专利名称：：用于基因抑制的不同启动子的制作方法
技术领域：
：本文公开的是用于基因抑制的重组DNA构建体和方法，以及包含使用此类重组DNA构建体和方法转移的DNA的转基因植物细胞、转基因植物和转基因种子。背景Redenbaugh等人在"SafetyAssessmentofGeneticallyEngineeredFruitsandVegetablesACaseStudyoftheFlavrSavrTomato",CRCPress,Inc.(1992)中^>开了通过土i裏杆菌转化将反义DNA构建体引入番茄基因组内，以产生多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因的基因沉默。显示所需性状的转基因植物中的转移的DNA(T-DNA)的共同特征是以头对头和/或尾对尾排列插入的两个或更多T-DNA区或片段，与Jorgensen等人Mol.Gen.Genet.207:471—477(1987)报道的T-DNA的多个拷贝通常转移且整合到单细胞的基因组内一致；且当这发生时，T-DNA在用土壤杆菌转化的植物中主要以反向重复结构组构。参照图1和表1,番茄用包含反义构建体(图la)的质粒进行转化，所迷反义构建体包含在"增强的"35SCaMV启动子与土壤杆菌基因和人工h力标记基因的区之间的反义方向的全长PGcDNA。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>这种构建体用于几种番茄近交系的商业规模转化，作为1994年由Calgene开发和销售的FlavrSav,M番茄的部分。命名为501、502、7B、22B和28B的番茄系使用消除毒性的根癌土壤杆菌用pCGN1436进行转化。事件主要基于表型进行选择，即在成熟水果中的低PG酶活性。每次近交产生约150个转基因事件植物，并且就PG水平测定具有成熟果实的573个植物。在所有番茄系中的那些事件的14-25%具有降低95%或更多的PG活性且导致总共103个事件。在那些植物中，84个具有足够的种子用于卡那霉素发芽测定法，以测定分离比率和对于h/基因3:1分离的27个事件(代表关于每个近亲交配的3-10个事件)。基于初步DNA分析，具有3:1分离比率的"个事件中仅约40%看起来明显具有PAGS基因和在单个物理基因座上插入的h/7基因。基于纯合系的可获得性，选择那些事件中的8个用于T-DNA插入结构的详细分子分析。那些分析的结果显示于图lb-d中，其中发现在近交系中的所有8个事件具有包含反向重复元件的T-DNA插入片段。数据与仅具有单个T-DNA插入片段的事件501-1001—致，但具有如图lb中举例说明的作为反向重复存在的/历/3，区。6个事件看起来包含如图lc中举例说明的以"尾对尾"排列的两个T-DNA区，事件501-1035具有以图Id中举例说明的方式整合的3个插入片段。8个所选事件的RNA分析证实在PG反义RNA水平和PG基因沉默的效力之间没有关联。观察到一系列PG反义RM水平，从l个事件中容易检测的量到多个事件中无法检测的水平，所有这些都产生延迟成熟的基因沉默性状。对于标记h/2基因和对于PG反义基因检测到尺寸大于预期的潜在的读通转录物。T-DNA插入片段中的反向重复元件可能比预期RMs更大地转录(虽然处于低水平)的观察支持下述理论PGmRNA减少是由于通过产生能够形成dsRNA的RNA而i秀导了RNAi。图lb中举例说明的具有3，^/(有义随后为反义)的反向重复序列的反义插入片段的结构非常类似于如PlantJournal,33，793-800(2003)中公开的由Brummell等人用于基因沉默的有义构建体，其中使用3，元件(反义随后为有义)作为反向重复。在每种情况下，可以形成3'发夹环且用作用于RNA依赖性的RNA聚合酶和革巴RNA的dsRNA序列形成的引物。图lc中举例说明和作为图lc中的元件的插入T-DNA的反向重复序列的发现，暗示通过用质粒中的反向重复序列直接转化，增加用反义DNA构建体转化的效力。然而，当在细菌例如大肠杆菌内时，质粒中反向重复序列的存在已被认为是有问题的，这干扰质粒维持，导致质粒不稳定性。下文描述的发明提供了在转化构建体中利用反向重复元件的潜在优点，而没有在细菌中邻近的反向重复序列的缺点。包含来自靶基因的序列的反向重复的单个表达盒对于所需植物组织中的基因抑制可能是无效的。例如，CaMV35S启动子一般表示为"组成型"，但在花粉中不充分表达。"组成型"稻肌动蛋白1启动子在花粉中良好表达但在叶中并非如此。下文描述的发明提供了通过利用具有单个启动子的单个盒无法提供的在多个植物组织中基因抑制的优点。发明概述本发明提供了基因抑制的改善方法，其包括用在质粒上彼此邻近定位的多个基因抑制构建体转化真核细胞。在本发明的一个方面，多个基因抑制构建体可以是多个邻近的反义基因抑制构建体；在另一个方面，它们可以是多个邻近的有义(共抑制)基因抑制构建体。在一个进一步的方面，它们可以是多个邻近的有义和反义基因抑制构建体。多个邻近的基因抑制构建体可以是重叠或非重叠的。更具体而言，该方法包括将用于从基因表达有义(或反义)DNA的盒插入用于土壤杆菌介导的转化的质粒内，所述基因被靶向进行抑制，其与用于表达相同的有义(或反义)DNA的第二种盒邻近。本发明进一步提供了在基因组中具有重组DNA构建体的转基因种子，所述重组DM构建体包含(a)与至少一个第一种基因抑制元件可操作地连接的植物胚乳特异性启动子，和(b)与植物胚乳特异性启动子处于相反方向且位于至少一个第一种基因抑制元件3'的植物胚特异性启动子。本发明进一步提供了在基因组中具有重组DNA构建体的稳定转基因植物细胞，其包含(a)与用于使至少一个第一种靶基因沉默的至少一个第一种基因抑制元件可操作地连接的第一种启动子，和(b)与第一种启动子处于相反方向且位于至少一个第一种基因抑制元件的第二种启动子，其中第一种和第二种启动子具有不同的表达模式，并且其中重组DNA构建体在植物细胞中的转录导致至少一个第一种靶基因沉默。本发明进一步提供了用于转化真核细胞(例如植物细胞)的构建体，关于其使用的方法，和包含此类构建体的稳定转化的转基因植物细胞。这些构建体包括(a)与用于使至少一个第一种靶基因沉默的至少一个第一种基因抑制元件可操作地连接的第一种启动子，和(b)与第一种启动子处于相反方向且位于至少一个第一种基因抑制元件3'的第二种启动子，其中笫一种和第二种启动子具有不同的表达模式，并且其中重组DNA构建体在真核细胞(例如植物细胞)中的转录导致至少一个第一种靶基因沉默。不同的表达模式包括在空间或时间上不同的表达模式，以及诱导型表达模式。本发明的特征是盒中的调节元件，即启动子调节元件和/或聚腺苷酸化调节元件的变化。在使用反义盒的实施方案中，第一种反义表达盒包含处于相反方向的、与被粑向用于抑制的基因的DM可操作地连接的第一种启动子，随后为第一个3'元件(例如，包含聚腺苦酸化信号和聚腺香酸化位点)；并且第二种反义RNA表达盒包含处于相反方向的、与被耙向用于抑制的基因的所述DNA可操作地连接的第二种启动子，随后为第二个3'元件。第一种和第二种盒以尾对尾构型组装到DNA构建体内，从而使得启动子在被靶向用于抑制的基因的组装的构建体结合的可转录DNA的末端上，并且当使用3'元件时，3'元件与启动子和可转录DM之间或组装物的末端区域处的启动子(a)邻接或(b)邻近。最低限度，第一种和第二种启动子是不同的。第一种和第二种3'元件也可以是不同的。该方法进一步包括通过土壤杆菌介导的转化经由转移DM构建体来转化真核细胞，所述DNA构建体具有来自质粒的所述组装的第一种和第二种盒。转基因生物由用第一种和第二种盒转化的细胞再生；并且，在转基因生物中测量由蛋白质水平抑制的性状，所述蛋白质由被靶向用于抑制的基因的所述DSA编码。在该方法的各方面，启动子可以包括在植物中起作用的众所周知的启动子，包括土壤杆菌胭脂碱合酶(nos)启动子、土壤杆菌章鱼碱合酶(ocs)启动子、花椰菜花叶病毒启动子(CaMV35S)、玄参花叶病毒启动子(FMV)、玉米RS81启动子、稻肌动蛋白启动子、玉米RS324启动子、玉米PR-l启动子、玉米A3启动子、y薏苡辛B32胚乳特异性启动子、玉米L3油质蛋白胚特异启动子、rd29a启动子、和在植物基因表达中有用的任何其他众所周知的启动子。在该方法的各方面，内含子是任何可剪接的启动子。在某些实施方案中，内含子优选是转录增强内含子，例如"增强子"，例如稻肌动蛋白1和稻肌动蛋白2基因、玉米醇脱氢酶基因、玉米热休克蛋白70基因和玉米皱缩1基因的内含子。在该方法的各方面，3'元件选自众所周知的3'元件，例如土壤杆菌基因3'元4牛侈寸^(口/20i1J，、/^/J，、^//rJ，、fyT^^T、ocs^r、fr7J，，和植物基因3'元件例如小麦(Triticumaestivum)热休克蛋白(Z^//7)3，、小麦泛素基因3\小麦果糖-1，6-二磷酸酶基因3'、稻谷蛋白基因3'、稻乳酸脱氢酶基因3'、稻P微管蛋白基因3'、豌豆(Pisumsativum)二磷酸核酮糖羧化酶基因(r&)3，和来自宿主植物内的其他基因的3'元件。在该方法的其^f也方面，多个盒中的至少一个包含标记基因，例如提供针对草甘膦(a/"W或i7V/V)或草铵膦(/7〃或^r)的抗性的除草剂标记基因；提供对卡那霉素(/2/7/〃)、庆大霉素J)、潮霉素(m力/。、链霉素和壮观霉素(wW)、或氨千青霉素(s/"/7)的抗性的杀菌剂标记基因；或可筛选标记例如萤光素酶(/"c)或荧光蛋白质(^/>)或P葡糖醛酸糖苷酶("/W)。净皮耙向用于抑制的基因的DNA的长度可以是任何长度，但优选长度为至少21个核苷酸。本发明的另一个方面提供了用于土壤杆菌介导的转化的质粒，其包含与用于表达相同DM的所述第二种盒邻近的、用于从被靶向用于抑制的基因表达有义(或反义)DNA的第一种盒，其中所述盒的组装使得不同的3'非翻译区是邻接的。在许多情况下，盒和至少一个标记盒位于质粒上的左和右T-DNA边界之间。在本发明的一个优选方面，转基因玉米植物包含具有用于反义抑制赖氨酸酮戊二酸还原酶基因的邻近盒的DNA构建体，在一种盒中使用胚乳特异性启动子并且在另一种盒中使用胚特异性启动子。附图简述图1和2举例说明DNA构建体。图3描述了本发明的构建体的非限制性例子，例如，如实施例3中所述的。胚乳特异性启动子由"pB32"指出，胚特异性启动子由"pL3"指出，一个或多个基因抑制元件由"SUP-LKR/SDH"(这表示靶向内源性赖氨酸酮戊二酸还原酶/酵母氨酸脱氬酶的稳定的反义抑制元件)指出，"GSE1"和"GSE2"和终止子由"tHspl7，，、"tGlbl"、"terl"和"ter2"指出。发明详述如本文所使用的，"盒"意指通常与从基因表达蛋白质相关的DNA元件的组合，并且至少包含(a)用于起始转录的DNA例如启动子元件、(b)编码蛋白质的DM例如cDNA或包含外显子和内含子的基因组DM、和(c)在序列编码和添加polyA尾部后用于从转录的RM剪接3'RNA的DM，例如包含聚腺苷酸化位点的3'元件。一般地，当编码蛋白质的DNA是有义方向时，转录的RNA可以翻译成表达蛋白质，或在某些情况下用于有义共抑制。当编码蛋白质的DNA是反义方向时，转录的RNA可以涉及基因抑制机制。例如，为了促进基因抑制，反义DM—般对应转录成聚腺苷酸化位点下游的mRNA的DNA。因此，"反义盒"意指DNA元件的组合，其包含与来自被耙向用于抑制的基因的反义定向DNA可操作地连接的启动子和3'元件。尽管常见，但3'元件包含聚腺苷酸化位点不是关键的。在邻近的有义盒或邻近的反义盒中重要的是邻近的3'元件是不同的，即由邻近的3'元件转录的RNA不能杂交以形成双链RNA或在大肠杆菌中容易地从质粒切离。重组DNA构建体例如本发明的盒，可以由本领域技术人员使用商购可得的材料和众所周知的公开方法容易地制备。当多基因被靶向用于抑制时，多顺反子DNA元件可以如美国专利申请序列号10/465,800中举例说明和公开的进行构建。用于建立DNA构建体和载体用于转化的有用技术是GATEWAY克隆技术(可从InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,California获得)，其使用来自细菌喧菌体入载体构建的整合酶<3〃系统的位点特异性重组酶LR克隆反应，而不是限制性核酸内切酶和连接酶。LR克隆反应公开于美国专利5，888,732和6,277,608、美国专利申请公开2001283529、2001282319、20020007051和20040115642。同样由Invitrogen提供的GATEWAY克隆技术指导手册还提供了用于将任何所需DNA常规克隆到包含可操作的植物表达元件的载体内的简明指导。可替代的载体构建法利用如由Aslandis，C.等人，NucleicAcidsRes.,18,6069-6074，1990和Rashtchian,A.等人，Biochem.，206,91-97，1992公开的不依赖于连接的克隆，其中将具有单链5'和3'末端的DNA片段连接到所需载体内，所述所需载体随后可以在体内进行扩增。在植物细胞中有活性的众多启动子已在文献中得到描述。这些包括存在于植物基因组中的启动子以及来自其他来源的启动子，包括携带在根癌土壤杆菌的根瘤诱导质粒上的胭脂碱合酶(NOS)启动子和章鱼碱合酶(OCS)启动子，花椰菜花叶病毒启动子例如花椰菜花叶病毒或玄参花叶病毒启动子。例如，参见公开了来源于花椰菜花叶病毒的组成型启动子(CaMV35S)形式的美国专利号5，858，742和5，322，938，公开了玄参花叶病毒(FMV)35S启动子的美国专利号5,378,619,公开了玉米RS81启动子的美国专利6，437,217,公开了稻肌动蛋白启动子的美国专利5,641,876，公开了玉米RS324启动子的美国专利6，426，446,公开了玉米PR-1启动子的美国专利6,429,362,公开了玉米A3启动子的美国专利6,232，526，公开了组成型玉米启动子的美国专利6,177,611,公开了玉米L3油质蛋白启动子的美国专利6,433,252，公开了稻肌动蛋白2启动子和内含子的美国专利6，429，357，公开了根特异性启动子的美国专利5，837，848,公开了冷诱导型启动子的美国专利6，084，089,公开了光诱导型启动子的美国专利6，294，714,公开了盐谦导型启动子的美国专利6，140,078，公开病原体诱导型启动子的美国专利6，252，138，公开了磷缺乏诱导型启动子的美国专利6，175，060,公开了了用于设计有效的植物表达载体的5'、3'和内含子元件的美国专利申请公开2002/0192813Al，公开了薏苡辛启动子的美国专利申请序列号09/078,972,公开了玉米叶绿体醛缩酶启动子的美国专利申请序列号09/757,089,和公开了水缺乏诱导型启动子的美国专利申请序列号10/739,565。这些和在植物细胞中起作用的众多其他启动子是本领域技术人员已知的，并且可用于本发明的重组多核苷酸中以提供所需基因在转基因植物细胞中的表达。在该方法的各方面，3'元件选自来自根癌土壤杆菌基因的众所周4口的3'元4牛，例如/osJ，、/^/J'、z^ry、/yz^J，、ocsJ，、"7J，，例如公开于美国专利号6,090,627;来自植物基因的3'元件，例如小麦(Triticumaestivum)热休克蛋白17(&;77J，)、小麦泛素基因、小麦果糖-1，6-二磷酸酶基因、稻谷蛋白基因、稻乳酸脱氢酶基因和稻卩微管蛋白基因，所有这些公开于美国公开专利申请2002/0192813Al;和豌豆(Pisumsativum)二磷酸核酮糖羧化酶基因()和来自宿主植物内的基因的3'元件。此外，启动子可以进行改变以包含多个"增强子序列"，以帮助提高基因表达。此类增强子是本领域已知的。通过包括增强子序列与此类构建体，可以增强所选择的蛋白质的表达。这些增强子通常发现在真核细胞中起作用的启动子转录开始的5',但通常可以以对于编码序列的正或反方向5'或3'插入。在某些情况下，这些5'增强元件是内含子。特别有用的增强子是稻肌动蛋白1(参见美国专利号5，6"，876)和稻肌动蛋白2基因、玉米醛脱氪酶基因、玉米热休克蛋白70基因(参见美国专利号5，593，874)和玉米皱缩1基因的内含子。在本发明的某些方面，优选DNA构建体中的启动子元件在水缺乏条件下能够引起足够的表达，以导致有效量的多肽的产生。此类启动子可以在水缺乏条件下过量表达的植物基因的调节区中得到鉴定和分热《木克蛋白17,5基因(#5777,"、HVA22基因(#^2",玉米(Zeamays)的Rabl7基因和肉桂酸4-羟化酶(CA4H)基因(的5'调节区，或来源于鉴定为rabl7基因(WW7)、肉桂酸4-羟化酶(基因((^^7)、HVA22基因(#MW),和水稻(Oryzasativa)的热休克蛋白17.5(#5777,"、22(v^尸Z)和16.9(#577《.夕)的基因的5'调节区。此类水缺乏诱导型启动子公开于美国专利申请序列号10/739,565和11/066，911。在本发明的其他方面，在植物种子组织中的足够表达是所需的，以实现种子组成的改良。用于种子组成修饰用途的示例性启动子包括来自种子基因的启动子，例如油菜籽蛋白(美国专利5,420,034)、玉米L3油质蛋白(美国专利6，433，252)、玉米醇溶蛋白Z27(Russell等人(1997)TransgenicRes.6(2):157-166)、球蛋白1(Belanger等人(1991)Genetics129:863-872)、谷蛋白1(Russel1(1997)同上)、和过氧化物氧还蛋白(Perl)(Stacy等人(1996)PlantMolBiol.31(6):1205-1216)。在本发明的另外方面，在植物绿色组织中的优先表达是所需的。用于此类用途的目的启动子包括来自基因，例如SSU(Fischhoff等人(1992)PlantMolBiol.20:81-93)、醛缩酶和丙酮酸正石粦酸二激酶(PPDK)(Taniguchi等人(2000)PlantCellPhysiol.41(1):42-48)的那些。在实践中，DNA在任何一种转化实验中仅引入小百分比的革巴细胞内。标记基因用于提供用于鉴定的那些细胞的有效系统，所述细胞通过接受转基因DM构建体和将转基因DNA构建体整合到其基因组内进行稳定转化。优选的标记基因提供赋予对选择剂例如抗生素或除草剂的抗性的选择标记。本发明的植物可能对其有抗性的任何除草剂是用于选择标记的有用试剂。使潜在转化的细胞暴露于选择剂。在存活细胞的群体中将是那些细胞，其中一般地，抗性赋予基因以足够水平整合和表达以允许细胞存活。细胞可以进一步进行测试以证实外源DNA的稳定整合。常用的选择标记基因包括赋予对抗生素例如卡那霉素潮霉素BU/7力/P0和庆大霉素(aacJ和a"W)的抗性，和对除草剂例如草甘膦(bar或pat)和草铵膦(EPSPS)的抗性的那些。此类选择标记的例子在美国专利5,550,318;5,633,435;5，780，708和6，118，047中得到举例说明。还可以利用提供肉眼鉴定转化体的能力的可筛选标记，例如，表达有色或荧光蛋白质例如萤光素酶或绿色荧光蛋白(GFP)的基因、或各种生色底物已知的表达P葡糖醛酸糖苷酶的基因或w/W基因(GUS)。本发明提供了在其因组中具有重组DNA构建体的转基因种子，所述重组DNA构建体包含(a)与至少一个第一种基因抑制元件可操作地连接的植物胚乳特异性启动子，和(b)与植物胚乳特异性启动子处于相反方向且位于至少一个第一种基因抑制元件3'的植物胚特异性启动子。在某些实施方案中，植物胚特异性启动子可以转录至少一个第一种基因抑制元件。在其他实施方案中，植物胚特异性启动子可以转录至少一个第二种基因抑制元件(例如，用于沉默由胚乳特异性启动子耙向的相同基因，或用于沉默不同基因的第二种基因抑制元件)。在转基因种子的一个实施方案中，至少一个第一种基因抑制元件包括用于使氨基酸的分解代谢基因(或氨基酸的生物合成中间产物的分解代谢基因)沉默的基因抑制元件，例如但不限于，赖氨酸分解代谢基因。可以使其他分解代谢基因沉默，例如涉及脂质或碳水化合物分解代谢或其生物合成中间产物分解代谢的基因。在一个特别要求保护的实施方案中，转基因种子是转基因玉米种子，并且氨基酸分解代谢基因是赖氨酸分解代谢基因，例如内源性玉米LKR/SDH基因。在转基因种子的某些实施方案中，重组DNA构建体进一步包括选自下述的一种或多种元件(a)与植物胚特异性启动子可操作地连接的至少一个第二种基因抑制元件；(b)与植物胚乳特异性启动子或植物胚特异性启动子可操作地连接的氨基酸生物合成基因；和(c)选择标记基因。在基因抑制元件和另一种基因(例如氨基酸生物合成基因)的表达元件与一个启动子可操作地连接的某些实施方案中，基因抑制元件可以嵌入内含子中，所述内含子在许多实施方案中优选是转录增强内含子(例如，例如"增强子"，例如稻肌动蛋白1和稻肌动蛋白2基因、玉米醇脱氪酶基因、玉米热休克蛋白70基因和玉米皱缩1基因的5'内含子)。在某些优选实施方案中，重组DNA构建体进一步包含选自下述的一种或多种元件(a)用于使与植物胚特异性启动子可操作地连接的赖氨酸分解代谢基因沉默的至少一个第二种基因抑制元件；(b)与植物胚乳特异性启动子可操作地连接的赖氨酸生物合成(例如，外源性DHDPS或CordapA基因)基因；(c)与植物胚乳特异性启动子或植物胚特异性启动子可操作地连接的天冬氨酸激酶基因(例如，lysC基因)；和(d)选择标记基因。在某些优选实施方案中，构建体包括天冬氨酸激酶基因(与胚或胚乳特异性启动子可操作地连接)和用于使内源性LKR/SDH沉默的基因抑制元件(优选地与胚乳特异性启动子或对胚和胚乳两者都具有特异性的启动子可操作地连接)，并且优选地还包括外源性DHDPS或CordapA基因(与胚乳特异性启动子可操作地连接)。标记基因包括选择标记(例如常用于选择转化细胞，例如抗生素或除草剂抗性基因)、可检测标记(例如，萤光素酶、绿色荧光蛋白、GUS)，并且可以包括编码序列或非编码序列(例如，抑制内源性基因，导致可观察表型的抑制元件，例如用于使涉及植物色素生产的基因沉默的抑制元件)。图3描述了用于提供本发明的转基因种子的重组DNA构建体的非限制性实施方案(a)(参见图3A)重组DNA构建体包括(i)与包括DNA的至少一个第一种基因抑制元件可操作地连接的植物胚乳特异性启动子，所述DNA转录成RNA，用于通过形成双链RNA来使赖氨酸分解代谢基因沉默(例如，包括至少一个反义DM区段和至少一个有义DNA区段的DNA，所述反义DNA区段与至少一个第一种靶基因的至少一个区段是反义的，所述有义DNA区段是至少一个第一种靶基因的至少一个区段；或编码至少一种反式作用miRNA且在两个转录方向上转录成靶向靶基因的双链RNA的DNA)，和(ii)与第一种启动子处于相反方向且与至少一个第一种基因抑制元件可操作地连接的植物胚特异性启动子；(b)(参见图3B)重组DNA构建体包括(i)与包括DM的至少一个第一种基因抑制元件可操作地连接的植物胚乳特异性启动子，所述DNA转录成RM,用于通过形成双链RNA来使赖氨酸分解代谢基因沉默(例如，包括至少一个反义DNA区段和至少一个有义DNA区段的DNA,所述反义DNA区段与至少一个第一种粑基因的至少一个区段是反义的，所述有义DNA区段是至少一个第一种粑基因的至少一个区段；或在两个转录方向上编码反式作用miRNA的DM)，(ii)与笫一种启动子处于相反方向且与至少一个第一种基因抑制元件可操作地连接的植物胚特异性启动子，和(Ui)与第一种或第二种启动子可操作地连接的至少上)；或、"P、、。、、—、'(c)(参见图3C)重组DNA构建体包括(i)与用于使赖氨酸分解代谢基因沉默的至少一个第一种嵌入内含子的基因抑制元件可操作地连接的植物胚乳特异性启动子、至少一种赖氨酸生物合成基因(优选地cordapA或lysC或两者)、和第一种终止子，(H)与第一种启动子处于相反方向且与用于使赖氨酸分解代谢基因沉默的至少一个第二种基因抑制元件(其任选嵌入内含子中，优选地，嵌入转录增强内含子)可操作地连接的植物胚特异性启动子；或(d)(参见图3D)重组DNA构建体包括(i)第一种基因抑制盒，其包括与用于使赖氨酸分解代谢基因沉默的至少一个笫一种嵌入内含赖氨酸生物合成基因(优选地cordapA或lysC或两者)、和第一种终止子，和(ii)第二种基因抑制盒，其包括与用于使赖氨酸分解代谢基因沉默的至少一个第二种基因抑制元件可操作地连接的植物胚特异性启动子、和第二种终止子，其中第一种和第二种基因抑制盒处于相反方向(任选以使得启动子在构建体的末端上的方式组装)；或(e)(参见图犯)重组DM构建体包括(i)第一种基因抑制盒，其包括与用于使赖氨酸分解代谢基因沉默的至少一个第一种嵌入内含子的基因抑制元件可操作地连接的植物胚乳特异性启动子、至少一种赖氨酸生物合成基因(优选地cordapA或lysC或两者)、和第一种终止子，和(ii)第二种基因抑制盒，其包括与用于使赖氨酸分解代谢基因沉默的至少一个嵌入内含子的第二种基因抑制元件可操作地连接的植物胚特异性启动子、至少一种赖氨酸生物合成基因(优选地cordapA或lysC或两者)、和第二种终止子，其中第一种和第二种基因抑制盒处于相反方向(任选以使得启动子在构建体的末端上的方式组装)；或(f)(参见图3F)重组DNA构建体包括(i)第一种基因抑制盒，其包括与用于使赖氨酸分解代谢基因沉默的至少一个第一种基因抑制元件可操作地连接的植物胚乳特异性启动子、和第一种终止子，和(ii)第二种基因抑制盒，其包括与用于使赖氨酸分解代谢基因沉默的至少一个第二种基因抑制元件可操作地连接的植物胚特异性启动子、和第二种终止子，其中第一种和第二种基因抑制盒处于相反方向(任选以使得启动子在构建体的末端上的方式组装)。图4描述了本发明的构建体的其他具体实施方案。尽管图3和4描述了某些基因抑制元件包括以稳定的反义元件("SUP-LKR/SDH")形式的有义和反义序列，其他基因抑制元件也是有用的，条件是它们通过合适的启动子转录成MA分子或能够抑制一种或多种粑基因的分子。当构建体包括两个非重叠的表达"盒"时(参见例如，图3D、3E和3F),可替代排列用于彼此邻近定位且处于相反方向的2种启动子(导致"趋异"转录)。一般地，优选阻止终止子的"读通"和例如相反启动子或与相反启动子可操作地连接的序列的非有意沉默。因此，在某些实施方案中，可以任选插入内含子或其他可剪接元件例如核酶，以阻止任何下游序列的"读通"(参见例如，图3B的底部构建体)。在基因抑制元件的转录物无需聚腺苷酸化(例如，当靶位于核中时)的某些实施方案中，可以插入内含子或其他可剪接元件例如核酶，以阻止相反启动子的"读通，，(参见例如，图3A的底部构建体)。在其他实施方案中，可以排列内含子以包括嵌入其内的基因抑制元件，以阻止任何下游序列的"读通"(参见例如，图3E的底部构建体)。本发明进一步提供了在基因组中具有重组DNA构建体的稳定转基因植物细胞，其包括(a)与用于使至少一个第一种靶基因沉默的至少一个第一种基因抑制元件可操作地连接的第一种启动子，和(b)与第一种启动子处于相反方向且位于至少一个笫一种基因抑制元件3'的第二种启动子，其中第一种和第二种启动子具有不同的表达模式，并且其中重组DNA构建体在植物细胞中的转录导致至少一个第一种靶基因沉默。"稳定转基因植物细胞，，意指具有稳定整合到基因组内的外源基因(转基因)的植物细胞。在许多优选实施方案中，此类稳定转基因植物细胞对于转基因是纯合的。在特别优选的实施方案中，整合的转基因是可遗传的，即可转移至后代植物。不同的表达模式包括在空间或时间上不同的表达模式，以及诱导型表达模式。合适的第一种和第二种启动子的非限制性例子包括控制在不同细胞器、细胞或组织中的转录的第一种和第二种启动子，或控制在不同时间(例如，在昼夜节律周期的不同点上)或发育阶段的转录的第一种和第二种启动子，或通过诱导物不同地诱导或通过不同的诱导物诱导的第一种和第二种启动子。稳定转基因植物细胞可以是分离的转基因植物细胞，或可以在由转基因植物细胞再生的转基因植物、或此类再生的转基因植物的转基因后代种子或转基因后代植物中。在稳定转基因植物细胞的一个优选实施方案中，第一种和第二种启动子包含植物胚特异性启动子和植物胚乳特异性启动子，并且稳定转基因植物细胞包含农作物植物(例如，玉米、稻或具有包含大量胚乳的种子的其他农作物植物)的种子胚和胚乳细月包。本发明进一步提供了用于转化真核细胞(例如植物细胞和动物细胞)的构建体、关于其使用的方法、和包含此类构建体的稳定转基因植物细胞。这些构建体包括(a)与用于使至少一个第一种靶基因沉默的至少一个第一种基因抑制元件可操作地连接的第一种启动子，和(b)与第一种启动子处于相反方向且位于至少一个第一种基因抑制元件3'的第二种启动子，其中第一种和第二种启动子具有不同的表达模式，并且其中重组DNA构建体在真核细胞(例如植物细月包或动物细胞)中的转录导致至少一个第一种靶基因沉默。不同的表达模式包括在空间或时间上不同的表达模式，以及诱导型表达模式。因此，在某些实施方案中，第一种和第二种启动子具有不同的空间表达模式，并且沉默在至少两个不同的空间位置中发生。在其他实施方案中，第一种和第二种启动子具有不同的时间表达才莫式，并且沉默在至少两个不同的时间或发育阶段(非重叠或重叠的时间段)中发生。合适的启动子包括例如，例如控制在不同细胞器(例如，质体、核、线粒体)、细胞或组织中的转录的第一种和第二种启动子，或控制在不同时间(例如，在昼夜节律周期的不同点上)或发育阶段的转录的笫一种和第二种启动子，或通过诱导物不同地诱导或通过不同的诱导物诱导的第一种和第二种启动子。在重组DNA构建体的某些实施方案中，至少一个基因抑制元件在第一种和第二种启动子这两者的转录控制下。在这些实施方案中，至个不同^间或发育阶段)的至^一种靶基^。^在某些实施方案中，重组DNA构建体进一步包括下述中的一种或多种(a)与第二种启动子可操作地连接的第二种基因抑制元件；(b)用于表达至少一个外源基因的至少一个基因表达元件；(c)至少一个终止子，和U)至少一个T-DM边界。第二种基因抑制元件以使得第二种基因抑制元件的转录导致其革巴向的基因的有意沉默的方式排列；因此，在许多实施方案中，第二种基因抑制元件与第一种启动子处于相反方向。由至少一个基因抑制元件表达的至少一个外源基因可以是任何在天然背景外表达的一种或多种，并且可以包括例如标记基因、密码子优化基因、天然基因的等位置换。在重组DNA构建体的某些实施方案中，至少一个第一种基因抑制元件包括选自下述的至少一个元件(a)包括至少一个反义DM区段的DNA,所述反义DNA区段与至少一个第一种粑基因的至少一个区段是反义的；(b)包括至少一个反义DNA区段的多个拷贝的DM,所述反义DM区段与至少一个第一种耙基因的至少一个区段是反义的；(c)包括至少一个有义DNA区|殳的DM，所述有义DNA区段是至少一个第一种乾^基因的至少一个区段；(d)包括至少一个有义DNA区段的多个拷贝的DNA,所述有义DM区段是至少一个第一种耙基因的至少一个区段；(e)DNA,其转录成RNA,用于通过形成双链RNA而抑制至少一个第一种革巴基因，并且包括与至少一个靶基因的至少一个区段反义的至少一个反义DNA区段、和作为至少一个第一种靶基因的至少一个区段的至少一个有义DNA区I殳；(f)DNA,其转录成RNA,用于通过形成单个双链RNA而抑制至少一个第一种靶基因，并且包括与至少一个第一种靶基因的至少一个区段反义的多个连续的反义DNA区段、和作为至少一个第一种耙基因的至少一个区段的多个连续的有义DNA区段；(g)DNA,其转录成RNA，用于通过形成多个双链RM而抑制至少一个第一种靶基因，并且包括与至少一个第一种靶基因的至少一个区段反义的多个反义DNA区段、和作为至少一个第一种靶基因的至少一个区段的多个有义DNA区段，并且其中多个反义DNA区段和多个有义DNA区段以一系列反向重复排列；(h)包括来源于植物miRNA的核苷酸的DM;(i)包括siRNA的核普酸的DNA;(j)转录成能够与配体结合的RM适体的DNA;和(k)转录成与配体结合的RNA适体的DNA,和转录成能够调节第一种粑基因表达的调节RNA的MA,其中调节依赖调节RNA的构象，并且调节RNA的构象受RNA适体的结合状态的变构效应影响。合适的基因抑制元件在美国专利申请号11/303,745中得到进一步描述。在重组DNA构建体的某些实施方案中，第一种基因抑制元件嵌入内含子中。在优选实施方案中，内含子在一侧或所有两侧上側接非蛋白质编码DNA，和更优选地是转录增强内含子(例如，"增强子"，例如稻肌动蛋白1和稻肌动蛋白2基因、玉米醇脱氢酶基因、玉米热休克蛋白70基因和玉米皱缩l基因的5'内含子)。在某些实施方案中，重组DNA构建体进一步包括与第二种启动子可操作地连接的第二种基因抑制元件，其中第一种和第二种基因抑制元件嵌入内含子中(单个地在分开的内含子中或一起在单个内含子中)。第二种基因抑制元件以使得第二种基因抑制元件的转录导致其靶向的基因的有意沉默的方式排列；因此，在许多实施方案中，第二种基因抑制元件与第一种启动子处于相反方向。在重组DNA构建体的一个特别优选的实施方案中，第一种和第二、由本发明进一步提供的是植物中的基因沉默方法其包括(a)用重组DNA构建体转化植物细胞，从而提供转基因植物细胞，所述重组DNA构建体包括(i)与用于使至少一个第一种耙基因沉默的至少一个第一种基因抑制元件可操作地连接的第一种启动子，和(ii)与第一种启动子处于相反方向且位于至少一个第一种基因抑制元件3'的第二种启动子，其中第一种和第二种启动子具有不同的表达模式，并且其中重组DNA构建体在真核细胞(例如植物细胞或动物细胞)中的转录导致至少一个第一种靶基因沉默；(b)由转基因植物细胞制备再生的转基因植物、或制备再生的转基因植物的转基因后代种子或转基因后代植物；(c)在再生的转基因植物或转基因后代种子或转基因后代植物中转录重组DNA构建体，由此使至少一个笫一种靶基因在再生的转基因植物或转基因后代种子或转基因后代植物中沉默。在该方法的优选实施方案中，植物是农作物植物，例如，谷类作物(例如，玉米、稻、小麦、大麦、黑麦)，豆类(例如，大豆、苜蓿、菜豆、花生)，油料种子(例如，油菜、卡诺拉(canola)、大豆、坚果)，和水果或蔬菜农作物植物。在一个优选实施方案中，重组DNA构建体在具有大量胚乳的转基因后代种子(例如，转基因玉米或稻种子或其他谷类谷粒种子)中进行转录，并且第一种和第二种启动子包括植物胚特异性启动子和植物胚乳特异性启动子。特别优选的是这样的方法，其中转基因后代种子是转基因后代玉米种子，至少一个第一种靶基因是至少一个赖氨酸分解代谢基因，并且使至少一个赖氨酸分解代谢基因在转基因后代种子的胚和胚乳细胞中沉默。在该方法的另一个特别优选的实施方案中，转基因后代种子是转基因后代玉米种子，至少一个第一种粑基因是至少一个赖氨酸分解代谢基因，使至少一个赖氨酸分解代谢基因在转基因后代种子的胚和胚乳细胞中沉默，并且重组DNA构建体进一步包括与胚乳特异性启动子可操作地连接的至少一个赖氨酸生物合成基因。本发明进一步提供了用于制备具有增加水平的营养物质的转基因玉米种子的方法，该方法包括(a)选择包含重组DNA构建体的第一种转基因玉米植物，所述重组DNA构建体包括(i)与用于使至少一个第一种靶基因沉默的至少一个第一种基因抑制元件可操作地连接的第一种启动子，其中至少一个第一种耙基因是选自氨基酸、脂质或碳水化合物的营养物质的分解代谢基因，和(ii)与第一种启动子处于相反方向且位于至少一个第一种基因抑制元件3'的所述第二种启动子，其中第一种和所述第二种启动子具有不同的表达^f莫式，和其中重组DNA构建体在真核细胞(例如植物细胞或动物细胞)中的转录导致至少一个第一种粑基因沉默；(b)将重组DM构建体基因渐渗到第二种玉米植物内；(c)由第二种玉米植物培养种子以产生后代玉米植物群体；(d)在后代玉米植物群体中筛选后代玉米植物，其产生相对于非转基因玉米植物具有增加水平的营养物质的玉米种子；(e)从群体中选择一种或多种后代玉米植物，其产生相对于非转基因玉米植物具有增加水平的营养物质的玉米种子；(f)验证重组DNA构建体稳定整合到所选择的后代玉米植物中；(g)验证相对于缺乏重组DNA构建体的玉米植物，营养物质的分解代谢基因在所选择的后代玉米植物中被沉默；(h)收集来自所选择的后代玉米植物的转基因玉米种子。重组DNA构建体任选包括基因表达元件。在该方法的各种实施方案中，待增加的营养物质是氨基酸(例如，赖氨酸、甲硫氨酸或色氨酸)，脂质(例如，脂肪酸或脂肪酸酯)，或碳水化合物(例如简单糖或复合糖)。在该方法的一个优选实施方案中，营养物质是赖氨酸，分解代谢基因是赖氨酸分解代谢基因(例如，玉米赖氨酸酮戊二酸还原酶/酵母氨酸脱氬酶)，并且第一种和第二种启动子包括植物胚特异性启动子和植物胚乳特异性启动子；任选地，重组DNA构建体还包括用于表达赖氨酸生物合成基因(例如，cordapA或lysC)的基因表达元件。植物转化方法用重组DNA转化植物细胞的众多方法是本领域已知的，并且可以在本发明中使用。用于植物转化的2种常用方法是土壤杆菌介导的转化和微粒轰击。微粒轰击法在美国专利5，015，580(大豆)；5,550,318(玉米)；5,538,880(玉米)；5，914，451(大豆)；6，160，208(玉米)；6,399,861(玉米)和6,153,812(小麦)中得到举例说明，土壤杆菌介导的转化在美国专利5,159，135(棉花)；5，824,877(大豆)；5,591，616(玉米)；和6,384，301(大豆)中得到描述。对于基于根癌土壤杆菌的植物转化系统，存在于转化构建体上的另外元件包括T-DNA左和/或右边界序列(一般地左和右边界序列，但优选地至少一个边界序列，例如至少右边界序列)，以促进重组多核苷酸掺入植物基因组内。一般而言，随机引入重组DM是有用的，即在靶植物系基因组中的非特异性位置上。在特别情况下，靶重组DNA插入可能是有用的，以便达到位点特异性整合，例如替换基因组中的现有基因，使用植物基因组中的现有启动子，或在已知对于基因表达有活性的预定位点上插入重组多核苷酸。已知在植物中起作用的现存的几种位点特异性重组系统包括如美国专利4，959，317中^>开的cre-lox和如美国专利5，527，695中公开的FLP-FRT。本发明的转化方法优选在培养基上和受控环境中的组织培养中进行实践。"培养基"指用于在体外，即在完整活生物外培养细胞的众多营养物质混合物。受体细胞靶包括但不限于，分生组织细胞、愈伤组织、未成熟胚和配子细胞例如小孢子、花粉、精子和卵细胞。预期可以再生可育植物的任何细胞可用作受体细胞。愈伤组织可以由组织来源起始，所述组织来源包括但不限于，未成熟胚、幼苗顶端分生组织、小孢子等。能够作为愈伤组织繁殖的细胞也是用于遗传转化的受体细胞。用于制备本发明的转基因植物的实践转化方法和材料，例如各种培养基和受体靶细胞、未成熟胚的转化和可育转基因植物的后续再生公开于美国专利6，194，636和6，232，526以及美国专利申请序列号09/757，089。转基因植物的种子可以由可育转基因植物进行收获，并且用于培养本发明的转化植物的后代，包括包含重组DNA构建体的杂交植物系，所述重组DNA构建体表达用于基因抑制的试剂。除了用重组DNA构建体直接转化植物外，转基因植物可以通过使具有重组DNA构建体的第一种植物与缺乏构建体的第二种植物杂交进行制备。例如，用于基因抑制的重组DNA可以引入第一种植物系内，所述第一种植物系容易进行转化以产生可以与第二种植物系杂交的转基因植物，以使用于基因抑制的重组DNA基因渐渗到第二种植物系内。具有实现基因抑制的重组DM的转基因植物可以与具有其他重组DM的转基因植物系进行杂交，所述其他重组DNA赋予另一种性状，例如产量改善、除草剂抗性或害虫抗性，以产生具有赋予基因抑制和另一种性状的重组DM的后代植物。一般地，在用于组合性状的此类育种中，贡献另外性状的转基因植物是雄系，携带基础性状的转基因植物是雌系。这种杂交的后代将以下述方式分离，即，使得某些植物将携带2种亲本性状的DNA,并且某些将携带1种亲本性状的DM;此类植物可以通过与亲本重组DM相关的标记进行鉴定。携带2种亲本性状的DNA的后代植物可以与母系多次回交，例如通常6-8代，以产生除了另一个转基因亲本品系的重组DNA夕卜，具有与一个原始转基因亲本品系基本上相同的基因型的后代植物。实施例实施例1这个实施例举例说明了本发明的方法。参考图2,制备2种盒用于反义抑制表达愛光素酶的生物中的萤光素酶。第一个萤光素酶反义盒包含与萤火虫萤光素酶编码DNA(反义LUC)的反义区段可操作地连接的CaMV35S启动子(35S3，)和nos3'元件。第二个萤光素酶反义盒包含与萤火虫萤光素酶编码DNA的相同反义区段可操作地连接的FMV启动子(FMV5，)和小麦热休克蛋白3'元件(hsp3')。反义盒在转化质粒中彼此反向地组装，其中各自3'元件是邻接的。令人惊讶地，当质粒插入普通的大肠杆菌菌林内时，组装的盒不易于切割。质粒连同能够表达萤火虫萤光素酶和肾海鳃(Renilla)萤光素酶基因的两个质粒一起共转化到植物细胞内，后者充当萤火虫萤光素酶表达的基线对照，萤火虫萦光素酶表达针对其进行标准化。因此，营火虫萤光素酶与肾海鳃萦光素酶表达的比是萤火虫萤光素酶基因抑制水平的测量值。与用萤火虫萤光素酶反义盒的单拷贝转化的植物细胞比较，多种盒显示转基因植物细胞中更高水平的萤火虫萤光素酶抑制。实施例2这个实施例举例说明了用于植物组织中的选择性基因抑制的构建体。制备第一种反义基因抑制构建体，其在与有义方向的第二个区段连接的反义方向的第一个区段中，包含与可转录DNA可操作地连接的玉米植物胚乳特异性启动子B32(Genbank登记号X70153的核苷酸848至1259,还参见Hartings等人(1990)PlantMol.Biol.,14:1031-1040),所述可转录DNA由玉米赖氨酸酮戊二酸还原酶/酵母氨酸脱氢酶基因(LKR/SDH)的LKR结构域的约500个石咸基对组成。因为LKR是赖氨酸分解代谢酶，所以它的抑制导致增加的赖氨酸。制备第二种反义基因抑制构建体，其与第一种反义基因抑制构建体基本上相同，除了启动子替换为玉米植物胚特异性启动子L3油质蛋白(参见美国专利号6,433,252)。根据本发明的第三种基因抑制构建体通过使第一个构建体中使用的B32启动子与第二种构建体的3'末端连接进行制备，提供具有与DNA的反义定向区段可操作地连接的相反启动子的构建体，所述DNA来自被单巴向用于抑制的基因。在一个可替代的实施方案中，本发明的基因抑制构建体由第二种反义基因抑制构建体进行制备，其是通过用与在构建体的相反末端上的L3启动子处于相反方向插入的B32启动子替换提供聚腺苷酸化信号和位点的3'调节区(参见图3A)而实现的。在另一个可替代的实施方案中，本发明的构建体通过下述进行制备添加3'调节区下游和与在构建体的相反末端上的L3启动子处于相反方向的B32启动子；任选地第二个3'调节区插入在L3启动子和可转录DNA之间。在另外一个实施方案中，本发明的构建体通过使3'调节区位于构建体的外侧区进行制备，其中每个3'调节区定向于在构建体的相反末端上的启动子。在另外一个实施方案中，两个反义构建体以尾对尾方向进行组装，提供由各自的启动子结合的构建体。适合于土壤杆菌介导的植物转化的质粒使用下述中的每一个进行制备(a)具有B32启动子的第一种反义基因抑制构建体，(b)具有L3启动子的第二种反义基因抑制构建体，和(c)具有在构建体的相反末端上和处于相反方向的B32和L3启动子的本发明的基因抑制构建体。将每个构建体插入用于土壤杆菌介导的转化系统的二元载体的质粒内的左和右T-DNA边界之间，且紧靠用于表达来自根癌土壤杆菌的aroA基因的选择标记盒。通过土壤杆菌介导的转化将每个质粒插入玉米愈伤组织内。事件作为对草甘膦除草剂的抗性进行选择，并且生长成转基因玉米植物以产生Fl种子。来自每个事件的成熟种子进行分析，以测定转化的成功和力^的抑制。成熟的转基因种子进行剖析，以提取蛋白质用于蛋白质分析。与野生型比较，来自转基因玉米植物的种子显示Z/i的减少和增加的赖氨酸。具有胚乳特异性启动子的第一种构建体提供具有约1000ppm游离赖氨酸的种子；LKR减少基本上仅在胚乳组织中观察到。具有胚特异性启动子的第二种构建体提供具有约3000ppm游离赖氨酸的种子；LKR减少基本上仅在胚组织中观察到。因为赖氨酸被认为在胚和胚乳之间移动，所以使用本发明的构建体同时抑制胚和胚乳组织中的LKR提供了具有比来自单独一个组织抑制的叠加效应更高的游离赖氨酸值的种子，例如大于1300ppm。实施例3于其使用的方法、^本发明的转基因玉米种子。在这个具#"实施例中，包括植物胚特异性启动子和植物胚乳特异性启动子的重组DNA构建体用于提供转基因植物细胞、以及来源于此类转基因植物细胞的转基因后代玉米植物和种子，所述启动子各自与用于使赖氨酸分解代谢基因沉默的至少一个基因抑制元件可操作地连接，其中转基因后代种子具有增加的赖氨酸。用于例如提供本发明的转基因植物细胞、转基因植物和转基因种子的重组DNA构建体的一个非限制性实施方案在图3B中得到举例说明，并且包括(i)与包括DNA的至少一个第一种基因抑制元件可操作地连接的植物胚乳特异性启动子，所述DNA转录成RNA,用于通过形成双链RNA来使赖氨酸分解代谢基因沉默(例如，包括至少一个反义DNA区段和至少一个有义DNA区段的DNA,所述反义DNA区段与至少一个第一种耙基因的至少一个区段是反义的，所述有义DNA区段是至少一个第一种靶基因的至少一个区段；或在两个转录方向上编码反式作用miRNA的DNA),(ii)与第一种启动子处于相反方向且与至少一个第一种基因抑制元件可操作地连接的植物胚特异性启动子，和(iii)与第一种或第二种启动子可操作地连接的至少一个终止子(其中每个终止子可以在处于相反方向的启动子的任一侧上。在一个具体例子中，重组DM构建体(在图4中举例说明，从顶部起的第三个构建体)通过土壤杆菌介导的转化稳定引入玉米植物细胞内，并且后代玉米植物如上文"植物转化方法"下所述的进行再生。这种构建体包括(a)与稳定的反义基因抑制元件和用于表达赖氨酸不敏感性棒状杆菌(Corynebacterium)腸PS或cordapA("cordapA，，)的基因表达元件(参见美国专利号6,459,019和5，773，691以及美国专利申请发明者L·吉尔伯森,S·黄,T·M·马尔瓦申请人:孟山都技术有限公司