专利名称：半抗原化合物以及抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种巯基十一氢十二硼酸盐(日文乂》力7°卜，y f力
八< K 口 K亍、力求！^一卜，英文mercaptoundecaphydrododecaborate )
(BSH)的半抗原化合物、BSH的抗体以及使用其的免疫学测定方法等， 在硼中子俘获疗法(BNCT)中使用的中子俘获疗法剂的检测、定量中尤 其有用。
背景技术：
近年来，作为利用放射性同位素的新的癌的治疗方法，硼中子俘获疗 法(BNCT)备受瞩目。硼中子俘获疗法是将内含硼10同位素(1QB)的 硼化合物被摄入到癌细胞中，照射低能量的中子束(例如热中子)，利用 在细胞内发生的核反应，局部地破坏癌细胞的治疗方法。在该治疗方法中， 使内含1QB的硼化合物选择性地蓄积于癌组织的细胞中对于提高治疗效果 很重要，所以必须开发出被选择性地摄入到癌细胞中的硼化合物。
过去，作为在BNCT中使用的药剂，合成有向基本骨架导入硼原子 或硼原子团的含硼化合物。作为在实际的临床上使用的药剂，包括对位一 硼苯丙胺酸(p—boronophenylalanine) (BPA)或巯基"f^一氢十二硼酸盐 (BSH)。其中，BSH以钠盐的形式主要被用于脑肿瘤的治疗，其有用性 正在得到确认(例如参照非专利文献1 8)。
非专利文献l: I.M.Wyzlic等，TetrahedronLett.,1992,33,7489—74卯 非专利文献2: W.Tjark,J.Organomet.Chem.,2000,614 —615,37—47 非专利文献3: K.Imamura等，Bull.Chem.Soc.Jpn.，1997,70,3103 —3110 非专利文献4: A.S.Al—Madhom等，J.Med.Chem.，2002,45,4018—4028 非专禾U文献 5 : F.Compostella等，Res.Develop .Neutron Capture Ther.,2002,81 — 84
非专利文献6: S.B.Kahl等，对癌症的中子俘获疗法的进展(Progress
in Neutron Capture Therapy for Cancer) ，Plenum Press,New York 1992， 223
非专利文献7: J.Cai等，J.Med.Chem.,1997,40,3887 —3896 非专利文献8: H丄im等，Res.Develop.Neutron Capture Ther.,2002,37
一42
但是，对伴随BNCT的BSH的生物体内举动尤其对细胞表层或细胞 的微观分布的具体情况尚不清楚，强烈需要开发出能够简便且迅速地对 BSH的生物体内举动进行定性、定量的方法。作为BSH的检测、定量方 法，有望利用免疫学测定方法，但BSH之类的低分子无机化合物的分子 量，体积小或者容易离子化，所以抗原性低，目前尚不能获得能够高灵敏 度地检测BSH的抗体。
发内容
因此，本发明的目的在于提供一种用于制作高灵敏度而且高选择性地 识别BSH的抗体的半抗原化合物，BSH的抗体，以及使用该抗体的高灵 敏度且定量性出色的BSH测定用试剂盒以及免疫学测定方法。
本发明人等为了实现所述目的而着眼于在BSH的侧链SH基上结合 连接序列(linker)的半抗原化合物，进行了潜心研究，结果发现，以下 所示的半抗原化合物、抗体、杂交瘤等能够实现所述目的，以至完成本发 明。
艮口，本发明涉及一种化合物，其是具有由下式(1)
表示的结构的化合物。
本发明还涉及一种抗体，其是通过以所述化合物为半抗原，将该半抗 原与高分子化合物的复合体用作抗原得到的抗巯基十一氢十二硼酸盐 (BSH)的抗体。所述抗体优选为单克隆抗体。
本发明还涉及一种产生所述单克隆抗体的杂交瘤。所述杂交瘤优选为 HybridomaBSF—2 (保藏编号ABP—10689)。
本发明还涉及一种含有所述单克隆抗体的巯基十一氢十二硼酸盐 (BSH)的测定试剂盒。
另外，本发明还涉及一种巯基十一氢十二硼酸盐(BSH)的测定方法， 其特征在于，使用所述单克隆抗体或所述试剂盒。
本发明的化合物优选用作BSH半抗原。通过将该半抗原与高分子化 合物的复合体用作抗原，可以良好地在动物中引起抗BSH的免疫应答， 可以得到特异且高灵敏度的BSH抗体。
本发明的抗体可以特异且高灵敏度地检测BSH。在该抗体为单克隆 抗体的情况下，对BSH尤其为高灵敏度，交叉反应性也低。本发明的杂 交瘤可以稳定地在短时间内生产所述单克隆抗体，通过培养该杂交瘤，可 以制造大量的单克隆抗体。
另外，本发明的试剂盒通过含有本发明的单克隆抗体，可以提供在 BSH的免疫学测定方法中优选使用的能够特异、高灵敏度以及简便地测 定BSH的手段。
本发明的BSH的测定方法通过使用本发明的单克隆抗体或试剂盒， 来实现特异性及操作的简便性出色的效果。
图1是表示使用本发明的单克隆抗体的直接竞争ELISA法中的BSH 浓度与吸光度的关系的曲线图。
具体实施例方式
本发明提供一种具有由下式(1)
表示的结构的化合物。所述化合物为6 — S —十一氢十二硼基己酸(6-s-々yf力八J K口 H、f力求!J/Wx年廿:/酸)，优选用作BSH半抗原。在
所述式(1)中，通过羧基与后述的高分子化合物共价结合，形成复合体 (接合体)。
所述BSH半抗原的制造可以利用公知的合成方法进行，没有特别限 定，例如由下述反应式
<formula>formula see original document page 6</formula>表不。
所述BSH半抗原在形成与牛血清白蛋白(BSA)、兔血清白蛋白 (RSA)、卵白蛋白(OVA)、钉形贝血蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋白(TG)、 免疫球蛋白等高分子化合物(蛋白质)的复合体之后，用作免疫原。
复合体的形成方法可以利用公知的方法进行，没有特别限定。例如可
表示的方法在各工序中以高收率得到化合物，所以优选使用。在所述反应 式中，式(2)、 BSH等原料化合物均为容易获得的化合物。 另外，在所述各工序中的详细合成方法记载于实施例1。 所述巯基十一氢十二硼酸盐(BSH)具有由硼、氢及硫原子构成的 20面体的硼簇结构。BSH不仅为无机低分子化合物，而且体积大于苯环， 具有3个硼原子共有2个电子的所谓三中心键(three center bond)结构， 具有电子定域化的特异结构。在本发明中，BSH由下式(4)
(4)
或下式(5)
(5)
6 以利用混合酸酐法或活性酯法等使所述BSH半抗原的羧基与所述高分子 化合物的官能团(例如氨基等)反应，形成复合体。
本发明通过将所述半抗原与高分子化合物的复合体用作抗原，提供得
到的抗BSH的抗体。
在本发明所述的"抗体"包括多克隆抗体或单克隆抗体，也包括Fab 片断或F (ab，) 2片断等之类的具有抗原结合性的抗体的一部分。在这些 抗体中，优选单克隆抗体。
所述抗体的制造方法为公知的，本发明的抗体也可以按照常规方法制 造(Current Protocol in Molecular Biology, Chapter 11.12 11.13 (2000))。 具体而言，在本发明的抗体为多克隆抗体的情况下，可以按照常规方法形 成所述BSH半抗原与高分子化合物的复合体，然后向家兔等非人动物免 疫该复合体，从该免疫动物的血清，按照常规方法获得。
另一方面，在为单克隆抗体的情况下可如下得到通过按照常规方法
向小鼠等非人动物免疫所述复合体，对使得到的脾脏细胞和骨髓瘤细胞发 生细胞融合从而配制而成的杂交瘤细胞进行筛选，培养单克隆抗体产生杂
交瘤(Current Protocols in Molecular Biology编者Ausubel等(1987)出 版John Wiley and Sons.Section 11.4 11.11)。
抗体的配制可以适当地组合超滤、硫酸铵分离、离子交换层析、凝胶 过滤层析、亲合层析等浓缩 纯化法来进行。
另外，作为所述抗体，更具体而言，例如可以举出如下所示的具有在 本发明的实施例中得到的单克隆抗体的重链及轻链的核苷酸序列或在本 发明的实施例中得到的单克隆抗体的重链及轻链的氨基酸序列的抗体。另 外，所述核苷酸序列或氨基酸序列只要起到本发明的效果，也包括具有所 述序列的一部分发生缺损、附加、修饰、置换、变异的序列的序列。进而， 在这种情况下，优选所述序列的一部分发生缺损、附加、修饰、置换、变 异的序列与所述序列的相同性为70%以上，更优选为80%以上，进而优 选为90%以上，特别优选为95%以上。
重链的序列
(5' —) CTCGAGTCTGGCCCTGGAATATTGCAGCGCTCCCAGACCC
CAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTACTAGT
轻链的序列
(5' —) GAGCTCGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCAC
TTTGTCCCGTGCTGAGTGTTCCTAATTCTAGA
重链的氨基酸序列 (N — ) LESGPGILQRSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVG曹RQPSTKGL EWLADIWWNDNKYYNPSLKSRLTISKDTSKNQVFLKIASVDTIDTAT YYCSLRNSAEKTNTWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNS MVTLGCLVKGYFPEPVTVT丽SGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSS VTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCTS
轻链的氨基酸序列 (N —) ELWTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYVNWVQEKP
DHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFC
GLWYSNHWVFGGGTKLTVLGQPKSSPSVTLFPPSSEELETNKATLV
CTITDFYPGWTVD區VDGTPVTQGMETTQPSKQSNNKYMASSYL
TLTARAWERHSSYSCQVTHEGHTVEKSLSRAECS
另外，本发明还提供产生所述单克隆抗体的杂交瘤。以下对在小鼠中 制作杂交瘤的方法进行详细说明。
以下以Balb/c小鼠为例进行说明。将如上所述地配制而成的抗原(免 疫原)溶解于生理磷酸缓冲液中，使其成为2mg/ml左右，与佐剂等量混 合，然后向Balb/c小鼠的腹腔内给药。然后，在每约2周进行追加免疫。
摘出从尾血管采集的血液的血清中的抗体效价变高的所述小鼠的脾 脏，在已加入DMEM培养基(Dulbecco改良Eagle培养基)的细胞培养 皿内，从所述脾脏取出细胞。将培养基移至离心沉淀管中，使大的组织片
沉淀，轻轻地取出脾脏细胞浮游的上清，以低速离心分离单细胞的悬浮液， 收集细胞，配制脾脏细胞。
以细胞数的比5: 1 (骨髓瘤(myeloma)细胞脾脏细胞)，混合小 鼠的骨髓瘤细胞(P3x63Ag8.653)，以低速离心分离，收集细胞。在解开 沉淀细胞之后，缓慢地加入保温于37匸的50%聚乙二醇(分子量1500) 溶液lml，进行细胞融合。
在细胞融合之后，加入DMEM培养基9ml，进而添加40ml含胎牛血 清DMEM培养基。向利用离心分离收集的细胞中，加入HAT培养基，使 细胞数以5Xl()S个/ml悬浮，在96孔塑料板中，以250|11/孔的量分注细 胞悬浮液，在37'C、 5%二氧化碳、加湿条件下的孵箱中进行培养。
l周后，用HAT培养基置换孔中的培养基的一半量，培养10 14天。 用ELISA检测培养液中的抗体的活性，对产生目的抗体的孔的细胞，利 用极限稀释法，进行杂交瘤的克隆形成。利用形成克隆，得到产生抗BSH 抗体的稳定的杂交瘤株。
在本发明中，利用所述方法制作杂交瘤，建立BSF—2等多个杂交瘤 株。其中，对于HybridomaBSF-2，在保藏编号ABP—10689下，在2006 年10月2日，被独立行政法人产业技术综合研究所，专利生物委托保管 中心(邮政编码305 — 8566，茨城县筑波市东l丁目l番l号)国际委托 保管。另外，对于BSF—2，在保藏编号FERM AP—20805下，在2006 年2月22日，被独立行政法人产业技术综合研究所，专利生物委托保管 中心(邮政编码305 — 8566，茨城县筑波市东l丁目l番l号)国内委托 保管。
本发明的杂交瘤可以使用培养基(例如内含10%胎牛血清的DMEM) 培养，将该培养液的离心上清作为单克隆抗体溶液。另外，可以通过向来 源该杂交瘤的动物的腹腔内注入，生成腹水，将得到腹水作为单克隆抗体 溶液。这些抗体溶液可以进而如上所述地纯化，浓縮。
另外，本发明还涉及内含所述抗体的BSH的测定试剂盒。本发明的 测定试剂盒可以通过含有对BSH特异结合的抗体，而简便地测定BSH， 可以在后述的BSH的测定方法中优选地使用。所述试剂盒根据测定法， 还可以含有标记的二次抗体或标记的BSH半抗原(抗原)、缓冲液、检测
试剂及/或BSH标准溶液等。
优选的试剂盒可以被用于如下所示的间接竞争ELISA法或直接竞争 ELISA法。在直接竞争ELISA法中使用的情况下，本试剂盒优选进而含 有固相化本发明的单克隆抗体的载体。这种情况下，可以省略下述直接竞 争ELISA法的工序(1)。
在间接竞争ELISA法中使用的情况下，本试剂盒优选进而含有固相 化抗原，优选含有固相化该固相化抗原的载体。这种情况下，可以省略下 述间接竞争ELISA法的工序(1)。
所述固相化抗原包括与为了制造本发明的抗体而使用的半抗原不同 的半抗原。所述固相化抗原的半抗原部分优选为BSH—己酸。
另外，所述固相化抗原可以通过形成所述固相化抗原用半抗原与牛血 清白蛋白(BSA)、兔血清白蛋白(RSA)、卵白蛋白(OVA)、钉形贝血 蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋白(TG)、免疫球蛋白等高分子化合物(蛋 白质)的复合体来得到。
所述固相化抗原用的半抗原可以利用公知的方法合成，也可以利用市 售品。复合体的形成方法可以利用公知的方法进行，但没有特别限定。例 如，可以利用混合酸酐法或活性酯法等使所述固相化抗原用半抗原的羧基 与所述高分子化合物的官能团(例如氨基)反应，形成复合体。
本发明的试剂盒在下述间接竞争ELISA法的情况下，含有所述固相 化抗原、保持固相化抗原的载体、BSH抗体、酶标记的二次抗体及检测 试剂等。
进而，本发明还涉及一种BSH测定方法，其中，使用所述抗体或试 剂盒。作为测定方法，只要是利用通常的抗原一抗体反应的方法即可，没 有特别限制，可以举出放射线同位素免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法 (ELISA)、荧光或发光测定法、凝集法、免疫印迹法、免疫色谱 (immunochromato)法等(Meth.Enzymol.,92,147 — 523 (1983)， Antibodies Vol.II IRL Press Oxford (1989))，但从灵敏度或简便性等点出发，优选 ELISA。作为在ELISA中使用的酶，可以举出过氧化物酶、碱性磷酸酶、 P —半乳糖苷酶、虫荧光素酶等。
利用ELISA的测定法可以举出间接竞争ELISA或直接竞争ELISA 等。例如间接竞争ELISA可以利用如下所述的顺序进行。
(1) 向载体固相化固相化抗原
使用的载体只要是通常的ELISA中使用的载体即可，没有特别限制， 优选96孔、48孔、192孔等微孔板。固相化只要例如在载体上放置内含 固相化用抗原的缓冲液，进行孵育即可。缓冲液中的抗原的浓度通常为 0.01 100jig/ml左右。作为缓冲液，可以对应检测手段使用公知的缓冲液。
(2) 为了防止蛋白质向载体的固相表面的非特异性的吸附，利用与 抗原无关的蛋白质等封闭没有吸附固相化用抗原的固相表面部分。
作为封闭剂，可以使用BSA或脱脂奶(skimmed milk)溶液或者市 售的Block Ace (大日本制药公司制)等。封闭通过向载体添加所述封闭 剂，例如在约4'C下孵育一晚，然后用洗涤液清洗来进行。作为洗涤液， 没有特别限制，可以使用与所述(1)相同的缓冲液。
(3) 向在所述(1)及(2)中处理的固相表面加入内含各种浓度的 BSH的样本及本发明的单克隆抗体溶液，使该抗体与所述固相化抗原及 BSH竞争地反应，产生固相化抗原一抗体复合体及BSH—抗体复合体。
反应通常可以在4 37。C下进行1 2小时左右。
(4) 抗原通过测定固相化抗原—抗体复合体的量，从预先作成的标 准曲线决定样本中的BSH的量。
固相化抗原一抗体复合体的量可以添加识别酶标记的二次抗体(识别 BSH抗体的抗体)来测定。例如在使用小鼠单克隆抗体作为BSH抗体的 情况下，优选使用酶标记(例如过氧化物酶或碱性磷酸酶等)的抗小鼠一 山羊抗体，使其与结合于载体的BSH抗体反应。反应只要在与所述(3) 相同的条件下进行即可。反应后，用缓冲液清洗。
(5) 可以加入与结合于载体的二次抗体的标记酶反应的显色基质溶 液，测定吸光度，由此从标准曲线算出BSH的量。
作为结合于二次抗体的酶，使用过氧化物酶的情况下，例如可以使用 内含过氧化氢和3， 3'， 5， 5'—四甲基联苯胺或邻苯二胺的显色基质溶液。 通常在加入显色基质溶液，使其在室温下反应约IO分钟左右之后，通过 加入硫酸使酶反应停止。在使用3， 3'， 5， 5'—四甲基联苯胺的情况下， 测定450nm的吸光度。在使用邻苯二胺的情况下，测定490nm的吸光度。
此外，为了校正背景值，优选也同时测定630nm的吸光度。
在使用碱性磷酸酶作为结合于二次抗体的酶的情况下，例如可以举出
将对硝基苯基磷酸作为基质使其显色，加入NaOH溶液，停止酶反应，测
定在415nm下的吸光度的方法。
对于没有添加BSH的反应溶液的吸光度，将添加BSH并使其与抗体
反应而成的溶液的吸光度的减少率作为抑制率，来计算。可以使用预先利
用添加已知浓度的BSH的反应液的抑制率作成的标准曲线，算出样本中
的BSH的浓度。
作为其他方式，BSH的测定例如也可以利用如下所述的使用本发明 的单克隆抗体的直接竞争ELISA进行。
(1) 向载体固相化本发明的单克隆抗体 使用的载体优选96孔、48孔、192孔等微孔板。固相化只要例如在
载体上放置内含固相化用抗体的缓冲液，进行孵育即可。缓冲液中的抗体 的浓度通常为0.01 10(Hig/ml左右。作为缓冲液，可以对应检测手段使用 公知的缓冲液。
(2) 为了防止蛋白质向载体的固相表面的非特异性的吸附，利用与 抗原无关的蛋白质等封闭没有吸附固相化用抗体的固相表面部分。
作为封闭剂，可以使用BSA或脱脂奶溶液或者市售的Block Ace (大 日本制药公司制)等。封闭通过向载体添加所述封闭剂，例如在约4'C下 孵育一晚，然后用洗涤液清洗来进行。作为洗涤液，没有特别限制，可以 使用与所述(1)相同的缓冲液。
(3) 向内含各种浓度的BSH的样本，加入使BSH半抗原与酶结合
而成的酶结合半抗原，配制混合物。
酶结合半抗原的配制只要是使BSH半抗原与酶结合的方法即可，没
有特别限制，可以用任意方法进行。
(4) 使工序(3)的混合物与在工序(2)中得到的抗体固相化载体反应。
利用BSH与酶结合半抗原的竞争抑制反应，生成它们与固相化载体 的复合体。反应例如在约25'C下约进行1小时。反应结束后，用缓冲液 清洗载体，除去没有与固相化抗体结合的酶结合半抗原。
通过测定固相化抗体一酶结合半抗原复合体的量，从预先作成的标准 曲线，决定样本中的BSH的量。
在本工序中，可以与所述的间接竞争抑制ELISA法同样地加入与酶
结合半抗原的酶反应的显色基质溶液，通过测定吸光度，从标准曲线算出
BSH的量。
在所述本发明的测定方法中，根据测定对象物进行前处理成为样本， 然后提供到所述间接竞争ELISA或直接竞争ELISA的工序(3)。
可以使用从本发明的杂交瘤BSF—2产生的单克隆抗体，实施BSH 的测定方法。通过使用该抗体，可以实施目前利用免疫分析法的测定法没 有的BSH的特异且高灵敏度测定。
作为本发明的另一个方式，可以在免疫染色法中使用本发明的单克隆
抗体，检测伴随BNCT的BSH的生物体内举动、特别是细胞表层或细胞 的微观分布。
另外，本发明的杂交瘤可以稳定地在短时间内产生所述单克隆抗体， 通过培养该杂交瘤，可以制造高灵敏度地分子识别BSH的单克隆抗体。 实施例
以下利用实施例具体地说明本发明。从业者可以基于本说明书的记载 容易地在本发明中加入修饰、变更，这些均被包括在本发明的技术范围中。 在下述实施例中，使用以下机种或试剂进行化合物的分析及分离纯化。
'NMR光谱日本电子JMTC—400/54/SS400MHz (日本电子公司 制)。只要没有特别记载，使用TMS作为内部标准。另外，下述化学位移 用S值表示。
'柱色谱用硅胶BW—200 (富士、乂U 、乂7公司制) (a) BSH—己酸乙酯(3)的合成
将BSH (101mg， 0.46mmo1)溶解于乙腈(lOmL),然后在室温下搅 拌并同时缓慢地滴注溴己酸乙酯(0.2mL， 1.12mmo1)，在室温下搅拌2 天。然后，利用减压浓縮除去乙腈，利用硅胶柱色谱(氯仿甲醇=9: 1) 纯化浓縮残余物，得到黄色的油状物(101mg，收率67.4%)。
TLC: Rf=0.58 (氯仿甲醇=3: 1)
:H-NMR(DMSO) 5 (ppm):0.60—2.10 (m)、 1.08 (t, 3H, J=7.08Hz)、 1.34-1.42 (m, 2H)、 1.52-1.59 (m， 2H)、 1,63-1.70 (m, 2H)、 2.19 (t， 2H, J=7.32Hz)、 2.77 (m， 2H)、 3.95 (q， 2H, J:7.08Hz)。
(b) BSH—己酸(4)的合成
将在所述(a)中得到的化合物(H3.7mg， 0.31mmo1)溶解于甲醇 (2.0mL)，滴注2N氢氧化钠(0.63mL)，在室温下搅拌6小时。使用醋 酸乙酯清洗反应液，然后加入1N盐酸，直至成为pH3，用醋酸乙酯抽提。 然后，用水及饱和盐水清洗，使硫酸镁干燥，利用减压浓縮除去醋酸乙酯， 利用硅胶柱色谱(氯仿甲醇=4: 1)纯化浓縮残余物，得到黄色的油状 物(69.9mg，收率67.4%)。
TLC: Rf=0.30 (氯仿甲醇=2: 1)
'工H-NMR(DMSO) 5 (ppm):0.60-2.10 (m)、 1.30-1.37 (m' 2H)、 1.45-1.53 (m， 2H) 、1,63-1.73 (m， 2H)、 2.20 (t， 2H' J=7.32Hz)、 2.85 (m, 2H)。 [实施例2 (免疫原的调整)]
(c) BSH—己酸一BSA复合体(使用BSA的免疫原)的合成 在离心管中加入760]iL牛血清白蛋白(llmg， 164nmo1)及pH9.4的
硼酸盐缓冲液(四硼酸钠50mmo1、氯化钠15.4mmo1、叠氮化钠0.3mmo1/ 纯水100mL)，在4"C下搅拌1晚，然后加入DMF (40nL) (I液)。
向另一个离心管中加入在所述(b)中得到的化合物(6.0mg， 18^mo1) N—羟基琥珀酰亚胺(1.5mg， 13.3|imol)、 1 —乙基一3— (3 — 二甲氨基丙 基)—碳化二亚胺盐酸盐(2.5mg， 13.3pmol)、 DMF (200pL)，在室温 下搅拌一晚(II液)。
在室温下，向I液中滴注II液(10pL/5分)，在室温下搅拌2.5小时， 然后在4t:下搅拌一晚。用10%异丙醇一磷酸缓冲液对其进行透析约60 小时(更换6次缓冲液)，得到BSH—己酸一BSA复合体(结合体)。利 用ICP分析测定其硼浓度，然后移至1.5mL的eppendorf管，在4'C下保 存。
(c) BSH—己酸一KLH复合体(使用KLH的免疫原)的合成 作为免疫原，与所述(c)同样地进行，制作KLH与本发明BSH半
抗原的结合体。
用磷酸缓冲液(pH7.4)，将在实施例2中调整的BSH半抗原一KLH 结合体稀释至lmg/mL。将该抗原溶液600|iL与等量的R1BI佐剂(MPL +TDM Adjuvant System, SIGMA M6536)混合，用涡旋2 3分钟充分 地混合。利用腹腔内注射，将其免疫(50pg/doSe) 5只Balb/c小鼠(8周 龄，雄性)。每2周进行，在第3次免疫之后，从各免疫l周后采血(眼 窝采血)。
用PBS (pH7.4)将在实施例2中调整的抗原(BSH半抗原一BSA结 合体)稀释至5.0pg/mL,在ELISA用微孔板中分注100pL，在37'C下静 置1小时，将抗原固定于板表面。
然后，用PBS—Tween溶液(磷酸缓冲液pH7.4， 0.05%Tween20)清 洗，为了防止非特异性吸附，每孔加入20(HiL封闭溶液(磷酸缓冲液pH7.4， 4.1Q/^Block Ace)，在37。C下静置1小时，进行封闭。接着，用PBS—Tween 溶液清洗，然后加入5(HiL二次抗体，在37'C下静置1小时，使其与二次 抗体(HRP标记山羊抗小鼠IgG (Y链特异))反应。
用PBS—Tween溶液清洗之后，在事先调整的基质溶液(磷酸柠檬酸 缓冲液(pH5.0)、 0.04% —苯二胺)中加入200fiL过氧化氢水，使其成为 Q.02%。在37。C下静置30分钟，使其显色，然后使用酶标仪[Microplate Reader] (BIO—RAD/Mode1550)，测定吸光度。 (a)动物的免疫和抗体产生细胞的配制
用磷酸缓冲液pH7.4(PBS) (NaCl 137mM、NaHP04 '121120 8.10mM、 KH2P04 1.47mM)稀释合成的BSH半抗原一KLH结合体(实施例2)，稀 释至500昭/mL。将在40。C下加温10分钟后的RIBI佐剂系统(RIBI/MPL (注册商标)+TDM乳剂，R—700)与该抗原溶液2mL混合，涡旋2 3分钟，充分地混合。
利用皮下注射，将其免疫(50pg/dose) 5只Balb/c小鼠(8周龄，雄 性)。每2周进行，在第2次免疫之后，从各免疫1周后采血(眼窝采血)。 将采血的血液收集于1.5mL中，在37'C下1小时孵育，然后，在4'C下静
置一晚。
(b) 细胞融合
(b—l) DMEM培养基的配制
向Dulbecco改良Eagle培养基(IWAKI DME/LOW， Lot.99562013) 1包、硫酸庆大霉素(庆大霉素642吗/mL， SIGMA Lot. 105H0457)78.4mg、 碳酸氢钠(关东化学，Lot302F1378) 2.2g中加入MilliQ，成为1L，然后， 用0.22nm过滤器(MILLIPOREMILLEX (注册商标)一GV， 0.22pm过 滤器SLGV1352)灭菌，配制DMEM培养基。 (b—2) HAT培养基及HT培养基的配制
在HAT supplement (SIGMA， Lot#61K8934) —瓶中加入10mL已灭 菌的MilIiQ，使瓶内的试剂完全溶解。向该溶液中加入DMEM培养基(15 %FCS)的1/50量，混合，成为HAT培养基。在HT supplement (SIGMA， Lot#32K8928) —瓶中加入10mL已灭菌的MilliQ，使瓶内的试剂完全溶 解，向该溶液中加入DMEM培养基(15%FCS)的l/50量，混合，成为 HT培养基。
(b_3) 50XPEG培养基的配制
在20rnL的DMEM培养基中加入20g的PEG6000 (PEG弁6000 (M.W.7300—9000)，于力，^T亍7夕，LotM8H2950)，利用加热型搅拌 器(hot stirrer)搅拌2小时，完全溶解。然后，定容(mess up)到40mL， 在超净工作台中，使用0.20pm过滤器，灭菌。然后，分注为各1.8mL， 冷冻，在使用前溶解，加入200^L的DMSO (SIGMA, Lot#42K2401 )， 制作50XPEG (10%DMSO)溶液。 (b—4) ACK lysis缓冲液的配制
在90mLMilliQ中加入802.3mg氯化铵、10.01mg碳酸氢钾、 3.72mgEDTA，调节至pH7.2 7.4，定容到100mL。将其加入培养基瓶中， 在12rC下高压20分钟，灭菌，成为ACKlysis缓冲液(0.15M氯化铵， l.OmM碳酸氢钾，O.lMmEDTA， pH7.2 7.4)。
(c) 脾脏细胞的调整
向抗体价达到饱和的小鼠进行最终免疫(尾静脉注射)，3天后摘出 脾脏。将摘出的脾脏放入冰上的已加入DMEM的细胞培养皿中，放入超
净工作台内。去除摘出的脾脏的不需要的部分，放入已加入新的DMEM
培养基的5mL细胞培养皿中。使用2根镊子，刮出脾脏细胞，用细胞过 滤网(cell strainer) (FALCO—N2350， 70(xm尼龙)过滤，去除不需要的 部分，将通过的细胞收集于玻璃制的离心管中，在1000rpm下离心IO分钟。
弃上清，加入5mL的ACK lysis缓冲液，利用吸液(pipetting)均一 地混合，在室温下静置5分钟，清洗除去脾脏细胞(红细胞的除去)。在 其中加入20mL的DMEM培养基，以1000rpm离心10分钟，除去上清。 进而，加入20mL的DMEM培养基，利用吸液清洗细胞，以1000rpm离 心10分钟。除去上清，加入lOmLDMEM培养基，利用吸液混合，然后 使用血细胞计算盘(ErmaTokyo4062)，计数细胞数。
(d) 骨髓瘤细胞的调整 对应进行细胞融合的日程培养骨髓瘤细胞(P3X63Ag8U.1)，在使用
前在玻璃制的离心管中收集细胞，以1000rpm离心IO分钟。除去上清， 加入lOmLDMEM培养基，利用吸液混合，然后使用血细胞计算盘(Erma Tokyo4062)，计数细胞数。
(e) 细胞融合
将骨髓瘤细胞悬浮液的量调整成脾脏细胞骨髓瘤细胞为10: 3，放 入脾脏细胞悬浮液的离心管中，利用吸液混合。以1000rpm对其离心10 分钟，除去上清，然后使用巴斯德吸管，完全地除去上清。
然后，拍敲离心管，使细胞扩展到离心管的壁上。用手温暖离心管， 转动并同时用1分钟以上缓慢地加入lmL的50%PEG (10%DMSO)溶 液。温暖1分钟离心管并同时转动，用相同的方法，用2分钟以上加入 2mL的DMEM培养基，进而用5分钟以上加入8mL的DMEM培养基。
然后，以1000rpm离心10分钟，弃上清，进而加入10mL的DMEM 培养基，清洗细胞，以1000rpm离心IO分钟。除去上清，用DMEM(15 XFCS)培养基调整成细胞密度为2X 1()S个/mL，向96孔板中分注各10pL， 在37'C下静置一晚。
(f) HAT选择
在向96孔板中分注的细胞中，分注各100pL的2倍左右HAT培养基，
在37"C下放置1周。然后，加入100)iL的HAT培养基。然后，将阳性的 孔的杂交瘤细胞转移至24孔板，使用HT培养基，使总量成为lmL。 3 天后，进行2次筛选，利用极限稀释法对为阳性的孔进行克隆形成。
(g) 使用极限稀释法的克隆形成
使用血细胞计算盘(Erma Tokyo4062)，计数在2次筛选中为阳性的 孔的杂交瘤细胞的细胞数，求浓度，使用克隆形成用的培养基(DMEM (15XFCS)培养基20mL，Briclone lmL)，通过梯度稀释，调整成10g/mL、 5个/mL。向96孔板中分注各10pL，每1孔中细胞成为1个或0.5个。
在37"C下将其静置1周，然后向各孔中加入各100pL的克隆阳的培 养基，进而在37'C下静置1周。将为阳性的孔的细胞移至48孔板，同样 地进行第2次克隆形成，最终得到单一的杂交瘤细胞。
(h) 从无血清培养基的抗体的纯化
以1000rpm、 10分钟离心用无血清培养基培养的杂交瘤细胞BSF—2 培养液，对细胞上清，加入硫酸铵，使其成为60%硫酸铵浓度，使抗体 蛋白沉淀。在4〔下对其搅拌2小时，进而放置一晚。然后，在4'C下， 以13500rpm离心20分钟，使其溶解于结合缓冲液中，用结合缓冲液透析。
透析后，以8000rpm离心10分钟，用0.45pm过滤器过滤上清，成 为样本。以流速1滴/秒(1 2mL/分)向柱中送液5mL的超纯水，然后 以流速l滴/秒(1 2mL/分)送液3 5mL的结合缓冲液，进行柱的平衡 化。然后，以流速l滴/2秒(1 2mL/分)送液已调整的样本，使抗体吸 附于柱上。
以流速1滴/秒送液3 5mL的结合缓冲液(20mM磷酸钠，0.8M硫 酸铵，pH7.5)，由此除去非吸附成分，然后以流速l滴/秒(1 2mL/分) 送液5mL洗脱缓冲液(20mL磷酸钠，pH7.5)，使抗体洗脱。回收洗脱液 各0,5mL。
测定全部的组分的吸光度(OD二280nm)，利用Bradford法，对内含 抗体蛋白的组分测定抗体蛋白浓度。然后，用SDS-PAGE确认单克隆抗 体的纯度。另外，得到的单克隆抗体的核苷酸序列及氨基酸序列如上所述。
(i) 抗体的灵敏度测定和标准曲线的作成(直接竞争ELISA法) 将使用PBS溶液(磷酸缓冲液pH7.4)配制成5路/mL的单克隆抗体
(骨髓瘤株(从BSF—2配制))溶液分注于96孔ELISA用板各100pL， 通过在37'C下静置1小时，在板上固相化抗体。反应后，用PBS—Tween 溶液(磷酸缓冲液(pH7.4)， 0.05%Tween20)清洗，为了防止非特异性 吸附，向板中加封闭溶液(磷酸缓冲液(pH7.4)， 1%BSA)，在室温下使 其反应1小时或在4'C下使其反应一晚，进行封闭。
用PBS—Tween溶液清洗之后，在HRP标记的竞争剂(HRP结合BSH 一己酸)的PBS溶液(0.5pg/mL)中，将样本调整成BSH分别成为100 0.00 lppm的浓度。
向96孔ELISA用板(IWAKI 3801—096)中分别加入各100pL配制 的样本，使其在37'C下反应1小时。然后，按照常规方法，进行ELISA
(基础溶液(50mmol磷酸柠檬酸缓冲溶液(pH5.0)， 0.04%邻苯二胺))， 使用酶标仪(BIO—RADMode1550)，测定490nm下的吸光度。
测定结果如图l所示。X轴表示BSH浓度，Y轴表示吸光度。如图 l所示，使用从骨髓瘤株BSF—2配制而成的单克隆抗体，可以特异性地 检测出BSH，在BSH浓度为0.001 lpM的宽幅范围内利用测定吸光度 的BSH的浓度测定成为可能。这样，通过使用本发明的杂交瘤及抗体， 以BSH的宽幅浓度范围的灵敏度非常高的定量评价及定性评价等成为可
权利要求
1. 一种化合物，其具有下式(1)表示的结构。
2. —种抗体，其是通过以权利要求1所述的化合物为半抗原，将该 半抗原与高分子化合物的复合体用作抗原而得到的抗巯基十一氢十二硼 酸盐(BSH)的抗体。
3. 根据权利要求2所述的抗体，其中， 所述抗体为单克隆抗体。
4. 一种杂交瘤，其产生权利要求3所述的单克隆抗体。
5. 根据权利要求4所述的杂交瘤，其中， 所述杂交瘤为HybridomaBSF—2 (保藏编号ABP—10689)。
6. —种巯基十一氢十二硼酸盐(BSH)的测定试剂盒，其含有权利 要求3所述的单克隆抗体。
7. —种巯基十一氢十二硼酸盐(BSH)的测定方法，其特征在于， 使用权利要求3所述的单克隆抗体。
8. —种巯基十一氢十二硼酸盐(BSH)的测定方法，其特征在于， 使用权利要求6所述的试剂盒。
全文摘要
本发明是一种具有由右式(1)表示的结构的化合物，通过以所述化合物为半抗原、将该半抗原与高分子化合物的复合体用作抗原得到的抗BSH的抗体。通过使用本发明，可以提供用于制作高灵敏度而且高选择性地识别BSH的抗体的半抗原化合物，抗BSH的抗体，以及使用该抗体的高灵敏度且定量性出色的BSH测定用试剂盒以及免疫学测定方法。
文档编号C12N5/10GK101395162SQ20068005317
公开日2009年3月25日 申请日期2006年10月5日 优先权日2006年2月23日
发明者上原幸树, 切畑光统, 浅野智之 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构;公立大学法人大阪府立大学;斯特拉化工公司