生长成骨和其他结締组 织包括软骨、脂肪和肌肉的祖细胞的有用来源，并为了治疗目的用于 自体和同种异体转移祖细胞给患者。更特别地，该方法提供了一种脐带胶质提取物，其中该提取物包 含人祖细胞，并且是通过酶消化在有用地称为血管周围脐带胶质区的 区域中邻近人脐带的血管系统的脐带胶质所获得的。处于该血管周围 区中且祖细胞提取自其中的组织还可称为血管周围组织。该提取方法 适宜地产生了基本上无脐带血的细胞、UC上皮细胞或内皮细胞以及来 源于脐带血管结构的细胞的提取物，在此血管结构被规定为小动脉或
静脉血管的内膜(tunicaeintima)、中膜和外膜。所得到的提取物也不同 于分离自已与血管结构相分离的大量脐带胶质组织的其他脐带胶质提 取物。
因此，该方法提供了一种用于获得人祖细胞的方法，包括从根据 本发明所获得的脐带胶质提取物分离细胞的步骤'
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胞群，包括骨祖细胞群和MHC -/-祖细胞群，
所提取的祖细胞群具有在粘附条件下i1
得的粘附细胞群的特征。在另一个实施方案中，所提取的祖细胞群具
"粘附后，，)(PA)细胞群的特征。该PA级分是通过将最初铺板的 HUCPVCs的上清液转移到新的T-75烧瓶中以容许到目前为止未粘附 的细胞粘附于培养表面所得到的。使用这种新的T-75烧瓶重复该操作， 将其培养基转移到另一个新的T-75烧瓶中以便收获任何残留的PA细 胞。该PA细胞群包含当在粘附条件下培养时，快速增殖并自发形成骨 小结和脂肪细胞的祖细胞亚群。这种技术提供了一种增加分离自酶消 化细胞群的粘附细胞产量的手段。
需的补充物的情况下培养时分化为骨细胞的特性的定向骨祖细胞群。
还提供了一种用于产生包括骨组织、软骨组织、脂肪组织和肌肉 组织的结締组织的方法，其包括让获得自脐带胶质提取物的细胞处于 有助于那些细胞分化为期望的结締组织表型的条件下的步骤。在这方 面，本发明进一步提供了这样的细胞在基于细胞的治疗中的应用，所 述治疗包括细胞移植介导的医学状况、疾病和病症的治疗。还提供了一种组合物及其在组织工程化中的应用，所述组合物包
递送至所选择的组织部位的载体。
提供了一种脐带胶质(WJ)的提取物，其作为包含包括骨祖细胞以 及无免疫能力的细胞的人祖细胞的快速增殖细胞群的来源。
所提取的细胞群可称为人脐带血管周(HUCPV)细胞。该HUCPV细 胞群构成了在其表型上是独特的，特别是为包含在其中的多种细胞亚 群所揭示的多能祖细胞的丰富来源。被提取的细胞所来源的脐带胶质 的血管周围区可被称为血管周组织。
当在本文中使用时，术语"祖细胞"指在控制和/或规定的条件下 会分化为给定表型细胞的细胞。因此，骨祖细胞是一种当在为这样的 定向和分化所建立的条件下培养时，会定向为成骨细胞谱系并最终形 成骨组织的祖细胞。"无免疫能力的"或"非免疫原性的"祖细胞是 一种具有与I类和II类主要组织相容性复合体(MHC)有关的表面抗原 阴性表型的细胞。这样的祖细胞在本文中还被称为HLA双阴性或MHC -/-。
提取自WJ的HUCPV细胞群还具有"快速增殖"的特征，其指在 用于祖细胞扩增的标准条件下，相对于其他已知的祖细胞群，所提取 的细胞生长的速度。根据本文中所呈现的实验结果以及如图16中所示 的，应当理解祖细胞群可在至少约25小时之内，以及在快达7-15小时 之内倍增，并因此较其他已知的骨祖细胞群和提取自WJ的其他祖细胞 群扩增快得多。
细胞和细胞群可通过从人脐带的WJ中提取获得。和现有技术不 同，这样的细胞提取自締合即邻近脐带血管系统外壁的WJ。与脐带血 管系统外表面締合或非常邻近的脐带胶质位于称为血管周围区的区域 中，且当从脐带中切离血管(如从脐带中提取脐带胶质或从脐带中提取 血管以及締合的脐带胶质)时通常与该血管系统保持締合。已显著地发
现位于该血管周围区中且在现有技术实践中通常被弃去的脐带胶质是 具有本文中所描述的特性的祖细胞的丰富来源。因此，利用了来自该
脐带胶质的血管周围区的组织作为称为HUCPVCs的有用的人祖细胞来源。在实施方案中，HUCPV细胞群的特点在于存在具有许多指示功能 性间充质细胞(非造血)表型的标志(即CD45-、 CD34-、 SH2+、 SH3+、 Thy-l+和CD44+)的祖细胞。特别有意义的是，该细胞群的特点在于通 常作为3G5抗体阳性的容纳细胞(harbouring cells),该抗体是一种指示 周细胞的标志。所提取的细胞群通常是一种在形态学上同质的成纤维 细胞群，其表达a-肌动蛋白、结蛋白和波形蛋白，并提供非常有用的 来源，期望细胞亚群可通过操纵培养条件并基于例如细胞分选原理和 技术选择获得自所迷来源。
为从人脐带中提取这样的血管周围细胞，要注意在提取过程期间 避免提取脐带血细胞、UC上皮细胞或内皮细胞以及来源于脐带血管结 构的细胞，在此血管结构被少见定为动脉或静脉血管的内膜、中膜和外 膜。可通过在解剖前仔细地冲洗并洗涤脐带，接着小心地将血管从脐 带中解剖出来，就能获得基本上不含有这些不需要的细胞的提取物。 还可小心地将这些血管从周围的脐带组织拉出来，在这样的情况下将 血管周围组织与血管相切离。应当理解要小心以避免提取这些不需要 的细胞，它们仍有可能少量存在于所得到的提取物中。可接受的前提 条件是它们以如此低的以致于不千扰本文中所呈现的观察结果的频率
细胞集落的观察、CFU-F、 CFU-0和CFU-A形成的频率和速度以及对 在培养的细胞群中所观察到的HLA表型的表征。
位于血管周围区中的组织是邻近脐带血管系统外壁的脐带胶质， 并且通常位于由血管外壁向外延伸约3mm的区域内。适宜地，该靶提 取区可位于三条血管中任何一条的外壁向外延伸约2mm,如约lmm的 范围内。利用实施例中所描述的技术能容易地实现从该区中提取WJ。 在该技术中，血管用作为WJ的载体，并且血管本身亦可用作为提取祖 细胞的基质。因此，通过外科手术或手工从已充分洗涤从而基本上除 去所有脐带血污染物的新鲜的脐带上将具有血管周围组织薄覆盖层的 脐带血管切离。然后在含有适合于消化期望细胞所驻留的血管周围组 织的胶原基质的酶的提取介质如磷酸盐緩冲盐水(PBS)中于约37°C下 温育具有邻近的血管周围组织的血管或其切片。为了该目的，用约
0.1mg/mL-10.0mg/mL或更多，如0.5mg/mL浓度的胶原酶进行消化是 适合的。酶的类型、浓度和温育时间可以改变，并且可通过在所选择
18的条件下监测细胞表型和细胞群的产生，从而简单容易地确定可选的
提取条件。举例来说，在约3小时(如1-5小时)的较短的消化时间内， 4mg/mL(如l-4mg/mL)的较高的胶原酶浓度也是适合的。在提取期间， 打结或剪去血管末端，并可将其悬挂在提取介质上以避免血管中所包 含的物质污染介质。因此，应当理解脐带胶质提取物基本上不含有脐 带血细胞、脐带上皮细胞、血管内皮细胞和血管平滑肌细胞。
根据本发明，这样的组织被冷冻并优选地低温保存，并以一种容 许从所保存的组织提取活的HUCPV祖细月包的方式从冷冻或〗氐温状态 恢复。
其他可用于该分离步骤的消化酶为0.1-10mg/ml透明质酸酶、 0.05-10mg/ml胰蛋白酶以及EDTA。尽管较便宜的备选方案是使用 0.5mg/ml消化18-24小时，但最佳的胶原酶浓度为4mg/ml，消化时间 为3小时。另一种胶原酶浓度的备选方案是如图21中所举例说明的。 期望地，如图21中所示，在血管开始降解时或降解之前停止消化，取 决于胶原酶浓度该降解在不同的时间点出现。
在0.5mg/mL月交原酶提取介质中约24小时，如12-36小时，如18-24 小时后，或在4.0mg/mL胶原酶提取介质中约3小时后，移除血管，留 下含有人祖细胞的血管周围组织提取物。在用于祖细胞扩增的标准条 件下扩增这些细胞。这些细胞能例如在聚苯乙烯上被选择以选取粘附 细胞，例如在聚苯乙烯皿或烧瓶中，并接着保持在适合的培养基中。 如Baksh等在WO 02/086104(其内容在此并入作为参考)中所举例描述 的，无论有否之前的粘附细胞选择，都可在搅动的悬浮液的条件下培 养所提取的细胞用于扩增。
所提取的HUCPVCs群可在粘附条件下培养，并回收驻留于上清液 中的非粘附细胞用于进一步的培养。这些"粘附后，，细胞的特征在于 是一种具有自发形成骨小结和脂肪细胞倾向的细胞亚群。因此，该方 法提供了 一种提取自血管周围组织的分离的祖细胞群，这些细胞具有 形成包括骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌肉细胞在内的几种分化细 胞类型中的至少 一 种的倾向，其中这样的祖细胞构成了在粘附条件下 培养的HUCPVCs的非粘附级分。通过在粘附条件下培养血管周围组织 提取的HUCPVCs、选择非粘附的细胞群并接着在对(l)扩增所述细胞群 或(2)导致其分化为期望细胞表型有用的条件下培养该非粘附的细胞群，从而获得这样的细胞。用于其中的培养条件是如本文中所例证的 对这样的扩增和分化已建立的那些条件。
可在标准的粘附培养条件下培养并扩增HUCPV亚群。如本文中所 揭示的，这样的粘附细胞群已知包含无免疫能力的或非免疫原性的祖 细胞以及间充质祖细胞。
可利用已建立的技术直接或在扩增之后保存存在于提取物中的细 胞以提供富集所给定表型的细胞的能扩增的细胞亚群。因此，进一步 提供了血管周围组织提取的富集多能的间充质祖细胞、骨祖细胞的细
胞群，富集无免疫能力的祖细胞的细胞群以及富集无免疫能力的多能 和骨祖细胞的细胞群。此外，细胞可被富集以只选择对周细胞标志3G5 阳性的那些细胞，该选择利用了其3G5抗体，以及只选择对MHCI类 和II类标志中任何一种或两种阴性的那些细胞。还可通过针对其他表 面标志的选择富集细胞群，如通过耗竭那些带有CD45的细胞以例如除 去造血细月包。
如图17中所显示的，通过冻融改变了祖细胞群中MHC标志的分 布。新鲜的细胞刚一传代，MHC双阴性细胞的频率就相对恒定地/微小 增加。然而，在冷冻后铺板的细胞中祖细胞群中的MHC双阴性细胞的 频率明显增加了。因此，在祖细胞群中，MHC双阴性表型的细胞进一 步的特征在于具有冷冻后频率增加的倾向。通过首先制备细胞等分试 样，然后将细胞制备物保存一段期望的时间，以这种常用的方法进行 这样的冷冻。应当理解如果需要的话这样的细胞可保存许多年。
该方法通过获得如本文中所描述的血管周围组织提取物或其富含 MHC双阴性细胞的级分，对该提取物或其级分进行冷冻，并接着培养 该冷冻的细月包，/人而具有产生MHC双阴性3且细胞的用途。如所注意到 的，所得到的细胞在人受试者中能潜在地用于诱导组织形成或修复。
获得自提取物或其适合的富集级分的细胞群直接或在它们扩增之 后用于提供分化的细胞群。所有适合于它们分级分离和富集以及适合 于它们扩增的方法都在现有技术中得以建立。例如，扩增可在诸如IL-3 和干细胞因子的因子以及本领域中已知的类似试剂的存在下进行。佳_ 用为从其中生长骨组织所建立的条件，可让细胞群以及特别是其中的
骨祖细胞分化。值得注意的是，故称为定向骨祖细胞的来源于祖细月包 群培养的骨祖细胞亚群已显示在成骨补充物不存在下的分化能力。可选地，在补充有一种或多种刺激骨生成的试剂如地塞米松的培养基中 培养骨祖细胞。此外，还可用适合于刺激分化为其他间充质细胞来源
的结締组织(Caplan, 1991),包括软骨、肌肉、腱、脂肪等的补充物培 养祖细胞，所有操作都与本领域中的标准操作一致。
作为细胞群中细胞的体外培养的备选实践，应当理解可体内移才直 细胞以直接在患者中诱导期望组织形成。为了患有不同骨状况、疾病 和病症，尤其包括骨折和骨质疏松的患者的利益，通过该途径，经移 植骨祖细胞提供了骨原位形成。这样的治疗还可应用于减弱其他结締 组织例如但不限于软骨、脂肪和肌肉的疾病。存在于细胞群中的无免 疫能力的祖细胞在这方面上是特别有价值的，因为基本上减弱了可预 计在它们移植之后发生的排异反应。
为了在移植中使用，细胞可作为进一步包含用于将它们递送至一皮 选择用于工程化的组织部位的载体的组合物提供。细胞以对于预期戋文 果有效的剂量存在。预计有效的细胞剂量将处于每剂103-107个细胞， 如104- 106个细胞，如2 x 105个细胞。根据所建立的用于递送活细月包 的方法，组合物中被选择用于那些细胞递送的载体可以改变。在实施 方案中，细胞被用于骨组织工程化的目的。在一个实施方案中，细月包 与以用来将细胞作为植入物定位在缺损或折断或经外科手术准备接受 该植入物的骨部位的支架材料形式的载体一起存在。多种材料适合作 为载体用于该目的。在一个特定的实施方案中，载体由诸如磷酸钙、 PLGA或它们的混合物的可再吸收材料形成。可使用等效材料，只要它 们能让细胞在组合物形成和递送期间保持存活并且在植入部位是生理 学上相容的即可。
其他适合于祖细胞递送的载体包括诸如PBS和包括透明质酸、明 胶等的凝胶的载体，等效物也是有用的，前提条件是它们具有细胞存 活力必需的pH和其他特性。
还应当理解细胞用作为宿主用于递送基因表达产物给期望的组织 部位。换句话说，可对细胞进行遗传工程化以接受并表达基因，所述 基因表达后产生了在组织修复方法中有用的产物，如不同的生长因子， 就骨组织来说，所述生长因子可有效地包括PTH、 BMPs、降钙素等。 细胞还可被开发作为转基因细胞用于其他目的，如通过导入改变细月包 表型的基因以使该细胞更强壮或更适合于给定的最终用途。本发明的实施方案描述于下列实施例中。 从人脐带胶质中收获祖细胞
在加拿大多伦多Sunnybrook & Women's College医院，从刚分娩的
足月剖宫产婴儿中收集uc。通过外科医生将uc转移到含有培养基
(80%a-MEM、 20%抗生素)的无菌容器中，并马上运送到位于多伦多大 学生物材料和生物医学工程学院(Biomaterials & Biomedical Engineering, University of Toronto)的我们的实验室。
从这一刻开始所有操作都在生物学安全工作橱中无菌进行。在石粦 酸盐緩冲盐水(PBS) (-Mg2+,國Ca,中洗涤UC三次，尽可能多地除去 UC血液，然后移回具有培养基的容器中。用无菌剪刀剪下大约6 cm 长的脐带并置于无菌软木解剖板上。将剩余的脐带(30-45 cm)送回填充 培养基的容器中并置于37。C保温箱中。将该6 cm脐带切片逆着其螺 旋'扭开，，并钉住两端以暴露出UC上皮光滑且直的表面。使用精细 手术剪沿UC长度方向将UC切开大约l-2mm深以暴露WJ。从每条切 开上皮的'皮瓣，开始，使用解剖刀的钝缘从其内表面挑出WJ,并4丁 住挑离的上皮(大约0.5mm厚)。该步骤产生了暴露的WJ,并带有从头 到尾直的而非沿其纵轴成螺旋形的包埋在其中的三条血管。小心地不 断地用37。C PBS冲洗切片。用镊子分离一条血管的一个末端，沿WJ 长度方向将其挑出直至其游离于大部分的WJ基质为止。可选地，拿着 镊子可将中间 一条的血管从基质中剥离，并在朝着其末端的任何一个 方向上从基质中挑离。 一旦为任何一种方法所释放，血管就被大约 l-2mm的带细胞WJ基质围绕着。然后用手术钳或蚊式夹(mosquito clip) 夹住或缝合解剖出血管的两端以形成'环，，封闭液体进出血管的通 道。马上将该'环，与剪刀一起放置于含有0.5mg/ml胶原酶PBS(-Mg2、 -。&2+)溶液的50ml管中，并置于37。C保温箱中。以类似方式解剖出剩 余的两条血管，成环并同样置于保温箱的胶原酶溶液中。在除去血管 后，就能容易地从上皮上解剖出构成血管周围组织的WJ条带并置于具 有胶原酶溶液的50ml管中。然后在生物危害废弃物容器中处理剩余的 上皮层。将相同的实验方案用于剩余的30-45cm的UC,产生了 15-25 管的'环，或血管周围组织条带。脐带胶质祖细胞培养的开始
在18-24小时后，借助于附在其上的吊夹或缝线以及移液管移除 '环，，然后用PBS稀释剩余的悬浮液2-5次并在1150rpm下离心5 分钟以获得作为管底沉淀的细胞级分。在除去上清液后，在室温下将 细胞重悬于8倍体积的4%NH4C1中5分钟，以便裂解^f壬何红细月包污染 物。然后在1150rpm下再离心悬浮液5分钟以分离作为沉淀的细胞级 分，并除去上清液。在借助于血细胞计数器对细胞计数后，将它们直 接铺板于T-75 cn^聚苯乙烯组组织培养亚上，并在37°C下温育24-72 小时以便让细胞粘附于聚苯乙烯表面。之后每隔2天更换一次培养基。
利用上述方法再次产生了详述于下的结果，但其中所进行的基于 胶原酶的消化为在4mg/mL下3小时，在2mg/ml下6小时以及在 lmg/mL下12小时。
7天后利用0.1%胰蛋白酶溶液传代粘附细胞，此刻如通过光学显 微镜所观察到的它们显示80-90%汇合，并如在相差显微镜下所揭示的 以及通过预期的光学性质改变所显示的，证明了 '矿化的，积聚物形 成。刚一传代，就以4xl(^个细胞/cm2将细胞铺板于35mm组织培养聚 苯乙烯皿或6孔平板的经补充的培养基(SM) (75% a-MEM或D-MEM、 15%FBS、 10%抗生素)中，并用l(T8MDex、 5mM卩-GP和50 pg/ml抗 坏血酸处理以测试这些细胞的成骨能力。对于原本称为'骨小结，形 成的CFU-O，在培养的第2、 3、 4和5天观察这些平板。
为了测试这些细胞的软骨形成能力，在1150rpm下离心2xl05个细 胞5分钟以便获得作为沉淀的细胞。 一旦除去上清液，就将细胞保持 在补充有10 ng/ml转化生长因子-(3(TGF-p)(以及任选地补充有10々M地 塞米松)的SM中。每隔2天更换一次经补充的培养基，保持培养3-5 周，此刻收获它们用于组织学(通过用100/。中性福尔马林緩沖液(NFB) 固定)、包埋于石蜡中、切成6nm切片以及为胶原II的存在(抗体染色) 以及氨基葡聚糖的存在(阿尔新蓝染色)进行染色。为了评价细胞的生脂 分化能力，将它们最初于6孔平板的SM(含有D-MEM)中培养，每隔2 天更换一次培养基，直至它们达到60%汇合为止。此刻用生脂诱导培 养基(AIM) (88% D-MEM、 3。/。FBS、 33^M生物素、17pM泛酸盐、5pM PPAR-y、 100nM牛胰岛素、lpM地塞米松、200^M异丁基甲基黄嘌呤 和10%抗生素)更换培养基。每隔2天更换一次AIM,持续10天，此
23刻在10% NFB中固定细胞并用油红O(其将脂肪细胞的脂质泡染成红 色)染色。最后，为了评价细胞的生肌能力，将它们最初于T-75cn^组 织培养烧瓶的SM(含有D-MEM)中培养，直至它们达到80-90%汇合为 止，此刻用生肌培养基(MM) (75% D-MEM、 10% FBS、 10%马血清、 50(iM氬化可的松和10%抗生素)更换培养基。每隔2天更换一次MM。 培养3-5周后，从培养表面移出细胞(参见传代培养实验方案)，裂解细 胞以便获得它们的mRNA,并通过rtPCR评价几种生肌基因的存在， 所述生月/L基因包括MyoG、 MyoDl、 Myf5、肌球蛋白重链、成月/L蛋白 和结蛋白。
已采用了另一种对于获得血管周围组织来源的祖细胞培养物有用 的方法，使用了下列实验方案
1. 从剖宫产患者中获得无菌脐带(UC)并转移到生物学安全工 作橱中，置于培养基(80。/oa-MEM、 20%抗生素)中。
2. 在无菌的37。C磷酸盐緩沖盐水(PBS)中洗涤UC3次。
3. 使用锋利的剪刀将UC切成大约l-2英寸的切片。
4. 在无菌37。C PBS中洗涤每一UC切片2次以尽可能多地除 去残留的脐带血(UCB)。
5. 分离一个UC切片置于干燥的无菌皿上。
6. 利用两副一蔽子，夹持大约2mm间隔的上皮，并彼此拉离， 撕裂上皮。
7. 夹住上皮，沿着UC切片的长度方向持续撕裂上皮，暴露底 下的WJ。
8. 类似于步骤6，持续撕裂上皮为'条带，，直至大约一半的 上皮撕掉为止。
9. 脐血管应当通过WJ清晰可见，并且血管末端松散地搭UC 切片的切口上。
10. 通过用一副镊子夹住上皮的剩余部分，并用另一副镊子夹住 血管的末端，可将血管从带有环绕其的血管周围组织(PVT)
的大部分WJ中"拉出"。
11. 对每一条血管重复该处理，直至所有三条血管都不含有底下 的WJ基质为止。
12. —旦释放，就将每一条血管置于37。CPBS中。13. 对每一UC切片重复步骤5-12,直至所有的血管都分离于无 菌的充满37°C PBS的烧杯中为止。
14. 然后，通过将每条血管单独置于清洁的、无菌表面上，利用 缝合线打双结将血管末端连接在一起形成'环，。
15. —旦所有的血管都已连接成环，就将环置于无菌的50ml管 中的0.5mg/ml胶原酶溶液中。在备选的方案中，并根据本 发明，可冷冻血管，低温保存并接着恢复，利用本发明的方 法保持驻留的祖细胞(HUCPVCs)的存活力，还可利用步骤 15中 一 开始的方法回收驻留在解冻和处理的脐带组织中的 活的纟且细月包。
16. 将该50ml管置于旋转器中，于37。C, 5%。02的保温箱中过 夜。
17. 第二天，用lml胎牛血清(FBS)灭活胶原酶，并将环从悬浮 液中移除。
18. 用PBS稀释残留的悬浮液，在1150rpm下离心5分钟，并 弃去上清液。
19. 然后在室温下将沉淀重悬于8倍体积的4%NH4C1中5分钟 以裂解所有红细胞污染物，接着在1150rpm下离心5分钟， 并弃去上清液。
20. 将保留在沉淀中的细胞重悬于经补充的培养基(SM) (75% a-MEM、 15% FBS、 20%抗生素)中，并在血细胞计数器上 对等分试样计数，
21. 接着，将细胞悬浮液铺板于T-75组织培养聚苯乙烯烧瓶上， 并使之增殖。
22. 2天后，从烧瓶中将上清液转移到新的T-75烧瓶中，以便 收获"粘附后"(PA)细胞。
23. 2天后，从第一 PA烧瓶中将上清液转移到新的T-75烧瓶中， 以-使收获任何残留的PA细月包。
24. 每隔2天更换一次所有三个T-75烧瓶中的SM,直至细胞达 到亚汇合(l-2周)为止，此刻它们是传代培养的(传代的)。
完整的脐带血管的低温保存本发明容许从低温保存的脐带组织中回收活细胞，使用了下列例
证性的方法
冷冻
如上所述分离单条脐带血管，并如上所述用缝合线将血管末端打 结形成环。将血管置于15mL聚丙烯管中，每一聚丙烯管含有5mL的 由90。/。胎牛血清(FBS)和10。/o二曱亚砜(DMSO)组成的低温保存培养基。 然后将制备好的管置于-70C冷冻机中过夜，并在第2天转移到液氮中 进行长期保存。
解冻
在保存3天后将含有所制备的样品的管从液氮中移出，并立刻置 于37C水浴中。 一旦完全解冻，大约5分钟，就将样品环置于如上所 述的胶原酶消化介质中并放置在37C保温箱的旋转架(rotisserie)中。 在18-24小时温育后，移除被消化的血管，并使用上述方法分离祖细胞。 亦如上所述，在铺于组织培养平板上并在5-15% FBS补充的培养基中 培养之后，通过台盼蓝排除鉴定活细胞。
如下所述还开发了 一种改良的方法。使用如上所述的取出技术从 脐带上取出具有締合的脐带胶质的血管并切成约1-2英寸或约4cm长 的片段。然后将取出的血管片段(约5-10个片段/管，以避免拥挤)置于 50mL离心管的100/oDMSO和90。/oFBS(冷却的，@4。C)t，每条血管 lmL。可使用不同的含血清混合物或掺和物取代90% FBS,如10%血 清(FBS或其他)和80% DMEM或其他适合于细胞培养的培养基。接着
液中的血管片段的管。然后将管取出，并将血管转移到被称为低温管 的低温保存容器中。 一条血管片段添加到一个管中。向含有血管的低 温管添加每4cm血管切片lmL或足以完全浸没血管的低温防护溶、液 (如上所述90%血清，10%DMSO)。
接着将低温管藏的血管片段置于控速冷冻机中过夜(约6-12小时)， 降温温度并保持在约-70。C。此后，将管转移到液氮储存(气相)中，标记 用于识别，并在-196"C下保持约1周。
26为解冻血管，从液氮储存中移出低温管。从低温管中取出血管，
并在3/C水浴中让其解冻10分钟。接着将血管片段转移到50mL管中， 并在冷的(4C)PBS中洗涂，每条血管片段使用约lmL的PBS。然后在 4。C下于水箱中温育含有处于PBS中的血管片段的管，以除去DMSO。 然后加倍每个管中冷的PBS的量，并在水箱中将管温育额外的5分钟。 在该步骤后，特别是根据本文中进一步描述的祖细胞提取、培养 和分化技术，血管片段就随时可作为活的祖细胞包括HUCPVCs的来 源。
为证实活细胞可回收自如此保存的组织，对血管片段进行如上所 迷的消化步骤，根据图22所描述的将所释放的细胞铺板，并使用台盼 蓝排除在ViCell-XR机器中对细胞计数。在此之后，将确定为活的细胞^ 铺于如本文中所提及的标准培养基中，并如图22A和B中所示的证实 它们形成集落和增殖的能力。
该方法产生了生物学等价于从标准消化步骤中取出的细胞的细胞。
已尝试了其他方法，包括将解剖出的组织浸没于10%DMSO中， 然后的步骤是在-70C下冷冻，接着低温保存。如图22C中所示，这些 方法产生了非常少的活细胞。
3且细力包测定 细胞增殖测定
在每周一次的传代步骤中(每隔6天发生一次)，将3 x 104个细胞< 的等分试样铺于24块6-孔组织培养聚苯乙烯平板的每个孔中。在培养 的第1、 2、 3、 4、 5和6天，对6-孔平板中的4个孔进行传代并计数 细胞。对这些细胞的指数扩增进行作图，并计算在这些培养中细胞的 平均倍增时间。结果示于图16中。注意到在整个培养过程中PVWJ细 胞培养的倍增时间为约24小时。在对数期，值得注意的是倍增时间为 16小时。将其与文献所寺艮道的骨髓间充质细胞的约33-36小时(Conget 和Minguell, 1999)以及来源于脂肪组织的间充质干细胞的约3.2天(Sen 等，2001)的倍增时间相比较。为了观察具有连续传代的增殖，将3xl05 个细胞铺于4个T-75烧瓶(n-4)中并用SM补料，每隔2天更换一次。 在培养6天后，传代培养细胞(参见上述传代培养实验方案)，并借助于血细胞计数器计数。将3xl05个细胞的等分试样接种于4个新的T-75 烧瓶中，培养6天，并重复计数步骤。对于4个脐带样品从PO至P9 重复该步骤。
图18图解说明了 HUCPVCs的CFU-F频率。1:300的频率明显高 于对其他间充质祖细胞源所观察到的，包括新生儿BM (1:104) (Caplan, 1991)和脐带血来源的"不受限制的体千细胞"(USSCs) (Kogler等， 2004),其出现频率为l:2xl08。图19图解说明了连续传代时HUCPVCs 的增殖率。在P0最初的60小时倍增时间下降到在Pl的38小时，从 P2-P8其下降并自身保持在20小时。此后细胞开始进入衰老并且它们 的增殖速度开始快速下降。有趣的是，当在培养的最初30天期间观察 时(图20),在30天内HUCPVCs产生了 2xl0"个细胞。由于一个治疗 剂量(TD)定义为2xl()5个细胞(Horwitz等，1999) (Horwitz EM, Prockop DJ, Fitzpatrick LA, Koo WW, Gordon PL, Neel M等Transplantability and therapeutic effects of bone marrow-derived mesenchymal cells in children with osteogenesis imperfecta. Nat Med 1999; 5:309- 313.), 因此 在10天的培养中HUCPVCs可产生1 TD，并且在24天的培养中产生 了 1,000 TDs。
如图15中所示，血管周围组织来源的祖细胞包含不同的祖细胞亚 群。在该细胞群中，存在特征在于如本文中所示的在诱导这样的分化^ 通常所需的培养补充物不存在下，如在地塞米松存在下培养，具有形 成骨小结能力的所谓的"定向，，骨祖细胞。因此，这些定向骨祖细月包 自发分化形成骨小结。还包含在祖细胞群中的是当在必需因子如地塞 米松、P-磷酸甘油和抗坏血酸存在下培养时可被诱导形成骨小结的成骨 细胞。因此，描绘于图15中的"总成骨祖细胞，，亚群诱导了 "定向成 骨祖细胞，，群以及"未定向成骨祖细胞"群，并揭示了沿着成骨分化 途径可被诱导分化的细胞总数。在"定向"和"未定向，，细胞群之间 的实际比率为大约1:1，并且在"总成骨祖细胞"群和"定向成骨相_ 细胞，，群之间这样的比率为约2:1。如下所述进行祖细胞成骨特性的分 析。
还已观察到细胞的软骨形成、生脂和生肌分化。尽管自发观察到 成骨分化和偶然的生脂分化，但仅在用于相应表型的特定诱导条件下 培养时才观察到其他表型。连续稀释和CFU-F测定
将HUCPVCs的1 x 105、 5xl04、 2.5 x104、 1 x 104、 5xl03、 lx 10S稀释物接种在6-孔组织培养平板(Falcon弁353046)上并每隔2天补料 SM —次。在培养的第10天计数每个孔中包含>16个细胞的集落的数 目，并在第14天确-〖人。从而，将CFU-F频率(产生一个集落所需的细 胞平均数目)确定为1 CFU-F/300个铺板的HUCPVCs。基于该频率， 计算提供300 HUCPVCs所需的单位体积(对3条脐带的每一条重复三 次)，将8倍增加的单位体积的HUCPVCs接种在6-孔平板的单个孔中。 再一次，在培养的第10天计数包含>16个细胞(CFU-Fs)的集落以测定 釆用增加接种的CFU-F频率。
CFU-0测定
在每周一次的传代步骤期间，将测试细胞群的等分试样直接铺于 组织培养聚苯乙烯中的骨形成培养基上，该骨形成培养基含有75% a-MEM, 15。/。FBS(StemCell批号S13E40)，含有青霉素G(167单位/ml)、 庆大霉素(50jig/ml)和两性霉素B(0.3ixg/ml)的10%抗生素储液，和Dex (1(T8M), p-磷酸甘油(5mM)以及L-抗坏血酸(50ug/ml),细胞接种密度 为1 x 1(^个细胞/cm2。每隔2天对培养物再补料一次，持续12天。保 持培养物直至观察到作为骨小结检测到的矿化的小结区为止(通常3 天)，此刻在最后一次培养物再补料中用含四环素培养基对培养物再补 料，然后在Karnovsky氏固定剂中固定并准备用于分析。在相差和UV 焚光下用Leitz Aristoplan显微镜(Esselte Leitz GmbH & Co KG, Stuttgart, Germany)观察四环素标记的培养物，并用Hitachi S-2000扫 描电镜在15 kV的加速电压下来产生证实存在形态学上可辨认的骨基 质的图像。
CFU-C测定
为了测试这些细胞的软骨形成能力，在1150卬m下离心2xl()S个 细胞5分钟以便获得作为沉淀的细胞。 一旦除去上清液，就将细胞保 持在补充有10ng/ml转化生长因子-P(TGF-(3)(以及任选地补充有1(T7M 地塞米松)的SM中。每隔2天更换一次经补充的培养基，保持培养物3-5周，此刻收获它们用于组织学(通过用10%中性福尔马林緩冲液 (NFB)固定)、包埋于石蜡中、切成6 pm切片以及为胶原II的存在(抗 体染色)以及氨基葡聚糖的存在(阿尔新蓝染色)进行染色。染色证实在 诱导条件下形成软骨细胞。
CFU-A测定
为了评价细胞的生脂分化能力，将它们最初于6孔平板的SM(含 有D-MEM)中培养，每隔2天更换一次培养基，直至它们达到60%汇 合为止。此刻用生脂诱导培养基(AIM)(88。/。D-MEM、 3% FBS、 33^M 生物素、17pM泛酸盐、5pMPPAR-Y、 100nM牛胰岛素、1^M地塞米 松、200pM异丁基曱基黄噤呤和10%抗生素)更换培养基。每隔2天更 换一次AIM,持续10天，此刻在10%NFB中固定细胞并用油红O(其 将脂细胞的脂质泡染成红色)染色。染色证实了不仅在诱导条件下，还 在这些条件不存在的情况下(即自发地)形成了脂肪细胞。
CFU-M测定
为了评价细胞的生肌能力，将它们最初于T-75 cn^组织培养烧瓶 的SM(含有D-MEM)中培养，直至它们达到80-90%汇合为止，此刻用 生肌培养基(MM) (75% D-MEM、 10%FBS、 10%马血清、50jiM氢化可 的松和10%抗生素)更换培养基。每隔2天更换一次MM。在培养3-5 周后，从培养表面移出细胞(参见传代培养实验方案)，裂解以便获得它 们的mRNA,并通过rtPCR评价几种生肌基因的存在，所述生肌基因 包括MyoG、 MyoDl、 Myf5、肌球蛋白重链、成肌蛋白和结蛋白。结 果证实在这些诱导条件下存在肌细胞。
数据分析 四环素染色
在终止前添加四环素(9 pg/ml)到培养物中。在终止时，在Karnovsky 氏固定剂中固定细胞过夜，然后通过UV-激发的荧光成像观察小结区 矿物成分的四环素标记。
扫描电子显微术(SEM)
30通过首先将CFU-0培养物置于70%、 80%、 90%和95%乙醇中1 小时，然后浸没于100%乙醇中3小时，制备用于SEM的CFU-O培养 物的代表性样品。接着在临界点干燥它们。用PolaronSC515 SEM涂层 系统将大约3 nm的金层'践涂在样品上，然后在Hitachi S-2000扫描电 镜中于15kV的加速电压下在不同的放大倍率下观察。将所产生的图 像用于证实形态学上可辨认的骨基质的存在。
用于HLA-分型的流式细胞术
在含有2% FBS(StemCell批号S13E40)的PBS中洗涤>1 x 105个 细胞的测试细胞群，并在4。C下重悬于具有饱和浓度(1:100稀释)的下 列缀合的小鼠IgGl HLA-A， B， C-PE和HLA-DR, DP, DQ-FITC的 PBS + 2% FBS中30分钟。用PBS + 2% FBS洗涤细胞悬浮液两次，用 l貼/ml 7-AAD(BD Biosciences)染色并重悬于PBS + 2% FBS中用于在 使用ExpoADCXL4软件(Beckman-Coulter)的流式细胞仪(XL，Beckman-Coulter， Miami, FL)上的分析。阳性染色定义为超过来自于用匹配的 同种型抗体(FITC-和PE-缀合的小鼠IgGl, k单克隆同种型抗体标准物， BD Biosciences)染色的对照细胞群的〉99Q/o的细胞所获得的水平的荧光 信号发射。对于每一样品，收集至少10,000个列表形式(listmode)的事 件。在EXP0 32 ADC分析软件中产生所有的图。
除HLA分型之外，还评价了 HUCPV细胞群的其他标志，结果如
下标志表达
CD105《SH2》
CD73 (SH3>
CD90 (Thy1>
CD44+ +
CD"7(c-kit)15% +
MHCI75% +
MHCII-
CD106(VCAM1)-
STR01-
CD123(IL"3)
SSEA"4-
OcM-
-
CD34-
CD235a (血型糖蛋白A)-
CD45-
结果
骨小结集落的光学显微照片
图3、 4和5图解说明了在第3天和第5天CFU-O存在于培养物 中。它们证实了环绕在小结区域周围的"成纤维细胞样"细胞的汇合 层由产生骨基质的多角形细胞的'聚集物，所代表。在Dex(+)和Dex(-) 培养物中都观察到了这些CFU-O,并在连续传代期间显示类似的形态学。
CFU-0培养物的四环素标记
培养物的四环素标记用于标记与骨的生物矿化阶段有关的新形成 的磷酸钓。通过将培养物暴露于紫外线显示，培养物的四环素标记与 矿化小结区符合。图6和7描绘了祖细胞培养第3天和第5天的四环 素标记的CFU-O培养物。这些图像是通过UV-激发的荧光成像产生并 拍照的。
扫描电子显孩i术
对于矿化胶原基质的形成，在SEM下观察CFU-O,其证实了从最 初的胶原形成阶段到成熟的CFU-0中稠密矿化的基质的CFU-O形成。 图8、 9、 10、 11、 12和14是CFU-0的扫描电镜照片。流式细胞术和HLA-分型
鉴定表现两种主要组织相容性复合体(MHCs)的细胞表面抗原的流 式细胞术证实了 77.4%的分离的细胞群为MHC -/-。图13图解说明了 相对于阴性对照的流式细胞术结果。图17显示了在祖细胞群中冻融对 MHC-A细胞频率的影响。对该冻融影响的研究如下
在含有2% FBS的PBS中洗涤>1 x 105个细胞的测试细胞群，并在 4°C下重悬于具有饱和浓度(1:100稀释)的下列缀合的小鼠IgGl HLA画A, B, C-PE(BD Biosciences #555553,批号M076246) (MHC 1)、 HLA-DR, DP, DQ-FITC(BD Biosciences #555558，批号M074842) (MHC II)和CD45國Cy-Cychrome(BD Biosciences # 555484,批号0000035746) 的PBS + 2% FBS中30分钟。用PBS + 2% FBS洗涤细l包悬浮液两次， 并重悬于PBS + 2% FBS中用于在使用ExpoADCXL4软件 (Beckman-Coulter)的流式细月包4义(XL， Beckman國Coulter, Miami, FL) 上的分析。阳性染色定义为超过来自于用匹配的同种型抗体(FITC- 、 PE-和Cy-cy chrome-缀合的小鼠IgGl ， k单克隆同种型标准物，BD Biosciences)染色的对照细胞群的>99%的细胞所获得的水平的荧光信 号发射，其通过人BM样品的阳性荧光得以证实。对于每一样品，收 集至少10,000个列表形式(listmode)的事件。在EXPO 32 ADC分析软 件中产生所有的图。
传代培养和细胞接种
7天后利用0.1%胰蛋白酶溶液传代培养(传代)粘附细胞，此刻如通 过光学显微镜所观察到的它们显示80-90%汇合。刚一传代，就通过流 式细胞术观察到细胞表达MHC-A, B, C、 MHC-DR、 DP、 DQ和CD45。 然后以4xl03个细胞/ci^将它们铺于T-75組织培养聚苯乙烯烧瓶的SM 中，并用10-8MDex、 5mMp-GP和50 pg/ml抗坏血酸处理以测试这些 细胞的成骨能力。在为了 CFU-O或骨小结形成的培养的第2、 3、 4、 5 和6天观察这些烧瓶。还对任何来自传代步骤的残留细胞进行低温保 存供未来使用。
细胞的低温保存在由90% FBS, 1()0/o二曱亚砜(DMSO)(SigmaD-2650,批号11K2320) 组成的lml总体积中制备lxl()S个PVT细胞的细胞等分试样，并移液 到lml聚丙烯低温管形瓶中。将管形瓶置于-70。C冷冻机中过夜，第二 天转移到-150。C冷冻机中进行长期保存。在低温保存一周后，解冻PVT 细胞并通过流式细胞术观察MHC-A, B， C、 MHC-DR, DP， DQ和 CD45的表达。使用了另一种实验方案，其中在一周低温保存后解冻 PVT细胞，再培养一周，接着通过流式细胞术再次分析传代培养中 MHC-A， B, C、 MHC-DR, DP， DQ和CD45的表达。
结果示于图17中。注意到通过几次传代新鲜细胞群中MHCV-的 频率仍得以保持。当在传代后于-150。C冷冻新鲜的细胞1周并立刻分 析MHC表型时，该被分析的细胞群显示显著增加的MHC -A表型细胞 频率。因此，通过冷冻，MHC-A表型的细胞能有效地富集自PVT细胞 群。刚一传代前述冷冻细胞的培养物，就能实现更进一步的富集。特 别是，并如图17中所见的，低温保存的细胞的笫一次传代增加1411(:-/-细胞的相对群体至大于50%,并且继续冷冻和传代的那些细胞产生了 大于80%、 85%、 90%和95%的MHC-A群。由于它们的非免疫原性特 性，在人类治疗中冷冻的PVT细胞自身可能是非常有用的。
粘附后HUCPV细胞级分的收获
可以如下方式增加回收自血管周围组织的祖细胞的产量。为了收 获HUCPVCs的"粘附后"(PA)级分，将最初接种的HUCPV收获物的 上清液重新铺于新的T-75烧瓶上，并在37。C, 5%(302下温育2天。 然后用新鲜的SM补料最初接种的HUCPV烧瓶。2天后，将上清液再 次转移到新的T-75烧瓶中，并给粘附的细胞补料新鲜的SM。最后， 吸出第三次接种的烧瓶的上清液，并给烧瓶补料新鲜的SM (因此，对 于每一脐带，产生了 3个烧瓶最初接种的烧瓶、第一PA级分和第二 PA级分)。类似于与最初接种的细胞相比较所见的这些细胞的相同的特 性，证实了通过分离这些PA级分获得了更高的细胞产率。类似于最初 接种的HUCPVCs,这些PA细胞在培养中具有快速的增殖速度、自发 产生骨小结，并能被诱导分化为其他三种细胞系软骨、脂肪和肌肉。
包含^!L细力包的组织工^呈^:组合物
34在该实施例中，将细胞与以通常用于骨工程化领域的CAP/PLGA 形式存在的载体结合。为了接种CAP/PLGA支架，将它们切成5mmx 5mm的圆柱体。然后，将200 pl的2x10s HUCPVCs的悬浮液置于无菌 的1.5mleppendorf管中，并将支架放入该悬浮液中。利用改变的移液 管口(具有5 mm的吸口直径)，吸入细胞悬浮液并通过往复移液操作彻 底洗涤支架几次。然后，在37。C, 5%(302下将支架在该悬浮液中温育 4小时，以容许细胞与支架附着。4小时后，从悬浮液中取出支架并置 于无组织培养处理的24-孔平板的各个孔中，补料lml的SM并在37。C， 5%C02下温育14天，每隔2天更换一次SM。然后将支架在Karnovsky 氏固定剂中固定并准备用于SEM分析(见上)。在14天培养后， HUCPVCs完全覆盖了支架。
如所述的，通过在适合于这样的分化的条件下培养，PVT祖细胞 群还可用于产生间充质细胞以及除骨之外的组织。为了产生脂肪细胞， 例如，制备104个细胞/cm2浓度的祖细胞并铺于3 5 mm组织培养亚中。 细胞在前脂肪细胞培养基(PM)(DMEM/Ham'sF-10(l:l， v/v)、 10%胎 牛血清、15 mM HEPES、 100 U/ml青霉素、100吗/ml链霉素、0.25 ^g/ml 两性霉素B)中培养3天。在3天后，除去PM，并将生脂培养基 (DMEM/Ham's F-10营养肉汤，1:1， v/v; HEPES緩冲液(15 mM);胎 牛血清(3%);生物素(33MVI)、泛酸盐(17 P-M)、人胰岛素(100nM)、 地塞米松(0.5 H-M)、 PPARY激动剂(1H-M)和抗生素)补料给细胞，接 着培养3天。在诱导3天后，除去生脂培养基，并将培养物于脂肪细 胞培养基(AM) (DMEM/Ham's F-10 (1:1， v/v)、 3。/。胎牛血清、1 地 塞米松、100nM人胰岛素、33pMD-生物素、17pM泛酸钠、15 mM HEPES、 100U/ml青霉素，100 pg/ml链霉素，0.25 (xg/ml两性霉素B) 中培养，每隔3天定期补料，确保仅除去一半的培养基，再补料相等 体积的AM,因为如果除去所有的培养基，脂细胞会浮起。在四次补料 (12天)后，细胞看起来环绕着脂质小滴。可通过用油红O和尼罗红染 色证实间充质细胞分化为脂细胞的阳性鉴定。
类似地，可利用以104个细胞/^112浓度制备并铺于35 mm组织培 养皿中的细胞悬浮液产生软骨细胞。为促进软骨形成，在没有血清以 及具有转化生长因子-|33下培养细胞。在培养期间细胞沉淀发展为多层的富集基质的形态学，并且在组织学上显示增加的富集蛋白多糖的细 胞外基质。
为了产生成肌细胞，制备104个细胞/ c m浓度的细胞悬浮液并铺于 35 mm组织培养皿中。将细胞在补充了 15。/。胎牛血清(FBS)的MCDB 120培养基的中保持1周(成肌细胞增殖培养基，MPM)。在1周时，基 础培养基(MPM)中血清水平下降至2%(成肌细胞分化培养基，MDM), 并在7天后终止培养。用适当的培养基对培养物再补料， 一周三次。
因此，应当理解本发明提供了可作为活的人祖细胞有效来源的低 温保存的脐带组织，所述活的人祖细胞具有用于产生不同的结締组织， 包括骨以及无免疫能力的且理想地用于移植给人患者以治疗结締组织 状况，包括骨疾病和病症的祖细胞的特性。该人祖细胞产生自从邻近 脐带血管外壁伸出的称为血管周围区的人脐带胶质特定区域的提取 物。提取自该区域的细胞群显示了值得注意的特性，包括快速增殖、 细胞形态改变，为如下事实所证明在所有的传代培养烧瓶(大约7-10 次倍增)中第7天前出现细胞集落形成和不添加成骨补充物到培养基中 出现骨小结形成，以及相对高频率的MHC双阴性细胞，刚一培养已冷 冻的细胞其频率就增加。
当在本文中使用时，术语"约"指为该术语所限定的值+/-10%的 值。因此，"约-70C"的温度可指载63C-77C范围内的温度。
下列文献在此并入作为参考
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3权利要求
1. 用于从冷冻的脐带组织回收活细胞的方法，包括步骤1)获得低温保存的脐带组织，其中脐带组织已通过包括下述步骤的方法得以制备a)获得包含活细胞的脐带组织，b)将脐带组织与含有含血清细胞培养基和低温防护剂的低温防护溶液组合，和c)对组合物进行冷却处理，其中组合物在容许低温防护剂渗入组织的时间和温度下作为液体被冷却，d)冷冻所冷却的组合物以提供冷冻的组织，并任选地接着e)在低温条件下保存所冷冻的组织；2)使冷冻的脐带组织解冻；3)处理解冻的脐带组织以用水置换低温防护剂；以及4)从这样处理的脐带组织中回收活细胞。
2. 用于保留存在于脐带组织中的细胞的存活力的方法，包括步骤a) 获得包含活细胞的脐带組织，b) 将脐带组织与含有含血清细胞培养基和低温防护剂的低温防 护溶液组合；c) 对组合物进行冷却处理，其中组合物在容许低温防护剂渗入组织 的时间和温度下作为液体^皮冷却，d) 冷冻所冷却的组合物，并任选地，接着e) 在低温条件下保存所冷冻的组合物。
3. 才艮据权利要求1或2的方法，其中低温防护剂为DMSO。
4. 根据权利要求1或2的方法，其中细胞培养基为胎牛血清。
5. 根据权利要求1或2的方法，其中低温防护溶液按体积计包含 5-25。/。DMSO和75-95%胎牛血清。
6. 根据权利要求5的方法，其中低温防护溶液是10%DMSO和 90%胎牛血清。
7. 根据权利要求l-6任一项的方法，其中脐带组织是具有包含祖 细胞的血管周围脐带胶质的脐带血管或其片段。
8. 根据权利要求7的方法，其中脐带组织是人脐带组织。
9. 根据权利要求7或8的方法，其中脐带组织基本上不含有血液。
10. 根据任一前述权利要求的方法，其中在约4C下进行至少20 分钟的冷却处理。
11. 根据任一前述权利要求的方法，其中在约-70C下进行冷冻处理。
12. 根据任一前述权利要求的方法，其中在约-196C下进行低温保存。
13. 根据权利要求1和3-12任一项的方法，其中在约37C下进4亍 解冻处理。
14. 根据权利要求1和3-13任一项的方法，其中通过在约4C下浸 没于水或緩冲液中处理解冻的脐带。
15. 根据权利要求1和3-14任一项的方法，其中回收自保存的脐 带的活细胞为人脐带血管周围细胞。
16. 根据权利要求15的方法，其中通过消化脐带胶质回收活细胞。
17. 以低温保存状态存在并包含能以存活状态回收的祖细胞的脐 带组织，其通过根据权利要求2-14任一项的方法所制备。
18. 根据权利要求17的脐带组织，以包含多个容器和注明每个容 器内含物的目录的组织库形式存在，其中每个容器包含所述脐带组织 的样品。
19. 根据权利要求17或权利要求18任一项的脐带組织，其中脐带 组织为具有包含祖细胞的血管周围脐带胶质的脐带血管或其片段。
20. 从冷冻的脐带组织回收活HUCPVCs的方法，包括步骤1)获得低温保存的脐带组织，其中脐带组织为具有締合的血管周 围脐带胶质的新鲜的、分离的人脐带血管或其片段，并已通过包括下 述步骤的方法得以制备a) 获得所述脐带组织，b) 将脐带组织与含有含血清细胞培养基和DMSO的低温防护溶 液组合，c) 对组合物进行冷却处理，其中组合物在容许DMSO渗入组织的 时间和温度下作为液体净皮冷却，d) 冷冻所冷却的組合物，和e) 在低温条件下保存所冷冻的组合物一段时间；并接着2) 使保存的脐带组织解冻；3) 处理解冻的脐带组织以用水置换DMSO;以及4) 消化与保存的血管締合的脐带胶质以释放活HUCPVCs。
全文摘要
从冷冻的脐带组织提取活的祖细胞。在实施方案中，脐带组织是具有血管周围脐带胶质的血管，并且所提取的祖细胞是HUCPVCs。
文档编号C12N5/08GK101479377SQ200680053313
公开日2009年7月8日 申请日期2006年12月21日 优先权日2005年12月22日
发明者拉胡尔·萨鲁加瑟, 简·恩尼斯, 约翰·E·戴维斯 申请人:简·恩尼斯;拉胡尔·萨鲁加瑟;约翰·E·戴维斯