抗mn抗体和使用它们的方法

专利名称：：抗mn抗体和使用它们的方法抗MN抗体和^f吏用它们的方法引用参考本申请要求2005年12月12日提交的美国临时专利申请No.60/749,716的权利。前述申请，以及其中引用的所有文献和其中引用或参考的所有文献，以及本文引用或参考的所有文献("本文引用的文献")，以及在本文引用的文献中所引用或参考的所有文献，连同用于本文提到的或本文参考引入的任何文献中提到的任何产品的任何厂商4吏用说明、说明书、产品说明书和产品插页，都因此而引入本文作为参考，并且可以,皮用于实施本发明。
背景技术：
：1.发明领域本发明涉及对MN蛋白有特异性的抗体和/或其片段。本发明进一步涉及抗体和/或免疫缀合物组合物以及它们治疗、预防和/或i貪断MN相关病症例如癌症的用途。2.背景癌症的发生最常见地是与衰老相关联的，所有癌症新病例的65%都是在年龄65岁及以上的患者中记录到的。癌症是美国第二大主要死亡原因，仅次于心脏病。实际上，美国癌症学会已经预计，，i定目前的死亡率保持恒定，美国四分之一的人将死于癌症。仅仅在美国，2006年就预期有1,399,790个癌症新发病例和564,830个癌症死者。这些新发病例的大多数都可以预期是结肠癌(106,680)、肺癌(172,570)和乳A袈癌(214,640)。而且，预计癌症的发病率和流行都将在未来十年增加大约15%,反映出1.4%的平均增长率(美国癌症学会，2006)。MN是一种最近鉴别到的肿瘤相关抗原，它是细胞表面蛋白，已经发现它在许多临床癌中表达。例如，已经发现MN在100%的肾细胞癌(Lmo,SY,CancerRes.,1997,57:2827-2831)、100%的食管癌(TurnerJR，Hum.Pathol.,199,28:740-744)、超过90%的宫颈癌(Liao,SY,CancerRes.:1997,57:2827-2831)、76%的恶性结肠癌(Saarmo,J.etal.,Am.J.Path.，161997,153:279-285)、80%的非小细胞肺癌(VermylenP.etal.,Eur.Respir.J.,1999,14:806-81l)和48Q/o的乳腺癌(ChiaSKetal.,J.Clin.Oncol.,200119:3660-3668)中异常表达。象其它肺瘤相关抗原一样，MN蛋白也存在于少数正常组织细胞上，包括例如胃、胆管粘膜和位于小肠中的高度增歹直的正常细月包(SaarnioJ.etal.,J.Histochem.Cytochem.,1998,46:497-504)。已经克隆并测序了人类MNcDNA(Pastorek,etal.,Oncogene,1994,9:2877-2888)。预测的蛋白由信号肽、蛋白聚糖相关序列、碳酸酐酶结构域(碳酸酐酶IX或CAIX)、跨膜区段以及短的胞内尾組成。碳酸酐酶IX结构域催化二氧化碳可逆水合为碳酸。该活性可能在调节胂瘤环境的胞外部分的局部酸化方面具有作用，这可能因此而导致蛋白酶的激活以及最终的转移。也已经研究了MN表达的调节。一方面，例如，MN表达被缺氧所上调。被称为缺氧诱导因子-l(HIF-1)的转录复合物是MN表达的调节剂。因此，MN被称为HIF-1应答基因，它牵涉到对缺氧的肺瘤应答的理解(WykoffCCetal.,CancerRes.，2000,60:7075-7083)。此外，MN表达与肺瘤缺氧水平相关，并且是宫颈癌的总体存活和无转移存活的预后指示(Loncaster，JAetal.,CancerRes.,2000，60:7075-7083)。画表达也与高的平均血管密度、晚期癌阶,殳、头颈部癌的坏死程度(BeasleyNJPetal.,CancerRes.,2001,61:5262-5267)、鼻咽癌的低存活(HuiEPetal.,Clin.CancerRes.,2002,8:2595-2604)、侵入性乳腺癌的肿瘤坏死、更高分级、阴性雌激素受体状态、更高的复发率和低存活(ChiaSKetal.,J.Clin.Oncol,2001,19:3660-3668)相关。因此MN抗原的表达与j氐存活预后和更高分级的癌症相关。用于这些迅速发展的癌症的新的改进治疗方法，特别是耙向MN表达的那些方法，将是非常期望的，这将代表现有技术的进步。同样地，治疗、预防和/或诊断方面是有用的。发明概述本发明涉及结合到细胞表面蛋白MN上并且可用于治疗、预防和/或诊断癌症的抗体，例如单克隆抗体，或者抗体片段。本发明的抗体可进一17步被缀合到细胞毒性试剂例如单曱基金抑素-E(monomethylaunstatin-E)上，和/或与一种或多种另外的抗癌试剂共同给药或配制。本发明的抗MN抗体和免疫缀合物可用于本发明的方法中来治疗和/或诊断和/或监测癌症，例如实体瘤。一方面，本发明提供了抗体或抗体片段，或者包括抗体或抗体片段的组合物，其中抗体或抗体片段具有特异性针对MN蛋白的抗原结合位点。抗原结合位点可包括至少一个CDR1、CDR2或CDR3，或者CDR1与CDR2或CDR3—起，或者CDR2与CDR1或CDR3—起，或者CDR3与CDR1或CDR2—起，或者它们的任意组合。CDR1可选自SEQIDNO:57,58,59,60,61,62,77,80,81,86,87,88,89,98,99,104,107和108。CDR2可选自SEQIDNO:63,64,65,66,67,68,69,78,82,83,90,91,92,93,100,101,105,109和110。CDR3可选自SEQIDNO:70,71,72,73,74,75,76,79,84,85,94,95,96,97,102,103,106,111和112。本发明这个方面的CDR序列也可包括与上面对每种CDRl、CDR2或CDR3所述序列的任一序列具有优选高于大约80%序列同一性，更优选高于大约85%的序列同一性，还更优选高于大约90%的序列同一性，更加优选大约95%或者甚至大约99%的序列同一性，甚至达到大约100%的序列同一性的氨基酸序列。另一方面，抗原结合位点可具有重链可变区CDR，其选自SEQIDNO:57-85以及与SEQIDNO:57-85的任一序列具有高于大约80%序列同一性的氨基酸序列。抗原结合位点可具有轻链可变区CDR,其选自SEQIDNO:86-112以及与SEQIDNO:86-112的任一序列具有高于大约80%序列同一性的氨基酸序列。抗原结合位点也可选自一组特定CDR序列，包括下面这些六种CDR的组(a)[3ee9]SEQIDNO:57,63,70,89,93和97;(b)[3ef2]SEQIDNO:58,64,71,107,109和111;(c)[le4]SEQIDNO:59,65,72,107,109和111;(d)[3a4]SEQIDNO:60,66,73,108,110和112;(e)[3ab4]SEQIDNO:61,67,74,87,91和95;(f)[3ahl0]SEQIDNO:61,68,75,88,92和96;(g)[3bb2]SEQIDNO:62,69,76,98,100和102;(h)[laal]SEQIDNO:77,78,79,86,90和94;(i)[5a6]SEQIDNO:80,82,84,99,101和103;以及(j)[5aa3]SEQIDNO:81,83，85,104,105和106。抗原结合位点也可包括一组重链CDR序列，其选自(a)[3ee9]SEQIDNO:57,63和70;(b)[3ef2]SEQIDNO:58,64和71;(c)[le4]SEQIDNO:59,65和72;(d)[3a4]SEQIDNO:60,66和73;(e)[3ab4]SEQIDNO:61,67和74;(f)[3ahl0]SEQIDNO:61,68和75;(g)[3bb2]SEQIDNO:62,69和76;(h)[laal]SEQIDNO:77,78和79;(i)[5a6]SEQIDNO:80,82和84;以及(j)[5aa3]SEQIDNO:81,83和85。抗原结合位点也可包括一组轻链CDR序列，其选自(a)[3ee9]SEQIDNO:89,93和97;(b)[3ef2]SEQIDNO:107，109和111;(c)[le4]SEQIDNO:107,109和111;(d)[3a4]SEQIDNO:108,IIO和112;(e)[3ab4]SEQIDNO:87,91和95;(f)[3ahl0]SEQIDNO:88,92和96;(g)[3bb2]SEQIDNO:98,100和102;(h)[laal]SEQIDNO:86,90和94;(i)[5a6]SEQIDNO:99,101和103;以及(j)[5aa3]SEQIDNO:104，105和106。还有另一方面，本发明提供了具有抗原结合位点的抗体或抗体片段，所述位点含有选自下组的一对重链可变区和轻《连可变区(a)重链可变区SEQIDNO:133和轻链可变区SEQIDNO:134;(b)重《连可变区SEQIDNO:135和轻《连可变区SEQIDNO:136;(c)重链可变区SEQIDNO:137和轻链可变区SEQIDNO:138;(d)重链可变区SEQIDNO:139和轻链可变区SEQIDNO:140;(e)重链可变区SEQIDNO:141和轻链可变区SEQIDNO:142;(f)重链可变区SEQIDNO:143和轻链可变区SEQIDNO:144;(g)重链可变区SEQIDNO:145和轻链可变区SEQIDNO:146;(h)重链可变区SEQIDNO:147和轻链可变区SEQIDNO:148;(i)重链可变区SEQIDNO:149和轻链可变区SEQIDNO:150;以及(j)重链可变区SEQIDNO:151和轻链可变区SEQIDNO:152。本发明的抗体或抗体片段能够以优选大约0.15nM到大约50nM的离解常数结合到MN蛋白上。另一方面，本发明的抗体或片段是IgG抗体或IgG片段。抗体或片段也可以是IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgD、IgE、IgA或IgM抗体、Fab片段、F(ab')2片段、scFv片段、Fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体、生物特异性抗体、多特异性抗体或者嵌合抗体(例如包括稼接到人或非人抗体结合区的人抗体支架，或者稼接到人或非人抗体结合区的非人抗体支架)。嵌合抗体可包括，例如，来自非人来源的抗体支架区，诸如来自牛、小鼠、美洲驼、骆驼或兔子。关于抗体工程化的更多信息可在文献中找到，例如Holliger和Hudson,NatureBiotechnology,(2005年9月)23:1126-1136,将其引入本文作为参考。上述片段可从免疫球蛋白获得或者通过合适手段以片段形式产生，例如重组表达。本发明的抗体或抗体片段也可是人源化的，其中CDR序列或区域(例如CDR1、CDR2、CDR3)可以是非人的，例如鼠的。本发明的抗体或抗体片段、或者包括抗体或片段的组合物可包括缀合到抗体或片段上的细胞毒性试剂。一方面，细胞毒性试剂是单曱基金抑素-E(MMAE),然而，也提供了其它细胞毒性试剂，可包括例如MMAE的功能性类似物(例如单甲基金抑素-F)和其它细胞毒性试剂例如阿普立丁(aplidin)、氮杂尿苷、阿那曲唑、氮杂胞苷、博来霉素、硼替左米(bortezomib)、薯司他丁-1、白消安、刺孢霉素(calicheamycm)、喜树碱、10-羟基喜树碱、卡氮芥、塞来西布、苯丁酸氮芥、顺铂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴。秦、多西他赛、放线菌素、葡糖苷酸柔红霉素、正定霉素、地塞米松、己烯雌酚、阿霉素、葡糖苷酸阿霉素、葡糖苷酸表阿霉素、炔雌醇、雌氮芥、依托泊苷、葡糖苷酸依托泊苷、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、3',5'-〇-二油酰-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟利坦、氟尿嘧啶、氟羟甲睾酮、吉西他滨、己酸羟孕酮、羟基脲、去曱柔毛霉素、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、曱酰四氬叶酸、罗氮芥、氮芥、醋酸甲孕酮(medroprogesteroneacetate)、醋酸曱地孕酮、美法仑、巯基噤呤、6-巯基嘌呤、氨甲喋呤、米托恩醌、光神霉素、丝裂霉素、米托坦、丁酸苯酯、强的松、甲基千肼、紫杉醇、喷托他丁、PSI-341、司莫司汀、链脲霉素、他莫昔芬、紫杉烷(taxanes)、紫杉醇、丙酸睾酮、沙立度胺、巯基鸟嘌呤、塞替哌、替尼泊苷、拓朴替康、尿嘧啶氮芥、万珂(velcade)、长春花碱、长春瑞宾、长春新碱、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、豹蛙酶(onconase)、rapLRl、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素以及假单胞菌内毒素或者它们的组合。任意细胞毒性试剂也可包括它们的功能性类似物。本发明的组合物除了抗体和片段(带有或不带上述缀合的细胞毒性试剂)之外，还可包括各种抗癌试剂，可包括例如博来霉素、多西他赛(肽帝索)、阿霉素、依达曲沙、厄洛替尼(erlotinib)(特罗凯(Tarceva))、依托泊普、非那雄胺(保列治)、氟利坦(氟他胺)、吉西他滨(健择(Gemzar))、吉非替尼(gemtmib)(易瑞沙(Irresa))、醋酸性瑞林(诺雷德(Zoladex))、格雷西隆(凯特瑞(Kytril))、伊马替尼(imatmib)(格列卫(Gleevec))、伊立替康(开普拓/开普拓沙(Camptosar))、奥丹西隆(枢复宁)、紫杉醇(他克唑)、培加帕酶(培门冬酶)、盐酸毛果芸香碱(匹罗卡品)、卟吩姆钠(光敏素)、白介素-2(普罗白精)、利妥希单抗(rituximab)(利妥希玛(Rituxan))、拓朴替康(盐酸拓朴替康)、司徒曼布(赫赛汀)、特立平(Triapine)、长春新^威和长春瑞宾(i若维本)，或者它们的治疗性抗体或片段，或者抗血管生成试剂例如制管张素、贝伐单抗(bevacizumab)(阿瓦斯丁⑧(Avastm))、索拉非尼(sorafemb)(多吉美⑧(Nexavar))、杆抑素(baculostatin)、癌抑素(canstatm)、乳腺丝抑蛋白、抗VEGF抗体或肽、抗胎盘生长因子抗体或肽、抗Flk-l抗体、抗Flt-l抗体或肽、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素12、IP-IO、Gro-卩、血小板反应蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白相关蛋白、酰胺基三唑21(carboxiamidotriazole)、CM101、马马司他、戊聚糖多碌^酸盐、血管生成素2、干扰素-a、除莠霉素A、PNU145156E、16K促乳素片段、罗喹美克、沙立度胺、己酮可可碱、染料木素、TNP-470、内皮抑制素、紫杉醇、阿卡丁(accutin)、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板第四因子或者米诺环素。另一方面，本发明进一步提供了通过给予治疗有效量的本发明的抗体和/或片段、或者包括本发明抗体和/或片段的本发明的组合物治疗MN相关病症的方法。MN相关病症可包括例如癌症，诸如实体瘤癌症。实体瘤可以位于或源自乳腺、呼吸道、肺、脑、生殖器、消化道、结肠、泌尿道、肾、食道、子宫颈、眼、肝、皮肤、头部、颈部、甲状腺和甲状旁腺。另一方面，本发明提供了诊断以异常MN水平为特征的MN相关病症的方法，包括将疑似患病组织或细胞中的MN水平与相应健康组织或细胞中的MN水平进行比较，其中疑似患病组织或细胞中的异常MN水平表示存在MN相关病症，所述比较步骤进一步包括用本发明的抗体或抗体片段通过免疫分析检测患病组织和健康组织中的MN水平。在特定方面，本发明提供了诊断MN相关病症的方法，其中免疫分析包括步骤(a)检测健康组织中的MN蛋白水平；(b)检测疑似患病组织中的MN蛋白水平；以及(c)比较(a)和(b)的MN蛋白水平。与健康组织中的MN蛋白水平相比，^是似患病组织中的MN蛋白水平升高表示存在MN相关病症。本发明也提供了试剂盒，包括本发明的抗体或抗体片段，或者备选地，包括本发明的组合物，以及治疗MN相关病症或用于诊断MN相关病症的方法中使用试剂盒的一套说明书。这些和其它实施方案是下面的详细说明所公开的，或者由此是显而易见的并且是它所包括的。附图简述结合附图可以最好地理解通过实施例方式给出的以下详细说明，但是不打算将本发明仅仅限定到所描述的特定实施方案，其中图1图示了抗体互补决定区(CDR)的DNA序列；图2图示了抗体互补决定区(CDR)的蛋白序列；图3图示了特定抗体轻链和重链可变区的DNA序列，每一种都含有CDR和构架区这两者；图4图示了特定抗体轻链(VL)和重链(HL)可变区的蛋白序列，每一种都含有CDR和构架区这两者；图5图示了本发明的MN抗体的MN结合性质；图6图示了通过用抗MN抗体温育所产生的肿瘤细胞对MN包被平板的粘附的抑制；图7图示了在含有MaTu肺瘤的异种移植模型中的体内抗肿瘤活性，这是通过用含有抗MN单克隆抗体1e4的免疫缀合物处理而产生的；图8图示了FACS测定抗MN抗体对PC3mm2细胞系的结合，该细胞系在其表面上表达MN蛋白；图9示意性图示了抗体缀合物(缀合到MMAE上的抗MN抗体)；图10a显示了FACS图谱，图示了3ee9/MMAE结合画+(MaTu)细胞但不结合MN-(DLD)细胞；图10b显示了FACS图谱，图示了1E4免疫缀合物结合MN+(PC3mm2)细胞但不结合MN-(DLD)细胞；图10c显示了FACS图谱，图示了laal免疫缀合物结合MN+(PC3mm2)细胞但不结合MN-(DLD)细胞；图lla显示了免疫荧光照片，图示了MN+细胞导致的3ee9/MMAE的内化，而MN-细胞没有导致内化。内化的3ee9/MMAE显示为荧光；图lib显示了免疫荧光照片，图示了MN+细胞导致的1E4免疫缀合物的内化，而MN-细胞没有导致内化。内化的1E4免疫缀合物显示为荧光；图12显示了免疫印迹，图示了MN抗体导致的生物素化细月包表面蛋白的特异性免疫沉淀；图13a用图表描述了3ee9/MMAE对MN+细胞而不对MN-细胞有细胞毒性；图13b用图表描述了1E4免疫缀合物对MN+细胞而不对MN-细胞有细i包毒性；图13b用图表描述了laal免疫缀合物对MN+细胞而不对MN-细胞有细胞毒性；图14显示了免疫荧光照片，图示了通过微管蛋白抑制产生的3ee9/MMAE对正常纺锤体形成的抑制；图15用图表描述了3ee9/MMAE对MaTu异种移才直物的抗肺瘤功效；图16用图表描述了1E4免疫缀合物对已证实的MaTu乳腺肿瘤的抗月中瘤功戋支；图17用图表描述了laal免疫缀合物对MaTu异种移植物的抗肿瘤功效；图18用图表描述了3ee9/MMAE对MaTu异种移植物的治疗指数(TI);图19用图表描述了3ee9/MMAE和没有MMAE时对HT-29异种移才直物的抗肿瘤功效；图20用图表描述了4要照Q7Dx2方案，3ee9/MMAE对HT-29异种移植物的抗肿瘤功效；图20用图表描述了按照QlDxl方案，3ee9/MMAE对HT-29异种移植物的抗肺瘤功效；图22用图表描述了3ee9/MMAE对PC3mm2异种移才直物的抗肺瘤功效；图23用图表描述了3ee9/MMAE对Colo-205异种移才直物的抗肺瘤功效；图24用图表描述了3ee9/MMAE对HCT-15异种移才直物的抗肺瘤功效；图25用图表描述了3ee9/MMAE对MN-(左侧图)和MN+(右侧图)MIAPaca2异种移才直物的抗肿瘤功效；图26a和26b用图表描述了3ee9/MMAE联合希罗达⑧在不同剂量下对Colo-205CRC异种移4直物的抗肺瘤功效；图27显示了免疫焚光照片，图示了3ee9在huMN-MIAPaca2和MIAPaca2肺瘤中的体内定位；以及图28显示了免疫焚光照片(组织样品)，图示了两种剂量的3ee9/MMAE对HT-29CRC异种移植物中微管蛋白聚合的抑制。图29显示了哺乳动物表达载体3ee9H+LpCMVUCOE8(见实施例21)的插入区的全部核苷酸序列，该载体编码人IgG抗MN抗体，该抗体包括分别为SEQIDNO:126和125的K和重链CDR可变区，该载体获自载24体3ee9pMORPHx9(见实施例1-3)。SEQIDNO:153。发明详述要明白的是，本文所述的本发明并不被限定到涉及本发明任意方面的本文提供的特定细节，包括所描述的抗MN抗体、免疫缀合物、治疗方法、实-验方案、细胞系、动物种或属、构建体以及试剂，同样也可以变化。也要明白的是，本文使用的术语只是为了描述特定实施方案，并不打算限定本发明的范围。定义除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属
技术领域：
的普通技术人员所通常理解的意义。然而，下面的参考文献能够提供本发明所属
技术领域：
的技术人员许多本发明中使用的术语的一般定义，只要这些定义与现有技术中所通常理解的意义一致，都能够参考并使用。这些参考文献包括但不限于Singleton"a/.,DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology(2ded.1994);TheCambridgeDictionaryofScienceandTechnology(Walkered.,1988》Hale&Marham,TheHarperCollinsDictionaryofBiology(1991);和Lackiea/.,TheDictionaryofCell&MolecularBiology(3ded.1999》和CellularandMolecularImmunology,Eds.Abbas,LichtmanandPober,2ndEdition,W.B.SaundersCompany。可以参考本领域普通技术人员所能获得的任何其它的技术资源，其中提供了具有本领域所通常理解意义的本文所使用术语的定义。对于本发明来说，进一步定义以下术语。另外的术语在说明书的其它地方定义。如本文中以及所附权利要求书中所使用的，单数形式巧"一个，，、"一种"和"该"包#复数含义，除非上下文另外明确规j定了其它意思。这样，例如，在谈到"一个基因"时，就是指一个或多个基因，包括本领域技术人员已知的它们的等价物，等等。本文所使用的术语"抗体"包括免疫球蛋白分子(例如任何类型包括IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY,和/或任意亚型包括IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2),它们是从天然分离的或者通过重组方式制备的。抗体的含义也包括结合抗原的抗体片段，诸如Fab、(ab')2、cFv(单链Fv)、Fv、单4连抗体、双抗体(diabodies)、二石克4建连接的Fv(sdFv)以及包含Vl或Vh結枸域的片段，它们是由完整免疫球蛋白制备的或者通过重组方式制备的。本发明的抗体和/或结合抗原的抗体片段可以是单特异性的(例如单克隆抗体)、双特异性的、三特异性的或者更多特异性的。多特异性抗体可以是特异于抗原的不同表位或者可以是特异于多种抗原的表位。参见例如PCT7^开文本WO93/17715;WO92/08802;WO91/00360;WO92/05793;Tutt,etal.,1991,J.Immunol.147:6069;美国专利No.4,474,893;4,714,681;4,925，648;5,573,920;5,601,819;Kostelnyetal.,1992,J.Immunol.148:15471553,每一篇都引入本文作为参考。的整体或部分铰链区、CH1、CH2、CH3和CL结构域。本发明也包括这样的抗原结合的抗体片段，即它们也包含可变区与铰链区、CH1、CH2、CH3和CL结构域的任意组合。优选地，抗体或结合抗原的抗体片段是人的、人源化的、鼠的(例如小鼠和大鼠)、驴的、绵羊的、兔的、山羊的、豚鼠的、马的或者鸡的。本文使用的"人"抗体包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，以及包括分离自人免疫球蛋白文库、人B细胞或者对于一种或多种人免疫球蛋白是转基因的动物的抗体，如下文所述，例如在Kucherlapati等的美国专利No.5,939,598中。术语抗体也延伸到其它蛋白支架，它们能够将抗体CDR插入物定位成天然抗体中所发现的同样的活性结合构象，以致于用这些嵌合蛋白所观察到的耙抗原结合相对保持了这些CDR所来源的天然抗体的结合活性。本文使用的术语非人(例如鼠)抗体的"人源化"形式是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。人源化抗体大部分都是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的的超变区残基(例如互补决定区"CDR")被非人物种的抗体(供体抗体)的超变区残基(CDR)所替换，非人物种的抗体是来自诸如小鼠的、大鼠的、兔的或非人灵长类的具有期望的特异性、亲和性和结合能力的抗体。在一些情况下，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基可以被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可以包含受体抗体或供体抗体中不存在的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。一般而言，人源化抗体可以基本上包含至少一个或典型地两个可变结构域的全部，其中全部或基本上全部的超变区相应于非人免疫球蛋26白的那些并且全部或基本上全部的FR都是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体也可任选包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc),典型地是人免疫球蛋白的。综述参见Jones,etal.,(Nature321:522-525,1986);Reichmann,etal.,(Nature332:323-329,1988);以及Presta,(Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596,1992)。人源化抗体的制备可在美国专利No.7,049,135、6,828,422、6,753,136、6,706,484、6，696,248、6,692,935、6,667,150、6,653,068、6,300,064、6,294，353和5,514,548中找到，每一篇都引入本文作为参考。本文使用的术语"单链Fv"或"sFv"抗体片段包含抗体的Vh和Vl結构域，其中这些结构域是以单链多肽存在的。通常，Fv多肽还包含VH和vl结构域之间的多肽接头，它能够让sFv形成适合抗原结合的期望结构。综述参见Pluckthun(ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,Vol.113,RosenburgandMooreeds.Springer國Verlag,NewYork,pp.269-315,1994),将其完整引入本文作为参考。术语"双抗体"是指带有两个抗原结合位点的小抗体片段，这些片段包含在同一多肽链(VH-V。中连接到轻链可变结构域(VO上的重链可变结构域(Vh)。通过使用足够短的而不会导致同一链上的两个结构域之间配对的接头，迫使结构域与另一链上的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点。双抗体更全面地描述在例如EP404,097;WO93/11161;以及Hollinger,etal.,(Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448,1993)中,每一篇都引入作为参考。术语"线性抗体"是指现有4支术例如Zapata,etal.,(ProteinEng.8(10):1057-1062,1995)中描述的抗体,将该文引入作为参考。简要地说，这种抗体含有一对串联Fd区段(Vh-Ch1-Vh-Ch1)，形成了一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。本文使用的术语"单克隆抗体"是指从一群基本上均质的抗体中获得的抗体，也就是包含同一群体中的个体抗体，除了可以少量存在可能的天然突变。单克隆抗体是高度特异性的，也就是针对单一抗原位点。而且，与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的传统(多克隆)抗体制剂不同的是，每个单克隆抗体只针对抗原上的单一决定簇。修饰语"单克隆"表示了从基本上均质的抗体群中获得的抗体的特征，不要理解为需要通过任何特定方法生产抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过首先由Kohler,etal.,(Nature256:495,1975)描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见例如美国专利No.4，816,567。单克隆抗体也可使用例如Clackson,etal.,(Nature352:624-628,1991)和Marks,etal.,(J.Mol.Biol.222:581-597,1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离到。本文的单克隆抗体也包括"嵌合"抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或者属于特定抗体类型或亚型的抗体的相应序列相同或同源，而链的其它部分与源自另一物种或者属于另一抗体类型或亚型的抗体，以及这种抗体的片段的相应序列相同或同源，只要它们显示出期望的生物学活性(参见例如美国专利No.4,816,567;以及Morrison,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855,1984,每一篇都引入作为参考)。本文使用的术语"生物样品"或本文使用的"患者样品"是指获自生物或生物组分(例如细胞)的样品。样品可以是任何生物组织或流体。样品可以是"临床样品"，它是源自患者的样品。这些样品包括但不限于痰、血液、血清、血浆、血细胞(例如白细胞)、组织样品、活组织纟企测样品、尿、腹膜液、以及胸膜液、唾液、精液、乳腺渗出液、脑脊液、泪液、粘液、、淋巴液、胞质溶力交、腹水、羊水、膀胱沖洗液、以及支气管肺泡灌洗液或其中的细月包，连同其它体液样品。患者样品可以是新鲜的或冷冻的，可以用肝素、柠檬酸盐或EDTA处理。生物样品也可包括组织切片诸如用于组织学目的的冷冻切片。术语"癌"包括但不限于实体瘤，诸如乳腺癌、呼吸道癌、脑癌、生殖器癌、消化道癌、泌尿道癌、眼癌、肝癌、皮肤癌、头颈部癌、曱状腺癌、曱状旁腺癌以及它们的远处转移。该术语也包括肉瘤、淋巴瘤、白血病和浆细胞骨髓瘤。乳腺癌的例子包括但不限于侵入性导管癌、侵入性小叶癌、导管原位癌和小叶原位癌。呼吸道癌的例子包括但不限于小细胞肺癌和非小细胞肺癌，以及支气管腺瘤和胸膜肺母细胞瘤。脑癌的例子包括但不限于脑干和下丘脑胶质瘤，小脑和大脑星形细胞瘤，髓母细胞瘤，室管膜瘤，以及神经外胚层和松果体肺瘤。雄性生殖器肺瘤包括但不限于前列腺和睾丸癌。雌性生殖器肿瘤包括但不限于子宫内膜癌、宫颈癌、卯巢癌、阴道癌和外阴癌，以及子宫肉瘤。消化道肿瘤包括但不限于肛门癌、结28肠癌、结肠直肠癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、胰&，癌、直肠癌、小肠癌、以及唾液腺癌。泌尿道肺瘤包括但不限于膀胱癌、阴茎癌、肾癌、肾盂癌、输尿管癌、以及尿道癌。眼癌包括但不限于眼内黑色素瘤和视网膜母细胞瘤。肝癌的例子包括但不限于肝细胞癌(带有或不带纤维层状变异的肝细胞癌)，胆管癌(肝内胆管癌)，以及混合型肝细胞胆管癌。皮肤癌包括但不限于鳞状细胞癌，卡波西肉瘤，恶性黑素瘤，梅克尔细胞(Merkelcell)皮肤癌，以及非黑素瘤皮肤癌。头颈部癌包括但不限于喉癌/下咽癌/鼻咽癌/口咽癌，以及唇癌和口腔癌。'淋巴瘤包括j旦不限于AIDS相关淋巴瘤，非何杰金氏淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，何杰金氏病，以及中枢神经系统淋巴瘤。肉瘤包括但不限于软组织肉瘤，骨肉瘤，恶性纤维性组织细月包瘤，、淋巴肉瘤，以及^黄紋月几肉瘤。白血病包才舌{旦不限于急性髓细胞白血病，急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病，慢性粒细胞白血病，以及毛细胞白血病。本发明中使用的术语"表位"意指抗原上的任何抗原决定簇，例如MN蛋白，抗体通过抗原结合位点结合到它上面。决定簇或抗原决定簇通常由诸如氨基酸或糖侧链这些分子的化学活性表面基团所组成，通常具有特殊的三维结构特征以及特殊的电荷特征。术语"特异性免疫反应性"是指抗体和蛋白、化合物或抗原之间的结合反应，所述蛋白、化合物或抗原具有由抗体的抗原结合位点所识別的表位。该结合反应是在蛋白和其它生物物质的混合群体的存在之中存在具有识别的表位的蛋白、抗原或表位的决定因素。在免疫分析情况下，特异性免疫反应性抗体可结合具有识别的表位的蛋白，即使结合样品中存在的没有表位的蛋白，也是在可检测的更低程度上结合。在体内情况下，"特异性免疫反应性"可指这样的条件，在此条件下动物形成针对疫苗或抗原的免疫应答，例如对抗原的体液应答(针对免疫反应性条件下所呈递疫苗、蛋白、化合物或抗原的抗体的产生)或细胞介导的应答(也蛋白、化合物或抗原的应答)。本文使用的术语"免疫反应性条件"是在免疫分析情况下或体外反应中使用的，其中提供或调节了反应的物理条件以便能够将关联抗体结合到抗原上，这些物理条件包括例如温度、盐浓度、pH、试剂及其浓度、以及抗原和对抗原有特异免疫反应性的关联抗体的浓度。免疫反应性条件取决于抗体结合反应的模式，典型地是免疫分析实验方案中所利用的那些。参见HarlowandLane(1988)Antibodies:ALaboratoryMa腿l，ColdSpringHarborPublications,NewYork,对于免疫分析才莫式和条件的描述。本文使用的术语"患者"或"受试者"包括哺乳动物(例如人和动物)。抗体本发明涉及结合MN的抗体。这些抗体对于各种治疗和诊断目的可能是有用的。本领域技术人员一般都将理解的是，抗体选择性和结合亲和力的最关键决定因素是互补决定区(CDR)的序列和由此产生的构象。大多数抗体含有六个CDR,重链可变区(VH)中三个，轻链可变区(VL)中三个。VH和VL中的CDR之间的间插序列是定l吏CDR定向的构架区。CDR共同形成了抗体中的抗原结合位点。已经在抗体人源化和抗体优化方法中对这些CDR在决定抗体功能性质方面的关键作用进行了长期探索。在前一方法中，将来自单克隆抗体例如小鼠抗体的CDR转移到相似构架设计的人抗体中，从而产生具有同样功能性质的但是在人体中的免疫原性减弱的抗体。根据已经成功商业化为人体治疗剂的人源化抗体的数量，该方法的成功是明显的，这些治疗剂包^^赫赛汀⑧(司4走曼布，Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,CA)、Synagis(palivizumab,Medimmune,Inc.,Gaithersburg,MD)、Campath(alemtuzumab,GenzymeOncology,Cambridge,MA)、Zenapax(daclizumab,RochePharmaceuticlas,Nutley,NJ)、Xolair(omalizumab,Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,CA)、Raptiva(efalizumab,Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,CA)、阿瓦斯丁⑧(贝4戈单^:,Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,CA)以及Mylotarg(gemtuzumabozogamicin,Wyeth-Ayerst,Madison,NJ)。其它例子已经描述于Smger,etal.,(J.Immunol,150:2844-2857,1993);Luo,etal.,(J.ImmunolMeth.,275:31-40,2002);以及Kostelny,etal.,(Int.J.Cancer93;556-565,2001)中。抗体优化方法集中于通过CDR序列的特殊改变来改善抗体选#^生或结合亲和力。在抗体开发领域中所公认的是，CDR编码治疗和诊断用途所需的结合亲和力和选择性，也可使用这些CDR来将这些期望的功能性质赋予给大范围的各种备选抗体构架，这可以使用本领域技术人员已知的标准程序进行。也可能通过将抗体CDR架接到其它具有免疫球蛋白样折叠的蛋白上以转移抗体结合活性，所述蛋白诸如免疫球蛋白超家族中的其它蛋白以及具有与免疫球蛋白相似的折叠的非免疫球蛋白(Nicaise,etal.,ProteinScience13:1882-1891,2004)。本发明打算包括任何已知的或合适的用于制备本发明的抗体和结合抗原的抗体片段的技术。例如，噬菌体展示技术对于获得本发明的高亲和力抗MN抗体或结合抗原的抗体片段来说是有用的，它们用于诊断和/或治疗MN相关病症诸如MN相关癌症的用途中。被称为亲和力成熟的技术采用诱变或者CDR步移和重选择，其使用MN抗原来鉴别以比初始抗体或亲本抗体更高的亲和力结合抗原的抗体(参见例如Glaseretal.,1992,J.Immunology149:3903)。诱变整个密码子而不是单个核苦酸产生了氨基酸突变的半随机文库。可构建由一组变体克隆所组成的文库，每一克隆都在单个CDR中相差单个氨基酸改变，并且这些克隆包含代表了每个CDR残基的每个可能氨基酸取代的变体。可通过与含有标记抗原的固定化突变体相接触来筛选对抗原的结合亲和力增加的突变体。可使用本领域已知的任何筛选方法来筌定对抗原的亲和力增加的突变抗体(例如ELISA)(参见Wuetal.,1998,ProcNatl.Acad.Sci.USA95:6037;Yeltonetal.,1995,丄Immunology155:1994,引入作为参考)。也可使用CDR步移来随机化轻链(参见Schieretal.,1996,J.Mol.Bio.263:551，引入作为参考)。在特定实施例中，MorphoSysAG(德国)提供了可用于产生全人抗体的噬菌体-抗体技术。MorphosysHuCALGOLD文库提供了许多优于该技术早期版本的改进(Knappik,etal.,J.Mol.Biol.296:"-86,2000,引入作为参考)，包括Rauchenberger,etal.,(J.Biol.Chem.278:38194-38205，2003,引入作为参考)所描述的HuCAL-Fab1文库。象早期版本一样，HuCALGOLD加入了人抗体设计，其描述人共有构架序列和模拟天然人序列多样性的CDR可变性才莫式。然而，HuCALGOLD中的多样性延伸到了包括六种抗体CDR。而且，通过CysDisplayTM特征增加了高亲和力4元体的回4史(KretzschmarandvonRuden,Curr.Opin.Biotechnol.13:598-602,2002)。用该才支术产生的抗体显示了免疫原性可能性的才及大降低。噬菌体展示技术，诸如可从Morphosys获得的那些，是本领域已知的，可进一步参考BoehnckeWHetal.，BrJDermatol.(2005),Nov;153(5):1092;SimonMoroneyetal.,ModernBiopharmaceuticals;编者J.KnaebleinWiley-VCHVerlag(2005);alfOstendorpetal.,抗体(Antibodies),第2巻:確斤才支术禾口治疗用途(Noveltechnologiesandtherapeuticuse),p.13-52,(2004),KluwerAcademic/PlenumPublishers,NewYork;R.Rauchenbergeretal.,JBiolChem.,(2003),Oct3,278(40):38194-38205;T.Kretzschmaretal.，CurrOpinBiotechnol.,(2002),Dec,13(6):598-602;KrebsBetal,JImmunolMethods,(2001),Aug1,254(1-2);M.Margetetal.,TissueAntigens,(2000),56:1-9;A.Knappiketal.,J.MolBiol.,(2000),Feb11,296(1):57-86;以及A.Pltickthunetal.,Immunotechnology,(1997),Jun;3(2):83-105，每一篇都整体引入本文作为参考。作为例子，可以使用MorphoSys技术鉴别具有MN结合活性和细胞粘附中和活性的抗体。可将MN蛋白包一支在农i量滴定板上或者i兹珠上，与MorphoSysHuCAL-GOLDFab噬菌体文库保温。可将不结合MN的噬菌体连接的Fab从平板上冲洗掉，只留下结合MN的噬菌体。可通过加入碌u醇还原试剂诸如二石危苏糖醇(DTT)导致连接抗体与噬菌体的二碌J建裂解从而将结合的噬菌体洗脱下来。可以用表达结合MN的抗体片段的噬菌体富集所回收的噬菌体群，可以通过感染大肠杆菌宿主进行扩增。可以使用富集的噬菌体群重复该淘选过程以进一步富集结合MN的噬菌体连接的抗体群。然后可使用标准克隆技术将编码Fab的基因序列切下来，转移到表达载体，诸如细菌(例如大肠杆菌)表达载体或者哺乳动物表达载体中，将载体用来转化宿主细胞系，诸如CHO或大肠杆菌表达细胞系。然后就可以表达并纯化来自富集的集合的Fab。备选地，可以使用MN表达细胞作为抗原进行淘选。例如，可用生物素标记转染了MN抗原的细胞。然后可将这些转染细胞与未标记的、未转染MN的细月包进行混合，标记的与未标记的比例为1:10。将噬菌体文库加入到细胞中，生物素化，用结合了链霉亲和素的磁珠捕获带有MN的细胞，该磁珠被结合到磁铁上。将非特异性的噬菌体冲洗掉，通过去除磁场将带有MN的细胞特异性洗脱下来。然后可将这些特异性结合的噬菌体扩增，进行另外几轮的细胞淘选，或者可用肽和/或蛋白淘选代替。方法是从B细胞中筛选DNA文库，如Dower,etal.,(WO91/17271，引入作为参考)以及McCafferty,etal.,(WO92/01047)(每一篇都整体引入作为参考)所述。在这些方法中，产生了噬菌体文库，其中的成员在其外表面上展示了不同抗体。抗体通常展示为Fv或Fab片段。通过亲和富集选择噬菌体展示抗体，用于结合所选蛋白。在噬菌体展示方法的变型中，可生产具有所选鼠抗体结合特异性的人抗体(例如WO92/20791,引入作为参考)。在该方法中，可以使用所选鼠抗体(例如5C7.29)的重链或轻链可变区作为起始材料。例如如果选择轻链可变区作为起始材料，就可构建噬菌体文库，其中的成员展示同样的轻链可变区(也就是鼠起始材料)和不同的重链可变区。重链可变区可从重排的人重链可变区文库中获得。选择对蛋白显示出强烈特异性结合(例如至少10nM或至少InM)的噬菌体。然后将来自该噬菌体的人重链可变区用作构建进一步的噬菌体文库的起始材料。在该文库中，每个噬菌体都展示同样的重链可变区(也就是从第一个展示文库鉴定的区域)和不同的轻链可变区。轻链可变区可从重排的人轻链可变区文库中获得。再次选择显示出强烈特异性结合的噬菌体。作为另一个例子，也可4吏用三体瘤(trioma)方法生产抗体。基本方法和用于该方法中的例i正性细月包融合配偶体SPAZ-4已经描述于Oestberg,etal.,(Hybridoma2:361-367,1983;美国专利No.4,634,664,每一篇都引入作为参考)；以及Engleman,etal.,(美国专利No.4,634,666,引入作为参考)。通过该方法获得的产生抗体的细胞系被称为三体瘤，因为它们来自三个细胞——两个人细胞和一个小鼠细胞。最初，将小鼠骨髓瘤SPAZ-4细胞系。然后将异种细胞与免疫过的人B淋巴细胞融合以获得产生抗体的三体瘤细胞系。已经发现三体瘤产生的抗体比由人细胞制备的普通杂交瘤更稳定。从人供体的血液、脾、淋巴结或骨髓中获得B淋巴细胞。通常不希望用蛋白对活的人体进行体内免疫，因为有引起有害应答的风险。因此，通常都是用蛋白(例如MN)或其抗原性片段或含有所述蛋白(如MN)的细胞在体外免疫B淋巴细胞。也可将基本上由结合例证性鼠抗体之一的氨基酸区段所组成的特定表位片段用于体外免疫。典型地将B淋巴细胞在培养基诸如补充10%人血清的RPMI-1640(参见美国专利No.4,634,666)中暴露给抗原7-14天。也可将免疫过的B淋巴细胞通过本领域已知的方法融合到异种杂交细胞诸如SPAZ-4上。例如，可用40-50%的分子量1,000-4,000的聚乙二醇在大约37。C处理细胞大约5-10分钟。可从融合混合物中分离细胞，在选择期望杂种(例如HAT或AH)的培养基中增殖。可通过分析三体瘤培养基对蛋白(例如MN)结合的能力来鉴别可分泌具有所需结合特异性的抗体的克隆，使用的是与上述用于非人抗体同样的方法。可亚克隆能够产生具有期望特异性的人抗体的三体瘤，例如通过限制性稀释技术和在培养基中体外培养。尽管三体瘤是遗传稳定的，但是它们不可能产生极高水平的抗体。表达水平的增加可通过将抗体基因从三体瘤克隆到一种或多种表达载体中，并将载体转化到细胞系中，诸如表达重组或人源化免疫球蛋白的细胞系。也可从非人转基因哺乳动物中生产与蛋白(例如MN)具有交叉反应性的人抗体，该转基因哺乳动物具有编码人免疫球蛋白基因座至少一个区段的转基因。通常，这些转基因哺乳动物的内源免疫球蛋白基因座都是功能上灭活的。人免疫球蛋白基因座区段可包括重链和轻链组分的未重排序列。内源免疫球蛋白基因的失活和外源免疫球蛋白基因的引入都可通过耙向的同源重组或通过引入YAC染色体来实现。由该方法产生的转基因哺乳动物能够功能性重排免疫球蛋白组分序列，表达由人免疫球蛋白基因编码的各种同种型抗体的所有组成成分，不表达内源免疫球蛋白基因。具有这些性质的哺乳动物的生产和性质详细描述于例如Lonberg,etal.,(WO93/12227);以及Kucherlapati，(WO91/10741)(每一篇都整体引入作为参考)。可通过如上所述免疫转基因非人哺乳动物获得交叉反应性MN人抗体。单克隆抗体的制备可通过例如使用常规的Kohler-Milstein技术将来自这些哺乳动物的B细胞融合到合适的骨髓瘤细胞系中(KohlerandMilstein,Nature256:495-497,1975，引入作为参考)。可使用各种免疫策略来获得与蛋白(例如MN)具有交叉反应性的小鼠或其它非人抗体。在一些策略中，可用MN抗原免疫非人动物(通常是非人哺乳动物诸如小鼠)。免疫原可包括稳定转染了MN并在其细胞表面表达MN的纟田月包，以及MN蛋白或含有能够结合到例证性交叉反应性抗体上的这些分子的区段的表位片段。获自被免疫动物的产生抗体的细胞可被永生化，并选择用于产生特异性结合MN的抗体(例如Harlow&Lane，Antibodies,ALaboratoryManual,C.S.H.P.,N.Y.，1988,引入作为参考)。可以使用例如带有第二标记的适当二抗来检测结合。然';:能力:；'、、、本发明也涉及与所选小鼠或其它非人抗体具有相似结合特异性和亲和力的人源化抗体。人源化抗体的形成可通过重组DNA4支术将非人抗体的CDR区(例如CDR1、CDR2和CDR3)连接到人构架区和恒定区(例如Queen,etal.,Proc.Natl.Acad,Sci.USA86:10029-10033,1989;WO卯/07861;每一篇都整体引入作为参考，也就是CDR稼接。这些人源化免疫球蛋白具有基本上来自人免疫球蛋白(称为受体免疫球蛋白)的可变区构架残基和基本上来自小鼠免疫球蛋白(称为供体免疫球蛋白)的互补决定区(CDR)。恒定区，如果有的话，也可基本上来自人免疫球蛋白。原则上，来自任何人抗体的构架序列都可用作CDR稼接的模板。然而，已经证明直接在这种构架上进行CDR替换经常会导致对抗原的结合亲和力的明显丧失(Glaser，etal.,J.Immunol.149:2606,1992);Tempest,etal.,Biotechnology9:266,1992;Shalaby,etal.,J.Exp.Med.17:217,1992)。人抗体与最初鼠抗体的同源性越高，鼠CDR与人构架的结合就越不可能在CDR中引入能够降低亲和力的畸变。因此，建议人源化抗体可变区构架与供体抗体可变区构架之间的同源性(即序列同一性百分比)优选至少大约65%，更优选至少大约75%,还更优选至少大约85%,以及进一步更优选大约95%或大约99%。重链和轻链可变区构架残基可源自相同的或不同的人抗体序列。然而，选自相同人抗体的重链和轻链构架序列降低了两条链组装不兼容的体的共有序列(例如WO92/22653,引入作为参考)。根据对CDR构象和/或结合抗原的可能影响，可选择人可变区构架残基的某些氨基酸进行取代。这些可能影响的分析可通过模拟、检验特定位置的氨基酸性质，或者对特定氨基酸的取代或诱变功效进行经验性观察来实现。例如，当鼠可变区构架残基和所选人可变区构架残基之间的氨基酸35不同时，人构架氨基酸就可被来自小鼠抗体的等效构架氨基酸所取代，这时可合理地预期该氨基酸(1)直接接触抗原，(2)在序列中与CDR区相邻，或者(3)以其它方式与CDR区相互作用(例如在CDR区的4-6A之内)。其它取代候选物是例如在那个位置上对人免疫球蛋白来i兑是不常见的受体人构架氨基酸。这些氨基酸可用来自供体抗体的等同位置的氨基酸或来自更典型人免疫球蛋白的等同位置的氨基酸进行取代。人源化免疫球蛋白可变区构架可显示出与人可变区构架序列或这些序列的共有序列例如至少优选大约85%的序列同一性，更优选至少大约90%的序列同一性，还更优选至少大约95%的序列同一性，以及更优选至少大约99%的序列同一性。本发明也涉及双特异性或双功能性抗体，它们具有特异性结合蛋白(例如MN)的一个结合位点以及特异性结合第二部分的第二结合位点。在双特异性抗体中，一个重链和轻链对通常来自例如MN结合抗体，另一对来自针对另一表位而产生的抗体。这产生了多功能性价，也就是同时结合至少两种不同表位的能力。结合分析描述本发明的抗体或抗体片段与本发明的抗原(MN蛋白)之间的结合强度(或亲和力)的任何有用方法都可以使用。例如，可通过本领域已知的标准动力学分析方法确定离解常数Kd(Kd=k2/kl=[抗体][抗原]/[抗体-抗原复合物])。本领域普通技术人员将理解的是，离解常数指示了抗体和抗原之间的结合强度，它是依据分开复合物的容易程度。如果需要高浓度的抗体和抗原来形成复合物，结合强度或结合亲和力就低，产生较高的Kd。由此可见，Kd越小(表示为浓度单位，例如摩尔或纳摩尔)，结合就越强。可通过各种已知技术和免疫分析法分析和/或测定亲和力，包括例如酶联免疫特异性分析(ELISA)、双分子相互作用分析(BIA)(例如SjolanderandUrbaniczky,Anal.Chem.63:2338-2345,1991;Szabo,etal.,Curr.Opm.Struct.Biol.5:699-705，1995,每一篇都引入本文作为参考)以及用于定量抗体对表达MN的细胞的结合的荧光激活细胞分选(FACS)。BIA是用于实时分析生物特异性相互作用的技术，不标记任何反应物(例如BIAcoreTM)。BIAcore是基于确定生物分子之间，诸如本发明的抗体和MN蛋白抗原之间的实时反应中的光学现象表面等离子共振(SPR)。关于BIAcore技术的参考文献可进一步在美国已公布申请No:2006/0223113、2006/0134800、2006/0094060、2006/0072115、2006/0019313、2006/0014232和2005/0199076中找到，每一篇都整体引入本文作为参考。特异性结合蛋白(例如MN)的本发明的抗体或结合抗原的抗体片段提供了检测信号，例如，当与免疫化学分析中使用的其它蛋白提供的检测信号相比时，优选至少大约高5倍、更优选至少大约高10倍、以及还更优选至少大约高20倍。同样地，这些抗体也可用于从溶液中免疫沉淀蛋白(例如MN)。可通过本领域已知的任何合适方法分析本发明的抗体和片段的免疫特异性结合(或者本文所定义的"特异性免疫反应性"的结合)。涉及抗体和抗原的分析被称为"免疫分析"，在本发明中可使用来表征本发明的抗体和抗原。可使用的免疫分析，包括但不限于竟争性和非竟争性分析系统，使用的技术仅举几个例子诸如蛋白印迹、放射免疫分析、ELISA(酶联免疫吸附分析)、"夹心"免疫分析、免疫沉淀分析、沉淀反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散分析、凝集分析、补体结合分析、免疫放射分析、荧光分析、蛋白A免疫分析。这些分析方法是本领域常规的禾口/>^口的(参见例》口Ausubeletal.,eds,1994,CurrentProtocolsinMolecularBiology,Vol.1,JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,整体引入本文作为参考)，不需要过度实验就可进行。例证性的免疫分析在下文简要描述(但是不打算用限定的方式)。免疫沉淀实验方案通常包括在裂解緩沖液诸如补充了蛋白磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(例如EDTA、PMSF、抑酶肽、钒酸钠)的RIPA緩冲液(1%NP-40或TritonX-IOO，1%脱氧胆酸钠，0.1%SDS,0.15MNaCl,pH7.2的0.01M磷酸钠，1%Trasylol)中裂解细胞群，将感兴趣的抗体加入到细胞裂解物中，在4。C保温一段时间(例如14小时)，将蛋白A和/或蛋白G琼脂糖珠加入细胞裂解物中，在4。C保温大约一小时或更久，在裂解緩沖液中漂洗珠，将珠重悬浮在SDS/样品緩冲液中。感兴趣的抗体免疫沉淀特定抗原的能力可通过例如蛋白印迹进行分析。本领域技术人员将明白能够修改以增加抗体对抗原的结合并降低背景的参数(例如预先清除带有琼脂糖珠的细胞裂解物)。关于免疫沉淀实验方案的进一步探讨参见例如Ausubeletal.,eds,1994,CurrentProtocolsinMolecularBiology,Vol.1,JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork第10.16.1,引入本文作为参考。蛋白印迹分析通常包括制备蛋白样品，在聚丙烯酰胺凝胶(例如8%、20%SDS-PAGE,根据抗原的分子量)中电泳蛋白样品，将蛋白样品从聚丙烯酰胺凝胶转移到诸如硝酸纤维素、PVDF或尼龙的膜上，在封闭液(例如带有3%BSA或脱脂奶的PBS)中封闭膜，在漂洗緩冲液(例如PBS-Tween20)中漂洗膜，用在封闭緩冲液中稀释的一抗(感兴趣的抗体)封闭膜，在漂洗緩冲液中漂洗膜；用在封闭緩冲液中稀释的缀合到酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(例如32P或I25l)上的二抗(它识別一抗，例如抗人抗体)封闭膜，在漂洗緩冲液中漂洗膜，以及检测抗原的存在。本领域技术人员将明白能够修改以增加检测信号并降低背景噪声的参数。关于蛋白印迹实验方案的进一步探讨参见例如Ausubeletal.,eds,1994,CurrentProtocolsinMolecularBiology,Vol.1,JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork第10.8.1,引入本文作为参考。ELISA典型地包括制备抗原，用抗原包被96孔樣i量滴定一反的孔，将缀合到可检测化合物诸如酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)上的感兴趣的抗体加入到孔中，保温一段时间，以及冲企测抗原的存在。在ELISA中，感兴趣的抗体不必缀合到可检测化合物上；而是可将缀合到可检测化合物上的二抗(它识别感兴趣的抗体)加入到孔中。此外，不用抗原包被孔，而是可将抗体包被到孔中。在这种情况下，可在感兴趣的抗原加入到包被的孔之后将缀合到可检测化合物上的二抗加入。本领域技术人员将明白能够修改以增加检测信号的参数，以及将明白本领域已知的其它ELISA变型。关于ELISA的进一步探讨参见例如Ausubeletal.,eds,1994,CurrentProtocolsinMolecularBiology,Vol.1,JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork第11.2.1,引入本文作为参考。一方面，本发明包括许多具有MN结合特性的不同抗体，它们是通过筛选MorphoSysHuCALGOLDFab文库而鉴别到的。在本发明的一方面，鉴别到了人抗体VH区三个CDR的氨基酸序列(SEQIDNO:57-85;图2)。在本发明的另一实施方案中，鉴别了人MN抗体VL区的三个CDR的氨基酸序列(SEQIDNO:86-112，图2)。本发明也涉及CDR、构架和VH/VL对的组合。这些组合的例子示于图3(SEQIDNO:113-132用于编码核酸序列)和图4(SEQIDNO:133-152用于蛋白序列)。具有MN结合性的抗体也示于图4中。筛选方法的细节在本文所述的实施技术人员可预见的，并用于鉴别人MN抗体。本发明的抗体和/或结合抗原的抗体片段也可从表达抗体的任何细胞中纯化得到，包括已经转染了编码抗体的表达构建体的宿主细胞。可将宿主细胞培养在抗体可表达的条件下。可使用本领域公知的方法将纯化的抗体和/或结合抗原的抗体片段与细胞中可能与抗体结合的其它细胞组分诸如某些蛋白、碳水化合物或脂分开。这些方法包括但不限于大小排阻层析、硫酸铵分级分离、离子交换层析、亲和层析和制备凝胶电泳。制剂纯度可通过本领域已知的任何手段进行分析，诸如SDS-聚丙烯酰胺凝月交电泳。纯化抗体的制剂可含有一种以上的抗体(例如具有MN结合和中和特性的抗体)。备选地，抗体的生产可使用化学方法来合成它的氨基酸序列或抗体序列的一部分(诸如CDR序列)，诸如通过使用固相技术指导肽合成(例如Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154,1963;Roberge,etal.,Science269:202-204,1995,每一篇都引入本文作为参考)。蛋白合成可使用手动技术或通过自动化来进4亍。自动合成可4吏用例如AppliedBiosystems431A肽合成仪(PerkinElmer)来实现。任选地，抗体片段可单一旦例如通过本文描述的任一方法，例如包括通过抗体生产(例如动物免疫方法)、单克隆生产的常规方法或者通过重组DNA手段鉴别到或获得了根据本发明的抗体或片段，那么就可优选进行进一步的步骤来表征和/或纯化和/或修饰抗体。例如，制备免疫反应性抗体片段或者制备所鉴别的期望抗体的纯化的高滴度组合物，或者测试所鉴别抗体或其片段的免疫活性都是理想。本发明包括用于表征、纯化或分析本发明抗体的任何已知的和合适的方法，可以预期的是，本发明所属
技术领域：
的普通技术人员将具有必需水平的技术知识和资源，例如技术手册或论文，以实现对本发明抗体的任何进一步的表征、纯化和/或分析，而不需要过度实验。在特定方面，本发明的抗体和/或抗体片段可从重组细胞培养物中回收并纯化，其通过公知的方法包括但不限于蛋白A纯化、碌iJ臾4妄或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析以及凝集素层析。也可采用高效液相层析("HPLC")进行纯化。参见例如Colligan，CurrentProtocolsinImmunology或CurrentProtocolsinProteinScience,JohnWiley&Sons,NY,N.Y.,(19972001),例如第1、4、6、8、9、10章，每一篇都整体引入本文作为参考。在抗体情形下的术语"分离，，是指本领域纯化抗体的任何已知方法。用于纯化抗体的方法是本领域公知的，本发明包括技术人员已知的且不需要过度实验的任何合适方法。例如层析法，诸如免疫-亲和层析(固定化配体结合并捕获感兴趣的抗体)、亲和层析、蛋白沉淀、离子交换层析、疏水相互作用层析、大小排阻层析，以及电泳，它们都可在技术文献中找到描述，例如MethodsinEnzymology,第182巻，GuidetoProteinPurification,Eds.J.Abelson，M.Simon,AcademicPress,1stEdition,1990,将其引入本文作为参考。这样，用于进行这些纯化步骤诸如层析步骤的合适材料都是本领域技术人员已知的。这些方法都适合于纯化根据如本文所述发明的任何抗体、抗原或其片段。某些实施方案可能需要从宿主细胞或其一部分中纯化或分离所表达的蛋白或抗体或其片段。用于从转化宿主细胞中分离重组蛋白的常规程序是本发明所打算包括的。这些方法包括例如分离感兴趣的蛋白或片段，其通过首先从细胞沉淀或从细胞培养基中提取，接着通过盐析，可使用一个或多个层析步骤，包括含水离子交换层析、大小排阻层析步骤，高效液相层析(HPLC),以及亲和层析来分离重组蛋白或片段。用于蛋白纯化的程序指南可在技术文献中找到，包括例如MethodsinEnzymology,第182巻,GuidetoProteinPurification,Eds.J.Abelson,M.Simon，AcademicPress,1stEdition,1990,已经引入作为参考。可通过制备性高效液相层析充分纯化化学合成分子(参见例如Creighton,Proteins:StructuresandMolecularPrinciples,WHFreemanandCo.,NewYork,N.Y.,1983,引入本文作为参考)。合成多肽的组成可通过氨基酸分析或测序(例如^f吏用Edman降解)来确认。多核苦酸另一方面，本发明涉及编码本发明的抗体(例如4元MN的抗体)或结合抗原的抗体片段的多核苷酸。这些多核苷酸可用于例如生产大量抗体用于治疗或诊断用途，或者生产抗体或片段的样品用于本发明的免疫分析用途。可用于编码例如抗体VH区中三种CDR每一种的多核苷酸由SEQIDNO:l-29所描述。可用于编码例如抗体VL区中三种CDR每一种的多核苷酸由SEQIDNO:30-56所描述。编码例如抗体的完整重链和轻链可变区的多核苷酸由SEDIDNO:l13-132所描述(图3)。本发明的多核苷酸也可分离自宿主细胞，不存在根据现有技术中任何已知或合适方法的其它细胞组分诸如膜组分、蛋白和脂。可使用标准核酸纯化技术分离多核苷酸，或者使用扩增技术诸如聚合酶链式反应(PCR)合成或通过使用自动合成仪合成多核苷酸。分离多核苷酸的方法是常规的，它们是本领域已知的。可以使用获得多核苷酸的任何这种技术来获得编码本发明抗体的分离的多核苷酸。例如，可使用限制酶和探针来分离编码抗体的多核苦酸。可使用mRNA作为才莫板，以标准分子生物学技术制备编码抗体的cDNA分子。然后，可以复制cDNA分子，使用的是本领域已知的和手册诸如Sambrook,etal.,(MolecularCloning:ALaboratoryManual,(SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress;ColdSpringHarbor,N.Y.;1989,Vol.1-3,引入本文作为参考)中披露的分子生物学技术。可以使用扩增技术诸如PCR来获得多核苷酸的其它拷贝。备选地，可使用合成化学技术来合成编码本发明抗体的多核苷酸。遗传密码的筒并性使得能够合成备选核苷酸序列，它们将编码具有例如VH-CDR1、VH-CDR2、VH隱CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3、完整VH或完整VL氨基酸序列(例如SEQIDNO:57-112和133-152)之一的抗体。为表达编码抗体的多核苷酸，可将多核苷酸插入到含有转录和翻译所插入编码序列的必需元件的表达载体中。可使用本领域技术人员公知的方法来构建含有编码抗体的序列以及合适的转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA4支术、合成冲支术以及体内遗传重组。这些4支术描述于例如Sambrook,etal.(1989)和Ausubel,etal.,(CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork,41N.Y.,1995,引入本文作为参考)中。可利用各种表达载体/宿主系统来包含和表达编码抗体的序列。它们包括但不限于微生物，诸如重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；酵母表达载体转化的酵母；感染了病毒表达载体(例如杆状病毒)的昆虫细胞系统；病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV;烟草花叶病毒，TMV);或者细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统，或者动物细胞系统。控制元件或调节序列是载体的非翻译区，即增强子、5'和3'非翻译区，它们与宿主细胞蛋白相互作用以执行转录和翻译。这些元件在强度和特异性方面可以不同。根据所采用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的合适转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。例如，当在细菌系统中克隆时，可使用诱导型启动子诸如BLUESCRIPT噬菌粒(Stratagene,LaJolla，Calif.)、pSPORTl质粒(LifeTechnologies)的杂合lacZ启动子等等。在昆虫细胞中可使用杆状病毒多角体蛋白。可将源自植物细胞基因组(例如热休克蛋白、RUBISCO和贮存蛋白基因)的启动子或增强子或者源自植物病毒的启动子或增强子(例如病毒启动子或前导序列)克隆到载体中。在哺乳动物细胞系统中，可使用来自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子，例如CMV启动子。如果有必要产生包含编码抗体的核苷酸序列的多个拷贝的细胞系，就可以使用带有合适的选-棒标记的基于SV40或EBV的载体。因此，本发明也涉及包括本发明分离核酸分子(例如SEQIDNO:113-132的重链和轻链可变区)的重组载体，用重组载体遗传工程化的宿主细胞，以及本发明重组抗体或其片段的生产和/或表达。表达构建体可进一步含有转录起始位点、终止位点以及位于转录区的用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录物的编码部分可进一步包括开头的翻译起始密码子和恰当地位于待翻译mRNA末端的终止密码子(例如UAA、UGA或UAG),对于哺乳动物或真核细月包表达来说优选UAA和UAG。表达载体也可包括至少一种选择标记。这些标记包括但不限于哺乳动物细胞标记，诸如氨甲喋呤(MTX)、二氢叶酸还原酶(DHFR)(参见例如美国专利No.4，399,216;4,634，665;4,656,134;4,956,288;5,149,636和5,179,017，每一篇都引入作为参考)、氨千青霉素、新霉素(G418)、霉酚酸或谷胺酰胺合成酶(GS)(参见例如美国专利No.5,122,464;5，770,359;5,827,739,每一篇都引入作为参考)，以及细菌细胞标记，诸如四环素或氨千青霉素抗性基因。用于上述宿主细胞的合适培养基和培养条件是本领域已知的。合适的载体对于技术人员来说将是显而易见的。可以利用任何合适的已知方法来将本发明的DNA,例如含有SEQIDNO:l13-132的一种或多种抗体编码序列的DNA载体引入到宿主细胞中。一些已知方法包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂介导的转染、电穿孔、转导、转染或者其它已知方法。这些方法描述于现有才支术中，诸如Sambrook，etal.,(MolecularCloning:ALaboratoryManual,(SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress;ColdSpringHarbor,N.Y.;1989)Vol.1-3,第14、16和18章)。分的核酸的多种表达系统方面是了如指掌的。物细胞。哺乳动物细胞系统经常将是单层细胞的形式，尽管也可使用哺乳动物细胞悬浮液或生物反应器。现有技术中已经发展了多种能够表达完整糖基化蛋白的合适细胞系，包括CHO、CHO-S、COS-1(例如ATCCCRL1650)、COS-7(例如ATCCCRL-1651)、HEK293、BHK21(例如ATCCCRL-10)、CHO(例如ATCCCRL1610)和BSC-1(例如ATCCCRL-26)细胞系、Cos-7细胞、CHO纟田胞、hepG2细胞、P3X63Ag8.653、SP2/0-Agl4、293纟田胞、HeLa细胞等等，它们都很容易从例如美国典型培养物保藏中心获得。用于这些细胞的表达载体可包括一种或多种下列表达控制序列，例如4旦不限于复制起点；启动子(例如晚期或早期SV40启动子、CMV启动子(例如美国专利No.5,168,062;5,385,839)、HSVtk启动子、pgk(磷酸甘油激酶)启动子、EF-1a启动子(美国专利No.5,266,491)、免疫球蛋白启动子；增强子，和/或加工信息位点诸如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点(例如SV40大T抗原聚腺苷酸添加位点)，以及转录终止子序列。适用于生产本发明核酸或蛋白的其它细胞是已知的，和/或可从例如美国典型微生物保藏中心细胞系和杂交瘤目录或者其它已知的或商业来源获得。当采用真核宿主细胞时，可将聚腺苷酸化序列或转录终止子序列引入载体中。终止子序列的例子是来自牛生长激素基因的聚腺苷酸化序列。也可包括用于转录物的精确剪接的序列。剪接序列的例子是来自SV40(Sprague,etal.,丄Virol.45:773781(1983))的VP1内含子。此外，可将控制宿主细胞中的复制的基因序列？I入到载体中，如现有技术中已知的那样。包括BergerandKimmel(GuidetoMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzvmologv,Vol.152,AcademicPress,Inc.);Sambrook,etal.,(MolecularCloning:ALaboratoryManual,(SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress;ColdSpringHarbor,N.Y.;1989)Vol.1-3);CurrentProtocolsinMolecularBiology,(F.M.Ausabeletal.[Eds.],CurrentProtocols,ajointventurebetweenGreenPublishingAssociates,Inc.andJohnWiley&Sons,Inc.(supplementedthrough2000》；Harlowetal.,(MonoclonalAntibodies:ALaboratoryManual-ColdSpringHarborLaboratoryPress(1988),Paul[Ed.]);FundamentalImmunologv、(LippincottWilliams&Wilkins(1998));以及Harlow,etal.,(UsingAntibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1998》，所有的都引入本文作为参考。在另一实施方案中，本发明也涉及用定量免疫分析测定患者样品中的MN蛋白水平。为用在本发明的方法中，可对许多形式进行适应性改变。例如，患者样品中MN蛋白的检测和定量可通过酶联免疫吸附分析、放射免疫分析、双抗体夹心分析、凝集分析、荧光免疫分析、免疫电镜和扫描显樣i术进行，以及本领域通常已知的其它分析法。可通过本领域已知的常规方法对这些分析法中的MN蛋白定量进行适应性改变。在一个实施方案中，循环MN蛋白水平的连续变化可通过夹心分析法检测和定量，其中使用常规技术将捕获抗体固定在支持物表面上。合适的支持物包括例如合成的聚合物支持物，诸如聚丙烯、聚苯乙烯、取代的聚苯乙烯、聚丙烯酰胺(诸如聚酰胺和聚氯乙烯)，玻璃珠，琼脂糖以及硝酸纤维素。可用在本发明方法中的ELISA夹心免疫分析法的例子是使用小鼠抗人MN单克隆抗体作为捕获抗体，生物素化的山羊抗人MN多克隆抗44体作为检测抗体。捕获单克隆抗体被固定在微量滴定板的孔上。将稀释的血清/血浆样品或MN标准(重组野生型MN蛋白)在孔中保温以4吏得MN抗原能够被捕获单克隆抗体结合。漂洗孔之后，将固定化的MN抗原暴露给生物素化的检测抗体，之后再次漂洗孔。然后加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物。最后的漂洗之后，将TMB蓝底物加入到孔中以检测结合的过氧化物酶活性。通过加入2.5N碌^酸终止反应，测定450nm的吸光度。样品与MN标准的吸光度数值的关联能够确定血清或血浆中MN的以pg/ml为单位的定量值。适用于筌别MN蛋白的抗体可以以任何常规方式进行标记。标记的例子是辣根过氧化物酶，标记抗体的方法的例子是通过使用生物素-链霉亲和素复合物。适当的时候，本发明的免疫分析中使用的用作示踪剂的抗体可以以任何方式进行直接或间接标记，从而产生可见的或能够变得可见的信号。可检测标记物质包括放射性核素，诸如3H、1251和mI;荧光剂，诸如异硫氰酸荧光素和其它荧光染料、藻胆蛋白、藻红蛋白、稀土金属螯合物、得克萨斯红、丹磺酰和罗丹明；比色试剂(色原)；电子不透性材料，诸如胶体金；生物发光剂；化学发光剂；染料；酶，特别是诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氩酶、乙酰胆石咸酯酶、a-半乳糖苦酶、卩-半乳糖苦酶；辅酶；酶底物；酶辅因子；酶抑制剂；酶亚基；金属离子；自由基；或者提供检测或测定所形成免疫复合物之存在或量的手段的任何其它免疫活性物质或惰性物质。酶底物组合的例子是辣根过氧化物酶和四曱基联苯胺(TMB),以及碱性磷酸酶和磷酸对硝基苯酯(pNPP)。根据本发明的其它检测和定量系统产生发光信号，其是生物发光(BL)或化学发光(CL)。在化学发光(CL)或生物发光(BL)分析中，测定密度或总发光，将其与未知分析物的浓度进行关联。可使用光度计(光电倍增管作为检测器)或电荷耦合器件定量测定光或者通过照相胶片或X-射线胶片定性测定光。使用这些分析法的主要优点在于它们的简单性和分析灵敏度，使得能够检测和/或定量极少量的分析物。例证性的发光标记是吖啶铺酯(acridmmmester)，丫啶铺磺酰曱酰胺(acridiniumsulfonylcarboxamide),鲁米i若，伞开j花内酉旨(umbelliferone),异鲁米诺书亍生物，发光蛋白诸如水母发光蛋白以及来自萤火虫、海洋细菌、海荧属和海鳃属的荧光素酶。鲁米诺可任选与增强剂分子一起使用，诸如4-碘苯酚或4-羟基肉桂酸。典型地，通过用氧化剂在碱性条件下处理来产生CL信号。另外的发光检测系统是那些通过底物上的酶反应产生信号(可检测标记)的系统。已经发展了CL和BL检测方案用于分析特别是碱性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氳酶、辣根过氧化物酶(HRP)和黄噤吟氧化酶标记。AP和HRP是两种能够通过一系列CL和BL反应定量的酶标记。例如，AP可与底物诸如金刚烷基-l,2-二氧杂环丁烷芳基石粦酸酯底物(例如AMPPD或CSPD;Kricka,L丄，"ChemiluminescenceandBioluminescence,Analysisby,"MolecularBiologyandBiotechnology:AComprehensiveDeskReference(ed.R.A.Meyers)(VCHPublishers;N.Y.,N.Y.;1995))—起使用；例如，4-甲氧基-4-(3-磷酸苯基)-螺-[1,2-二氧杂环丁乙烷-3,2，-金刚烷]的二钠盐，带有或不带增强剂分子诸如l-(三辛基辚甲基)-4-(三丁基辚曱基)-二氯苯。HRP可与底物诸如2，,3，，6，-三氟苯基-甲氧基-10-甲基9,10-二氬化吖啶-9-羧酸酯一起使用。可适应性修改CL和BL反应，不但可用于分析酶，也可用于分析其它底物、辅因子、抑制剂、金属离子等等。例如，鲁米诺、萤火虫荧光素酶和海洋细菌荧光素酶反应是分别用于过氧^i物、ATP和NADPH的产生或消碑毛的指示剂反应。它们可与涉及氧化酶、激酶和脱氬酶的其它反应相偶联，可用于测定偶联反应的任何组分(酶、底物、辅因子)。可检测标记可直接或间接地连接到本发明分析法中所使用的抗体上。可才企测标记的间接连4妻的例子是4吏用抗体和标记之间的结合对或者使用信号放大系统。可用于将抗体连接到可检测标记上的结合对的例子是生物素/抗生物素蛋白，链霉亲和素，或者抗生物素；亲和素/抗亲和素；曱状腺素/结合曱状腺素的球蛋白；抗原/抗体；抗体/抗抗体；碳水化合物/凝集素；半抗原/抗半抗原的抗体；染料和疏水分子/疏水蛋白结合位点；酶抑制剂，辅酶或辅因子/酶；多核酸/同源多核酸序列；焚光素/抗萸光素；二硝基苯酚/抗二硝基苯酚；维生素B12/内因子；可的松，氢化可的松/氬化可的松结合蛋白；以及特定受体蛋白/膜结合的特定受体蛋白的配体。用于将标记直接或间接连接到抗体的各种手段是现有技术中已知的。例如，标记可共价或非共价结合。例证性的抗体缀合方法描述于46Avarmeas,etal.,Scan.J.Immunol.8(Suppl.7):7,1978);Bayer,etal.,Meth.Enzymol.62:308,1979;Chandler,etal.,J.Immunol.Meth.53:187,1982;EkekeandAbuknesha,J.SteroidBiochem.11:1579,1979;EngvallandPerlmann,J.Immunol.109:129,1972;Geoghegan,etal.,Immunol.Comm.7:1,1978;以及WilsonandNakane,ImmunofluorescenceandRelatedTechniques,Elsevier/NorthHollandBiomedicalPress;Amsterdam(1978),，每一篇都引入本文作为参考。根据标记的性质，可采用各种技术来检测和定量标记。对于荧光剂来说，大量荧光计是可获得的。对于化学发光剂来说，光度计或胶片是可获得的。对于酶来说，可以使用荧光计、光度计、分光光度计或者目测确定或测定焚光、化学发光或有色产物。具有吖啶铩、苯并吖啶铩或9,10-二氢化吖啶型杂环系统的各种类型的化学发光化合物是标记的其它例子。吖啶铩酯的例子包括具有杂环或环系统的那些化合物，其含有正氧化态的的杂原子包括诸如吖啶铩、苯并[a]吖啶锑、苯并[b]吖啶f翁、苯并[c]吖啶铩、苯并咪唑阳离子、喹啉争翁、异喹啉铩、喹嗪锑、环取代的喹啉锑、菲啶铩以及喹喔啉铩这样的环系统。示踪剂的制备可通过将吖啶锑或苯并吖啶铺酯上存在的活性官能团直接或间接连接到所选抗体上，如本领域技术人员所公知的那样(参见例如Weeks,etal.,Clin.Chem.29(8):1474画1479,1983)。化合物的例子是在芳基环的对位或间位存在芳基环离去基团和活性官能团的吖啶铩和苯并吖啶铩酯(例如美国专利No.4,745,181和WO94/21823,引入本文作为参考)。使用方法术语"处理"包括任何的过程、作用、应用、治疗等等，其中受试者(或患者)，包括人，被给予了目的在于直接或间接改善患者状况、或者减緩患者状况或病症进展、或者改善所治疗中的疾病或病症的至少一种症状的医学救助。术语"联合治疗"或"共治疗"意指给予两种或更多种治疗剂来治疗疾病、状况和/或病症。这种给药包括以基本上同时的方式共同给予两种或更多种治疗剂，诸如具有固定比例活性组分的单个胶嚢或者用于每种抑制剂的多个分开的胶嚢。此外，这种给药包括以连续方式使用每种类型的治疗剂。两种或更多种连续共同给予治疗剂的给药顺序不受限制。用语"治疗有效量"意指每种所给药试剂的量将达到改善疾病、状况和/或病症的严重程度和/或其症状的目的，同时避免或最小化了与所给予治疗性处理相关的不良副作用。术语"药学可接受的"意指适合用于药用产品中的对象物品。本发明的抗体预期作为治疗剂是有价值的。因此，本发明的实施方案包括治疗患者(包括哺乳动物)中各种状况的方法，包括将含有治疗目标状况有效量的本发明抗体给予所述患者。本发明的抗体可用于治疗或预防与MN蛋白相关的疾病和/或行为。这些疾病和/或行为包4舌例如癌症，诸如肾癌、食道癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌和肺癌。本发明也涉及改善病症症状的方法，其中MN升高或者异常表达。这些病症包括但不限于肾癌、食道癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌和肺癌(参见例如Liao,CancerRes.57:2827-2831,1997;Turner,Hum.Pathol.28:740-744,1997;Liao,etal.,Am.J.Pathol.145:598-609,1994;Saarnio,etal.,Am.J.Pathol.153:279-285,1998;Vermylen,etal.,Eur.Respir.J.14:806-811,1999。在发明的一个实施方案中，将治疗有效剂量的本发明抗体给予具有MN升高的病症的患者。本发明的抗体可单独给药或者与一种或多种另外的治疗剂。联合治疗包括含有本发明抗体和一种或多种另外的治疗剂的单个药物剂量制剂的给药，也包括本发明抗体与每种其本身为分开的药物剂量制剂的另外的治疗剂的给药。例如，本发明抗体和治疗剂可以以单个口服剂量组合物一起给予患者，或者每种试剂可以以分开的口服剂量制剂给药。当使用分开的剂量制剂时，本发明抗体和一种或多种另外的治疗剂可以基本上同时给药(例如同时给药)或者分别在错开的时间给药(例如顺序给药)。试剂的给药顺序不被限制。例如，一方面，本发明的抗MN抗体或抗体片,殳与一种或多种抗癌剂一起共给药以加强抗体/片段或抗癌剂二者之一或者两者的效果，这可;波预期用于治疗MN相关病症诸如癌症。也可使用这些联合治疗法来预防癌症，防止癌症复发，防止癌症的传播或转移，或者减轻或改善癌症相关症状。一种或多种抗癌剂可包括现有技术中任何已知的和适合的化合物，例如化学试剂，其它免疫治疗剂，癌疫苗，抗血管生成试剂，细胞因子，激素治疗，基因治疗，以及放射治疗。化学试剂(或者"抗癌试剂"或"抗肿瘤试剂"或"癌治疗剂")是指参与癌症治疗的任何分子或化合物。本发明化学试剂的例子包括但不限于阿糖胞苷，紫杉醇类(例如紫杉醇、多西他赛)，抗微管蛋白试剂(例如紫杉醇、多西他赛、埃博霉素B(epothiloneB)或其类似物)，大环内酯(例如根霉素)，顺铂，卡铂,P可審素，鬼臼p塞口分戒(tenoposide),米4乇蒽、酉昆，discodermolide,五力口苷(eleutherobine),2-氯脱氧腺苷，烷化剂(例如环磷酰胺，氮芥，噻替哌，苯丁酸氮芥，美法仑，卡氮芥(BSNU),罗氮芥(CCNU)，环磷酰胺，白消安，二溴甘露醇，链脲菌素，丝裂霉素C,顺二氯二胺铂(n)(DDP)顺铂，瘗替哌)，抗生素(例如更生霉素(以前的放线菌素)，博来霉素，光神霉素，氨茴霉素)，抗代谢物(例如氨甲喋呤，6-巯基噤呤，6-硫代鸟噤呤，阿糖胞苷，flav叩iridol,5-氟尿嘧啶，氟达拉滨，吉西他滨，达卡巴。秦，泰莫佐罗)，天冬酰胺酶，卡介苗(BacillusCalmetteandGuerin),白喉毒素，六甲蜜胺、羟基脲，LYSODREN.RTM.,核普类似物，植物碱(例如他克唑，紫杉醇，喜树碱，拓朴替康，伊立替康(开普拓沙，CPT-ll),长春新碱，长春碱诸如长春花碱)，鬼臼毒素(包括衍生物诸如表鬼臼毒素、VP-16(依托泊苷)，VM-2^替尼泊苷))，细胞爭〉弛素B,秋水仙素，短杆菌肽D,溴化乙4走，吐根石咸(emetine),丝裂霉素，曱基苄肼(甲基苄肼)，氮芥，蒽环霉素(例如正定霉素(以前的道诺霉素)，阿霉素，阿霉素脂质体)，二羟基蒽环二酮，米托恩醌，光神霉素，放线菌素D,普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛尔，噤呤霉素，抗有丝分裂剂，相思豆毒蛋白，蓖麻毒蛋白A,假单胞菌外毒素，神经生长因子，血小板衍生生长因子，组织纤溶酶原激活物，阿地白介素(aldesleukin),allutamine,阿那曲唾，比卡鲁胺，biaomycin，白消安,卡i咅4也滨，卡4白,chlorabusil,克4立屈5宾,cylarabine,daclinomycin,站,莫司汀(estramusine)，floxuridhe,吉西^也滨，gosereine,去曱柔毛霉素，itosfamide,乙酸亮丙立得，左旋咪唑(levamisole),罗氮芥，氮芥，醋酸曱孕酮，巯基噤呤，巯乙磺酸钠(美斯那(mesna)),mitolanc,培加帕酵,pentoslatin,picamycin,riuxlmab,campath隱l,straplozocin,石危鸟噤呤，维生素A酸(tretmoin)，长春瑞宾，或者它们的任意片段、家族成员或衍生物，包括它们的药学可接受的盐。包括一种或多种化学试剂(例如FLAG、CHOP)的组合物也是本发明所预期的。FLAG包括氟达拉滨，阿糖胞苷(Ara-C)和G-CSF。CHOP包括环磷酰胺，长春新碱，阿霉素和强的松。化学试剂可以是抗血管生成剂，例如制管张素、贝伐单抗(阿瓦斯丁)、索拉非尼(多吉美⑧)、杆抑素、癌抑素、乳腺丝抑蛋白、抗VEGF抗体或肽、抗胎盘生长因子抗体或肽、抗Flk-l抗体、抗Flt-l抗体或肽、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素12、IP-IO、Gro-卩、血小板反应蛋白、2-曱氧基雌二醇、增殖蛋白相关蛋白、酰胺基三唑、CM101、马马司他、戊聚糖多硫酸盐、血管生成素2、干扰素-a、除莠霉素A、PNU145156E、16K促乳素片段、罗喹美克、沙立度胺、己酮可可碱、染料木素、TNP-470、内皮抑制素、紫杉醇、阿卡丁、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板第四因子或者米诺环素。不受理论所束缚，抗血管生成剂的共给药可有利地导致肿瘤中MN表达的增加，从而使得肿瘤对本发明的抗体和抗体缀合物更敏感。一方面，所述化学试剂是剂量范围100到1000mg/m"周期的吉西他滨。一个实施方案中，所述化学试剂是剂量范围200到4000mg/m"周期的达卡巴溱。另一方面，所述剂量范围是700到1000mg/m"周期。还有另一方面，所述化学试剂是剂量范围25到50mg/m"周期的氟达拉滨。另一方面，所述试剂是剂量范围200到2000mg/m"周期的阿糖胞苷(Ara-C)。还有另一方面，所述化学试剂是剂量范围1.5到7.5mg/kg/周期的多西他赛。另一方面，所述化学试剂是剂量范围5到15mg/kg/周期的紫杉醇。进一步的方面，所述化学试剂是剂量范围5到20mg/kg/周期的顺铂。还有另一方面，所述化学试剂是剂量范围5到20mg/kg/周期的5-氟尿嘧啶。另一方面，所述化学试剂是剂量范围2到8mg/kg/周期的阿霉素。另一方面，所述化学试剂是剂量范围40到160mg/kg/周期的表鬼臼毒素。另一方面，所述化学试剂是剂量范围50到200mg/kg/周期的环磷酰胺。进一步的方面，所述试剂是剂量范围50到150mg/m"周期的伊立替康。进一步的方面，所述试剂是剂量范围3.7到18.5mg/m"周期的长春花碱。另一方面，所述试剂是剂量范围0.7到2mg/m"周期的长春新碱。一方面，所述试剂是剂量范围3.3到1000mg/m"周期的氨曱喋呤。另一方面，本发明的抗MN抗体和/或抗体片段是与一种或多种免疫治疗剂组合给药的，诸如抗体或免疫调节剂，包括但不限于赫赛汀⑧、50Retuxan⑧、OvaRex、Panorex、BEC2、IMC陽C225、Vitaxin、CampathI/H、SmartMI95、LymphoCide、SmartIDlO,以及Oncolym、利妥希玛、利妥希单抗、gemtuzumab或司徒曼布。本发明也包括给予本发明的抗MN抗体和/或抗体片段与一种或多种抗血管生成剂，包括^旦不限于血管抑素、沙立度胺、kringle5、内皮抑制素、Serpin(丝氨酸蛋白酶抑制剂)、抗凝血酶、纤连蛋白的29kDaN末端蛋白水解片段和40kDaC末端蛋白水解片段、促乳素的16kDa蛋白水解片段、血小板第四因子的7.8kDa蛋白水解片段、相应于血小板第四因子片段(Maioneetal.,1990,CancerRes.51:2077)的卩-氨基酸肽、相应于胶原I片段(Tolmaetal.,1993,J.CellBiol.122:497)的14个氨基酸的肽、相应于血小板反应蛋白蛋白I片段(Tolsmaetal.,1993,J.CellBiol.122:497)的19个氨基酸的肽、相应于SPARC片段(Sageetal.,1995,J.Cell.Biochem.57:1329-)的20个氨基酸的肽，或者它们的任意片l史、家族成员或衍生物，包括它们的药学可接受的盐。抑制血管生成并相应于昆布氨酸、纤连蛋白、前胶原和EGF的片段的其它肽也已经被描述(参见综述Cao,1998,Prog.Mol.Subcell.Biol.20:161)。已经证实阻断能够结合RGD蛋白(也就是具有肽基序Arg-Gly-Asp)的某些整联蛋白的单克隆抗体和环五肽具有抗血管生成活性(Brooksetal.,1994,Science264:569;Hammesetal.,1996,NatureMedicine2:529)。此外，拮抗剂对尿激酶纤溶酶原激活物受体的抑制能够抑制血管生成、胂瘤生长和转移(Mmetal.,1996,CancerRes.56:2428-33;Crowleyetal.,1993,ProcNatlAcad.Sci.USA90:5021)。这些抗血管生成剂的用途也是本发明所预期的。另一方面，本发明的抗MN抗体和/或抗体片段是联合放射治疗方案来给药的。本发明的抗MN抗体和/或抗体片段也可与一种或多种细胞因子联:合给药，包括但不限于淋巴因子、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子样细胞因子、淋巴毒素-a、淋巴毒素-P、干扰素-|3、巨噬细胞炎性蛋白、粒细胞单核细胞集落刺激因子、白介素(包括但不限于白介素-1、白介素-2、白介素-6、白介素-12、白介素-15、白介素-18)、OX40、CD27、CD30、CD40或CD137配体、Fas-Pas配体、4-lBBL、内皮单核细胞活化蛋白或者它们的任意片段、家族成员或衍生物，包括它们的药学可接受的盐。51本发明的抗MN抗体和/或抗体片段也可与癌疫苗联合给药，其例子包括但不限于自体细胞或组织、非自体细胞或组织、癌胚抗原、a-甲胎蛋白、人绒毛膜促性腺激素、BCG活疫苗、黑素细胞系蛋白(例如gp100、MART-l/MelanA、TRP-1(gp75)、酪氨酸酶、广泛共有的肺瘤相关包括肺瘤特异性的抗原(例如BAGE、GAGE-1、GAGE-2、MAGE-1、MAGE-3、N-乙酰葡糖胺基转移酶-V、p15)、肿瘤相关的突变抗原(P-联蛋白、MUM-1、CDK4)、非黑素瘤抗原(例如HER-2/neu(乳腺和卵巢癌)、人乳头状瘤病毒-E6、E7(宫颈癌)、MUC-1(乳腺、卵巢和胰腺癌)。对于由T细月包所识别的人肺瘤抗原，通常参见RobbinsandKawakami,1996,Curr.Opin.Immunol.8:628。癌疫苗可以是纯化的制剂或者可以不是纯化的制剂。在另一实施方案中，本发明的抗MN抗体和/或抗体片段是与激素处理一起使用的。激素治疗处理包括激素激动剂、激素拮抗剂(例如氟利坦、他莫昔芬、乙酸亮丙立得盐(LUPRON)、LH-RH拮抗剂)、激素生物合成和加工的抑制剂、类固醇(例如地塞米松、类维生素A、倍他米松、氢化可的松、可的松、强的松、去氢睾酮、糖皮质激素、盐皮质激素、雌激素、睾酮、孕酮)、抗孕激素物质(例如米菲司酮、奥那斯酮)、和抗雄激素物质(例如甲撑氯地孕酮)。本发明的抗MN抗体和/或片I殳可与抗MDR(多药物抗性)表型试剂一起使用，例如共同给药。许多人类癌症都固有地表达或自发地发展出对几种类型抗癌药物同时产生的抗性，尽管每种药物类型具有不同的结构和作用机制。这种现象可在培养的哺乳动物细胞中进行才莫拟，它通常被称为多药物抗性("MDR")或者多药物抗性表型。MDR表型对病人癌症的成功化学治疗处理是明显的障碍。恶性肿瘤对多种化学治疗剂的抗性是治疗失败的主要原因(Wittesetal.,CancerTreat.Rep.70:105(1986);Bradley,G.etal.,Biochim.Biophys.Acta948:87(1988);Griswald,D.P.etal.,CancerTreat.Rep.65(S2):51(1981);Osteen,R.T.(ed.),CancerManual,(1990))。最初对细胞毒性药物敏感的胂瘤经常复发或者变得对多种化学治疗试剂来i兌是难治的(Riordanetal.，Pharmacol.Ther.28:51(1985);Gottesmanetal.,TrendsPharmacol.Sci.9:54(1988);Moscowetal.,J.Natl.CancerInst.80:14(1988);Croop,J.M.etal.,J.Clm.Invest.81:1303(1988))。从肿瘤获得的并且在选择性细胞毒性药物存在下培养的细胞或组织可能对那种类型的其它药物以及其它类型的药物，包括但不限于蒽环类、长春碱和表鬼臼毒素产生交叉耐药性(Riordanetal.,Pharmacol.Ther.28:51(1985);Gottesmanetal.,J.Biol.Chem.263:12163(1988))。这样，对单个药物的获得性抗性就同时产生了对结构上和功能上均不相关的不同组药物的抗性。这种抗性对于实体形式肺瘤和液体形式肿瘤(例如基于血液或淋巴的癌症)来说都可能是问题。哺乳动物细胞中多药物抗性的一个主要机制涉及170kDa质膜糖蛋白泵系统表达的增加(Jurankaetal.,FASEBJ3:2583(1989);Bradley,G.etal.，Blochem.Biophys.Acta948:87(1988》。该泵系统有时也被称为多药物转运蛋白，编码该泵系统的基因已经从培养的人细胞中克隆到了，通常称为m^/。该基因在几种类型的正常组织中表达，但是还没有鉴别到转运用于在这些组织中的mdrl基因产物的生理底物。MDR1产物是ABC转运蛋白超家族的成员，这是一组具有能量依赖的输出功能的蛋白。mdrl基因的蛋白产物通常称为P-糖蛋白("P-170","P-gp"),是170kDa的跨质膜蛋白，构成上述能量依赖的外排泵。P-gp在细胞表面的表达足以使细胞抗多种细胞毒性药物，包括许多抗癌试剂。P-gp介导的MDR似乎是不同类型胂瘤的肺瘤抗性的重要临床组分，mdW基因表达与不同类型癌症对一化疗的抗性相关联。基因的核苦酸序列(Gros,P.etal.,Cell47:371(1986);Chen,C.etal.,Cell47:381(1986))表明它编码与P-糖蛋白相似或相同的多肽，它们是相似于细菌转运蛋白的高度保守类型膜蛋白的成员，参与正常的生理转运过程。/m/r/基因的序列分析表明Pgp由分布在两个同源性(43%同一性)部分之间的1280个氨基酸组成。分子的每一半具有六个疏水跨膜结构域，每一个都在大胞质环中具有ATP结合位点。分子仅有大约8%是在胞外，碳水化合物部分(大约30kDa)结合到该胞外区的位点上。因此，将会理解的是，具有"多药物抗性"或"抗多药物"表型的哺乳动物细胞是通过它将许多细胞毒性物质(例如化疗药物)从胞内环境掩蔽、输出或排出的能力来表征的。细胞获得这种表型可能是作为选择压力的结果，该选择压力是通过暴露给单个化疗药物(选择毒素)而被施53加的。备选地，细胞可能在毒素暴露之前就显示出表型，因为毒性物质的输出可能涉及与细胞分泌产物、代谢物等等的正常输出相同的机制。多药物抗性不同于对选择毒素的简单获得性抗性，因为细胞获得了输出另外的细胞毒素(其它化疗药物)的能力，这些另外的细胞毒素是以前并未暴露给细胞的。例如，Mirskietal.(1987),47CancerRes.2594-2598描述了多药物抗性细胞群的分离，其通过培养源自人小细胞肺癌的H69细胞系，存在阿霉素(羟基正定霉素)作为选择毒素。发现存活细胞抵抗了蒽环类似物(例如道诺霉素、表阿霉素、美洛格瑞和米托恩醌)、异哺唑醋酸、依托泊普、短杆菌肽D、秋水仙素和长春花来源的生物碱(长春新碱和长春花碱)以及阿霉素的细胞毒性功效。可应用类似的选择培养技术来产生另外的多药物抗性细胞群。因此，本发明的药物组合物可另外包括作用是抑制MDR表型和/或MDR表型相关状况的化合物。这些组合物可包括任何现有技术中已知的MDR抑制剂化合物，诸如特异于MDR组分的抗体(例如抗MDR转运蛋白的抗体)或者MDR转运蛋白的小分子抑制剂，特别地包括他莫昔芬、维拉帕米和环孢菌素A,它们是已知的逆转或抑制多药物抗性的试剂(Lavieetal.J.Biol.Chem.271:19530-10536,1996,引入本文作为参考)。这些化合物可在美国专利No.5,773,280、6,225,325和5,403,574中找到，每一篇都引入本文作为参考。这些MDR抑制剂化合物可与本发明的抗MN抗体和/或片段共同给药，用于各种目的，包括在检测到MDR表型后逆转MDR表型以辅助或增强化疗处理。MDR抑制剂，例如他莫昔芬、维拉帕米或环孢菌素A,可以与本发明的化合物一起使用以辅助检测MDR表型。根据这个方面，MDR抑制剂能够增强本发明化合物在MDR癌细胞中的摄取和累积，因为MDR转运系统转运或者"泵出"与底物结构域相像的化合物的能力在MDR抑制剂存在时将被降低。在另一个实施方案中，本发明的抗MN抗体和/或抗体片,殳在癌症治疗中与基因治疗程序一起使用。用分泌白介素-2的重组细胞进行的基因治疗可以与本发明的抗体一起给药以预防或治疗癌症，特别是乳腺癌(参见例如Deshmukhetal.,2001,J.Neurosurg.94:287)。为评估特定抗体的治疗学上有用的治疗癌症的能力，作为例子，抗体可以在小鼠异种移植肿瘤模型中进行体内测试。如果需要，可在治疗性评估之前将MN抗体转变成IgGl抗体。这种转变描述于实施例5中，治疗才莫型的例子详细描述于实施例9中。也可4吏用抗体依赖性细胞介导的细月包毒性分析法来测试抗体活性，如实施例12中所述的。本发明也提供了诊断方法，用这些方法就可在患者样品或生物样品中才全测到MN。这些诊断方法可用于例如诊断其中的MN升高的那些病症。这些病症包括但不限于肾癌、食道癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌和肺癌。当用于诊断时，；险测到来自患者样品的抗体-MN复合物的量比正常样品的复合物的量更大时，就确定患者可能患有病症。在实施例11中描述了用于检测癌症组织中的MN的免疫组织化学方法。在本发明的另一方面，提供了用于检测和/或观察MN相关癌症的方法，所述癌症具有异常表达量的MN蛋白。这些方法可包括，将MN相关癌细胞与本发明的抗MN抗体或片段接触，使用医学成像设备成像，其中抗MN抗体或片段包括能够被医学成像设备检测到的标记结构域。本发明的片企测方法可在体外进4亍。癌细胞或组织可以来自任何合适来源，例如活组织4企测或者细胞或组织培养物。用于获得活组织检测物以及维持和/或增殖所取下组织和/或细胞的方法将是技术人员所公知的。多药物抗性的体外检测可以具有各种应用，例如在治疗之前、期间或之后确定特定患者的癌症是否已经发展出多药物抗性。用于检测本发明化合物的成像形式的类型将取决于本发明化合物中所使用的特定标记结构域。例如，如果标记结构域包括钆螫合物，那么典型地可以使用MRI来检测本发明的成像剂。如果使用放射性核素螯合物作为标"^己结构域，就可以4吏用核成^^方法(例如PET)。如果4吏用基于荧光的标记结构域，可以使用光学成像系统，例如FACS系统或荧光显微镜或萸光自动平板读数仪。选择用于本发明体外检测方法的合适成像设备完全在技术人员的知识范围之内。此外，用于本发明体外检测方法中的成像剂的量将由本领域普通技术人员来确定，可依赖于MDR表型的存在程度，例如MDR转运系统(例如P-糖蛋白)的表达水平。技术人员不需要过度实验就能够确定多大量的新显象化合物对于检测到MDR表型来说才是足够的，也就是可检测的足够的量。所使用成像形式的类型不限于任何特定类型，可包括例如MRI、核成像(例如PET或SPECT)、光学成像、声波发光成像或光声成像(超声)。技术人员将明白，本发明成像化合物的特定标记结构域应该与所使用的特定成像设备相兼容。在优选实施方案中，检测方法利用了抗MN抗体或其片段以及能够被MRI检测到的合适标记。例如，本发明的抗体或片段可包括作为MR造影剂的标记结构域，例如顺磁性金属螯合物或螯合物或任何的本文所描述的那些试剂。成像剂也可包括能被核成像形式诸如正电子发射成像(PET)或单光子发射计算机成像(SPECT)成像或检测的放射性核素标记结构域，例如放射性核素，诸如，Au、72As、141Ce、67Cu、6GCu、52Fe、67Ga、68Ga、51Gr、mIn、177Lu、51Mn、2°3Pb、188Re、97Ru、47Sc、177mSn、94mTc、167Tm和9QY。放射性核素可通过合适的螯合剂或通过多种螯合剂诸如HYNIC、DRPA、EDTA、DOTA、TETA、DTPA和BAT进行螯合。螯合剂与金属配位的条件描述于例如Gansowetal.,美国专利No.4,831,175、4,454,106和4,472,509,每一篇都引入本文作为参考。9^Tc(锝-99m)对于治疗和诊断应用来说是特别有吸引力的，因为它是核医学部门一般都可得到的，它也不贵，给予患者的是最低放射剂量，并且具有理想的核成像性质。可将患者样品与本发明的抗体接触，然后可分析患者样品中抗体-MN复合物的存在。如上所述，抗体可包括可检测标记，诸如荧光、放射性核素、化学发光或酶标记，诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶。、任选地，可将抗体结合到固相支持物上，它可以使得分析能够适应自动化。合适的固相支持物包括但不限于玻璃或塑料片、组织培养板、微量滴定孔、管子、硅片或者微粒诸如小珠(包括但不限于胶乳、聚苯乙烯或玻璃珠)。可以使用本领域已知的任何方法将抗体结合到固相支持物上，包括使用共价和非共价键、被动吸附或者结合到抗体和固相支持物上的结合对。可以在适于包含反应物的任何容器中完成MN和抗体的结合。这些容器的例子包括微量滴定板、试管和微量离心管。药物纟且合物和剂量可以以包括药学可接受载体的药物组合物的形式提供本文所述的抗体。药学可接受的载体可以是不致热的。组合物可以单独给药或者与至少一种其它试剂一起给药，诸如稳定化合物，可以以任何无菌的、生物相容的药学载体的形式给药，包括但不限于盐水、緩沖盐水、右旋糖和水。可以使用多种水性载体，包括但不限于盐水、甘氨酸等等。这些溶液是无菌的，通常不含颗粒物质。这些溶液可通过常规的公知灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。通常，用语"药学可接受的载体"是本领域所公认的，包括药学可接受的材料、组合物或运载体，适合将本发明的化合物给予哺乳动物。载体包括液态或固态填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，参与将测试试剂从一种器官或身体部分携带或运送到另一器官或身体部分。每种载体都必须是"可接受的"，意思是与制剂的其它成分相容，对患者无害。能够用作药学可接受载体的材料的一些例子包括糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧曱基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄芪胶；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄^览油、玉米油和大豆油；#唐醇，诸如丙二醇；多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；緩沖剂，诸如氪氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；等渗盐水；林格液；乙醇；磷酸盐緩沖液；以及药学制剂中所使用的其它无毒的相容性物质。本发明的抗体组合物中也可存在润湿剂、乳化剂和润滑剂，诸如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、脱才莫剂、涂布剂、甜味剂、调，朱剂和加香剂、防腐剂和抗氧^fc剂。药学可接受的抗氧化剂的例子包括水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氬钠、亚硫酸钠等等；油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BTH)、卵磷脂、没食子酸丙酯、a-生育酚等等；以及金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等等。组合物可含有接近生理条件所需的药学可接受的辅料，诸如pH调节剂和緩冲剂等等。根据所选择的特定给药模式，这种药物制剂中的本发明抗体的浓度可以大范围地变化，主要可基于流体体积、粘度、等进行选择。如果希望，可以在药物组合物中包括多于一种类型的抗体(例如具有不同Kd的抗体用于MN结合)。组合物可单独给予患者，或者与其它试剂、药物或激素一起给药。57除了活性成分之外，这些药物组合物可包含合适的药学可接受载体，包括赋形剂和辅料，它们帮助将活性化合物，加工为可在药学上使用的制剂。本发明的药物组合物可通过任何数量的途径进行给药，包括但不限于口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、脑室内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠外、局部、舌下或直肠方式。本发明的组合物另外包括合适的免疫载体，诸如蛋白、多肽或肽，诸如白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺球蛋白及其衍生物，特别是牛血清白蛋白(BSA)和钥孔血蓝蛋白(KLH),多糖，碳水化合物，聚合物和固相。其它蛋白衍生的或非蛋白衍生的物质是本领域技术人员已知的。在涉及疫苗，例如带有本发明抗体的癌疫苗的方面，本发明的组合物可与或不与佐剂一起给药。可在没有佐剂时进行给药以避免任何佐剂诱导的毒性。本发明所属
技术领域：
的普通技术人员，例如专攻癌症的医师，将理解并明白如何确定应不应该^吏用佐剂，这可能取决于患者的病史、家族数据、毒性数据、变态反应相关的测试结果等等。在使用佐剂的实施方案中，有利的是，佐剂促进了保护性抗体，诸如保护性IgG抗体的形成。本领域普通技术人员已知的任何合适佐剂都一皮本发明所包括，4艮容易使其适用于本发明。用于免疫动物用途的合适佐剂包括但不限于氢氧化铝、氢氧化铝、皂苷及其纯化成分QmtA、完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。已经证明硫酸葡聚糖是抗葡萄球菌细胞表面抗原的IgG2抗体的有效刺激物，也适合作为佐剂。技术人员将理解的是，一些佐剂可能更优选用于兽医应用，而其它佐剂将优选用于人体，在将化合物给予人体之前，技术人员应当考虑佐剂毒性。适用于肠胃外的、皮下的、静脉内的、肌肉内的制剂等等；合适的药学载体；以及用于制剂和给药的技术可通过本领域公知的任何方法制备(参见例如Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.,Easton,Pa.,20thedition,2000)。用于口服的本发明组合物的液体剂型包括药学可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆以及酏剂。除了活性成分，液体剂型可包含本领域通常使用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂，溶解试剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯曱酸千酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、种子油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氪吹喃醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯，以及它们的混合物。本文所使用的用语"肠胃外的给药"或"肠胃外给予"意指除了肠内和局部给药的给药模式，通常通过注射，包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、嚢内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、嚢下、虫朱网膜下、脊柱内和胸骨内注射和注入。治疗有效剂量的确定完全是在本领域技术人员的能力范围之内的。治疗有效剂量是指可用于有效治疗疾病(例如癌症)的抗体的量，与没有治疗有效剂量的疗效相比是明显的。治疗有效剂量最初可在动物模型(例如大鼠、小鼠、兔、狗或猪)中进行评估。动物模型也可用于确定合适的浓度范围和给药途径。然后可使用这些信息来确定用于人体给药的有用剂量和途径。抗体的疗效和毒性(例如ED5()——在50%群体中治疗有效的剂量和LD5。——对50%群体致死的剂量)可在细胞培养物或实验动物中通过标准药学程序来确定。毒性与疗效的剂量比就是治疗指数，它可表示为LD5o/ED5o比。从动物研究获得的数据可用于制定用于人体使用的剂量范围。这些组合物中包含的剂量可以在循环浓度范围之内，其包括几乎没有毒性或没有毒性的ED50。剂量在这个范围之内变化，取决于所使用的剂型、患者的敏感性以及给药途径。确切的剂量可由专业人员根据需要治疗的患者相关的因素来确定。可调整剂量和给药以提供足够水平的抗体或保持期望的功效。可被考虑的因素包括病状的严重性，患者的一般健康，患者的年龄、体重和性别，饮食，给药时间和频率，联合用药，反应敏感性以及对治疗的耐受/应答。可构建编码本发明抗体的多核苷酸，使用公知技术将其离体或体内引入到细胞中，这些技术包括但不限于转铁蛋白聚阳离子介导的DNA转移，用棵的或包裹的核酸进行的转染，脂质体介导的细胞融合，DNA包被的胶乳珠进行的胞内转运，原生质体融合，病毒感染，电穿孔，"基因枪"以及DEAE或磷酸钓介导的转染。抗体有效的体内剂量在大约5iug到大约500lug/kg体重的范围。对于编码抗体的多核苷酸的给药来说，有效的体内剂量在大约100ng到大约500)LigDNA的范围。含有抗体的本发明的药物组合物的给药模式可以是将抗体传递给宿主的任何合适途径。举例来说，本发明的药物组合物对于肠胃外给药(例如皮下、肌肉内、静脉内或鼻内给药)来说可能是有用的。本公开内容中引用的所有专利和专利申请都特别地S1入本文作为参考。上述公开内容一般性地描述了本发明。更完整的理解可以通过参考下面的特定实施例来获得，所提供的实施例仅仅是为了例证性说明，并不打算限制发明的范围。实施例本文所述的结构、材料、组合物和方法是本发明的代表性例子，本发明的范围不受实施例范围的限制，这是能够明白的。本领域技术人员将认识到，本发明的实施可以在所公开的结构、材料、组合物和方法的基础上进行变化，这些变化^:认为在本发明的范围内。实施例1:人组合Fab文库(HuCALGold)的构建HuCALGOLD是基于HuCAL⑧技术(人组合抗体文库；MorphoSysAG,Martinsried/Planegg,Germany)的抗体文库。这个文库组合了Fab才各式的合成的全人抗体文库，特征在于具有六个不同的CDR区，用展示4支术选"^高亲和力抗体CysDisplay(MorphoSysAG,Martinsried/Planegg,Germany)。CysDisplay是基于通过二硫键的表型-基因型连接的单价噬菌体展示技术，它能够以高亲和力回收特定抗体。噬菌体展示载体pMORPH23是能够容许Fab片段的单价CysDisplay的噬菌粒载体。它编码全长glllp、Fd链(VjrCHl)和轻链(VL-C0,它们都具有不同的分泌信号序列，引导相应蛋白链到大肠杆菌的周质中。利用了ompA和phoA信号序列两者来转运重链和轻链到周质，其中产生了由非共价相互作用引起的链组装。该展示载体携带有可诱导的lac启动子/操纵子区域。用于阻遏表达的laqia基因产物是由大肠杆菌宿主菌抹TG1提供的。Cys-gIIIp和Fab表达的诱导是通过加入IPTG(异丙基-P-D-硫代吡喃半乳糖苷)来实现的。使用限制酶Xbal和EcoRI将富集的Fab集合从pMORPH23亚克隆到Fab表达载体pMORPH⑧x9上。通过该步骤，除去了Fd链的C末端的半胱氨酸和接头-His6部分，切下了glllp。表达载体pMORPH⑧x9—Fab_FH才是供了两个C末端标志FLAG和6xHis,这样有助于Fab蛋白的检测和纯化。遵#在^炎/75f霧谬,乂f在补充了34|ug/ml氯霉素和1%葡萄糖的2xTY培养基中扩增TG1细胞中的HuCALGOLDFab噬菌粒。在辅助噬菌体于37。C感染(VCSM1360约2-6xl0"pfu/ml)30分钟后，通过离心浓缩TG1细胞。通过将感染的TG1细胞在含有34)ug/ml氯霉素、50lag/m卡那霉素和0.25mMIPTG的2xTY培养基中于22。C培养过夜，扩增噬菌粒。使用含有噬菌体的上清液进行p蓋菌体淘选。实施例2:固相淘选固相淘选是通过用PBS中的人MN蛋白包被MaxiSorpTM平板(NalgeneNuncInternational,Rochester,NY)或DynabeadsTM(Invitrogen,Carlsbad,CA)来进行的(liug/孔或1|ug/lmg珠)。MN蛋白代表了带有用于纯化的C末端his标志的蛋白的整个胞外结构域。MN蛋白是在哺乳动物细胞系HKB-11中表达的，通过Ni-NTA层析进行纯化，使用的是本领域技术人员公知的标准方法。用PBS中的5%奶对含有已结合的MN蛋白的孔进行封闭，在PBS中漂洗，然后用一等份预封闭的含有lxlO12个HuCALGOLDFab噬菌体的HuCALGOLD噬菌体文库于室温保温2小时。漂洗已结合的噬菌体，然后用10mMTris緩冲液pH8.0中的20mMDTT进行洗脱。进行三轮淘选，每轮淘选之间都进行如上所述的噬菌体扩增。每轮淘选之间都增加漂洗严谨度以减少非特异性结合。实施例3:亚克隆所选择的Fab片段用于大肠杆菌中的表达将所选择的Fab从pMORPH23展示载体克隆到pMORPH⑧x9_Fab—FH表达载体上以促进用于ELISA筛选的可溶性Fab的快速表达。用EcoRI和Xbal消化pMORPH23载体的DNA制备物，这样就切下了整个Fab编码片段(ompA-VL-VL和phoA-Fd)。在接着的纯化之后，将片段连接到所制备的pMORPHx9一Fab—FH载体上(也用EcoRI/Xbal消化并纯化)。通过电穿孔将含有Fab插入片段的载体转染到感受态大肠杆菌TGIF细胞中。将转化的大肠杆菌细胞于37。C下培养在含有34|ug/ml氯霉素和1%葡萄糖的LB平板上。挑选菌落，置于含有34pg/ml氯霉素和1%葡萄糖的培养基中。加入甘油到20%，将这些储备起始培养物保存在-80。C下直到需要用于ELISA。为获得纯化的Fab,将携带该载体的大肠杆菌转化体典型地培养在多个1L的摇瓶培养物中，收获，使用Ni-NTA亲和层析进行纯化，使用的是本领域技术人员公知的方法。实施例4:通过ELISA鉴别结合MN的Fab片段用PBS中的浓度为5|ag/ml的已纯化人MN蛋白溶液以100idl/孔包被Maxisorp96孔ELISA平板。使用培养在来自起始储备培养物的含有34|ug/ml氯霉素的2xTY培养基中的大肠杆菌转化体表达Fab。收获前十二(12)小时，加入IPTG(终浓度0.5mM)诱导Fab表达。裂解细胞，将100|Lil裂解物于室温下保温在预包^f皮了MN并用奶封闭的Maxisorp平板的孔中2小时。然后在TBS和含有吐温的TBS中漂洗平板以去除非特异性结合。用缀合到碱性磷酸酶上的山羊抗人(Fab，)2抗体(PierceChemical，Rockford,IL)检测结合的Fab。按照厂商说明书的指导4吏用底物AttoPhos(RocheDiagnostics,Alameda,CA)，在430nm;敫发，在535nm读出发射。大量的大肠杆菌转化体表达Fab,其显示的ELISA中的信噪比大于10。对超过50个的独特MN结合Fab鉴别了VH和VL区的DNA测序。根据它们的功能性，十个抗体的完整VH和VL的DNA和蛋白序列分别示于图3和4中。通过ELISA将这十个公开的抗体每一个都结合到分离自哺乳动物表达细胞系HKB-11的纯化MN蛋白上(图5)。所;险测的抗体也与分离自sf9昆虫细I包的纯化MN反应，这些昆虫细月包已经;故编码MN胞外结构域的杆状病毒感染过，(图5)这证明ELISA反应对于MN蛋白是特异性的，而不是蛋白制剂中的任何痕量污染物。在BIAcoreTM分析中，本发明的抗体特异性结合人MN,Kd范围在lnM(lx10—9M)到大约50nM(5.0x10—8nM)(图5)。实施例5:结合MN的Fab和IgG的鉴别使用表面等离子共振技术在BIAcore3000仪器(BIAcore,Uppsala,瑞典)上分析MN蛋白与本发明抗体之间的结合相互作用。对于全长IgG(le4、laal和3ee9)的结合来i兌，4吏用标准胺偶联试剂盒(BIAcore,Uppsala:瑞典)将山羊抗人IgGFc高密度地共价偶联到CM5生物传感器上。然后使用捕获分析法将这些IgG结合到固定了抗人IgGFc的表面上，目标是3000个应答单位的BIAcore信号。在25。C下操作BIAcore,流速是10jul/min流动緩冲液，其中含有PBS/0.05Q/。吐温20或含有10mMNa-HEPES:pH7.5/150mMNaCl/3mMEDTA/0.005。/。吐温20。配体结合之后，然后将流速增加到25jal/mm，让各种浓度的MN分析物(例如50nM到1nM的范围)流过表面10分钟以便能够监测締合阶段。然后进行离解35分钟，接着用100pl的10mM磷酸以100pl/mm再生固定了抗人IgGFc的表面。使用1:1Langmmr结合模型拟合传感曲线以计算速率常数。类62200680052716.X似地确定Fab与MN的结合，不同之处是将抗人Fab的IgG固定在芯片上并在MN结合评估之前用来捕获Fab。图5显示了对于所公开抗体与纯化MN蛋白之间的结合来说得到的结合常数。每个结合MN的抗体都显示出了0.15到50nM范围的Kd值。实施例6:构建HuCAL免疫球蛋白表达载体用于在293F细胞中瞬时表达抗体,遂《迷戎傳。去除pcDNA3.1+(Invitrogen,Carlsbad,CA)的多克隆位点(Nhel/Apal),插入与用于HuCAL的限制性位点相容的位点，进行前导序歹ll(Nhel/EcoRI)、VH结构域(EcoRI/BlpI)和免疫球蛋白恒定区(Blpl/Apal)的连接。前导序列(EMBLM83133)具有Kozak序列(Kozak,NucleicAcidRes.15:8125-8148,1987)。将人IgGl(PIRJ00228)、IgG4(EMBLK01316)和血清IgAl(EMBLJ00220)的恒定区切成大约70个碱基长度的重叠寡核苷酸。引入沉默突变以去除与HuCAL设计不相容的限制性位点。通过重叠延伸PCR剪接寡核苷酸。鞋^產这裁'沐。用两个不同位点取代pcDNA3.1/Zeo+(Invitrogen,Carlsbad,CA)的多克隆位点。k-位点提供了用于k-前导序列(Nhel/EcoRV)、HuCAL-scFvVk-结构域(EcoRV/BsiWI)和k-链恒定区(BsiWI/Apal)插入的限制性位点。人-位点中的相应限制性位点是Nhel/EcoRV(l-前导序列)、EcoRV/Hpal(Vl-结构域)和Hpal/Apal(X-链恒定区)。k-前导序列(EMBLZ00022)以及入-前导序列(EMBLL27692)都具有Kozak序列。人k-链(EMBLJ00241)和X-链(EMBLM18645)的恒定区通过上述重叠延伸PCR进行组装。,^F"6^全长/gG^,^。通过用Mfel/Blpl酶切，将包含在大肠杆菌表达载体pMORPHx9一Fab—FH中的Fab重链序列切下，连接到上述已经被EcoRI/BlpI酶切过的重链表达载体中。用EcoRV/BsiWI将包含在pMORPHx9—Fab—FH中的Fabk轻《连序列切下，连接到也已经^CEcoRV/BsiWI酶切过的k轻链表达载体中。用EcoRV/Hpal将包含在pMORPHx9一Fab—FH中的FabX轻链序列切下，连接到上述入表达载体中。全长/gG的义效^f錄〃^^迷。将Cellbag20L/0(WaveBiotechLLC,Somerset,NJ)以0.25x106个293F细胞/ml(Invitrogen)接种到9.3L的Freestyle293表达培养基(Invitrogen)中。将细胞培养到1xl()6/ml的密度，通过将编码全长抗体的5mg的每种轻链表达载体和重链表达载体加入到含有293fectin试剂(Invitrogen)的350mlOptimem(Invitrogen)中进行转染。在37。C发酵96小时后，通过离心收获细胞培养物上清液，无菌过滤，通过切向流过滤进行浓缩，将pH调节到7.6,然后进行标准蛋白A柱层析(AmershamPharmaciaBiotech,Piscataway，NJ)。实施例7:细胞贴壁分析将五十(50)jliL的1ng/mL的PBS中的纯化MN溶液吸附到未处理的96孔板上，4。C过夜。除去溶液，用PBS冲洗孔3次。用RPMI1640培养基中的200pL50%FBS封闭孔1小时。然后用含有1%BSA的PBS中的100jigle4抗MN抗体、含有1%BSA的PBS中的对照IgG或者含有1%BSA的PBS进行处理。用PBS漂洗之后，向孔中加入5000个MaTu细胞(MN+细胞)，在37。C和5%C〇2下过夜温育平板。用PBS漂洗之后，分析抗MN抗体阻断MaTu细胞贴壁到MN包被孔上的能力。该实-验的例子示于图6中，其中100jug的抗MN抗体le4显示出了细月包贴壁，而对照IgG或緩冲液赋形剂则不显示细胞贴壁。实施例8:带有免疫缀合物的皮下异种移植癌症模型^f吏用本领域已知的方案(例如Liu,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.93:8618-8623,1996.)将抗MN抗体缀合到细胞毒性小分子上。将人乳腺异种移植物MaTu细胞作为贴壁培养物培养在补充了10。/。FBS的RPMI中。用O.lmU々80%matrigel/20%HBSS中的5x106个细胞皮下接种在Ncr棵鼠(8-12周龄)的右胁腹。当肿瘤达到约180mg的平均大小时(6天)，开始进行处理。将缀合到细胞毒性小分子上的单克隆抗体静脉注射给药，以10mg/kg的剂量每四天给药一次(Q4Dx3)。对照小鼠用PBS或未缀合的单克隆抗体进行处理。对每只动物的健康状况每天进行检测。每个实验组由10只小鼠组成，剂量体积是O.lmL/10g体重。通过使用电子卡尺每周测量2-3次每个肿瘤的长度和宽度，根据公式[长度(mm)x宽度(mm)"/2计算肿瘤重量(mg)。记录整个研究过程中获得的所有数据包括每日观察结果。肿瘤生长抑制(TGI)计算为1-T/Cx100,其中T==来自处理组的最终肺瘤重量，C=来自对照组的最终肿瘤重量。图7显示了缀合到细胞毒性药物上的单克隆IgGlle4在30mg/kg免疫缀合物时产生了显著的抗胂瘤功效，而未缀合的抗体没有效果。这些数据证明了针对MN蛋白的抗体作为载体用于将细胞毒性药物输送到肿瘤的治疗用造。实施例9:荧光激活细胞分选分析(FACS分析)64可分析细胞的MN表达来作为诊断工具。用PBS溶液中的1:10胰蛋白酶/Versene处理5到10分钟，将贴壁的表达MN的PC-3mm2细胞和不表达MN的DLD1细胞从它们的瓶中分离下来。将细胞进行旋转(1000rpm,5分钟)，用水冷的RPMI10%FBS漂洗一次，以6xl()6个细胞/ml重悬浮在水冷的染色緩冲液(不含Ca+Mg+的PBS,2%BSA,0.05%叠氮化钠)中。将25|ug/mL的一抗，即人抗MNIgGl或者对照的人IgGl抗体与6x105个细胞在水上保温1小时。用冰冷的染色緩冲液将未结合的抗体从细胞上漂洗下去。用PBS中的2%曱醛固定细胞10分钟，然后用染色緩冲液漂洗两次。将细胞沉淀重悬浮在100pl的水冷染色緩沖液中，其中含有抗人Alexafluor488二抗(终浓度1:200,MolecularProbes/Invitrogen,Carlsbad,CA),在水上保温1小时。用流动緩冲液(含2%BSA的PBS)漂洗两次将未结合的抗体从细胞上漂洗下来，将细胞重悬浮在1mL的流动緩冲液中。在BeckmanFACSCaliber设备上进行重悬浮细胞的FACS分析。图8显示，根据FACS分析，PC-3mm2人前列腺癌细胞表达了MN,而DLD-1细胞不表达。实施例10:抗体依赖的细胞介导的细胞毒性分析(ADCC分析)抗MNIgG的抗胂瘤活性可能是通过ADCC活性介导的。将表达MN的PC-3mm2细胞和不表达MN的HCT-116细胞与250ng/mL、1000ng/mL或2000ng/mL的人抗MNIgGl或者对照的人IgGl抗地高辛抗体一起保温。将人PBMC加入到这些细胞中，效应物:耙的比例为50:1、25:1和5:1。进行铬-51释放分析来确定靶细胞裂解的水平。在存在DLD和PC-3mm2细胞时用对照抗体或者没有抗体保温时，观察到了少量裂解。这种自发裂解水平对于50:1、25:1和5:1的革巴:效应物比来说分别是10-15%、5-10%或2-3%。类似地，不表达MN的DLD细胞在与抗MN抗体保温时，它的裂解在0-10%的范围。然而，当PC-3mm2细胞与人抗MNIgG保温时，它的裂解比对照明显更高。当以50:l靶:效应物比使用250ng/mL、1000ng/mL和2000ng/mL时，观察到了40、50和60%的裂解。类似地，在25:1的比时》见察到了30、33和38%的裂解，最后，在5:1的耙:效应物比时^L察到了8、10和15%的裂解。这些实验显示，人抗MN抗体介导了抗肿瘤的ADCC活性，可用于癌症治疗。实施例11:免疫缀合物#务使用编码多种人Fab的噬菌体展示文库(Morphosys)来产生针对MN细胞表面抗原的人抗体。将该抗体缀合到单曱基金抑素E(MMAE)(Fransiscoetal.,Blood,2003,102:1458-1465)上(图9)。斜法'妙遂賴通过针对包含1()W个人Fab片段(Fab是抗体的抗原结合部分)的MorphoSys噬菌体文库进行人MN的纯化细胞外结构域的体夕卜"淘选，，，鉴别到了3ee9/MMAE的抗体部分(3ee9)。进一步检测活性Fab在加入到MN阳性细胞上时的选择性结合并进行内化的能力。然后将所得到的活性Fab转变成全长人IgGl抗体，在CHO细胞中表达、纯化，然后缀合到毒性簇MMAE(Liuetal,ProcNatlAcadSd,1996,93:8618画8623)上。然后测试缀合抗体杀死表达MN的细胞的能力。在所测试的一组七个全长抗体中，根据其体外和体内分析中的结合性质、选择性和效力，选择到了3ee9/MMAE。4面爭/ff^^「Aaco^)为W，和才法在BIAcore3000设备(Acore,Uppsala,瑞典)上使用表面等离子技术分析表达人MN蛋白的HKB11和人全长抗MNMab之间的结合相互作用。对于芯片制备来说，使用标准胺偶联试剂盒(BIAcore,Uppsala,瑞典)将山羊抗人IgGFc共价偶联到CM5生物传感器芯片上。然后使用捕获分析将感兴趣的抗体结合到固定了抗人IgGFc的表面上，目标是300个应答单位的BIAcore信号。在25。C下操作BIAcore,流速是10|ul/mm流动緩沖液，其中含有10mMNa-HEPES,pH7.5A50mMNaCl/3mMEDTA/0.005。/o吐温20。配体结合之后，将流速增加到25pl/min,让MN分析物(50nM到1nM)流过表面10分钟以便能够监测締合阶l殳。然后进行离解35分钟，接着用10mM磷酸以100lul/min再生固定了抗人IgGFc的表面。使用1:1Langmmr结合模型拟合传感曲线以计算速率常数(表1,如下)。表1通过表面等离子共振(Biacore)确定的来自淘选的抗体对可溶性MN的亲和力<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>的kD,与未缀合抗体3ee9的亲和力相同。对MN(CAIX)的结合似乎是特异性的，因为对13种其它碳酸酐酶没有可检测的结合。观察到了对线粒体相关的CA5的结合，但是该同工酶将难于接触到体内抗体。通过FACS分析，证明3ee9/MMAE结合表达MN的MaTu细胞，但是不结合MN阴性的DLD细胞(图10a)。在整个体外研究中使用MN抗体G250，即一种人源化IgGl抗体(Wilex)作为参照。它以5.3nM的Kd结合MN,显示了与3ee9/MMAE相似的结合MN+和MN-细胞系的结合曲线。对于抗体1E4和laal免疫缀合物获得了相似结果(分别见图10b和10c),显示了与MN+细胞的结合，但是不与MN-细胞结合。3ee9/MMAE被表达MN的细胞(PC3mm2)选择性内化，但是不被MN阴性的细胞内化，这是Cellomics所测得的(图lla)。类似地，发现了1E4免疫缀合物被MN+细胞(PC3mm2)内化，但是不被MN-(DLD1)细胞内化(图lib)。为进一步研究特异性，将包括3ee9/MMAE抗体部分(3ee9)和参照抗体GMO在内的各种候选抗体与MN+(P。mm"和MN-(DLD-1)细胞系的细胞裂解物保温，这些细胞系已用生物素选4奪性标记。将抗体和细胞蛋白之间的复合物免疫沉淀，使用酶联链霉亲和素显色的免疫印迹来观察共沉淀的抗原。G250和3ee9/MMAE的3ee9抗体都与来自MN+细胞的同样大小的MN单一条带选择性结合并共免疫沉淀(图12)。特异性4交差的抗体诸如3ef2、5aa3和5A6除了与MN共免疫沉淀之外，还与几种其它蛋白共免疫沉淀。进行体外细胞毒性分析。发现3ee9/MMAE对表达MN的PC3mm2细胞是高毒性的(EC50=50nM)，但是对MN阴性的MIAPaca2细胞是无毒的(图13a)。甚至在高达luM的剂量时也只发现少于10。/。的MN阴性细胞的杀伤。在体外细胞毒性分析中也发现1A4免疫缀合物对于MN+细胞(PC3mm2和MaTu)是选择性细胞毒性的，但是对于MN-细胞(MIAPaca2和DLD1)是无毒的(图13b)。此外，在体外细胞毒性分析中发现laal免疫缀合物对于MN+细胞(PC3mm2)是选择性细胞毒性的，但是对于MN-细胞(MIAPaca2)是无毒的(图13c)。通过3ee9/MMAE输送的细胞毒性药物是微管蛋白抑制剂，它抑制细胞有丝分裂期间的纺锤体形成，导致停滞G2/M。用3ee9/MMAE处理表达MN的细胞(Pc3mm2)和不表达MN的细胞(H460)的效果显示于图14中。用荧光标记抗体染色微管蛋白。未处理细胞显示正常的纺锤体形成，而处理过的表达MN的细胞显示了片段化的纤维，这是微管蛋白与MMAE结合产生的，抑制了正常的纺锤体形成。在不表达MN的细胞中未发现活性。这些研究证实抗体药物缀合物3ee9/MMAE通过靶向的微管蛋白破坏而杀死了细月包。实施例12:免疫缀合物的体内活性3ee9/A/A^4E#,,^T7"移孩W入7f^移控;^^娄^谬力^埋夢当通过l争脉途径以间隔的方案给药时，3ee9/MMAE显示了对于无胸腺小鼠中多种人异种移植肿瘤模型的生长具有显著的且一致性的抗胂瘤功效。在6个不同的人异种移植肿瘤模型中检测了3ee9/MMAE的体内抗肿瘤功效。这些模型是通过将人肿瘤细胞皮下移植到雌性无胸腺NCr(冊/"w)小鼠(Taconic,NY)中而建立的。所评估的人肿瘤异种移植才莫型包括MaTu人乳腺癌模型、HT-29和Colo-205人结直肠癌(CRC)模型、PC3MM2前列腺癌模型、HCT-15多药物抗性(P-gp)CRC模型以及MiaPaCa2人胰腺癌模型。将PBS用作赋形剂，每天新鲜制备剂量溶液。剂量体积是0.1mL/10g(10mL/kg)。使用电子卡尺每周测量2-3次每个肿瘤的长度和宽度，根据公式[长度(mm)x宽度(mm)2]/2计算肿瘤重量(mg)。在抗肿瘤数据牟集系统(ADAS)中记录整个研究过程中获得的所有数据包括日常观察结果。最大耐受剂量(MTD)定义为不产生超过20%死亡率和/或20%净体重减轻的最高剂量。肿瘤生长抑制(TGI)计算为l-T/Cx100,其中T:来自最后剂量之后的处理组的最终肺瘤重量，C=来自最后剂量之后的对照组的最终肿瘤重量。此外，作为应答发生率测定了抗肿瘤功效(或者是应答者或者是消退)，其定义为S50%原始大小的肿瘤。最少需要7天的持续时间来进行应答才一皮认为是持久的。Afo『w^3ee9/MM4五W^妓将人乳腺异种移植物MaTu细胞作为贴壁培养物培养在补充了10%FBS的RPMI中。用0.1mL的80%matrigel/20%HBSS中的5x106个细胞皮下接种在Ncr棵鼠(8-12周龄)的右胁腹。当肿瘤达到约180mg的平均大小时(6天)，开始进4亍处理。4争力永注射给药BAY79-4620(3ee9-IC)，以1、3和10mg/kg的剂量每四天给药一次(Q4Dx3)。对照小鼠用PBS或未缀合的单克隆抗体以10mg/kg剂量进行处理。对每只动物的健康状况每天进行检测。每个实验组由10只小鼠组成，剂量体积是O.lmL/10g体重。通过使用电子卡尺每周测量2-3次每个肿瘤的长度和宽度，根据公式[长度(mm)x宽度(mm)"A计算肿瘤重量(mg)。记录整个研究过程中获得的所有数据包括日常观察结果。肿瘤生长抑制(TGI)计算为l-T/Cx100,其中丁=来自处理组的最终肿瘤重量，C=来自对照组的最终肿瘤重量。3ee9/MMAE在所4企测的所有剂量下都是良好耐受的，所有的处理动物都没有显示出显著的重量减轻。3ee9/MMAE在MaTu肺瘤才莫型中的典型效果说明在图15中。来自未处理组和赋形剂处理的对照组的肿瘤在所有动物中都逐渐在生长。对照组和赋形剂组动物的平均倍增时间是11.2天。在用药剂量结束时，3ee9/MMAE在所有检测剂量下都显示了强的抗肺瘤功效。更特别地，BAY79-4620(3ee9-IC)在1、3和10mg/kg时分别产生了67、72和78。/。的TGI。相比之下，未缀合的3ee9mAb在抑制该乳腺异种移植肿瘤的生长方面没有明显功效。在预定剂量方案(Q4Dx3)完成之后，确定3ee9/MMAE对肿瘤生长延緩和消退的影响。如图15所示，3ee9/MMAE的处理产生了显著的肿瘤生长延緩和消退。在所检测的最低剂量(lmg/kg)时，终止处理之后，肺瘤稳定保持了大约2周，其后就开始重新生长。总的来说，30%的肿瘤对lmg/kg的这种处理是有应答的。相比之下，当用3和10mg/kg进4亍攻击时，100%的动物都应答。值得注意的是，即使在终止处理之后大约3个月后，在3和10mg/kg组也分别只有3个和1个胂瘤显示了重新生长的迹象，这表明即^f吏在终止处理之后大约90天后，70%和90%的动物仍然是没有肿瘤的。当缀合到细月包毒性药物上时，单克隆的IgGl1E4在以30mg/kg免疫缀合物给药时产生了对于人乳腺异种移植物MaTu的显著抗肺瘤功69效，而未缀合的抗体没有效果(图16)。使用同样方案但是替换成抗体laal(图17)、3ee9和5aa3的缀合形式的进一步实验得到了相似结果。此外，当使用3ee9的缀合形式时，在源自各种组织类型的其它人异种移植模型，包括HT-29和Colo-205人结直肠癌异种移植模型以及人前列腺异种移植模型PC3-mm2中发现了抗肿瘤功效。这些数据证明了针对MN蛋白的抗体，作为载体用于将细胞毒性药物输送到肿瘤的治疗用途。实施例13:确定MaTu异种移植模型中3ee9/MMAE的治疗指数使用带有MaTu异种移植肿瘤的小鼠来确定3ee9/MMAE的最大耐受剂量(MTD)、最小有效剂量(MED)和治疗指数(TI)。TI定义为MTD除以MED的比值。每4天一次静脉内》会药3ee9/MMAE，总共3次注射(Q4Dx3)。3ee9/MMAE的给药剂量水平是0.625、1.25、2.5、5.0、10、30和60mg/kg。对照小鼠用PBS或未缀合的单克隆抗体以60mg/kg剂量进行处理。60mg/kg剂量的3ee9/MMAE似乎是MTD,因为反应于这种处理，有10%的死亡率和约20%的体重减轻。所有的其它处理组都是良好耐受的。3ee9/MMAE的抗肺瘤活性呈现在图18中。在用药剂量结束时，0.625和1.25mg/kg剂量的3ee9/MMAE分别产生了62%和81%的抑制。2.5、5、10、30和60mg/kg的剂量产生了更大程度的肺瘤生长抑制(约90%),大多数肿瘤都开始显示出消退。#^居观察到的数据，3ee9/MMAE的MED是0.625mg/kg。在预定剂量方案(Q4Dx3)完成之后，确定3ee9/MMAE对肺瘤生长延緩和消退的影响。0.625mg/kg的剂量没有发现肿瘤消退。相比之下，80%的动物都显示了对1.25mg/kg进行应答的肿瘤消退。而且，2.5mg/kg以及更高的剂量时，100%的动物都对处理有应答。3ee9/MMAE的治疗指数纟皮确定为约96。实施例14:3ee9/MMAE在HT-29异种移植模型中的功效用0.1mLHBSS中的5x106个细胞将人CRC异种移植物HT-29细胞皮下接种在右胁腹。当肺瘤达到约120mg的平均大小(5天)时，开始进行处理。每四天静脉内给药3ee9/MMAE—次(Q4Dx3),剂量是0.625、1.25、2.5、5.0、10mg/kg。对照小鼠用PBS或未缀合的单克隆抗体以10mg/kg的剂量进行处理。此外还评估了作为游离药物的MMAE,剂量为0.1、0.2和lmg/kg。0.1和0.2mg/Kg的MMAE分别代表了与5和10mg/Kg3ee9/MMAE相当量的这种药物。3ee9/MMAE在所有检测剂量下都是良好耐受的，所有处理动物都未显示出显著的重量减轻。类似地，较^氐剂量即0.1和0.2mg/kg的MMAE也是良好耐受的，表现出不显著的、最低程度的重量减轻。然而，在lmg/kg的最高剂量,观察到了50%的死亡率，剩下的动物也都显示出了严重的重量减轻，因而被认为是有毒的。3ee9/MMAE和游离MMAE在HT-29肺瘤才莫型中的典型功步支示于图19中。来自未处理组和赋形剂处理的对照组的肿瘤在所有动物中都逐渐在生长。对照组和赋形剂组动物的平均倍增时间是6.4天。在用药剂量结束时，3ee9/MMAE在所有4全测剂量下都显示了强的抗肿瘤功效。更特别地，0.625、1.25、2.5、5和10mg/kg剂量的3ee9/MMAE分别产生了54、72、97、100和100%TGI。相比之下，0.2mg/kg的游离MMAE产生了60。/。的显著TGI，而O.lmg/kg在抑制该异种移植才莫型的生长方面没有显著效果。在肿瘤应答方面，1.25mg/kg剂量的3ee9/MMAE导致20%的动物显示出了消退。在更高剂量，肿瘤应答更强，2.5mg/kg显示了90%的消退，5和10mg/kg诱导了100%的应答。相比之下，游离MMAE没有诱导如上所述的任何肿瘤应答。也分析了不同方案的3ee9/MMAE的抗肿瘤效应，也就是每周给药一剂总共给药两剂(Q7Dx2,图20)以及在进程中给药单剂(QlDxl，图21)。在两种方案中，3ee9/MMAE的剂量是0.625、1.25、2.5、5和10mg/kg。不管是哪种方案，3ee9/MMAE在该CRC异种移才直才莫型中抑制生长方面是高度有效的。下面的表2总结了3ee9/MMAE的抗肺瘤功效。抗胂瘤功效与3ee9/MMAE的Q4Dx3方案中所观察到的非常相似，这表明在所冲企测的方案中，3ee9/MMAE的抗肿瘤功效似乎是依赖于方案的。3ee9/MMAE的抗胂瘤功效化合物剂量(mg/kg)处理的方案%抑制(1國T/D)"00(第18天)消退百分比对照N/A■N/A0PBS0Q4Dx3-1703ee9Ab10Q4Dx3-1103EE9IC0.625Q4Dx35403EE9IC1.25Q4Dx37223EE9IC2.5Q4Dx39793EE9ICQ4Dx3100103EE9IC10Q4Dx3100103EE9IC0.625Q7Dx24803EE9IC1.25Q7Dx27103EE9IC2.5Q7Dx29243EE9IC5Q7Dx29673EE9IC10Q7Dx2100103EE9IC0.625QlDx14203EE9IC1.25QlDx14803EE9IC2.5QlDx1933EE9ICQlDx19883EE9IC10QlDx110010MMAE1Q4Dx3丁oxicN/AMMAE0.1Q4Dx3270MMAE0.2Q4Dx3600实施例15:3ee9/MMAE在PC3mm2和Colo-205异种移植才莫型中的功效72接下来评估3ee9/MMAE对人前列腺(PC-3mm2)和CRC(Colo-205)肿瘤异种移植物的抗肿瘤功效。用5x106个PC3mm2或Colo-205细胞皮下(s.c.)植入雌性NCr"w/"w小鼠。当肺瘤平均大小在大约120-150mg时开始进行处理。每天监测并记录小鼠的一般健康。从处理第一天开始每周记录两次胂瘤尺寸和体重。在PC3mm2和Colo-205研究中，每4天静脉内(i.v.)给药一次3ee9/MMAE,总共注射3次(Q4Dx3)，剂量分别为1、3、10和30mg/kg以及1.25、2.5、5和10mg/kg。象其它研究中一样，在所有评估的剂量时3ee9/MMAE都是良好耐受的。当以10和30mg/kg的剂量给药时，3ee9/MMAE抑制了已产生的PC3MM2前列腺肺瘤的生长，100%的动物显示出应答(图22)。在1和3mg/kg的较低剂量，只发现了中等的效应，因为在剂量给药结束时观察到了45到50%的TGI。然而，3mg/kg组的20%的动物确实显示了应答。类似地，在Colo-205CRC异种移才直才莫型中，3ee9/MMAE在抑制肺瘤生长方面是高度有效的(图23)。在剂量给药结束时，对于5和10mg/kg的剂量观察到了〉90%的TGI,在应答2.5mg/kg剂量中发现了>70%的TGI。3ee9/MMAE的1mg/kg的最低剂量对该CRC才莫型是相对无效的。在消退方面，5和1Omg/kg剂量的3ee9/MMAE分别产生了40%和80%的应答。实施例16:3ee9/MMAE在HCT-15异种移植模型中的功效为才企测3ee9/MMAE在多药物抗性才莫型中的效果，用5x106个HCT-15细胞皮下(s.c.)植入雌性NCr鼎/薦小鼠。HCT-15是过表达P-糖蛋白(P-gp)的多药物抗性(MDR)细胞系。因而，该细胞系显示了多药物抗性表型，对他克唑@、阿霉素和依托泊苷是有抗性的。当小鼠产生了平均重量约150mg的胂瘤时，就给予3ee9/MMAE、他克唑和吉西他滨。吉西他滨是一种非P-gp底物的嘧。定类似物，它一皮用作阳性对照。如所预期的，吉西他滨(120mg/kg,i.p.,QDxlO)在该MDR模型中是高度活性的(图24)。相比之下，3ee9/MMAE(MMAE是P-gp的已知底物)和他克唑不能产生任何显著抗肺瘤效应。实施例17:3ee9/MMAE在huMN-MIAPaca2和MIAPaca2异种移植模型中的功效为更好理解MN表达和抗肺瘤功效之间的关系，使用低MN表达的胰腺模型MIAPaCa2和高MN表达的huMN-MIAPaCa2模型来进行异种移植功效研究。后一种细胞系是通过工程化MIAPaCa2细胞系以稳定表达MN而得到的。3ee9/MMAE在抑制该低MN表达的MIAPaCa2细胞系的生长方面具有最低效果(图25)。10mg/kg剂量的3ee9/MMAE仅产生了50%的TGI。相比之下，发现了3ee9/MMAE对huMN-MIAPaCa2模型的显著抗肺瘤活性，其中在剂量给药结束时，2.5、5和10mg/kg的剂量分别产生了63、82和94。/。的TGI。而且，10mg/kg的剂量诱导了100%的应答，这表明通过在肺瘤中过表达MN水平产生了敏感性的极大改变。实施例18:在Colo-205异种移植模型中与希罗达⑧的组合研究了3ee9/MMAE与其它癌症化疗剂一起使用的可行性。希罗达⑧被用作患有转移性结直肠癌的患者的一线治疗。评估了使用3ee9/MMAE和希罗达@的联合疗法的活性和耐受性。根据Q4Dx3方案静脉内给药3ee9/MMAE,剂量水平是1.25、2.5和10mg/kg。希罗达⑧每天口服一次给药9天，剂量水平是250和500mg/kg。单独以2.5和10mg/kg给药3ee9/MMAE产生了强的肿瘤生长抑制(分别是73%和96%的TGI)(图26a)。然而1.25mg/kg组的3ee9/MMAE是相对无效的，仅产生31%的TGI。以250和500mg/kg剂量水平单独给药希罗达⑧也产生了加强的TGI,分别是78%和86%。在应答方面，10mg/kg组的3ee9/MMAE诱导了80%的应答率，而希罗达两个剂量组的动物都没有显示任何消退。所有的联合处理组都是良好耐受的，产生了显著的肿瘤生长抑制以及应答率。这两种试剂的组合产生的TGI和肺瘤应答详细定量数据显示在图26a和26b以及下面的表3中。在所检测的剂量中，3ee9/MMAE与希罗达⑧组合的抗肺瘤活性远优于作为单一试剂给药的3669/]\1]^八6或希罗达@。最后，关于耐受性，这些治疗剂的给药是相当耐受的，没副反应。表3BAY79-4620(3ee9-IC)与希罗达⑧组合的抗肺瘤活性处理<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>实施例19:抗双侧移植的人异种移植癌模型的3ee9mAb的体内分布/肿瘤定位为确定3ee9/MMAE的mAb组分的体内分布和肿瘤定位，使用CRIMaestroTM在小鼠中进行了非侵入性的体内成像研究，所述小鼠接受了显示出高的和低的MN表达的胂瘤的双侧移植。设计了带有多重谱采集和分析的MaestroTM体内成像系统(CRI,Woburn,MA)来消除自身荧光背景。根据厂商说明书用AlexaFluor750(InvitrogenCat#A20011)缀合BAY79-4620的Mab3ee9、M75(识别MN的小鼠单克隆)和对照的人IgG。蛋白/AF750(mol/mol)的比对于3ee9是1/5.9,对于人IgG是8.9,对于M75是6.0。在注射每种焚光标记抗体之前12天，用MIAPaCa-2(低MN表达的；50%Matrigel中的7.5x106个细胞)皮下接种在右胁腹、用hu画-MIAPaCa2(转染了画的稳定细J包系；50%Matrigel中的5xl06个细胞)皮下接种在左胁腹进行HarlanBalb/C棵鼠的移植。在第0天(移植后第12天)注射4pg的缀合抗体给每只动物。在第4天、第5天和第10天进行成像。使用被麻醉的动物(腹膜内注射100mg/kg氯胺酮/10mg/kg甲苯噻嗪)并置于成像系统内采集数据。用680到950nm光谱范围内每10nm间隔的图象获得多重光谱成像立方体(系列图象)，其覆盖了近红外区(NIR)范围。每个图象曝光5秒。使用Maestro软件从光语立方体合成假彩色图象，使用ImageProPlus6.0调整到可见亮度。将所有图象调整一致，最亮的图象稍微低于饱和水平。大多数焚光标记的抗体都倾向于定位在肝和膀胱。4到5天后，然后来自肝和膀胱的大多数信号都降低了，在肺瘤中的信号稳定了。在第5天拍摄的图象产生了最高的信号与背景的比(图27)。五天之后，注射hlgG的动物几乎不产生信号了，这表明hlgG不能定位到肿瘤组织中。相比之下，M75和3ee9都特异性定位到高MN表达的(huMN-MIAPaCa2)肺瘤中。在同一动物中没有发现低MN表达的MIAPaCa2肺瘤的定位。实施例20:作用的体内机制为探索3ee9/MMAE的体内作用冲几制，用5乂106个HT-29细胞皮下接种小鼠的右胁腹进行肺瘤移植。八天后，用赋形剂或者用1.25和5mg/kg的3ee9/MMAE(QlDxl)处理带有HT-29肿瘤的无胸腺小鼠。在给药3ee9/MMAEl、3和5小时之后，采集肺瘤，在甲醛中固定4小时。然后将样品包埋在石蜡中，切片成5(Lim，去除石蜡，使用用于人组织的荧光免疫组化的标准方案进行染色，使用的是小鼠抗体抗a/(34敖管蛋白、抗磷酸组蛋白H3和DNA。然后在荧光显微镜下观察玻片，通过三个独立的彩色通道获取典型图象。3ee9/MMAE在4hr样品中对于影响细胞机制来说几乎没有效果。然而，到第1天，就有更多细胞停留在G2/M,并清楚地发现了多极纺4垂体。此外，可以观察到微管蛋白染色水平的降低。然后这些效果在第3天样品和第5天样品中一皮极大放大了。实际上，在第5天的3ee9/MMAE的5mg/kg剂量组中的几乎所有细胞都被处理所严重影响(图28)。这些数据清楚表明，3ee9/MMAE影响癌细胞生长是通过抑制微管蛋白，导致G2/M停滞和凋亡。下面的表4总结了3ee9/MMAE的性能谱。表43ee9/MMAE镨分析3ee9/MMAE的结果亲和力(Kd)3.6nM细月包结合(FACS):MN+/MN-+++/-内化画+/画-+++/-细月包毒性MN+/MN-(ec50)50nM/,M免疫沉淀特异性IHC特异性体内分布正常体内活性MED1mg/kg体内活性；MTD60mg/kg实施例21:使用稳定CHO细胞表达系统进行的基于3ee9轻链和重链CDR可变区的抗MNIgG的表达载体构建、转染、表达和纯化表达载体3ee9H+TpCMVTTmP.8的构建将来自载体3ee9pMORPHx9(根据实施例1-3获得)的K和重链CDR可变区(分别是SEQIDNO:126和125)如下所述插入到载体H+LpattB77(MLLaboratories)中。将来自3ee9pMORPHx9(根据前述实施例例如实施例1-3制备)的大约350个碱基对的EcoRV-BsiWI限制酶片段插入到H+LpattB的EcoRV谱BsiWI限制酶位点中以产生载体3ee9kappapAttB。接下来，将来自3ee9pMORPHx9的大约350个碱基对的Mfel-Bllpl限制酶片段插入到3ee9kappapAttB的EcoRI-Blpl限制酶位点中以产生3ee9H+LpattB。然后^f吏用GatewayBPClonaseII酶混合物(InvitrogenCat.#11789-100)将3ee9重链和轻链编码序列(分别是SEQIDNO:126和125)与pDONR221(InvitrogenCat.#12536-017)重组以产生载体3ee9H+LpENTR。使用GatewayLRClonaseII酶混合物(InvitrogenCat.#11791-100)经3ee9H+LpENTR和pCMV—UCOE8—DEST之间的重组而产生了载体3ee9h+l.pCMVUCOE8。如下所述构建pCMV—UCOE8—DEST。将Gateway载体转变盒(Invitrogen;cat#11828-029)插入到pCET906的Smal位点中以产生载体pCET906—gw。从MLLaboratories获得载体pCET906,它净皮充分描述于Williamset.al.,BMCBiotechnology,(2005),5:17,将其引入本文作为参考。然后将来自pCET906一gw的大约2900个碱基对的Agel限制酶片段克隆到pCET1015的Agel位点中以产生pCMV—UCOE8—DEST。也从MLLaboratories获得载体pCET1015,它描述于Williamsetal.中，同上。在抗ccdB毒素基因的大肠杆菌菌抹(诸如作为"一次命中ccdB存活T细胞,，("OneShotccdBSurvivalTlcells，，)进行销售的来自Invitrogen(cat#:C7510-03)的那些)中增殖载体pCMV—UCOE8—DEST。3ee9H+LpCMVUCOE8插入片段的完整核苷酸序列示于图29中，也就是从载体3ee9pMORPHx9获得的编码人IgG抗MN抗体的完整核苷酸序列，该抗体包括分别为SEQIDNO:126和125的k和重《逸CDR可变区。细胞克隆3ee9.25的分离为了用载体3ee9h+l.pCMVUCOE8转染CHO-S细月包，将60吗的DNA稀释到2mL的CDCHO完全培养基(mvitrogeirfl0743-029)中，其含有8mML-谷胺酰胺和HT(invitrogen)且不含PenStrep。接下来将2ml的CDCHO完全培养基加入到250ml锥形瓶中。然后将150的DMRIE-C(Invitrogenca估10459-014)加入到瓶中，室温保温10分钟。然后将稀释的DNA与稀释的DMRIE-C混合，用5%C02吹扫，室温保温30分钟。保温期间，在CDCHO完全培养基(没有P/S)中制备4ml密度为5xl06c/mL(总共2xl0个细胞)的CHO-S细胞。保温之后，将细胞加入到带有DNA-DMRIE-C复合物的瓶中，然后轻轻涡旋进行混合。然后用5%C02吹扫，37。C下125rpm振荡4小时。接下来，将32ml的不含PenStrep的CDCHO完全培养基加入到瓶中，用5%C02吹扫，然后回到振荡器(37°C)中过夜。24小时后，计数细胞，旋转，以适当细胞密度重悬浮在添加了5.5mL/LPenStrep的带有20%条件培养基和抗生素(12.5pg/ml嘌呤霉素)的CDCHO完全培养基中进行铺板。将细胞以100、300、900和2700个细胞/孔铺在96孔平板中。然后将平玲反保温在5%032培养箱中大约3周。小心不要干扰板。从这样的平板扩增个体克隆，该平板具有的孔中少于20%的孔中含有单个菌落。将细胞扩增到每孔带有1ml选择培养基的非组织处理的24孔平板上。将细胞保温大约l周，如果需要的话，其间可加入500jaL新鲜培养基。在单个稀释物中测试抗体表达以排除不表达的克隆。<吏用1:5稀释物(5uL上清液加入95uLTBS/吐温)一式两份经ELISA测试克隆。排除所得OD(光密度)低于0.1的克隆。将阳性克隆扩增到非组织处理的6孔平板上。接下来以4xl(^个细胞/mL的密度用5mL细胞进行接种。保温4天后，经ELISA确定蛋白表达。使用1:50、1:100、1:200和1:400稀释物测试克隆。克隆3ee9.25显示了最高的分泌抗体浓度。将3ee9.25细胞转移到125mL锥形瓶中，以2xl05个细胞/mL进行接种以适合细胞悬浮生长。抗MNIgG的表达将转染的CHO-S细胞以500,000个细胞/ml接种到Wave10升生物反应器(WaveBiotech,300FranklinSquareDrive,Somerset,NewJersey,08873，USA)中。细胞在50%CD-CHO培养基(Invitrogen10743)、50%SigmaCHO培养基第5号(Sigma0363)、1%FCS、lxHT添加物(Invitrogen11067-030)、青霉素/链霉素(Invitrogen15140-122)、8mML隱谷胺酰胺(Invitrogen25030-081)和12.5貼/ml噤呤霉素(BD631305)中培养七天，生物反应器在5。/oC02下于37。C以25rpm进行振荡。发酵周期结束之后，通过离心收集消耗的培养基，在IgG纯化之前进行无菌过滤(0.2阔。抗MNIgG的纯化使用Prep-ScaleTFF-230kDCartridge(Millipore)将10到20L含IgG的细胞培养基典型地浓缩2到5倍。向浓缩培养基中加入lMTris-Cl緩冲液pH7.5到终浓度50mM。然后加入5.0MNaCl到终浓度150mM。典型地将浓缩培养基加样到用PBS,pH7.4平衡过的30mL蛋白琼脂糖柱中。用含有0.1%吐温20和lmMEDTA的PBSpH7.4漂洗柱子。然后用PBS漂洗柱子，用100mM甘氨酸緩冲液pH3.0洗脱。一收集，就用1MTris-ClpH7.8将级分中和到pH7.5。经透析将纯化的IgG转移到PBS中，通过过滤(0.2pM)灭菌。将最终纯化的抗体制剂调整到1和5mg/mL之间，通过用考马斯亮蓝染色的SDSPAGE凝胶确定，它显示出>95%的纯度，其中蛋白作为两条带进行迁移，相应于Mr二50kDa的重链和Mr25kDa的轻链，通过SECHPLC确定，它具有小于lEU/mg蛋白的内毒素水平以及小于10%的蛋白聚集。也通过表面等离子共振对制剂的MN抗原结合进行功能性Q.C.,通过FACS测定了对表达MN的细胞的结合，通过自动成像(Cellomics)确定了它内化到表达MN的细胞中。20L混合发酵物典型地产生1克纯化蛋白，总回收率在50到75%。使用ABIProcise494HT测序仪对纯化的全长3ee9抗体的255pmol最终制剂进行N端测序，产生了368pmo1的如下预期序列的成熟k轻链3ee9的成熟Vk1轻链(SEQIDNO:146)的相应N端序列是相同的。未通过Edman测序检测到重链，这表明它的序列被封闭了。承*承如此详细描述了本发明的优选实施方案，但要明白的是，由上述段落定义的发明并不打算被限定到上述说明书中提供的特定细节，因为它的许多显而易见的改变都是可能的，只要不背离本发明的精神或范围。权利要求1.具有特异性针对MN蛋白的抗原结合位点的抗体或抗体片段，其中抗原结合位点包括至少一个CDR1、CDR2或CDR3(a)所述CDR1选自SEQIDNO57，58，59，60，61，62，77，80，81，86，87，88，89，98，99，104，107，108，以及与SEQIDNO57，58，59，60，61，62，77，80，81，86，87，88，89，98，99，104，107或108的任一序列具有高于大约80％序列同一性的氨基酸序列；(b)所述CDR2选自SEQIDNO63，64，65，66，67，68，69，78，82，83，90，91，92，93，100，101，105，109，110，以及与SEQIDNO63，64，65，66，67，68，69，78，82，83，90，91，92，93，100，101，105，109或110的任一序列具有高于大约80％序列同一性的氨基酸序列；并且(c)所述CDR3选自SEQIDNO70，71，72，73，74，75，76，79，84，85，94，95，96，97，102，103，106，111，112，以及与SEQIDNO70，71，72，73，74，75，76，79，84，85，94，95，96，97，102，103，106，111或112的任一序列具有高于大约80％序列同一性的氨基酸序列。2.根据权利要求1的抗体或抗体片段，其中抗原结合位点包括重链可变区CDR,其选自SEQIDNO:57-85以及与SEQIDNO:57-85的任一序列具有高于大约80%序列同一性的氨基酸序列。3.根据权利要求1的抗体或抗体片段，其中抗原结合位点包括轻4连可变区CDR,其选自SEQIDNO:86-112以及与SEQIDNO:86-112的任一序列具有高于大约80%序列同一性的氨基酸序列。4.根据权利要求1的抗体或抗体片段，其中抗原结合位点包括一组CDR序列，其选自(a)[3ee9〗SEQIDNOS:57,63，70，89,93和97;(b)[3ef2]SEQIDNOS:58,64,71,107,109和111;(c)[le4]SEQIDNOS:59,65,72,107,109和111;(d)[3a4]SEQIDNOS:60,66,73,108,110和112;(e)[3ab4]SEQIDNOS:61,67,74,87,91和95;(f)[3ahl0]SEQIDNOS:61，68,75,88,92和96;(g)[3bb2]SEQIDNOS:62,69,76,98,100和102;(h)[laal]SEQIDNOS:77,78,79,86,90和94;(i)[5a6]SEQIDNOS:80,82,84,99,101和103;以及(j)[5aa3]SEQIDNOS:81,83,85,104,105和106。5.根据权利要求1的抗体或抗体片段，其中抗原结合位点包括一组重链CDR序列，其选自(a)[3ee9]SEQIDNOS:57,63和70;(b)[3ef2]SEQIDNOS:58,64和71;(c)[le4]SEQIDNOS:59,65和72;(d)[3a4]SEQIDNOS:60,66和73;(e)[3ab4]SEQIDNOS:61,67和74;(f)[3ahl0]SEQIDNOS:61,68和75;(g)[3bb2]SEQIDNOS:62,69和76;(h)[laal]SEQIDNOS:77,78和79;(i)[5a6]SEQIDNOS:80,82和84;以及①[5aa3]SEQIDNOS:81，83和85。6.根据权利要求1的抗体或抗体片段，其中抗原结合位点包括一组轻链CDR序列，其选自(a)[3ee9]SEQIDNOS:89,93和97;(b)[3ef2]SEQIDNOS:107,109和111;(c)[le4]SEQIDNOS:107,109和111;(d)[3a4]SEQIDNOS:108,110和112;(e)[3ab4]SEQIDNOS:87,91和95;(f)[3ahl0]SEQIDNOS:88,92和96;Cg)[3bb2]SEQIDNOS:98,100和102;(h)[laal]SEQIDNOS:86,90和94;(i)[5a6]SEQIDNOS:99,101和103;以及(0[5aa3]SEQIDNOS:104,105和106。7.根据权利要求1的抗体或抗体片段，其中该抗体或抗体片段以大约0.15nM到大约50nM的离解常数结合到MN蛋白上。8.根据权利要求1的抗体或抗体片段，其中抗体是IgG。9.根据权利要求1的抗体或抗体片段，其中抗体是IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgD、IgE、IgA、IgMFab片段、F(ab，)2片段、scFv片段、Fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体、生物特异性抗体、嵌合抗体或者多特异性抗体。10.根据权利要求1的抗体或抗体片段，其中抗体或抗体片段是人源化的。11.根据权利要求1的抗体或抗体片段，其中CDR1、CDR2和CDR3是非人的。12.组合物，其包括根据权利要求1的抗体或其抗体片段以及一种或多种药学辅助性物质。13.根据权利要求1的抗体或抗体片段，其中序列同一性高于大约85%。14.根据权利要求1的抗体或抗体片段，其中序列同一性高于大约90%。15.根据权利要求1的抗体或抗体片段，其中序列同一性高于大约95%。16.根据权利要求1的抗体或抗体片段，其中序列同一性高于大约99%。17.对MN蛋白具有反应性的组合物，其包括缀合到细胞毒性试剂上的、具有特异性针对MN蛋白的抗原结合位点的抗体或抗体片段，其中抗原结合位点包括至少一个CDR1、CDR2或CDR3:(a)所述CDR1选自SEQIDNO:57,58,59,60,61,62,77,80，81,86,87,88,89,98,99,104,107,108，以及与SEQIDNO:57,58,59,60,6162,77,80,81,86,87,88,89,98,99,104,107或108的4壬一序列具有高于大约80%序列同一性的氨基酸序列；(b)所述CDR2选自SEQIDNO:63,64,65,66,67,68，69,78,82,83,90,91,92,93,100,101,105,109,110,以及与SEQIDNO:63,64,65,66,67,68,69,78,82,83,90,91,92,93,100,101,105,109或110的任一序列具有高于大约80%序列同一性的氨基酸序列；并且(c)所述CDR3选自SEQIDNO:70,71,72,73,74,75,76,79,84,85,94,95,96,97,102,103,106,111,112,以及与SEQIDNO:70,71,72,73,74,75,76,79,84,85,94,95,96,97,102,103,106,111或112的任一序列具有高于大约80%序列同一性的氨基酸序列。18.根据权利要求17的组合物，其中抗原结合位点包括重链可变区CDR，其选自SEQIDNO:57-85以及与SEQIDNO:57-85的任一序列具有高于大约80%序列同一性的氨基酸序列。19.根据权利要求17的组合物，其中抗原结合位点包括轻链可变区CDR,其选自SEQIDNO:86-112以及与SEQIDNO:86-112的任一序列具有高于大约80%序列同一性的氨基酸序列。20.根据权利要求17的组合物，其中抗原结合位点包括一组CDR序列，其选自(a)[3ee9]SEQIDNOS:57,63,70,89,93和97;(b)[3ef2]SEQIDNOS:58,64,71,107,109和111;(c)[le4]SEQIDNOS:59,65,72,107,109和111;(d)[3a4]SEQIDNOS:60,66,73,108,110和112;(e)[3ab4]SEQIDNOS:61，67,74,87,91和95;(f)[3ahl0〗SEQIDNOS:61,68,75,88,92和96;(g)[3bb2]SEQIDNOS:62,69,76,98,100和102;(h)[laal]SEQIDNOS:77,78,79,86,90和94;(i)[5a6]SEQIDNOS:99,101和103;以及(j)[5aa3]SEQIDNOS:104,105和106。21.根据权利要求17的抗体或抗体片段，其中抗原结合位点包括一组重链CDR序列，其选自a)[3ee9]SEQIDNOS:57,63和70;b)[3ef2]SEQIDNOS:58,64和71;c)[le4]SEQIDNOS:59,65和72;d)[3a4]SEQIDNOS:60,66和73;e)[3ab4]SEQIDNOS:61,67和74;f)[3ahl0]SEQIDNOS:61,68和75;g)[3bb2]SEQIDNOS:62,69和76;h)[laal]SEQIDNOS:77,78和79;i)[5a6]SEQIDNOS:80,82和84;以及j)[5aa3]SEQIDNOS:81,83和85。22.根据权利要求17的抗体或抗体片段，其中抗原结合位点包括一组轻链CDR序列，其选自a)[3ee9]SEQIDNOS:89,93和97;b)[3ef2]SEQIDNOS:107,109和111;c)[le4]SEQIDNOS:107,109和111;d)[3a4]SEQIDNOS:108,110和112;e)[3ab4〗SEQIDNOS:87,91和95;f)[3ahl0]SEQIDNOS:88,92和96;g)[3bb2]SEQIDNOS:98,100和102;h)[laal〗SEQIDNOS:86,90和94;i)[5a6]SEQIDNOS:99,101和103;以及j)[5aa3〗SEQIDNOS:104,105和106。23.根据权利要求17的组合物，其中细胞毒性试剂选自单甲基金抑素-E或其功能性类似物、单甲基金抑素-F或其功能性类似物、阿普立丁、氮杂尿苷、阿那曲唑、氮杂胞苷、博来霉素、硼替左米、薯司他丁-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、10-羟基喜树碱、卡氮芥、塞来西布、苯丁酸氮芥、顺铂、伊立替康(CPT-l1)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西他赛、放线菌素、葡糖苷酸柔红霉素、正定霉素、地塞米+>、己烯雌酚、阿霉素、葡糖苷酸阿霉素、葡糖苷酸表阿霉素、炔雌醇、雌氮芥、依托泊苷、葡糖苷醵依托泊苷、磷酸依托泊苦、氟尿苷(FUdR)、3',5'-0-二油酰-FudR(FUdR-dO)、氟达^立滨、氟利坦、氟尿嘧啶、氟羟甲睾酮、吉西他滨、己酸羟孕酮、羟基脲、去甲柔毛霉素、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、甲酰四氬叶酸、罗氮芥、氮芥、醋酸甲孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、巯基噤呤、6-巯基嘌呤、氨甲喋呤、米托恩醌、光神霉素、丝裂霉素、米托坦、丁酸苯酯、强的松、曱基节肼、紫杉醇、喷托他丁、PSI-341、司莫司汀、链脲霉素、他莫昔芬、紫杉烷、紫杉醇、丙酸睾酮、沙立度胺、巯基鸟嘌呤、塞替哌、替尼泊普、拓朴替康、尿嘧啶氮芥、万珂、长春花碱、长春瑞宾、长春新碱、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、豹蛙酶、rapLRl、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素以及它们的组合。24.权利要求17的组合物，其中细胞毒性试剂是单甲基金抑素-E或其功能性类似物。25.根据权利要求17的组合物，其中抗体或抗体片段以大约0.15nM到大约50nM的离解常数结合到MN蛋白上。26.根据权利要求17的组合物，其中抗体是IgG。27.根据权利要求17的组合物，其中抗体或抗体片段是IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgD、IgE、IgA、或IgM同种型、Fab片,爻、F(ab，)2片段、scFv片段、Fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体、生物特异性抗体、嵌合抗体或者多特异性抗体。28.根据权利要求17的组合物，其中抗体或抗体片段是人源化的。29.根据权利要求17的抗体或抗体片段，其中CDR1、CDR2和CDR3是非人的。30.用于治疗患有MN相关癌症的受试者的组合物，其包括抗癌试剂以及缀合到细胞毒性试剂上的、具有特异性针对MN蛋白的抗原结合位点的抗体或其抗体片段，其中抗原结合位点包括至少一个CDR1、CDR2或CDR3:a)所述CDR1选自SEQIDNO:57,58,59,60,61,62,77,80,81,86，87,88,89,98,99,104,107,108,以及与SEQIDNO:57,58,59,60,6162,77,80,81,86,87,88,89,98,99,104,107或108的任一序列具有高于大约80%序列同一性的氨基酸序列；b)所述CDR2选自SEQIDNO:63,64,65,66,67,68,69,78，82,83,90，91,92,93,100,101,105,109,110，以及与SEQIDNO:63,64,65,66,67，68,69,78,82,83,90,91,92,93，100,101,105,109或110的任一序列具有高于大约80%序列同一性的氨基酸序列；并且c)所述CDR3选自SEQIDNO:70,71,72,73,74,75,76，79，84，85,94,95,96,97,102,103,106,111,112,以及与SEQIDNO:70,71,72,73,74,75,76,79,84,85,94,95,96,97,102,103,106,111或112的任一序列具有高于大约80%序列同一性的氨基酸序列。31.根据权利要求30的组合物，其中抗原结合位点包括重链可变区CDR,其选自SEQIDNO:57-85以及与SEQIDNO:57-85的任一序列具有高于大约80%序列同一性的氨基酸序列。32.根据权利要求30的组合物，其中抗原结合位点包括轻链可变区CDR,其选自SEQIDNO:86-112以及与SEQIDNO:86-112的任一序列具有高于大约80%序列同一性的氨基酸序列。33.根据权利要求30的组合物，其中抗原结合位点包括一组CDR序列，其选自a)[3ee9]SEQIDNOS:57，63,70,89,93和97;b)[3ef2]SEQIDNOS:58,64,71,107,109和111;c)[le4]SEQIDNOS:59,65,72，107,109和111;d)[3a4]SEQIDNOS:60,66,73,108,110和112;e)[3ab4]SEQIDNOS:61,67,74,87,91和95;f)[3ahl0〗SEQIDNOS:61,68,75,88,92和96;g)[3bb2]SEQIDNOS:62,69,76,98,100和102;h)[laal]SEQIDNOS:77,78,79,86,90和94;i)[5a6]SEQIDNOS:80,82,84,99,101和103;以及j)[5aa3]SEQIDNOS:81,83,85,104,105和106。34.才艮据权利要求30的组合物，其中抗原结合位点包括一组重链CDR序列，其选自a)[3ee9]SEQIDNOS:57,63和70;b)〖3ef2]SEQIDNOS:58,64和71;c)[le4]SEQIDNOS:59,65和72;d)[3a4]SEQIDNOS:60,66和73;e)[3ab4]SEQIDNOS:61,67和74;f)[3ahl0〗SEQIDNOS:61,68和75;g)[3bb2]SEQIDNOS:62,69和76;h)[laal〗SEQIDNOS:77,78和79;i)[5a6]SEQIDNOS:80,82和84;以及j)[5aa3]SEQIDNOS:81,83和85。35.根据权利要求30的组合物，其中抗原结合位点包括一组轻链CDR序列，其选自a)[3ee9]SEQIDNOS:89,93和97;b)[3ef2]SEQIDNOS:107,109和111;c)[le4]SEQIDNOS:107,109和111;d)[3a4]SEQIDNOS:108,110和112;e)[3ab4]SEQIDNOS:87，91和95;f)[3ahl0]SEQIDNOS:88，92和96;g)[3bb2]SEQIDNOS:98,100和102;h)[laal]SEQIDNOS:86,90和94;i)[5a6]SEQIDNOS:99,101和103;以及j)[5aa3]SEQIDNOS:104,105和106。36.根据权利要求30的组合物，其中抗癌试剂选自博来霉素、多西他赛(肽帝索)、阿霉素、依达曲沙、厄洛替尼(特罗凯)、依托泊苷、非那雄胺(保列治)、氟利坦(氟他胺)、吉西他滨(健择)、吉非替尼(易瑞沙)、醋酸性瑞林(诺雷德)、格雷西隆(凯特瑞)、伊马替尼(格列卫)、伊立替康(开普拓/开普拓沙)、奥丹西隆(枢复宁)、紫杉醇(他克唑)、培加帕酶(培门冬酶)、盐酸毛果芸香碱(匹罗卡品)、卟吩姆钠(光lt文素)、白介素-2(普罗白精)、利妥希单抗(利妥希玛)、拓朴替康(盐酸拓朴替康)、司徒曼布(赫赛汀)、特立平、长春新碱、长春瑞宾(诺维本)，以及它们的治疗性抗体或片段。37.根据权利要求30的组合物，其中抗癌试剂是抗血管生成试剂，选自制管张素、贝伐单抗(阿瓦斯丁⑧)、索拉非尼(多吉美⑧)、杆抑素、癌抑素、乳腺丝抑蛋白、抗VEGF抗体或肽、抗胎盘生长因子抗体或肽、抗Flk-l抗体、抗Flt-l抗体或肽、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素12、IP-IO、Gro-P、血小板反应蛋白、2-曱氧基雌二醇、增殖蛋白相关蛋白、酰胺基三唑、CM101、马马司他、戊聚糖多v5危酸盐、血管生成素2、干扰素-a、除莠霉素A、PNU145156E、16K促乳素片段、罗喹美克、沙立度胺、己酮可可》咸、染4+木素、TNP-470、内皮抑制素、紫杉醇、阿卡丁、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板第四因子和米诺环素。38.根据权利要求30的组合物，其中抗癌试剂是阻断或抑制多药物抗性表型的试剂，选自他莫昔芬、维拉帕米和环孢菌素A。39.根据权利要求30的组合物，其中细胞毒性试剂是单曱基金抑素-E或其功能性类似物。40.根据权利要求31的组合物，其中细胞毒性试剂是单甲基金抑素-E或其功能性类似物。41.根据权利要求30的组合物，其中抗体或抗体片段以大约0.15nM到大约50nM的离解常数结合到MN蛋白上。42.根据权利要求30的组合物，其中抗体是IgG。43.根据权利要求30的组合物，其中抗体或抗体片段是IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgD、IgE、IgA、或IgM同种型、Fab片段、F(ab')2片段、scFv片段、Fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体、生物特异性抗体、嵌合抗体或者多特异性抗体。44.根据权利要求30的组合物，其中抗体或抗体片段是人源化的。45.根据权利要求30的组合物，其中CDR1、CDR2和CDR3是非人的。46.根据权利要求30的组合物，其中序列同一性高于大约85%。47.根据权利要求30的组合物，其中序列同一性高于大约90%。48.根据权利要求30的组合物，其中序列同一性高于大约95%。49.根据权利要求30的组合物，其中序列同一性高于大约99%。50.根据权利要求30的组合物，其中癌症是实体瘤的形式。51.根据权利要求50的组合物，其中实体瘤位于或源自乳腺、呼吸道、肺、脑、生殖器、消化道、结肠、泌尿道、肾、食道、子宫颈、眼、肝、皮肤、头部、颈部、甲状腺和曱状旁腺。52.诊断以异常MN水平为特征的MN相关病症的方法，包括将疑似患病组织或细胞中的MN水平与相应健康组织或细胞中的MN水平进行比较，其中疑似患病组织或细胞中的异常MN水平是MN相关病症的征兆，所述比较步骤进一步包括用根据权利要求1的抗体或抗体片段才全测患病组织和^:康组织中的MN水平。53.根据权利要求52的方法，其中与MN有关的紊乱是癌症。54.根据权利要求52的方法，其中癌症是实体瘤的形式。55.根据权利要求52的方法，其中实体瘤位于或源自乳腺、呼吸道、肺、脑、生殖器、消化道、结肠、泌尿道、肾、食道、子宫颈、目艮、肝、皮肤、头部、颈部、曱状腺和甲状旁腺。56.根据权利要求52的方法，其中比较步骤进一步包括以下步骤a);险测it康组织中的MN蛋白水平；b)检测疑似患病组织中的MN蛋白水平；以及c)比4交(a)和(b)的MN蛋白水平，其中当与健康组织中的MN蛋白水平相比，1€似患病组织中的MN蛋白水平升高表示存在MN相关病症。57.根据权利要求52的方法，其中检测步骤是通过核成像形式实现的。58.根据权利要求57的方法，其中核成像形式是SPECT或PET。59.试剂盒，其包括根据权利要求1的抗体或抗体片^a以及在治疗MN相关病症的方法中4吏用试剂盒的一套il明书。60.试剂盒，其包括根据权利要求17的组合物以及在治疗MN相关病症的方法中使用试剂盒的一套说明书。61.试剂盒，其包括根据权利要求30的组合物以及在治疗MN相关病症的方法中使用试剂盒的一套说明书。62.根据权利要求17的组合物，其中序列同一性高于大约85%。63.根据权利要求17的组合物，其中序列同一性高于大约90%。64.根据权利要求17的组合物，其中序列同一性高于大约95%。65.根据权利要求15的组合物，其中序列同一性高于大约99%。66.治疗以受试者中的异常MN水平为特征的MN相关病症的方法，包括给予治疗有效量的具有特异性针对MN蛋白的抗原结合位点的抗体或抗体片l殳，其中抗原结合位点包括至少一个CDR1、CDR2或CDR3:a)所述CDR1选自SEQIDNO:57,58,59，60,61,62,77,80,81,86,87,88,89,98,99,104,107,108,以及与SEQIDNO:57,58,59,60,6162,77,80,81,86,87,88,89,98,99,104,107或108的任一序列具有高于大约80%序列同一性的氨基酸序列；b)所述CDR2选自SEQIDNO:63,64,65,66,67,68,69,78,82,83,90,91,92,93,100,101,105,109,110,以及与SEQIDNO:63,64,65,66,67,68，69,78,82,83,90,91,92,93,100,101,105,109或110的任一序列具有高于大约80%序列同一性的氨基酸序列；并且c)所述CDR3选自SEQIDNO:70,71,72,73,74,75,76,79,84,85,94,95,96,97,102,103,106,111,112,以及与SEQIDNO:70,71,72,73,74,75,76,79,84,85,94,95,96,97,102,103,106,111或112的任一序列具有高于大约80%序列同一性的氨基酸序列。67.根据权利要求66的方法，其中抗原结合位点包括重链可变区CDR,其选自SEQIDNO:57-85以及与SEQIDNO:57-85的任一序列具有高于大约80%序列同一性的氨基酸序列。68.才艮据权利要求66的方法，其中抗原结合位点包括轻链可变区CDR,其选自SEQIDNO:86-112以及与SEQIDNO:86-112的任一序列具有高于大约80%序列同一性的氨基酸序列。69.才艮据权利要求66的方法，其中抗原结合位点包括一组CDR序列，其选自a)[3ee9]SEQIDNOS:57,63,70,89,93和97;b)[3ef2]SEQIDNOS:58,64,71,107,109和111;c)[le4]SEQIDNOS:59，65,72,107，109和111;d)[3a4]SEQIDNOS:60,66,73,108,110和112;e)[3ab4]SEQIDNOS:61,67,74,87，91和95;f)[3ahl0]SEQIDNOS:61,68,75,88,92和96;g)[3bb2]SEQIDNOS:62,69,76,98，100和102;h)[laal]SEQIDNOS:77,78,79,86,90和94;i)[5a6]SEQIDNOS:80,82,84，99,101和103;以及j)[5aa3]SEQIDNOS:81,83,85,104,105和106。70.根据权利要求66的抗体或抗体片段，其中抗原结合位点包括一组重链CDR序列，其选自b)[3ee9]SEQIDNOS:57，63和70;c)[3ef2]SEQIDNOS:58,64和71;d)[le4]SEQIDNOS:59,65和72;e)[3a4]SEQIDNOS:60,66和73;f)[3ab4]SEQIDNOS:61,67和74;g)[3ahl0]SEQIDNOS:61,68和75;h)[3bb2]SEQIDNOS:62,69和76;i)[laal]SEQIDNOS:77,78和79;j)[5a6]SEQIDNOS:80,82和84;以及k)[5aa3]SEQIDNOS:81,83和85。71.根据权利要求66的抗体或抗体片段，其中抗原结合位点包括一组轻《连CDR序列，其选自a)[3ee9]SEQIDNOS:89,93和97;b)[3ef2]SEQIDNOS:107，09和111;c)[le4]SEQIDNOS:107,109和111;d)[3a4]SEQIDNOS:108,110和112;e)[3ab4]SEQIDNOS:87,91和95;f)[3ahl0]SEQIDNOS:88,92和96;g)[3bb2]SEQIDNOS:98,100和102;h)[laal]SEQIDNOS:86,90和94;i)[5a6]SEQIDNOS:99,101和103;以及j)[5aa3〗SEQIDNOS:104,105和106。72.才艮据权利要求66的方法，其中抗体或抗体片l更以大约0.15nM到大约50nM的离解常数结合到MN蛋白上。73.根据权利要求66的方法，其中抗体是IgG。74.根据权利要求66的方法，其中抗体或抗体片段是IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgD、IgE、IgA、或IgM、Fab片段、F(ab，》片段、scFv片段、Fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体、生物特异性抗体、嵌合抗体或者多特异性抗体。75.根据权利要求66的方法，76.根据权利要求66的方法，的。77.根据权利要求66的方法，78.根据权利要求66的方法，79.根据权利要求66的方法，80.根据权利要求66的方法,81.根据权利要求66的方法性试剂上。82.4艮据权利要求81的方法，其中细胞毒性试剂选自单曱基金抑其中抗体或抗体片段是人源化的。其中CDR1、CDR2和CDR3是非人其中序列同一性高于大约85%。其中序列同一性高于大约90%。其中序列同一性高于大约95%。其中序列同一性高于大约99%。其中抗体或抗体片段缀合到细胞毒素-E或其功能性类似物、单甲基金抑素-F或其功能性类似物、阿普立丁、氮杂尿苷、阿那曲唑、氮杂胞苷、博来霉素、硼替左米、薯司他丁-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、10-羟基喜树碱、卡氮芥、塞来西布、苯丁酸氮芥、顺铂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴。秦、多西他赛、放线菌素、葡糖苷酸柔红霉素、正定霉素、地塞米松、己烯雌酚、阿霉素、葡糖苷酸阿霉素、葡糖苷酸表阿霉素、炔雌醇、雌氮芥、依托泊苦、葡糖苷酸依托泊苦、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、3',5'-0-二油酰-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟利坦、氟尿嘧啶、氟羟曱睾酮、吉西他滨、己酸羟孕酮、羟基脲、去甲柔毛霉素、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、甲酰四氢叶酸、罗氮芥、氮芥、醋酸甲孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、巯基。票呤、6-巯基嘌呤、氨甲喋呤、米托恩醌、光神霉素、丝裂霉素、米托坦、丁酸苯酯、强的松、甲基苄肼、紫杉醇、喷托他丁、PSI-341、司莫司汀、链脲霉素、他莫昔芬、紫杉烷、紫杉醇、丙酸睾酮、沙立度胺、巯基鸟嘌呤、塞替哌、替尼泊苷、拓朴替康、尿嘧啶氮芥、万珂、长春花碱、长春瑞宾、长春新碱、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、豹蛙酶、rapLRl、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素以及它们的组合。83.权利要求82的方法，其中细胞毒性试剂是单甲基金抑素-E或其功能性类似物。84.根据权利要求66的方法，进一步包括共同给予抗癌试剂。85.根据权利要求84的方法，其中抗癌试剂选自博来霉素、多西他赛(肽帝索)、阿霉素、依达曲沙、厄洛替尼(特罗凯)、依托泊苷、非那雄胺(保列治)、氟利坦(氟他胺)、吉西他滨(健择)、吉非替尼(易瑞沙)、醋酸性瑞林(诺雷德)、格雷西隆(凯特瑞)、伊马替尼(格列卫)、伊立替康(开普拓/开普拓沙)、奥丹西隆(枢复宁)、紫杉醇(他克唑)、培加帕酶(培门冬酶)、盐酸毛果芸香碱(匹罗卡品)、外吩姆钠(光敏素)、白介素-2(普罗白精)、利妥希单抗(利妥希玛)、拓朴替康(盐酸拓朴替康)、司徒曼布(赫赛汀)、特立平、长春新碱和长春瑞宾(诺维本)，以及它们的治疗性抗体或片段。86.根据权利要求84的方法，其中抗癌试剂是阻断或抑制多药物抗性表型的试剂，选自他莫昔芬、维拉帕米和环孢菌素A。87.4艮据斥又利要求66的方法，其中MN相关病症是癌症。88.根据权利要求87的方法，其中癌症是实体瘤癌症。89.根据权利要求88的组合物，其中实体瘤位于或源自乳腺、呼吸道、肺、脑、生殖器、消化道、结肠、泌尿道、肾、食道、子宫颈、眼、肝、皮肤、头部、颈部、曱状腺和甲状旁腺。90.根据权利要求l的抗体或抗体片段，其中抗原结合位点包括一对重链可变区和轻链可变区，其选自(a)重链可变区SEQIDNO:133和轻链可变区SEQIDNO:134;(b)重链可变区SEQIDNO:135和轻链可变区SEQIDNO:136;(c)重链可变区SEQIDNO:137和轻链可变区SEQIDNO:138;(d)重链可变区SEQIDNO:139和轻链可变区SEQIDNO:140;(e)重链可变区SEQIDNO:141和轻链可变区SEQIDNO:142;(f)重链可变区SEQIDNO:143和轻链可变区SEQIDNO:144;(g)重链可变区SEQIDNO:145和轻链可变区SEQIDNO:146;(h)重《连可变区SEQIDNO:147和轻链可变区SEQIDNO:148;(i)重链可变区SEQIDNO:149和轻链可变区SEQIDNO:150;以及(j)重链可变区SEQIDNO:151和轻链可变区SEQIDNO:152。91.由SEQIDNO:153的核苷酸序列编码的抗MNIgG抗体。全文摘要本发明提供了具有特异性针对MN蛋白的抗原结合位点的抗体，以及使用这些抗体治疗和诊断MN相关病症的方法。文档编号C12N5/02GK101501184SQ200680052716公开日2009年8月5日申请日期2006年12月12日优先权日2005年12月12日发明者G·兰杰斯,L·阿德南,P·坦布里尼,P·特雷尔,S·哈,T·麦凯布申请人:拜尔健康护理有限责任公司