借助细胞表达系统产生氢气的制作方法

专利名称：借助细胞表达系统产生氢气的制作方法
借助细胞表达系统产生氢气 本发明涉及通过细胞产生氢气的重组表达系统。更具体地，本发
明涉及在细菌细胞中(通常在大肠杆菌(EscAen'c/n'a co//)中)产生来自蓝 细菌的氢化酶蛋白复合体的表达载体、由所述表达载体转化的宿主细 胞、以及在适于光合产氢的条件下通过孵育所述宿主细胞产生氢气的 方法。
背景技术：
氢能是代替传统化石燃料的潜在候选者，特别是由微生物产生的 氬气。当前，从微生物来源光合产氢存在大量限制。诸如蓝细菌和绿 藻的传统产氢微生物表现相对低的能量转换效率和低氢气生成率。另 外，由于多种抑制性因素，从这些生物体的产生随时间存在固有的不 稳定。例如，负责的酶天然地对氧气敏感并在甚至微需氧条件中变性。
传统方法已在过程控制中寻找进步，以提高从微生物产生氢气。 US4532210公开了使用交替的光/暗循环在藻类培养物中产生氢气，所 述光/暗循环包括交替光存在时于需氧条件下水中培养所述藻类以在 所述藻类中积累光合产物的步骤和黑暗中于微需氧条件下水中培养所 述藻类以通过呼吸分解积聚的物质从而产生氢气的步骤。
更为近来，已采用分子技术处理所述问题。US6858718公开了所 述酶，即铁氢化酶(HydA)，具有产生氢气，具体地催化质子向分子氢 的可逆还原，的工业应用。该文件公开了从藻类斜生栅藻OSce"ecfes;m^ oW—M51)、 莱茵衣藻(CA/amj^/o歸朋51 mVi厶arato.)和小球藻(CA/ore〃a /w;yca)分离编码铁氢化酶的核酸序列。本发明进一步公开HydA的基因 组核酸、cDNA和蛋白序列。迄今，所提出的方法还没有适合以工业 规模产生氢气。
本公开内容涉及在宿主细胞中表达分离自光合细菌物种的酶或酶 复合体，所述光合细菌物种例如蓝细菌物种，所述宿主细胞通常是不
表达所述酶或酶复合体的细菌宿主细胞；并涉及由所述宿主细胞产生 氢气。
发明简述
根据本发明的方面，提供用于产生氢化酶蛋白或氢化酶蛋白复合 体的表达载体，所述表达载体包括可操作连接的下列元件
a) 转录启动子元件；
b) 编码具有与蓝细菌氢化酶相关的特异酶活性的多肽的核酸 分子；和
c) 转录终止子。 优选地，所述核酸分子选自
i) 包括SEQIDNO:l的核香酸序列的核酸分子；
ii) 具有与SEQIDNO:l的核苷酸序列至少70%—致性的核酸
分子；
iii) 与SEQ ID NO:l的核酸序列杂交并编码具有氢化酶活性 的多肽的核酸分子；或者
iv) 包括以上i)、 ii)和iii)的序列遗传密码的简并核苷酸序列的 核酸分子。
更为优选地，所述核酸分子由SEQIDNO:l的核苷酸序列组成。 可选择地，所述核酸分子选自
i) 包括SEQ ID NOs:2， 4， 7， 9和12的每一种的核苷酸序列的 核酸分子；
ii) 核酸分子，所述核酸分子包括具有与SEQ ID NO:2至少 70%—致性的核苷酸序列、具有与SEQ ID NO:4至少70%— 致性的核香酸序列、具有与SEQ ID NO:7至少70%—致性的 核苷酸序列、具有与SEQ ID NO:9至少70%—致性的核苦酸 序列以及具有与SEQ ID NO:ll至少70%—致性的核苷酸序 歹'J;或
iii) 核酸分子，所述核酸分子由下列所组成具有与SEQ ID NO:2至少70%—致性的核苷酸序列、具有与SEQIDNO:4至
少70%—致性的核苷酸序列、具有与SEQ ID NO:7至少70% 一致性的核苷酸序列、具有与SEQ ID NO:9至少70%—致性 的核苷酸序列以及具有与SEQ IDNO:ll至少70%—致性的核 苷酸序列。
更为优选地，所述核酸分子由SEQ ID NOs:2， 4, 7， 9和12的每一 种的核苦酸序列组成。
可选择地，所述核酸分子选自
i) 包括SEQ ID NOs:2， 4, 7, 9或12的至少一种的核芬酸序列 的核酸分子；或
ii) 包括下列的至少一种的核苷酸序列的核酸分子具有与 SEQ ID NO:2至少70%—致性的核苷酸序列、具有与SEQ ID NO:4至少70%—致性的核苷酸序列、具有与SEQIDNO:7至 少70%—致性的核苷酸序列、具有与SEQ ID NO:9至少70% 一致性的核苦酸序列以及具有与SEQ IDNO:ll至少70%—致 性的核苷酸序列。
更为优选地，所述核酸分子是由SEQIDNO:2的核酸序列代表的 核酸分子，或与SEQIDNO:2杂交并编码具有心肌黄酶活性的多肽的 变体核酸分子。可选择地，所述核酸分子是由SEQIDNO:4的核酸序 列代表的核酸分子，或与SEQIDNO:4杂交并编码具有NADH脱氢酶 I活性的多肽的变体核酸分子。可选择地，所述核酸分子是由SEQ ID NO:7的核酸序列代表的核酸分子，或与SEQ ID NO:7杂交并编码具
有NAD还原氢化酶7活性的多肽的变体核酸分子。可选择地，所述核 酸分子是由SEQ ID NO:9的核酸序列代表的核酸分子，或与SEQ ID NO:9杂交并编码具有NAD还原氢化酶S活性的多肽的变体核酸分子。 可选择地，所述核酸分子是由SEQ ID NO:12的核酸序列^表的核酸 分子，或与SEQIDNO:12杂交并编码具有NAD还原氢化酶jS活性的 多肽的变体核酸分子。优选地，所述核酸分子在严紧杂交条件下杂交。
优选地，所述核酸分子由编码SEQ ID NOs:3， 5, 8, 10和13的每 一种多肽的核苷酸序列组成。
优选地，所述变体核酸分子在严紧杂交条件下杂交。
优选地，所述转录启动子元件包括赋予所述核酸分子或变体核酸 分子诱导型表达的元件。可选择地，所述启动子元件包括赋予所述核 酸分子或变体核酸分子抑制型表达的元件。可选择地，所述转录启动 子元件赋予所述核酸分子或变体核酸分子组成型表达。
优选地，所述表达栽体包括可选择标志物。优选地，所述表达载 体包括翻译控制元件。优选地，所述翻译控制元件是核糖体结合序列。
优选地，所述核酸分子包括例如由DNA重排、倾向^l晉误的PCR 或定位突变导入的所述核苷酸序列的特定改变，以致优化密码子使用。
在另外方面，本发明提供使用根据本发明第 一方面的表达载体转 化的宿主细胞。
优选地，所述细胞是细菌细胞，更为优选地，是革兰氏阴性细菌 细胞，例如埃希氏菌(五sc/^n'c/n'as; / )属，优选大肠杆菌，更优选大肠 杆菌BL21或大肠杆菌BL21(DE3)pLys5。可选择地，所述细胞可以是 另一细菌细胞，例如革兰氏阳性细菌细胞，或者可选择地，是酵母细 胞、藻细胞、昆虫细胞或植物细胞。
优选地，所述细胞包括载体，所述载体包括tRNA基因，所述tRNA 基因例如编码argU、 ilex、 leuW、 proL或glyT的tRNA基因。
根据本发明的另外方面，提供用于产生氢气的方法，所述方法包
括
i) 将包括至少一种蓝细菌氢化酶基因的核酸分子并入用于在 宿主细胞中表达的表达载体；并且
ii) 使用所述表达载体转染宿主细胞； 其中所得转染的宿主细胞产生氢气。
优选地，所述至少一种氢化酶基因是双向氬化酶基因。优选地， 所述蓝细菌属于集胞藻属，更为优选地是集胞藻OS少wec/^Q^^ sp.)PCC 6803。
优选地，所述核酸分子选自
i) 包括SEQIDN0:1的核香酸序列的核酸分子；
ii) 具有与SEQIDNO:l的核苷酸序列至少70%—致性的核酸
分子；
iii) 与SEQIDNO:l的核酸序列杂交的核酸分子；或者
iv) 包括以上i)、ii)和iii)的序列遗传密码的简并核苷酸序列的 核酸分子。
更为优选地，所述核酸分子由SEQIDNO:l的核苷酸序列组成。 可选择地，所述核酸分子选自
i) 包括SEQ ID NOs:2， 4， 7， 9和12的每一种的核苷酸序列的 核酸分子；
ii) 核酸分子，所述核酸分子包括具有与SEQ ID NO:2至少 70%—致性的核苷酸序列、具有与SEQ ID NO:4至少70%— 致性的核香酸序列、具有与SEQ ID NO:7至少70%—致性的 核苷酸序列、具有与SEQ ID NO:9至少70%—致性的核苷酸 序列以及具有与SEQ ID NO:ll至少70%—致性的核苷酸序 歹寸；或
iii) 核酸分子，所述核酸分子由下列所组成具有与SEQ ID NO:2至少70%—致性的核苷酸序列、具有与SEQIDNO:4至 少70%—致性的核苷酸序列、具有与SEQ ID NO:7至少70% 一致性的核苦酸序列、具有与SEQ ID NO:9至少70%—致性 的核普酸序列以及具有与SEQ IDNO:ll至少70%—致性的核 苷酸序列。
更为优选地，所述核酸分子由SEQ ID NOs:2， 4, 7， 9和12的每一 种的核苷酸序列组成。
可选择地，所述核酸分子选自
i) 包括SEQ ID NOs:2， 4, 7, 9或12的至少一种的核苷酸序列 的核酸分子；或
ii) 包括下列的至少一种的核苷酸序列的核酸分子具有与 SEQ ID NO:2至少70%—致性的核苷酸序列、具有与SEQ ID NO:4至少70%—致性的核苷酸序列、具有与SEQIDNO:7至 少70%—致性的核苷酸序列、具有与SEQ ID NO:9至少70% 一致性的核苷酸序列以及具有与SEQ ID NO:ll至少70%—致 性的核苷酸序列。 更为优选地，所述核酸分子是由SEQIDNO:2的核酸序列代表的 核酸分子，或与SEQIDNO:2杂交并编码具有心肌黄酶活性的多肽的 变体核酸分子。可选择地，所述核酸分子是由SEQIDNO:4的核酸序 列代表的核酸分子，或与SEQIDNO:4杂交并编码具有NADH脱氢酶 I活性的多肽的变体核酸分子。可选择地，所述核酸分子是由SEQ ID NO:7的核酸序列4、表的核酸分子，或与SEQ ID NO:7杂交并编码具
有NAD还原氢化酶7活性的多肽的变体核酸分子。可选择地，所述核 酸分子是由SEQ ID NO:9的核酸序列代表的核酸分子，或与SEQ ID NO:9杂交并编码具有NAD还原氢化酶S活性的多肽的变体核酸分子。 可选择地，所述核酸分子是由SEQ ID NO:12的核酸序列代表的核酸 分子，或与SEQIDNO:12杂交并编码具有NAD还原氢化酶|3活性的 多肽的变体核酸分子。优选地，所述核酸分子在严紧杂交条件下杂交。
优选地，所述核酸分子由编码SEQ ID NOs:3， 5， 8， 10和13的每 一种多肽的核苦酸序列组成。
根据另外方面，本发明提供含有本发明的宿主细胞和足以支持所 述细胞生长的培养基的反应容器。在优选的实施方案中，所述容器是 生物反应器，例如发酵罐。
在另外方面，本发明提供产生氢气的方法，所述方法包括
i) 提供含有本发明的宿主细胞的容器；
ii) 提供促进通过包含于所述容器的细胞培养物的产生氬气的 细胞培养条件；并且可选择地
iii) 从所述容器收集氢气。
根据本发明的另外方面，提供用于通过细胞产生氢气并收集细胞 所产生氢气的装置，所述装置包括
i) 含有本发明的宿主细胞的反应容器；和
ii) 与所述细胞培养容器在流体上相关的第二容器，其中改造 所述第二容器以用于收集和/或储存由包含于(i)中的所述细胞 培养容器中的细胞产生的氢气。
根据本发明的另外方面，提供蓝细菌氢化酶在重组表达系统中用 于产生氢气的用途。优选地，所述蓝细菌氢化酶由核酸分子编码，所
述核酸分子选自
i) 包括SEQIDNO:-l的核苷酸序列的核酸分子；
ii) 具有与SEQ IDNO:l的核香酸序列至少70%—致性且编码 具有氢化酶活性的多肽的核酸分子；
iii) 与SEQ ID NO:l的核酸序列杂交且编码具有氢化酶活性 的多肽的核酸分子；或者
iv) 包括以上i)、ii)和iii)的序列遗传密码的简并核苷酸序列的 核酸分子。
根据本发明的另外方面，提供由SEQIDNO:l的核酸序列代表的 核酸分子。
贯穿本申请文件的说明书和权利要求书，词语"包括(comprise)" 和"包含"以及所述词语的变形，例如"包括(comprising)"和"包括 (comprises)"指"包括但不限于"，并且并非意在(且也未)排除其它部 分、添加物、组分、整数或步骤。
贯穿本申请文件的说明书和权利要求书，单数包括复数，除非上
下文另有要求。特别地，若使用不定冠词，应将本申请文件理解为涉 及复数和单数，除非上下文另有要求。
应将与本发明的特定方面、实施方案或实施例关联描述的特征、 整数、特性、化合物、化学部分或基团理解为适用于本文所述的任何 其它方面、实施方案或实施例，除非与其不兼容。
以下进一步详述本发明的多种方面。
附图简述


图1是集胞藻PCC6803全基因组内所有氢代谢相关基因的1:1000 比例的示意图2是集胞藻PCC6803基因组内所述Aox操纵子的示意图； 图3是表达载体pET-17b的示意图4是本发明的表达载体的图示，所述表达载体包括具有SEQID NO:l的核苷酸序列的核酸分子；
图5是SEQIDNO:l的核苷酸序列；
述核酸分子选自
图6是SEQ ID NO:2的核苷酸序列；
图7是SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
图8是SEQ ID NO:4的核苷酸序列；
图9是SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
图10是SEQIDNO:6的核苷酸序列；
图11是SEQIDNO:7的核苷酸序列；
图12是SEQIDNO:8的氨基酸序列；
图13是SEQIDNO:9的核苷酸序列；
图14是SEQIDNO:10的氨基酸序列；
图15是SEQIDNO:11的核苷酸序列；
图16是SEQIDNO:12的核苷酸序列；以及
图17是SEQIDNO:13的氨基酸序列。
发明详述
微藻(绿藻和蓝细菌)当作为太阳能收获器而生长时，相对于高等 植物具有某些独特优势；它们以较快的速率生长，容易在开放池或封 闭反应器中操作，并且通常具有较高的光合效率。可以将蓝细菌和绿
藻从水产生H2的固有能力改变成开发低碳清洁能量技术中的优势。所
述能力依赖多达两种不同氢化酶的活性。 一种是二聚膜结合氢化酶， 其主要限于异形细胞和再用固氮酶产生H2的功能。第二种是双向氢化 酶，即能再结合并消耗光合生成的电子和质子以既产生又降解H2的 酵。
集胞藻0Sy"edbc""5" sp.)PCC 6803是单细胞非固氮蓝细菌和淡水 居住者。该菌抹可由外源DNA天然转化(即，它亲自吸收DNA)，它 是自发地可转化，并且它能通过同源重组将DNA整合进其基因组。 所述生物体能在大量不同条件下生长，所述不同条件的范围从光合自 养模式到完全异养模式，从而使干扰基本过程的遗传修饰切实可行， 所述遗传修饰诸如光合作用(和本案的氢化酶)的研究。这些性质使集 胞藻PCC 6803成为诸如本文所述那些的遗传操作的受青睐选择。事 实上，该生物体已被表明缺少功能性吸氢酶(由于缺少大亚基)。所述
特征还增加了这一情况下所述生物体的"有用性"，因而移除该吸氢酶 的有害影响，从而使体内筛选氢化酶活性更为准确而无需考虑所述吸 氢酶的产生相反结果(本案中)的作用。
已描述5种基因形成所述双向氬化酶的酶复合体，四种与编码真 养产碱菌(i a/Wom'a e^ro; /^)的四聚NAD+'还原氢化酶的基因同源， 其中所述心肌黄酶部分由hoxFU编码并且该氢化酶部分由hoxYH编 码。与真养产碱菌内的所述可溶酶形成对照的是，集胞藻PCC 6803 的双向氢化酶基因簇含有据认为编码心肌黄酶第三亚单位的另外的开 放阅读框(hoxE)。因而，已假定HoxEFU起复合体I的NADH氧化部 分的作用，活跃于呼吸或围绕光系统I的循环电子传递，所述假定主 要归因于与线粒体复合体I(NADH:Q氧化还原酶)三亚单位的显著序 列相似性，以及HoxE与大肠杆菌的NuoE同源(所述三亚单位之一构 成复合体I的亲水部分)。选择性分离实验已确定在异形细胞蓝细菌物 种的单细胞及其异形细胞和营养细胞两者内注意到活性。
蓝细菌产氢可以得生自固氮酶或双向氢化酶的活性。蓝细菌产生
的净H2因而是固氮酶和双向氢化酶催化产生的H2与所述吸氢酶催化
消耗的H2总和。本申请涉及通过所述双向氢化酶(l)生成氢气，归因 于相对于所述固氮酶(2)的能量效率显著提高的该反应的能量效率，如 下所示
2H++ 2e-+ 2NADP — H2 + 2NAD++ 2P; (1) N2 + 8H+ + 8e- + 16ATP — 2NH3 + H2 + 16ADP + 16& (2) 已表明存在于集胞藻PCC 6803内的氬化酶相关基因包括(1) sll0322-氬化酶成熟蛋白HypF(hypF)、 (2) slll078-氢化酶表达/形成蛋 白HypA(hypA)、 (3) slll079-氢化酶表达/形成蛋白HypB(hypB)、 (4) slll220-NADH脱氬酶I链E(hoxE)、 (5) slll221画NADH脱氢酶I链 F(hoxF)、 (6) slll223-NAD-还原氢化酶HoxS 7亚单位(hoxU)、 (7) slll224-NAD-还原氬化酶HoxS S亚单位(hoxY)(EC. 1.12,1.2) 、 (8) slll226-NAD-还原氢化酶HoxS 0亚单位(hoxH)、 (9) slll432-氢化酶同 工酶形成(镍并入)蛋白HypB(hypB)、 (10) slll462-氢化酶表达/形成蛋 白HypE(hypE)、 (11) slll559-可溶氢化酶42 kD亚单位、(12) slrl498-
氢化酶同工酶形成蛋白HypD(hypD)、(13) slrl675-氢化酶形成(镍并入) 蛋白HypA(hypA)、 (14) slr2135-氢化酶辅助蛋白、(15) ssl3580-氢化酶 表达/形成蛋白HypC(hypC)。
集胞藻PCC 6803内所有这些氢化酶相关基因的确切定位图示于 图1，所述图即覆盖该生物体全基因组的约75%的定位图。因此，如 图2所示，本发明利用长约7 kb的得自集胞藻PCC 6803的Aojc操纵 子序列。
载体
如本文所用，术语"载体"指能够转运已与它连接的另一核酸的 核酸分子。该载体能够自主复制或者能整合进宿主DNA。该载体可以 包括用于重组DNA插入的限制性酶位点，并且可以包括一种或多种 可选择标志物。该栽体可以是质粒、噬菌体或粘粒形式的核酸。最为 优选地，该载体适于细菌表达，例如，适于在大肠杆菌、枯草杆菌 (5ac/〃w w6"fe)、 沙门氏菌属(Salmonella)、 葡萄；求菌属 (staphylococcus)、链主求菌属(Streptococcus)、 酵母菌(Saccharomycetes) 等中表达。
优选地，该载体能够在细菌细胞中增殖，并且被稳定地传递至后代。
本文所用"可操作连接的"指单一上述控制元件或上述控制元件 的组合与编码序列相互以功能性关系(例如，以使得指导所述编码序列 表达的连接关系)在一起。
本文所用"调节序列"指能够控制基因表达的DNA或RNA元件。 表达控制序列的实例包括启动子、增强子、沉默子、SD序列(Shine Dalgarno sequences), TATA盒、内部核糖体进入位点(IRES)、转录因 子的附着位点、转录终止子、多聚腺苷酸化位点、RNA转运信号或对 于紫外光介导基因应答重要的序列。优选地，所述表达载体包括与待 表达核酸序列可操作连接的 一种或多种调节序列。调节序列包括指导 组成型表达的那些，以及组织特异性调节和/或诱导型序列。
本文所用"启动子"指与RNA聚合酶结合以开始转录的DNA或
RNA的核苷酸序列。所述启动子可以是诱导型或组成型表达的。可选 择地，所述启动子受控于阻遏蛋白或刺激蛋白。优选地，所述启动子 是T7、 T3、 lac、 lacUV5、 tac、 trc、 [X]PL、 Sp6或紫外线诱导型启动 子。更为优选地，所述启动子是已知在例如大肠杆菌的细菌中具有功 能的T7或T3启动子。
本文所用"转录终止子"指终止负责将DNA转录成RNA的RNA 聚合酶功能的DNA元件。优选的转录终止子由富含GC的二重对称区 域后接连续的T残基而表征。更为优选地，转录终止子是来自所述T7 噬菌体的终止子序列。
本文所用"翻译控制元件"指控制mRNA翻译的DNA或RNA 元件。优选的翻译控制元件是核糖体结合位点。优选地，所述翻译控 制元件来自与所述启动子同源的系统，例如启动子和其相关的核酶结 合位点。优选的核糖体结合位点是T7或T3核糖体结合位点。
本文所用"限制性酶识别位点"指由限制性酶识别的DNA的基序。
本文所用"可选择标志物"指蛋白，所述蛋白当表达于宿主细胞 时在所述细胞上赋予表型，其允许选择表达所述可选择标志物基因的 所述细胞。 一般来说，这可以是赋予对诸如氨节青霉素、卡那霉素、 氯霉素、四环素、潮霉素、新霉素或甲氨蝶呤的抗生素的抗性的蛋白。 抗生素的另外实例是青霉素、盐酸氨千青霉素、氨千青霉素钠、羟氨 千青霉素钠、羧苄青霉素钠、青霉素G、头孢菌素、头孢噻肟钠、盐 酸先锋霉素、万古霉素、环丝氨酸。其它实例包括细菌抑制剂，例如 氯霉素、红霉素、林可霉素、四环素、硫酸壮观霉素、盐酸克林霉素、 盐酸金霉素。
所述表达载体的设计依赖诸如待转化宿主细胞的选择、所需蛋白 表达的水平等等的因素。本发明的表达载体可以被导入宿主细胞从而 产生包括融合蛋白或多肽的由本文所述的核酸编码的蛋白或多肽(例 如，集胞藻PCC6803双向氢化酶蛋白复合体，即hoxE、 hoxF、 hoxU、 hoxY和hoxH蛋白亚单位)。
原核生物中蛋白表达最常使用含有指导融合或非融合蛋白表达的
组成型或诱导型启动子的载体在大肠杆菌中进行。融合载体向其中编 码的蛋白(通常是向所述重组蛋白的氨基末端)添加一定量的氨基酸。
所述融合载体通常达到三种目的l)增强重组蛋白表达；2)增强所述 重组蛋白的可溶性；以及3)通过作为亲和纯化的配体起作用而帮助所 述重组蛋白的纯化。通常，在所述融合部分和所述重组蛋白的连接处 导入蛋白水解切割位点以使所述重组蛋白从所述融合部分分开以随后 纯化融合蛋白。所述载体在本发明的范围之内。
优选地，所述载体包括对在细菌细胞中表达双向氬化酶蛋白复合 体必需的那些遗传元件。在细菌细胞中转录和翻译所需的元件包括启 动子、所述双向氢化酶蛋白复合体编码区和转录终止子。
本发明的表达载体可以是细菌表达载体，例如重组噬菌体DNA、 质粒DNA或粘粒DNA、例如重组酵母表达载体的酵母表达载体、例 如重组病毒(例如杆状病毒)表达载体的用于在昆虫细胞中表达的载 体，或者用于在植物细胞中表达的载体，例如重组的病毒(诸如花椰菜 花叶病毒、CaMV、烟草花叶病毒、TMV)表达载体或重组的质粒(诸如 Ti质粒)表达载体。
优选地，所述载体是细菌表达载体。优选地，本表达载体是高拷 贝数表达载体；可选择地，本表达载体是低拷贝数表达载体，例如， 樣吏型F质粒。
优选地，所述载体是包括T7启动子系统的细菌表达载体。可选 择地，所述载体是包括^c启动子系统的细菌表达栽体。
更为优选地，所述载体是pET表达载体。例如，所述载体可以是 Novogen⑧pET载体，诸如pET-3a、 pET-3b、 pET-3c、 pET-3d、 pET-9a、 pET國9b、pET-9c、pET國9d、pET-lla、pET誦llb、pET國llc、pET國lld、pET隱12a、 pET國12b、 pET-12c、 pET-14b、 pET陽15b、 pET國16b、 pET-17b、 pET-17xb、 pET画19b、 pET画20b(+)、 pET隱21(+)、 pET-21a(+)、 pET-21b(+)、 pET画21c(+)、 pET画21d(+) 、 pET-22b(+) 、 pET-23(+) 、 pET-23a(+) 、 pET-23b(+)、 pET-23c(+) 、 pET-23d(+) 、 pET-24(+) 、 pET-24a(+) 、 pET-24b(+)、 pET-24c(+)、 pET-24d(+)、 pET-25b(+) 、 pET-26b(+) 、 pET-27b(+)、 pET陽28a(+)、 pET-28b(+)、 pET-28c(+) 、 pET陽29a(+) 、 pET-29b(+)、
pET國29c(+)、 pET-30Ek/LIC、 pET國30 Xa/LIC、 pET-30a(+)、 pET-30b(+)、 pET誦30c(+)、 pET-31b(+)、 pET國32 Ek/LIC、 pET-32 Xa/LIC、 pET國32a(+)、 pET-32b(+)、 pET-32c(+)、 pET-33b(+) 、 pET-39b(+) 、 pET-40b(+)、 pET-41a(+)、 pET-41b(+)、 pET-41c(+)、 pET-41 Ek/LIC、 pET-42a(+)、 pET-42b(+)、 pET-42c(+)、 pET-43.1a(+)、 pET-43.1b(+)、 pET-43.1c(+)、 pET-43.1 Ek/LIC、 pET-44a(+)、 pET-44b(+)、 pET-44c(+)、 pET-44 Ek/LIC、 pET-45b(+)、 pET曙46 Ek/LIC、 pET國47b(+)、 pET-48b(+)、 pET隱49b(+)、 pET画50b(+)、 pLacl、 pLysE、 pLysS，或者Invitrogen pET栽体，侈'JJ(口， pET161國DEST、 pET101/D-TOPO、 pET151/D/LacZ、 pET104.1國DEST、 pET161-GW/CAT、 pET104.1/GW/lacZ、 pET SUMO/CAT、 pETS而O、 pET-DEST41 、 pET-DEST42、 pET101/D/LacZ 、 pET151/D-TOPO 、 pET161國DEST、 pET100/D/LacZ、 pET161曙GW/CAT、 pET151/D/LacZ、 pET101/D-TOPO、 pET104-DEST、 pET160-DEST、 pET102/D/LacZ、 pET200/D/LacZ 、pET200/D國TOPO 、pET161/GW/D陽TOPO 、 pET160國GW/CAT。
更为优选地，所述载体是图3所示的pET-17b(Novagen ， Madison, Wisconsin, USA), (Seed, B. (1987) Mm/w 329, 840)。所述pET-17b载体 携带后接有用克隆位点区域的N-末端11aaT7标签序列。包含于所述 多克隆区的是允许使用不对称连接子有效克隆的双/位点。独特 位点示于图3的环形图。所述序列通过Pbr322惯例编号，因而所述 T7表达区在环形图上反向。图4示出T7RNA聚合酶转录的编码链的 克隆/表达区。
pET-17b载体包括T7启动子(核酸333-349)、T7转录起始(核酸332) 和T7终止子(核酸28-74)。所述pET-17b栽体还包括允许亲和纯化被 表达的酶的T7标签序列。所述pET-17b载体是/人所述BamHI识别位 点后的GAT三联子表达的翻译载体。
特别地，含有所述T7启动子区域的载体(例如，pET-17b)的使用 需要所述宿主细胞适于蛋白的高表达。
集胞藻PCC6803 Hox搡纵子
如本文所用，术语"核酸分子，，包括DNA分子(例如，cDNA或 基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及例如，通过使用核苷酸类 似物生成的DNA或RNA类似物。所述核酸分子可以是单链或双链， l旦优选是双链DNA。
关于基因组DNA，术语"分离的"包括从与基因组DNA天然结 合的染色体分离的核酸分子。优选地，"分离的"核酸没有在所述核酸 得自的生物体的基因组DNA中天然侧翼连接所述核酸的序列(即位于 所述核酸5，端和/或3'端的序列)。此外，诸如cDNA分子的"分离的" 核酸分子可以是由重组技术产生时基本上无其它细胞物质或培养基， 或者由化学合成时基本上无化学前体或其它化学制品。
如本文所用，术语"在严紧条件下杂交"描述杂交和清洗条件。 严紧条件为本领域技术人员已知并能在可获得的参考文献(例如， Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学实-睑室指南)，John Wiley & Sons, N.Y., 1989， 6.3.1-6.3.6)中找到。水性及非水性方法描述 于该参考文献且均可使用。严紧杂交条件的优选实例是在约45。C下于 6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，随后在50。C下于0.2xSSC、0.1%(w/v) SDS中清洗一次或多次。严紧杂交条件的另一实例是在约45。C下于 6xSSC中杂交，随后在55。C下于0.2xSSC、 0.1%(w/v) SDS中清洗一 次或多次。严紧杂交条件的另外实例是在约45°C下于6xSSC中杂交， 随后在60。C下于02xSSC、 0.1%(w/v) SDS中清洗一次或多次。优选 地，严紧杂交条件是在约45。C下于6xSSC中杂交，随后在65。C下于 0.2xSSC、 0.1%(w/v)SDS中清洗一次或多次。特别优选的严紧杂交条 件(以及如果实施者不确定应当应用什么条件以确定分子是否在本发 明的杂交限制内，应当使用的条件)是在65°C下0.5摩尔磷酸钠、 7%(w/v)SDS,随后在65。C下于0.2xSSC、 l%(w/v) SDS中清洗一次或 多次。优选地，在严紧条件下与SEQIDNO:1,2，4， 6, 7, 9, 11或12的 序列杂交的本发明的分离的核酸分子对应天然存在的核酸分子。
如本文所用，"天然存在的"核酸分子指具有天然存在(例如，编 码天然蛋白)的核苷酸序列的RNA或DNA分子。
如本文所用，术语"基因"和"重组基因"指核酸分子，其包含
编码蛋白的开放阅读框，还可以包含非编码调节序列和内含子。
"非必需"氨基酸残基是可以在(例如，SEQIDNO:3， 5, 8, 10或 13的序列)的野生型序列改变的残基，所述改变不破坏、或更为优选地 基本上不改变生物学活性，但是"必需"氨基酸残基导致这种变化。 例如，据预测在本发明的多肽中保守的氨基酸残基(例如，存在于保守 的钾通道结构域的那些)尤其经不起改变，除开通常可以将跨膜结构域 的氨基酸残基替换为具有大概等价的疏水性的其它残基而不显著改变 活性。
"保守氨基酸取代"是使用具有相似侧链的氨基酸残基代替所述 氨基酸残基的取代。本领域已定义具有相似侧链的氨基酸残基家族。 这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性 侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性側链(例如，甘氨酸、天 冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧 链(例如，丙胺酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、 甲疏氨酸、色氨酸)、/3分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸) 和芳香族側链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。 因而，优选地使用来自相同侧链家族的另 一氨基酸残基代替蛋白的非 必需氨基酸残基。可选择地，在另一实施方案中，可以诸如通过饱和 突变沿全部或部分编码序列随机引入突变，并且可以筛选所得突变体 的生物学活性以鉴定保留活性的突变体。依照SEQ ID NO:l， 2， 4, 6, 7, 9， 11或12的突变，可以重组地表达所编码蛋白并且可以确定所述蛋 白的活性。
如本文所用，蛋白的"生物学活性部分"包括参与分子和非分子 间相互作用的蛋白片段。蛋白的生物学活性部分包括由足够同源于或 得自所述蛋白的氨基酸序列(例如，SEQIDNO:3，5，8， 10和13所示的 氨基酸序列)的氨基酸序列组成的肽，所述肽包括比全长蛋白更少的氨 基酸并表现蛋白的至少一种活性。通常地，生物学活性部分包括具有 所述蛋白的至少 一 种活性的结构域或基序，所述活性例如调节膜应激 性、胞内离子浓度、膜极化和动作电位的能力。
蛋白的生物学活性部分可以是SEQ IDNO:3， 5， 8, 10或13的例如
长50， 100， 150, 200， 250， 300， 350， 400， 450， 500或更多氨基酸的多肽。 蛋白的生物学活性部分可以用作开发调节介导的活性，例如本文所述 生物学活性，的试剂的靶。
如下进行序列间序列同源性或一致性(所述术语在本文可互换使 用)的计算。
为确定两种氨基酸序列或两种核酸序列的百分数一致性，以最优 比较目的比对所述序列(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列之 一或两者中引入间隔以最优比对，并且为比较目的可以忽略非同源序 列)。在优选实施方案中，为比较目的比对的参考序列的长度是所述参 考序列长度的至少30%，优选至少40%,更优选至少50%,还更优选 至少60%,还更优选至少70%、 75%、 80%、 82%、 84%、 85%、 86%、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%。随后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸 残基或核苷酸。如果第一序列的位置由与第二序列的相应位置相同的 氨基酸残基或核苷酸占据，那么所述分子在该位置一致(如本文所用， 氨基酸或核酸的"一致性"等价于氨基酸或核酸的"同源性")。考虑 到为最优比对所述两序列需要引入的间隔数量以及每一 间隔的长度， 所述两序列间的百分数一致性是所述序列共有的一致位置的数量函 数。
可以使用数学算法完成两序列间的序列比较和百分数一致性的确 定。在优选的实施方案中，使用已并入GCG软件包的GAP程序(可自 http:〃www.gcg.com获4寻)6勺 Needleman et al. (1970) /. Mo/. 5z'o/. 48:444-453)算法，使用BLOSUM 62矩阵或PAM250矩阵，以及16, 14， 12, 10, 8, 6或4的间隔加权和1，2，3，4, 5或6的长度加权，确定两氨 基酸序列间的百分数一致性。在另一优选实施方案中，使用GCG软件 包的GAP程序(可自http:〃www.gcg.com获得)，使用NWSgapdna.CMP 矩阵和40, 50, 60, 70或80的间隔加权以及1， 2， 3， 4, 5或6的长度加 权，确定两核苷酸序列间的百分数一致性。特别优选的参数组(以及如
致性或同源性限制之内时，应使用的参数组)是具有12的间隔罚分、4
的间隔扩展罚分和5的移框间隔罚分的BLOSUM 62评分矩阵。
可以使用已并入ALIGN程序(版本2.0)的Meyers et al. (1989) C45/OS4:ll-17)算法，使用PAM120加权残基表、12的间隔长度罚分 和4的间隔罚分，确定两氨基酸或核苷酸序列间的百分数 一 致性。
本文所述的核酸和蛋白序列可以用作"查询序列"以进行对公共 数据库的检索，从而，例如鉴定其它家族成员或相关序列。可以使用 Altschul, et al.(1990)J. Mo/.所o/. 215:403-410)的NBLAST和XBLAST 程序(版本2.0)进行所述4企索。可以使用NBLAST程序、分数=100、 词长=12进行BLAST核苦酸检索，以获得与本发明的核酸分子同源的 核苷酸序列。可以使用XBLAST程序、分数=50、词长=3进行BLAST 蛋白检索，以获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。为获得比 较目的下的间隔比对，可以如Altschul et al. (1997， iVwc/.爿"V/j 25:3389-3402)所述使用间隔BLAST。当使用BLAST和间隔BLAST 程序时，可以使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。 参见〈http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov〉。
由本发明的载体表达的多肽可以具有与SEQ ID NO:3， 5， 8， 10或 13的氨基酸序列足够或基本上一致的氨基酸序列。本文所用的术语 "足够一致的"或"基本上一致的"指含有足够量的或最少量的与第 二氨基酸或核苷酸序列一致或等价(例如，具有相似侧链)的氨基酸残 基或核苦酸的第 一氨基酸或核苷酸序列，以致第 一和第二氨基酸或核 苷酸序列具有共同结构域或共同功能性活性。例如，本文将含有具有 至少约60%或65%—致性、很可能75%—致性、更可能85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%—致性的共 同结构域的氨基酸或核苷酸序列定义为足够或基本上一致。
本申请的表达载体包含编码双向氢化酶蛋白复合体的核酸序列。 所述核酸序列优选地编码图2 —般性示出的/ ox操纵子编码的集 胞藻PCC 6803的双向氢化酶蛋白复合体。
本申请的/ ox:操纵子的核酸序列示于SEQ ID NO:l。所述序列长 约6532个核苷酸。所述操纵子含有8个编码序列SEQ ID NO: 1， 2， 4， 6, 7, 9， 11和12。
SEQ ID NO:2(SEQ ID NO:l的核苷酸31-429)是522个核苷酸(174 个氨基酸)心肌黄酶中长约399个核苷酸且编码133个氨基酸的命名为 hoxE的NADH脱氢酶I链E(SEQ ID NO:3)。
SEQ ID NO:4(SEQ ID NO:l的核苷酸627-2228)长约1602个核苷 酸，且编码533个氨基酸的命名为/zojcF的NADH脱氢酶I链F(SEQ ID NO:5)。
SEQ ID NO:6(SEQ ID NO:l的核苷酸2269-2907)长约639个核苷 酸，且编码与参与转录调节和DNA复制的与病毒调节性蛋白E2共有 28。1%—致性的未知蛋白。
SEQ ID NO:7(SEQ ID NO:l的核苷酸2934-3650)长约717个核苷 酸，且编码238个氨基酸心肌黄酶，即命名为AojcU的NAD还原氢化 酶7亚单位(SEQ ID NO:8)。
SEQ ID NO:9(SEQ ID NO:l的核苷酸3696-4244)长约549个核苷 酸，且编码182个氨基酸的命名为Ao;cY的NAD还原氢化酶S亚单位 (SEQ ID NO: 10)。
SEQ ID NO: 11 (SEQ ID NO:l的核苷酸4560-5009)长约450个核苷 酸，且编码与同样未知功能的极端嗜热菌(77^nwws Aeramo; /n7w)HB27 蛋白共有32.8%—致性的未知蛋白。
SEQ ID NO:12(SEQ ID NO:l的核苦酸5099-6523)长约1425个核 苦酸，且编码474个氨基酸的命名为/zojcH的NAD还原氢化酶/3亚单 位(SEQ ID NO: 13)。
以下描述并入本发明的表达载体的另外核酸分子。
在一个实施方案中，本发明的表达载体包括核酸分子，所述核酸 分子包括SEQIDNO:l的核苷酸序列或其部分或其片段。在一个实施 方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子包括编码SEQID NOs:3， 5, 8， 10和13(集胞藻PCC6803五聚氢化酶蛋白复合体亚单位) 的多肽的核苷酸序列。在优选实施方案中，所述表达载体包括核酸分 子，所述核酸分子包括SEQ ID NOs:2， 4, 7, 9和12(HoxEFUYH编码区) 的核苷酸序列。在可选择的实施方案中，所述表达载体包括核酸分子， 所述核酸分子包4舌SEQ ID NOs:2， 4, 6， 7, 9, 11和12的核苷酸序列。
还在另一实施方案中，所述表达载体包括核苷酸序列，所述核苷酸序
列包括SEQIDNO:l的片段，优选地所述片段是生物学活性片段，即 具有氢化酶活性。
在另 一实施方案中，所述表达载体包括与SEQ ID NOs:l, 2, 4, 6, 7， 9， 11和12的任一所示的核苷酸序列或其部分或其片段互补的核酸序 列。在其它实施方案中，表达载体包括与SEQIDNOs:l， 2,4,6， 7， 9, 11 和12的任一所示的核苷酸序列足够互补的核酸序列，以致它可以分别 与SEQIDNOs:1，2，4， 6, 7, 9, 11和12的任一所示的核苷酸序列杂交， 从而形成稳定二聚体。
在一个实施方案中，所述表达载体包括与SEQIDNO:l所示的核 苷酸序列的全长或其部分或其片段至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99% 或100%同源的核酸序列。
在一个实施方案中，所述表达载体包括编码多肽的天然存在的等 位变体的核酸序列，所述多肽包括SEQIDNO:3， 5, 8, 10和13所示的 氨基酸序列。SEQ ID NO:3， 5， 8， 10或13所示的氢化酶亚单位等位变 体包括功能性等位变体和hoxE、 hoxF、 hoxU、 hoxY或hoxH的氢化 酶亚单位。功能性等位变体是SEQ IDNO:3， 5， 8, 10和13所示的hoxE、 hoxF、 hoxU、 hoxY或hoxH的氢化酶亚单位的天然存在的氨基酸序列 变体，其维持氢化酶活性。功能性等位变体通常会只包含SEQ ID NO:3， 5， 8， 10或13的一种或多种氨基酸的保守性取代，或所述蛋白非关键 区的非关键残基的取代、删除或插入。非功能性等位变体是SEQ ID NO:3,5，8， 10或13的天然存在的氨基酸序列变体，其不具有氢化酶活 性。非功能性等位变体通常会只包含SEQIDNO:3，5，8, 10或13的氨 基酸序列的非保守性取代、删除或插入或过早截断，或关键残基或关 键区的取代、插入或删除。相应于本发明的氢化酶核酸分子的天然等 位变体和同源物的核酸分子可以基于其与本发明的核酸分子的同源 性、4吏用SEQIDNO:1，2, 4, 6，7，9， 11或12所述的核苷酸序列或其部 分作为严紧杂交条件下的杂交探针而分离。
在另外的实施方案中，所述表达载体包括由SEQIDNO:2的核酸
序列代表的核酸分子，或与SEQIDN0:2杂交并编码具有心肌黄酶活 性的多肽的变体核酸分子。
在另外的实施方案中，所述表达载体包括由SEQIDNO:4的核酸 序列代表的核酸分子，或与SEQIDNO:4杂交并编码具有NADH脱氢 酶I活性的多肽的变体核酸分子。
在另外的实施方案中，所述表达载体包括由SEQIDNO:7的核酸 序列代表的核酸分子，或与SEQ ID NO:7杂交并编码具有NAD还原 氩化酶7活性的多肽的变体核酸分子。
在另外的实施方案中，所述表达载体包括由SEQIDNO:9的核酸 序列代表的核酸分子，或与SEQ ID NO:9杂交并编码具有NAD还原 氢化酶S活性的多肽的变体核酸分子。
在另外的实施方案中，所述表达载体包括由SEQ ID NO:12的核 酸序列代表的核酸分子，或与SEQIDNO:12杂交并编码具有NAD还 原氢化酶j8活性的多肽的变体核酸分子。
在另外的实施方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分 子包括SEQIDNO:2的核苷酸序列或其部分或其片段。在另一实施方 案中，所述表达栽体包括核酸分子，所述核酸分子包括与SEQIDNO:2 的核苷酸序列的全长或其部分或其片段至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核苷酸序列。在另一实施方案中，所述表达载体包 括核酸分子，所述核酸分子包括SEQIDNO:2的核苷酸序列或其部分 或其片^殳以及SEQIDNO:4， 6， 7， 9， 11或12的至少一种核香酸序列或 其部分或其片段。在另一实施方案中，所述表达载体包括核酸分子， 所述核酸分子包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列或其部分或其片段以及 与SEQIDNO:4， 6， 7， 9， 11或12的核苷酸序列的全长或其部分或其片 段至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的至少一种核 苷酸序列。在另一实施方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核 酸分子包括与SEQIDNO:2的核苷酸序列的全长或其部分或其片段至 少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、
94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核苷酸序列，以及 SEQ IDNO:4， 6, 7, 9, 11或12的至少一种核香酸序列或其部分或其片 段。在另一实施方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子 包括与SEQ ID NO:2的核苷酸序列的全长或其部分或其片段至少约 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核苷酸序列，以及与SEQ ID NO:4， 6， 7， 9， 11或12的核苷酸序列的全长或其部分或其片^R至少 约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的至少一种核苷酸序列。
在另一实施方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子 包括编码SEQ ID NO:3的多肽(集胞藻PCC6803五聚氢化酶蛋白复合 体的hoxE蛋白亚单位)或其部分或其片段的核苷酸序列。在另一实施 方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子包括编码与SEQ ID NO:3的多肽的全长或其部分或其片革殳至少约60%、65%、70%、75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的核苦酸序列。在另一实施方案中，所述表达 载体包括核酸分子，所述核酸分子包括编码SEQIDNO:3的多肽或其 部分或其片段的核苷酸序列以及编码SEQ ID NO:5， 8， 10或13的多肽 的至少一种或其部分或其片段的核苷酸序列。在另一实施方案中，所 述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子包括编码SEQIDNO:3的多 肽或其部分或其片段的核苷酸序列，以及编码与SEQ ID NO:5， 8， 10 或13的多肽的全长或其部分或其片段至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的至少一种核苷酸序列。在另一实施方案中， 所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子包括编码与SEQ ID NO:3 的多肽的全长或其部分或其片段至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99% 或100%同源的多肽的核苷酸序列，以及编码SEQIDNO:5， 8, 10或13 的多肽的至少一种或其部分或其片段的核苷酸序列。在另一实施方案 中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子包括编码与SEQ IDNO:3的多肽的全长或其部分或其片^:至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90o/o、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的核苷酸序列，以及编码与SEQ ID NO:5， 8, 10 或13的多肽的全长或其部分或其片段至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的至少一种核苷酸序列。
在另外的实施方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分 子包括SEQIDNO:4的核苷酸序列或其部分或其片段。在另一实施方 案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子包括与SEQIDNO:4 的核苷酸序列的全长或其部分或其片段至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核苷酸序列。在另一实施方案中，所述表达载体包 括核酸分子，所述核酸分子包括SEQIDNO:4的核苷酸序列或其部分 或其片段以及SEQIDNO:2， 6,7, 9, 11或12的至少一种核苦酸序列或 其部分或其片段。在另一实施方案中，所述表达载体包括核酸分子， 所述核酸分子包括SEQ ID NO:4的核苦酸序列或其部分或其片4殳以及 与SEQIDNO:2， 6， 7， 9, 11或12的核苷酸序列的全长或其部分或其片 段至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的至少一种核 苷酸序列。在另一实施方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核 酸分子包括与SEQ ID NO:4的核苷酸序列的全长或其部分或其片段至 少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核普酸序列，以及 SEQ IDNO:2， 6, 7， 9, 11或12的至少一种核苷酸序列或其部分或其片 段。在另一实施方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子 包括与SEQ ID NO:4的核香酸序列的全长或其部分或其片段至少约 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核苷酸序列，以及与SEQ ID NO:2， 6， 7， 9, 11或12的核苷酸序列的全长或其部分或其片l殳至少 约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、
95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的至少一种核苷酸序列。
在另一实施方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子 包括编码SEQ ID NO:5的多肽(集胞藻PCC6803五聚氢化酶蛋白复合 体的hoxF蛋白亚单位)或其部分或其片段的核苷酸序列。在另一实施 方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子包括编码与SEQ ID NO:5的多肽的全长或其部分或其片段至少约60。/o、65Q/。、70。/。、750/0、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的核苷酸序列。在另一实施方案中，所述表达 载体包括核酸分子，所述核酸分子包括编码SEQIDNO:5的多肽或其 部分或其片萃殳的核苷酸序列以及编码SEQIDNO:3， 8， 10或13的多肽 的至少一种或其部分或其片段的核苷酸序列。在另一实施方案中，所 述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子包括编码SEQ ID NO:5的多 肽或其部分或其片段的核苷酸序列，以及编码与SEQ ID NO:3， 8， 10 或13的多肽的全长或其部分或其片革殳至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的至少一种核苷酸序列。在另一实施方案中， 所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子包括编码与SEQ ID NO:5 的多肽的全长或其部分或其片段至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99% 或100%同源的多肽的核苷酸序列，以及编码SEQ IDNO:3， 8， 10或13 的多肽的至少一种或其部分或其片段的核苷酸序列。在另 一实施方案 中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子包括编码与SEQ ID NO:5的多肽的全长或其部分或其片段至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的核苷酸序列，以及编码与SEQ IDNO:3， 8, 10 或13的多肽的全长或其部分或其片段至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的至少一种核苷酸序列。
在另外的实施方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分 子包括SEQ ID NO:7的核苷酸序列或其部分或其片段。在另 一实施方
案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子包括与SEQIDNO:7 的核苷酸序列的全长或其部分或其片段至少约60%、 65%、 70°/。、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核苷酸序列。在另一实施方案中，所述表达载体包 括核酸分子，所述核酸分子包括SEQIDNO:7的核苦酸序列或其部分 或其片革爻以及SEQIDNO:2， 4， 6, 9， 11或12的至少一种核苷酸序列或 其部分或其片段。在另一实施方案中，所述表达载体包括核酸分子， 所述核酸分子包括SEQ ID NO:7的核苷酸序列或其部分或其片>R以及 与SEQIDNO:2，4, 6, 9, 11或12的核苷酸序列的全长或其部分或其片 4爻至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的至少一种核 苷酸序列。在另一实施方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核 酸分子包括与SEQ IDNO:7的核苷酸序列的全长或其部分或其片段至 少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核苷酸序列，以及 SEQ ID NO:2， 4， 6， 9, 11或12的至少一种核苷酸序列或其部分或其片 段。在另一实施方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子 包括与SEQ ID NO:7的核苷酸序列的全长或其部分或其片段至少约 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核苷酸序列，以及与SEQ ID NO:2， 4， 6， 9, 11或12的核苷酸序列的全长或其部分或其片^炎至少 约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的至少一种核苷酸序列。
在另一实施方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子 包括编码SEQ ID NO:8的多肽(集胞藻PCC6803五聚氢化酶蛋白复合 体的hoxU蛋白亚单位)或其部分或其片段的核苷酸序列。在另一实施 方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子包括编码与SEQ ID 1^0:8的多肽的全长或其部分或其片段至少约60%、65%、70%、75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93。/。、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的核苷酸序列。在另一实施方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子包括编码SEQIDNO:8的多肽或其 部分或其片段的核苷酸序列以及编码SEQIDNO:3，5, 10或13的多肽 的至少一种或其部分或其片段的核香酸序列。在另一实施方案中，所 述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子包括编码SEQIDNO:8的多 肽或其部分或其片段的核苷酸序列，以及编码与SEQ ID NO:3， 5, 10 或13的多肽的全长或其部分或其片段至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的至少一种核苷酸序列。在另一实施方案中， 所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子包括编码与SEQ ID NO:8 的多肽的全长或其部分或其片IS:至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99% 或100%同源的多肽的核苷酸序列，以及编码SEQIDNO:3，5， 10或13 的多肽的至少一种或其部分或其片段的核苷酸序列。在另一实施方案 中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子包括编码与SEQ ID NO:8的多肽的全长或其部分或其片段至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的核苷酸序列，以及编码与SEQ ID NO:3， 5， 10 或13的多肽的全长或其部分或其片革爻至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的至少一种核苷酸序列。
在另外的实施方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分 子包括SEQIDNO:9的核苷酸序列或其部分或其片段。在另一实施方 案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子包括与SEQIDNO:9 的核苷酸序列的全长或其部分或其片^殳至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核香酸序列。在另一实施方案中，所述表达载体包 括核酸分子，所述核酸分子包括SEQIDNO:9的核苷酸序列或其部分 或其片段以及SEQ ID NO:2， 4, 6, 7， 11或12的至少一种核苷酸序列或 其部分或其片段。在另一实施方案中，所述表达载体包括核酸分子， 所述核酸分子包括SEQ ID NO:9的核苷酸序列或其部分或其片段以及
与SEQIDNO:2，4, 6, 7, 11或12的核苷酸序列的全长或其部分或其片 ,殳至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80Q/。、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的至少一种核 苷酸序列。在另一实施方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核 酸分子包括与SEQ IDNO:9的核苷酸序列的全长或其部分或其片段至 少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核香酸序列，以及 SEQ ID NO:2， 4, 6， 7, 11或12的至少一种核普酸序列或其部分或其片 段。在另一实施方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子 包括与SEQ ID NO:9的核苷酸序列的全长或其部分或其片段至少约 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核苷酸序列，以及与SEQ ID NO:2， 4, 6, 7, 11或12的核苷酸序列的全长或其部分或其片^殳至少 约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的至少一种核苷酸序列。
在另一实施方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子 包括编码SEQ ID NO:10的多肽(集胞藻PCC6803五聚氢化酶蛋白复合 体的hoxY蛋白亚单位)或其部分或其片段的核苷酸序列。在另一实施 方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子包括编码与SEQ ID NO:10的多肽的全长或其部分或其片段至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的核苷酸序列。在另一实施方案中，所 述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子包括编码SEQ ID NO:10的 多肽或其部分或其片萃史的核香酸序列以及编码SEQ ID NO:3， 5, 8或13 的多肽的至少一种或其部分或其片段的核苷酸序列。在另一实施方案 中，所述表达栽体包括核酸分子，所述核酸分子包括编码SEQ ID NO:10的多肽或其部分或其片l史的核苷酸序列，以及编码与SEQ ID NO:3， 5， 8或13的多肽的全长或其部分或其片段至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的至少一种核苷酸序列。在另一
实施方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子包括编码与
SEQ ID NO:IO的多肽的全长或其部分或其片段至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的核苦酸序列，以及编码SEQID NO:3， 5, 8或13的多肽的至少一种或其部分或其片段的核苷酸序列。 在另一实施方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子包括 编码与SEQ ID NO:10的多肽的全长或其部分或其片^更至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的核苷酸序列，以及编码 与SEQ ID NO:3， 5， 8或13的多肽的全长或其部分或其片段至少约 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的至少一种核苦酸 序列。
在另外的实施方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分 子包括SEQ ID NO:12的核苷酸序列或其部分或其片段。在另一实施 方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子包括与SEQ ID NO:12的核苷酸序列的全长或其部分或其片段至少约60%、65%、70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核苷酸序列。在另一实施方案中，所述表达 载体包括核酸分子，所述核酸分子包括SEQ ID NO:12的核苷酸序列 或其部分或其片段以及SEQ ID NO:2， 4, 6， 7， 9或11的至少一种核苷 酸序列或其部分或其片段。在另一实施方案中，所述表达载体包括核 酸分子，所述核酸分子包括SEQ ID NO:12的核苷酸序列或其部分或 其片革爻以及与SEQ ID NO:2， 4, 6， 7， 9或11的核苷酸序列的全长或其 部分或其片段至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的至少 一种核苷酸序列。在另一实施方案中，所述表达载体包括核酸分子， 所述核酸分子包括与SEQ ID NO:12的核苷酸序列的全长或其部分或 其片段至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核苷酸序列，
以及SEQ ID NO:2， 4, 6, 7, 9或11的至少一种核苷酸序列或其部分或 其片段。在另一实施方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸 分子包括与SEQ ID NO:12的核苷酸序列的全长或其部分或其片段至 少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的核苷酸序列，以及 与SEQ ID NO:2， 4, 6， 7， 9或11的核苷酸序列的全长或其部分或其片 段至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的至少一种核 苷酸序列。
在另一实施方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子 包括编码SEQ ID NO:13的多肽(集胞藻PCC6803五聚氬化酶蛋白复合 体的hoxH蛋白亚单位)或其部分或其片段的核苷酸序列。在另一实施 方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子包括编码与SEQ ID NO:13的多肽的全长或其部分或其片段至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的核苦酸序列。在另一实施方案中，所 述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子包括编码SEQ ID NO: 13的 多肽或其部分或其片段的核香酸序列以及编码SEQ ID NO:3， 5, 8或10 的多肽的至少一种或其部分或其片段的核苷酸序列。在另一实施方案 中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子包括编码SEQ ID NO:13的多肽或其部分或其片^a的核苦酸序列，以及编码与SEQ ID NO:3， 5, 8或10的多肽的全长或其部分或其片段至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的至少一种核苷酸序列。在另一 实施方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子包括编码与 SEQ ID NO:13的多肽的全长或其部分或其片段至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80o/o、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的核香酸序列，以及编码SEQID NO:3， 5, 8或10的多肽的至少一种或其部分或其片段的核苷酸序列。 在另一实施方案中，所述表达载体包括核酸分子，所述核酸分子包括
编码与SEQ ID NO:13的多肽的全长或其部分或其片4爻至少约60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的核苷酸序列，以及编码 与SEQ ID NO:3， 5, 8或10的多肽的全长或其部分或其片^殳至少约 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同源的多肽的至少一种核苦酸 序列。
在另一实施方案中，所述表达载体包括如此前所述的核酸分子， 所述核酸分子包括所述核苷酸序列的特定改变，以致优化密码子和 mRNA二级结构用于在宿主细胞中翻译。优选地，改变所述核酸的密 码子使用以用于在所述宿主细胞中表达，例如，可以使用Calcgene， Hale， RS and Thomas G.尸ra^/"12, 185-188 (1998)， UpGene， Gao， W W a/.丑/o&c/mo/. iVog. 20， 443-448 (2004)，或者 Codon Optimizer, Fuglsang, A.尸rato'w尸i/ny: 31， 247-249 (2003) 完成密码子优化。可以通过大量不同实验操作，包括小量密码子的修 饰Ver雨rt " a/.油c/e/c ^"Ws紐25: 2069-2074 (2000),或者重写大 段所述核酸序列，例如多达1000 bp的DNA， Hale, RS and Thomas G.
五x; ^ Pw〃y: 12,185-188 (1998)，完成才艮据所述优选的密码子优 化^修改所述核酸。可以通过递归PCR完成所述核酸序列的重写，其中 通过重叠寡核苷酸引物的延伸产生所需序列，Prodromou and Pearl, 5: 827-829 (1992)。更大段DNA的重写可能需要多达三个 连续轮次的递归PCR， Hale, RS and Thomas G.尸ra^z'w五x/ er.尸wn;/: 12, 185-188 (1998)， Te'o " fl/， F5MS M!cra&o/.190: 13-19， (2000)。
可选择地，可以提高所述宿主细^^中同源tRNA的水平。可以通 过增加各自tRNA基因的拷贝数完成所述提高，例如通过将相容多拷 贝质粒上的相关tRNA基因插入所述宿主细胞，或者可选择地将所述 tRNA基因插入所述表达载体自身。使用大肠杆菌表达系统时，可以 采用具有增强表达的argU表达(用于AGG/AGA的识别)的大肠杆菌宿 主细胞。此外，还可以采用包括ilex(用于AUA的识别)、leuW(用于 CUA的识别)、proL(用于CCC的识别)或glyT(用于GGA的识别)的
tRNA基因的宿主细月包，Brinkmann & a/. 85， 109-114， (1989),
Kane FJ. C Opzw. 6:494-500 (1995), Rosenburg W a/, /
5a"en'o/. 175， 716-722， (1993), Siedel " a/, 5/oc/ 簡勿，31, 2598-2608 (1992)。
在另一实施方案中，所述表达载体包括如此前所述的核酸分子， 所述核酸分子包括所述核苷酸序列的特定改变，以致优化所述双向氲 化酶的表达、活性或功能性寿命。优选地，使此前所述双向氢化酶核 酸经受遗传操作和破裂技术。本领域已知多种遗传操作和破裂技术， 包括但不限于DNA滑动(US 6,132,970， Punnonen J et al, <Sc/e"ce cfe M^//c/"e, 7(2): 38-47， (2000)， US 6,132,970)、连续突变和筛选。突变的 一种实例是错误倾向PCR，借此使用例如可商购试剂盒，如 GeneMorph II试剂盒(Stratagene , US),在PCR期间通过US 2003152944所述4昔误倾向DNA聚合酶和反应条件的4吏用故意引入突 变。将随机化DNA序列克隆进表达载体并且筛选所得突变体文库的 改变的或改良的蛋白活性。
Hox表达载体的制备
本领域技术人员会清楚可用于表达载体制备的分子技术。
可以使用互为引物的寡核香酸和本文所述核酸序列，通过合成核 酸分子，制备如上所述的用于并入本发明的表达载体的核酸分子。
已开发大量分子技术用于经互补粘性末端可操作地将DNA连接 至载体。在一种实施方案中，可以将互补同聚物带添加至待插入所述 载体DNA的核酸分子。随后通过互补同聚尾巴间的氢键连接所述载 体和核酸分子以形成重组DNA分子。
在可选择的实施方案中，将含有所提供的 一种或多种限制性位点 的合成连接子用于可操作地将所述核酸分子连接至所述表达载体。在 一个实施方案中，如较早前所述，通过限制性内切酶消化生成所述核 酸分子。优选地，使用噬菌体T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合 酶I，即用其3，-5，-核酸外切活性移除突出性3'单链末端并用其聚合活 性填补3，凹端的酶，来处理所述核酸分子，〃Mv而生成平端DNA片段。
随后在诸如噬菌体T4 DNA连接酶的能催化平端DNA分子连接的酶 的存在下，使用大摩尔过量的连接子分子孵育所述平端片段。因而所 述反应产物是在其末端携带聚合连接子序列的核酸分子。随后使用适 当的限制性酶切割这些核酸分子并将其连接至已使用产生与所述核酸 分子末端相容的末端的酶切割的表达载体。
可选择地，可以采用包括无需连接的克隆(LIC)位点的栽体。随后 可以将所需PCR扩增的核酸分子克隆进所述LIC栽体而无需限制性消 化或连接(Aslanidis and de Jong, M/c/.18, 6069-6074， (1990)， Haun， eZ a/, 5z'c^ecA/n々i/e51 13， 515-518 (1992)。
为分离和/或修饰用于插入所选质粒的所关注的核酸分子，优选使 用PCR。可以设计用于PCR制备所述序列的适当引物以分离所述核酸 分子的所需编码区、添加限制性内切酶或LIC位点、将所述编码区置 于所需阅读框。
在优选实施方案中，通过使用如Saiki et al (1988)239, 487-491公开的聚合酶链式反应，使用适当的寡核普酸引物，制备用于 并入本发明的表达载体的核酸分子。扩增所述编码区，同时所述引物 自身被并入所述扩增序列产物。在优选实施方案中，所述扩增引物含 有使所扩增序列产物被克隆进适当载体的限制性内切酶识别位点。
优选地，通过PCR获得SEQIDNO:l的核酸分子，并使用限制性 内切酶消化和连接(本领域公知技术)将其引入表达载体。更为优选地， 将SEQIDNO:l的核酸分子引入pET-17b表达载体，并将其可操作地 连才妻至T7启动子。
可选择地，通过酵母同源重组将SEQIDNO:l的核酸分子引入表 达载体(Raymon et al.， 26(1): 134-8, 140-1， 1999)。
本发明的表达载体可以包含此前所述核酸分子的单一拷贝，或此 前所述核酸分子的多拷贝。
优选地，如图4所示，本发明的表达载体是包括SEQ ID NO: 1(6532 bp)的双向氢化酶的pET-17b表达载体(3306 bp)。
宿主细胞
本文所用"细胞的纯化制备物"指在所培养细胞或微生物细胞的
情况下，至少10%且更为优选50%的所述细胞的制备物。
本文所用"宿主细胞"和"重组宿主细胞"被可互换地使用。所 述术语指特定的所述细胞，并且还指所述细胞的子代或潜在子代。因 为出于突变或环境影响，某些修饰可能在后续代发生，因而所述子代 事实上可以与所述亲代细胞不一致，但是仍然包含在本文所用术语的 范围内。
在另一方面，本发明提供用于本发明的表达系统的宿主细胞，所 述宿主细力包包括表达栽体，所述表达栽体包括本文所述核酸分子(例如 SEQIDNO:l的Hox操纵子)或其部分或其片段。在可选择的实施方案 中，所述宿主细胞包括本发明的表达载体，所述表达载体包括本文所 述核酸分子(例如SEQIDNO:l的Hox才喿纵子)或其部分或其片段，所 述栽体还包括使其同源重组进所述宿主细胞基因组的特定位点的序 列。
用于本发明的表达系统的宿主细胞可以是需氧细胞或可选择地是 兼性厌氧细胞。优选地，所述细胞是细菌细胞。可选择地，所述细胞 可以是酵母细胞(例如，毕赤酵母(Saccharomyces， Pichia))、藻细胞、 昆虫细月包或才直物细月包。
细菌宿主细胞包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。合适的细菌宿 主细胞包括但不限于革兰氏阴性细菌，例如肠细菌(五w&ra6a"en'a)家 族的细菌，最为优选地，大肠杆菌。大肠杆菌是最为优选的用于本发 明的细菌宿主细胞。大肠杆菌中的表达相对其它表达系统提供众多优 势，特别是低开发成本和高产量。适合蛋白高表达的细胞包括，例如， 大肠杆菌W3110、大肠杆菌B菌株、大肠杆菌BL21, BL21(DE3)和 BL21(DE3)pLysS, pLysE， DH1， DH4I, DH5， DH5I, DH5IF，， DH5IMCR, DH10B, DHI0B/p3, DHl IS, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110， K38, RR1， Y1088, Y1089, CSH18, ER1451, ER1647特别适合用 于表达。还优选大肠杆菌K12菌抹，因为所述菌抹是非病原性标准实 验室菌林，并且所述菌林包括NovaBlue、 JM109和DH5a(Novogen⑧)、 大肠杆菌K12RV308、大肠杆菌K12C600、大肠杆菌HB101,参见，
例如，Brown, Molecular Biology Labfax(分子生物学实验室 Labfax)(Academic Press (1991))。
可选择地，来自沙门氏菌属、志贺菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属、 变形杆菌属和欧文氏菌属的肠细菌。其它原核宿主细胞包括沙雷氏菌、 假单胞菌、柄杆菌或蓝细菌，例如来自集胞藻属或聚球藻属的细菌， 更具体地，集胞藻PCC 6803或聚球藻PCC 6301。可选择地，所述宿 主细胞可以属于杆菌属，例如短杆菌CBac/〃Ms &ev&)或枯草杆菌
Sw6"7zX)、苏云金芽孢杆菌(5aCZ'〃MS ,/^W"g/eweS7'51)。可选捧地，
所述宿主细月包可以属于乳J求菌属，例如乳乳球菌(丄a"ococc"s /ac""。
可选择地，所述细菌细胞属于放线菌家族，更具体地来自链霉菌属、 红球菌属、棒杆菌属、分支杆菌属。更为特别地，浅青紫链霉菌
(&邵fom少ces //vzV^ms)、 产二素链霉菌(^邵tom少ces謂6o/ac/ew力、弗 雷德氏链霉菌(&^ptom_yces /ra&ae)、 灰褐链霉菌(5^e内ow^ces g/lseci/kscws)、 红串红球菌(朋odococctw "Arapo//"、 谷氛酸棒杆菌 (Cb^ywe6aCen'w附 g7w^zwn'ct/附)、耻；后分4支4干菌(Afyco6aCen、/w
用于在原核宿主中增殖载体的标准技术为本领域技术人员所公知 (参见,例如，Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology 3rd Edition(精编分子生物学实验指南第三版)(John Wiley & Sons 199")。 为最大化大肠杆菌中重组蛋白的表达，本发明的表达载体可以在 蛋白水解切割所述重组蛋白的能力受损的宿主细菌中表达并入其中 的#亥酸分子(Gottesman， S., (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185(基因表达技术酶学方法185)， Academic Press，SanDiego， California, 119-128)。可选择地，可以将并入本发明 的表达载体的核酸分子减毒以致用于每一氨基酸的单独密码子是大 肠杆菌中偏好4吏用的那些(Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118)。可以通过标准DNA合成4支术进行对本发明的核酸序 列的所述改变。
宿主细力包转化
可以通过常规转化或转染技术将本发明的表达载体引入宿主细胞。
本文所用"转化"和"转染"指本领域已知用于将外源核酸引入 宿主细胞的多种技术。使用本发明的表达载体转化适当宿主细胞由本 领域已知方法完成，并且通常依赖载体和宿主细胞的类型。所述技术
包括但不限于磷酸钩或氯化钾共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂 转染、化学穿孔或电穿孔。
本领域已知用于转染细菌宿主细月包的4支术7>开于例如Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual(分子克隆，实'验室 手册)，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y; Ausubel et al (1987) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY; Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110; Luchansky et al (1988) Mol. Microbiol. 2, 637-646。所有所述方法通过 引用并入本文。
可以通过本领域/>知技术鉴定成功转化的细胞，即，含有本发明 的表达载体的那些细胞。例如，可以培养使用本发明的表达载体转染 的细胞以产生所述双向氢化酶蛋白复合体。可以通过本领域公知技术 检验细胞的所述表达栽体DNA的存在。可选择地，可以使用与其杂 交的抗体检测所述双向氢化酶蛋白复合体或其部分或其片段的存在。
在优选实施方案中，本发明包括转化宿主细胞的培养物。优选地， 所述培养物是克隆上同质的。
所述宿主细胞可以包含此前所述表达载体的单一拷贝，或者可选 择地，所述表达载体的多拷贝。
氢气的产生
用包括此前所述核酸分子的本发明的表达载体转化的宿主细胞可 以用来产生(即表达)具有氢化酶活性的多肽。
优选地，本发明包括用于大规模产生氢气的表达系统，所述产生 使用编码双向氢化酶蛋白的本发明的核酸编码序列。优选地，所述表 达系统是大肠杆菌表达系统。
使本发明的转化的宿主细胞以技术人员熟悉的方式生长或培养，
所述方式取决于所述宿主生物体。通常，在0°C至100°C，优选地10°C 至60。C的温度下，使宿主细胞生长于液体培养基，同时通以氧气，所 述液体培养基包括通常以糖形式的碳源，通常以诸如酵母提取物的有 机氮源或诸如硫酸铵的盐的形式的氮源，诸如铁盐、锰盐和镁盐的微 量元素，以及，如果合适的话，维生素。
可以使或不使所述液体培养基的pH保持恒定，即可以在所述培 养期调节所述液体培养基的pH。可以使所述培养物分批地、半分批地 或连续地生长。可以在所述发酵开始时提供营养物或者半连续地或连 续地进料营养物。可以通过技术人员已知的方法，例如通过提取、蒸 馏、结晶化，如果合适的话，用盐沉淀，和/或色谱法，从上述生物体 分离所产生的产物。为此，可以预先有利地破坏所述宿主细胞。在这 一过程中，使所述pH值有利地保持在pH4至pH 12,优选地pH6至 pH9，尤其优选地pH7至pH8。
可以在Chmiel的教科书(Bioproze(3technik 1. EinfDhrung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess technology 1. Introduction to Bioprocess technology(生物工艺技术 1.生物工艺技术导论)](Gustav Fischer Verlag， Stuttgart, 1991))或在Storhas的教科书(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and peripheral equipment(生物反应 器和外围设备)](Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994))中找到已 知培养方法的综述。
待用培养基必须合适地满足所考虑菌抹的需要。可以在美国细菌 学学会的教科书"Manual of Methods for General Bacteriology(普通细菌 学方法手册)"(Washington D.C., USA, 1981)里找到对用于各种微生物 的培养基的描述。
如上所述，根据本发明可以采用的这些培养基通常包括一种或多 种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或微量元素。
优选的碳源是糖，诸如单糖、二糖或多糖。碳源的实例是葡萄糖、 果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗 糖、棉籽糖、淀粉或纤维素。也可以通过诸如糖蜜或来自糖精制的其
它副产物的复杂化合物向所述培养基添加糖。添加多种碳源的混合物 也可能是有优势的。其它可能的碳源是油和脂肪(诸如，例如，豆油、 向日葵油、花生油和/或椰子脂)、脂肪酸(诸如，例如，棕榈酸、^J旨
酸和/或亚油酸)、醇和/或多元醇o者如，例如，丙三醇、曱醇和/或乙醇) 和/或有才几酸(诸如，例如，乙酸和/或乳酸)。
氮源通常是有机或无机氮化合物或者包括这些化合物的物质。氮 源的实例包括液态或气态氨或诸如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵 或硝酸铵的铵盐，硝酸盐，尿素，氨基酸或诸如玉米浆、大豆粕、大 豆蛋白、酵母提取物、肉汁及其它的复杂氮源。所述氮源可以单独使 用或作为混合物使用。
可以存在于所述培养基的无机盐化合物包括钙、镁、钠、钴、钼、 钾、锰、锌、铜和铁的氯盐、磷盐和硫酸盐。
i者如，例如石克酸盐、亚石克酸盐、连二亚辟b酸盐、连四辟u酸盐、碌u 代硫酸盐、硫化物的含疏无机化合物，或者诸如硫醇和巯基化合物的 其它有机硫化合物可以用作用于产生特别是曱硫氨酸的含硫精细化学 药品的碌u源。
磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或对应的含钠盐可以用作磷源。 可以向所述培养基添加螯合剂以保持溶液中的金属离子。特别适
合的螯合剂包括诸如儿茶酚或原儿茶酸酯的二羟基苯酚以及诸如柠檬
酸的有才几酸。
根据本发明用于培养宿主细胞的发酵培养基通常也包括诸如维生 素或生长促进剂的其它生长因子，所述生长因子包括例如，生物素、 核黄素、碌b胺、叶酸、烟酸、泛酸和吡哆醇。生长因子和盐经常得自 诸如酵母提取物、糖蜜、玉米浆及类似物的复杂培养基组分。此外，
可能向所述培养基添加合适的前体。所述培养基化合物的准确组合严 重依赖具体的实验，并且为每一特定情况单独决定。可以在教科书 "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach(应用孩吏生物生理 学，实践方法)"(Editors P.M. Rhodes, P.F. Stanbury， IRL Press (1997) pp. 53-73， ISBN 0 19 963577 3)中找到优化培养基的信息。生长培养基还可 以获得自商业供应商，例如Standard l(Merck)或BHI(脑心浸液，DIFCO)
及类似物。
通过加热(在1.5巴和121。C下20分钟)或通过过滤除菌灭菌全部 培养基组分。所述组分可以一起灭菌或着如果需要，可以单独灭菌。 全部培养基组分可以按需要存在于培养起始或者连续地或分批地加 入。
所述培养温度通常是15。C至45°C，优选地25°C至40°C,更为 优选地25。C至37。C，更为优选地35。C至37°C，更为优选地，37°C，
变。所述培养基的pH应当在5至8.5的范围，优选7.0左右。可以通 过加入诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氨和氨水的碱性化合物或者诸如磷 酸或硫酸的酸性化合物，在培养期间控制用于培养的pH。可以通过采 用诸如，例如脂肪酸聚乙二醇醚的防沫剂，来控制发泡。为维持载体 稳定性，可以向所述培养基添加具有选择性作用的合适物质，例如抗 生素。可以通过向所述培养物导入氧气或含氧气的气体混合物(诸如， 例如环境空气)，来维持需氧条件。所述培养的温度通常是20。C至 45。C，并且优选地是25。C至40°C。继续所述培养直至所需产物的形 成处于极大。本目标通常在10小时至160小时内达到。
以这种方式获得的发酵肉汤，特别是包括多不饱和脂肪酸的那些， 通常包含按重量计7.5%至25%的干物质。
随后可以进一步加工所述发酵肉汤。根据需要，可以通过诸如， 例如离心、过滤、倾析或这些方法的组合的分离方法，从所述发酵肉 汤中完全或部分移除所述生物量，或者使所述生物量完全留于所述肉 汤。在所述生物量分离后将其加工是有优势的。
然而，也可以使用已知方法(诸如，例如，借助旋转蒸发器、薄膜 蒸发器、降膜蒸发器，通过反渗透或纳米过滤)，使所述发酵肉汤变浓 或浓缩，而不分离所述细胞。最后，可以加工所述浓缩发酵肉汤以获
得其中存在的脂肪酸。
优选地，培养转化的宿主细胞以致产生双向氢化酶蛋白复合物。 优选地，在能够诱导所述宿主细胞产生氢气的条件下培养细胞。
可以使用分批发酵培养转化的宿主细胞，特别是当需要使用本发
明的双向氢化酶表达系统大规模产生氢气时。可选择地，可以使用补 料发酵和/或连续培养从使用本发明的双向氢化酶表达系统转化的宿 主细胞生成一定量的氢气。
可以在需氧或厌氧条件下培养转化的宿主细胞。在需氧条件下， 优选地，通过例如，添加还原剂或去氧剂，或通过使用中性气体净化 所述反应培养基，从所述培养基连续地移除氧气。
本领域已知用于大规模培养宿主细胞的技术公开于，例如，Bailey and Ollis (1986) Biochemical Engineering Fundamentals(生物化学工程 基础)，McGraw-Hill, Singapore; 或者 Shuler (2001) Bioprocess Engineering: Basic Concepts(生4勿工艺工禾呈基础才既念)，Prentice Hall。 所有这些技术通过引用并入本文。
优选地，将转化的宿主细胞培养于含有用于所述表达载体的适当 选择性抗生素的LB。孵育所转化的宿主细胞同时在37°C下振摇直至 所述OD,达到0.6至1.0。随后将所述培养物过夜储存于4。C。次日 早上，通过离心(在微型离心机中30秒)收集所述细胞。随后将收集的 细胞重悬于新鲜LB培养基。优选地，所述LB培养基包含另外的营养 培养基。优选地，所述营养培养基是BG-ll或BG-110培养基，Stanier R,Y,a/. (1971) 5a"eno/.及ev. 35: 171- 205。
优选地，最适地表达本发明的双向氢化酶编码序列的细菌细胞培 养物的双向氪化酶含量是至少100 nmol/l全体细胞培养物，优选地至 少150 nmol/l全体细胞培养物，更为优选地几乎250 nmol/1全体细胞 培养物，还更优选地约500 nmol/1全体细胞培养物以及最为优选地约 1000 nmol/l。通常地，所述双向氢化酶含量是约200 nmol/1全体细胞 培养物。
可以将本发明的宿主细胞培养于容器，例如生物反应器。生物反 应器，例如发酵罐，是包括细胞或酶的容器，并且通常用于工业规模 地产生分子。所述分子可以是通过包含于所述容器的细胞产生的或通 过在所述反应容器中完成的酶反应产生的重组蛋白(例如，诸如氢化酶 的酶)或者化合物。通常，基于细胞的生物反应器包括所关注的细胞， 并且包括需要进行所述反应的所有营养物和/或辅因子。
实施例
实施例1 表达载体的构建
使用作为模板的集胞藻PCC 6803文库和寡核苷酸引物 SynBamFwd: ccaatcatgg atccgctgta ttgctccttt ttgagg (SEQ ID NO: 14)和 SynEcoRev: ggattactga attcccgtct gaatgttttt tg (SEQ ID NO: 15)通过PCR扩 增生成所述双向氢化酶蛋白复合体编码区，即SEQ ID NO: 1。所得基因 序列编码SEQ ID NO:l,其包括分别并入5'端和3'端的BamHI和EcoRI 限制性位点。
如图4所示，所得PCR产物由限制性内切酶，即BamHI和EcoRI, 于所并入的限制性位点而切割，并使用T4连接酶，通过连接插入也已使 用BamHI和EcoRI通过限制性内切酶消化切割的表达载体pET-17b(此前 已述)。
实施例2 表达载体的构建
在可选择的实例中，使用作为模板的集胞藻PCC 6803文库和寡 核苦酸引物SynBamFwd: ccaatcatgg atccgctgta ttgctccttt ttgagg (SEQ ID NO: 14)和SynNotRev: ggattactgc ggccgcccgt ctgaatgttt tttg (SEQ ID NO: 16)通过PCR扩增生成所述双向氬化酶蛋白复合体编码区，即SEQ ID NO: 1 。所得基因序列编码SEQ ID NO: 1,其包括分别并入5，端和3，端的BamHI 和NotI限制性位点。
所得PCR产物由限制性内切酶，即BamHI和Notl,于所并入的限 制性位点而切割，并使用T4连接酶，通过连接插入已使用BamHI和Notl 通过限制性内切酶消化切割的表达载体pET-17b(此前已述)。
实施例3 转化
随后将实施例1和实施例2所述的每一表达载体转化进NovoBlue⑧感受态细胞(Novagen⑧，USA)。将1 的每一表达载体产物 和20 ]Lil的1^(^081116@细胞于冰上孵育5分钟，于42°C温育30秒，并 于水上孵育2分钟。添加80 /xl的SOC(RT)，并将反应混合物于37°C 温育60分钟。随后将反应混合物接种于含有50 Ail羧千青霉素的LB 琼脂，并置于37。C温度下20小时。
载体稳定性
选择来自EcoRI表达载体转化子和Notl表达载体转化子两者的集 落，并将其重悬以100 /d加入10.0 ml含50 jng/ml羧苄青霉素的LB 肉汤。随后将所述反应混合物于37。C培养20小时，并以250RPM振摇。
为证实pET17b-hox质粒的存在，从所培养纯抹提取质粒。使用 MoBio 6分钟质粒小量提取试剂盒(MO BIO Laboratories, USA)完成 Notl质粒的提取。使用Qiager^质粒小量提取试剂盒(Qiagen气Inc. USA) 完成EcoRI质粒的提取。
相应地4吏用BamHI和EcoRI或BamHI和Notl， 4吏所提取质粒经 受限制性消化，并且将所消化产物于0.6% TAE琼脂糖凝胶在100 V 下经受凝胶电泳60分钟。检测含有大小正确的片段的菌抹，所述片段 为3.3 kb pET-17b载体和6.4 kb Aox操纵子核酸分子插入。
双向五聚氢化酶蛋白复合体的表达
将含有大小正确的片段的两种纯抹(一种Notl而一种EcoRI)转染 进大肠杆菌BL21和BL21(DE3)pLys5细胞系。具体地，制备1 ng/jtd 纯抹细胞的稀释液，用于转染进BL21和BL21(DE3)pLys5细胞系，所 述转染通过随后于冰上孵育5分钟，于42°C温育30秒，并于冰上再 孵育2分钟。随后添加80 /il的SOC(RT),并将反应混合物于37。C温 育60分钟。随后将100 jid的反应混合物划线接种于含有50 ]Lig/ml羧 苄青霉素或氨千青霉素的LB琼脂板，接着在37。C下温育过夜。
将Notl载体转染的细胞的 一种集落用作接种物，这包括将具有50 /ig/ml羧千青霉素的1 ml LB肉汤中的转化子集落用于接种250 ml烧
瓶中的50 ml培养物。类似地，将EcoRI载体转染的细胞的一种集落 用作接种物。在37。C下孵育每一所述烧瓶培养物，并以250RPM将 其振摇4-5小时。随后使用或不使用蛋白表达刺激(通过添加200/d的 100nMIPTG(终浓度0.4nM)而诱导)孵育培养物。接着在37。C下进一 步振摇孵育培养物3小时。随后通过在4°C下以5000xg离心收获细 胞。接着将所述细胞沉淀物干燥地储存于70。C以备后用。
重组双向氢化酶蛋白复合体以不溶性包涵体和可溶性蛋白积累。 使用12.5 ml TRIS-HC1 pH8.0清洗沉淀物一次。
使用2 ml的细菌蛋白提取试剂(溶于磷酸盐緩沖液的B-PER; Pierce, USA)和40 /xl的10 mg/ml溶菌酶(终浓度200 /xg/ml)以进一步消 化细胞碎片并释放包涵体，从而提取包涵体蛋白。随后将所述"包涵 体，，沉淀通过加热、涡旋和超声处理溶于1%SDS(1 ml)。
使用2 ml的B-PER试剂(Pierce, USA)并经涡旋或吹打的机械匀浆 提取可溶性蛋白。随后使用离心将所述部分在27,200xg下分离1小时， 从而导致超过90%的回收。通过添加5 ml的三氯乙酸/丙酮(5 ml的6N TCA或3 ml TCA,使用丙酮将300 /il的TBP稀释至总体积30 ml)使 用TCA沉淀浓缩所述可溶性蛋白组分，将其充分混合并储存于-20。C。 随后以4,600xg离心所述混合物1小时，接着使用平衡緩沖液(300 /xl 的TBP加入29,700 jnl丙酮)清洗。随后再次借助加热、涡旋和超声处 理将沉淀物重悬于1% SDS。
随后，根据pl将分离自Notl和EcoRI转化的细胞的可溶性蛋白 和包涵体分开，并使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将其可 视化。具体地，将10 /xl的每一样品(来自使用均诱导的和未诱导的DE3 和pLysS两者转化的Notl和EcoRI细胞的可溶性蛋白和包涵体)在150 V下跑10% SDS-PAGE凝胶65分钟。这接着是染色1小时并过夜脱 色。
考虑到所得SDS-PAGE凝胶内两种双向氢化酶亚单位(心肌黄酶 和天然的)的相对位置，将带切除、清洗、脱色、用胰蛋白酶消化并提 取肽，此后使用质语分析鉴定。使用QqTOF-MS-MS的肽指紋结果表 明在所述i秀导的DE3 Notl转化的细胞系中存在/wxU和hoxU亚单位。
而所述诱导的EcoRI转化细胞的结果表明Zw;cH、 AoxU、 ZjojcF和AoxY 也是以包涵体存在于DE3和pLysS大肠杆菌细胞系中。
读者的注意力涉及和本申请相关的与本说明书同时提交或之前提 交的且与本说明书一道向公众检查开放的所有论文和文件，并且所有 所述"i仑文和文件的内容通过引用并入本文。
可以将本说明书(包括任何附带的权利要求书、摘要和附图)公开 的所有特征，和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤以任意组合 方式而组合，所述组合方式除去至少一些所述特征和/或步骤相互排斥 的组合方式。
可以用达到相同、等^f介或类似目的的可选择特征4、替本"i兌明书(包 括任何附带的权利要求书、摘要和附图)公开的每一特征，除非已在表 达上相反地陈述。因此，除非已在表达上相反地陈述，公开的每一特 征只是等价或类似特征的 一般系列的 一种实例。
本发明不限于任何前述实施方案的细节。本发明延伸至本说明书 (包括任何附带的权利要求书、摘要和附图)所公开特征的任何新的一 种或任何新的组合，或者延伸至如此公开的任何方法或过程的步骤的 任何新的 一种或4壬何新的组合。
权利要求
1.用于产生氢化酶蛋白或氢化酶蛋白复合体的表达载体，包括可操作连接的下列元件a)转录启动子元件；b)编码具有与蓝细菌氢化酶相关的特异酶活性的多肽的核酸分子；和c)转录终止子。
2. 如权利要求1所述的表达载体，其中所述核酸分子选自i) 包括SEQIDNO:l的核苷酸序列的核酸分子；ii) 具有与SEQIDNO:l的核香酸序列至少70%—致性且编码 具有氢化酶活性的多肽的核酸分子；iii) 与SEQ ID NO:l的核酸序列杂交且编码具有氢化酶活性 的多肽的核酸分子；或者iv) 包括以上i)、ii)和iii)的序列遗传密码的简并核苷酸序列的 核酸分子。
3. 如权利要求2所述的表达载体，其中所述核酸分子由SEQ ID NO:l的核普酸序列组成。
4. 如权利要求1所述的表达载体，其中所述核酸分子选自i) 包括SEQ ID NOs:2， 4， 7， 9和12的每一种的核普酸序列的 核酸分子；ii) 核酸分子，所述核酸分子包括具有与SEQ ID NO:2至少 70%—致性的核苦酸序列、具有与SEQ ID NO:4至少70%—致性的核 苷酸序列、具有与SEQIDNO:7至少70%—致性的核苷酸序列、具有 与SEQ ID NO:9至少70%—致性的核普酸序列以及具有与SEQ ID NO:ll至少70%—致性的核苷酸序列；或iii) 核酸分子，所述核酸分子由下列所组成具有与SEQ ID NO:2至少70%—致性的核苷酸序列、具有与SEQ ID NO:4至少70% 一致性的核苷酸序列、具有与SEQIDNO:7至少70%—致性的核苷酸 序列、具有与SEQIDNO:9至少70%—致性的核苷酸序列以及具有与 SEQ IDNO:ll至少70%—致性的核苷酸序列。
5. 如权利要求4所述的表达载体，其中所述核酸分子由SEQ ID NOs:2， 4， 7, 9和12的每一种的核苷酸序列组成。
6. 如权利要求1所述的表达栽体，其中所述核酸分子选自i) 包括SEQ ID NOs:2， 4, 7, 9或12的至少一种的核香酸序列 的核酸分子；或ii) 包括下列的至少一种的核苷酸序列的核酸分子具有与 SEQ ID NO:2至少70%—致性的核香酸序列、具有与SEQ ID NO:4至 少70%—致性的核苷酸序列、具有与SEQIDNO:7至少70%—致性的 核苷酸序列、具有与SEQIDNO:9至少70%—致性的核苷酸序列以及 具有与SEQIDNO:ll至少70%—致性的核苷酸序列。
7. 如权利要求6所述的表达栽体，其中所述核酸分子是由SEQID NO:2的核酸序列代表的核酸分子，或与SEQ ID NO:2杂交并编码具 有心肌黄酶活性的多肽的变体核酸分子。
8. 如权利要求6所述的表达载体，其中所述核酸分子是由SEQID NO:4的核酸序列代表的核酸分子，或与SEQ ID NO:4杂交并编码具 有NADH脱氢酶I活性的多肽的变体核酸分子。
9. 如权利要求6所述的表达载体，其中所述核酸分子是由SEQID NO:7的核酸序列代表的核酸分子，或与SEQ ID NO:7杂交并编码具 有NAD还原氬化酶7活性的多肽的变体核酸分子。
10. 如权利要求6所述的表达载体，其中所述核酸分子是由SEQ ID NO:9的核酸序列代表的核酸分子，或与SEQ ID NO:9杂交并编码 具有NAD还原氬化酶S活性的多肽的变体核酸分子。
11. 如权利要求6所述的表达载体，其中所述核酸分子是由SEQ ID NO:12的核酸序列代表的核酸分子，或与SEQ ID NO:12杂交并编 码具有NAD还原氢化酶/5活性的多肽的变体核酸分子。
12. 如权利要求1所述的表达载体，其中所述核酸分子由编码SEQ IDNOs:3， 5, 8, 10和13的每一种多肽的核苷酸序列组成。
13. 如权利要求7至12中任一项所述的表达栽体，其中所述变体 核酸分子在严紧杂交条件下杂交。
14. 如权利要求1至13中任一项所述的表达栽体，其中所述转录件.
15.如权利要求1至13中任一项所述的表达载体，其中所述启动厶工S亦乂士 J:* 厶工杏l刑
16. 如权利要求1至13中任一项所述的表达载体，其中所述转录 启动子元件赋予所述核酸分子或变体核酸分子组成型表达。
17. 如权利要求1至16中任一项所述的表达载体，其中所述表达 载体包括可选择标志物。
18. 如权利要求1至17中任一项所述的表达载体，其中所述表达 载体包括翻译控制元件。
19.如权利要求1至18中任一项所述的表达载体，其中所述翻译 控制元件是核糖体结合序列。
20. 如任一前述权利要求所述的表达载体，其中所述核酸分子包 括所述核苷酸序列的特定改变，以致优化密码子使用。
21. 使用如权利要求1至20中任一项所述的表达载体转化的宿主 细胞。
22. 如权利要求21所述的宿主细胞，其中所述细胞是细菌细胞。
23. 如权利要求22所述的宿主细胞，其中所述细菌细胞是革兰氏 阴性细菌细胞。
24. 如权利要求23所述的宿主细胞，其中所述细胞属于埃希氏菌属。
25. 如权利要求24所述的宿主细胞，其中所述细胞是大肠杆菌。
26. 如权利要求25所述的宿主细胞，其中所述细胞是大肠杆菌 BL21或大肠斥干菌BL21(DE3)pLys5。
27. 如权利要求22所述的宿主细胞，其中所述细菌细胞是革兰氏 阳性细菌细月包。
28. 如权利要求21至27中任一项所述的宿主细胞，其中所述细 胞包括载体，所述载体包括tRNA基因。
29. 如权利要求28所述的宿主细胞，其中所述tRNA基因编码 argU、 ilex、 leuW、 proL或glyT。
30. 产生氢气的方法，包括i)将包括至少一种蓝细菌氢化酶基因的核酸分子并入用于在 宿主细胞中表达的表达载体；并且 iii)使用所述表达载体转染宿主细胞； 其中所得转染的宿主细胞产生氢气。
31. 如权利要求30所述的方法，其中所述至少一种氢化酶基因是 双向氢化酶基因。
32. 如权利要求30或31所述的方法，其中所述蓝细菌属于集胞条属o
33. 如权利要求32所述的方法，其中所述蓝细菌是集胞藻PCC 6803。
34. 如权利要求30至33中任一项所述的方法，其中所述核酸分 子选自i) 包括SEQIDN0:1的核苷酸序列的核酸分子；ii) 具有与SEQIDN0:1的核香酸序列至少70%—致性的核酸分子；iii) 与SEQIDNO:l的核酸序列杂交的核酸分子；或者iv) 包括以上i)、ii)和iii)的序列遗传密码的简并核苷酸序列的 核酸分子。
35. 如权利要求34所述的方法，其中所述核酸分子由SEQ ID NO:l的核苷酸序列组成。
36. 如权利要求30至35中任一项所述的方法，其中所述核酸分 子选自i)包括SEQ ID NOs:2， 4， 7, 9和12的每一种的核苷酸序列的 核酸分子；ii) 核酸分子，所述核酸分子包括具有与SEQ ID NO:2至少 70%—致性的核苷酸序列、具有与SEQ ID NO:4至少70%—致性的核 香酸序列、具有与SEQIDNO:7至少70%—致性的核苷酸序列、具有 与SEQ ID NO:9至少70%—致性的核苷酸序列以及具有与SEQ ID NO:ll至少70%—致性的核苷酸序列；或iii) 核酸分子，所述核酸分子由下列所组成具有与SEQ ID NO:2至少70%—致性的核苦酸序列、具有与SEQ ID NO:4至少70% 一致性的核苷酸序列、具有与SEQIDNO:7至少70%—致性的核苷酸 序列、具有与SEQIDNO:9至少70%—致性的核苷酸序列以及具有与 SEQ ID NO:ll至少70%—致性的核苷酸序列。
37. 如权利要求36所述的方法，其中所述核酸分子由SEQ ID NOs:2， 4, 7， 9和12的每一种的核苷酸序列组成。
38. 如权利要求30至33中任一项所述的方法，其中所述核酸分 子选自-.i) 包括SEQ ID NOs:2， 4, 7， 9或12的至少一种的核苷酸序列 的核酸分子；或ii) 包括下列的至少一种的核苷酸序列的核酸分子具有与 SEQ ID NO:2至少70%—致性的核苷酸序列、具有与SEQ ID NO:4至少70%—致性的核苷酸序列、具有与SEQ ID NO:7至 少70%—致性的核苦酸序列、具有与SEQ ID NO:9至少70% 一致性的核苷酸序列以及具有与SEQ ID NO:ll至少70%—致 性的核苦酸序列。
39. 如权利要求38所述的方法，其中所述核酸分子是由SEQ ID NO:2的核酸序列代表的核酸分子，或与SEQ ID NO:2杂交并编码具 有心肌黄酶活性的多肽的变体核酸分子。
40. 如权利要求38所述的方法，其中所述核酸分子是由SEQ ID NO:4的核酸序列代表的核酸分子，或与SEQ ID NO:4杂交并编码具 有NADH脱氬酶I活性的多肽的变体核酸分子。
41. 如权利要求38所述的方法，其中所述核酸分子是由SEQ ID NO:7的核酸序列代表的核酸分子，或与SEQ ID NO:7杂交并编码具 有NAD还原氢化酶7活性的多肽的变体核酸分子。
42. 如权利要求38所述的方法，其中所述核酸分子是由SEQ ID NO:9的核酸序列代表的核酸分子，或与SEQ ID NO:9杂交并编码具 有NAD还原氢化酶S活性的多肽的变体核酸分子。
43. 如权利要求38所述的方法，其中所述核酸分子是由SEQ ID NO:12的核酸序列代表的核酸分子，或与SEQ ID NO:12杂交并编码 具有NAD还原氢化酶jS活性的多肽的变体核酸分子。
44. 如权利要求38所述的方法，其中所述核酸分子是由编码SEQ IDNOs:3， 5,8， 10和13的每一种多肽的核苷酸序列组成。
45. 反应容器，包含如权利要求21至29中任一项所述的宿主细 胞和足以支持所述细胞生长的培养基。
46. 如权利要求45所述的反应容器，其中所述容器是生物反应器。
47. 如权利要求45或权利要求46所述的反应容器，其中所述容 器是发酵罐。
48. 产生氢气的方法，包括i)提供包括如权利要求21至29中任一项所述的宿主细胞的谷奋，ii) 提供促进通过包含于所述容器的细胞培养物产生氢气的细 胞培养条件；并且可选择地iii) 从所述容器收集氬气。
49. 用于由细胞产生氢气并收集细胞所产生氢气的装置，所述装 置包括i) 含有如权利要求21至29中任一项所述的宿主细胞的反应 容器；和ii) 与所述细胞培养容器在流体上相关的第二容器，其中改造 所述第二容器以用于收集和/或储存由包含于(i)中的所述细胞 培养容器的细胞产生的氢气。
50. 蓝细菌氢化酶在重组表达系统中用于产生氢气的用途。
51. 如权利要求50的用途，其中所述蓝细菌氬化酶由核酸分子编 码，所述核酸分子选自i) 包括SEQIDN0:1的核香酸序列的核酸分子；ii) 具有与SEQIDNO:l的核苷酸序列至少70%—致性且编码 具有氢化酶活性的多肽的核酸分子；iii) 与SEQ ID NO:l的核酸序列杂交且编码具有氢化酶活性 的多肽的核酸分子；或者iv) 包括以上i)、ii)和iii)的序列遗传密码的简并核苷酸序列的 核酸分子。
52. 由SEQIDNO:l的核酸序列代表的核酸分子。
全文摘要
本申请公开了使用重组表达系统产生氢气的表达载体、宿主细胞和方法。所述表达载体包括SEQ ID NO1的双向氢化酶蛋白复合体编码序列。
文档编号C12N9/02GK101370931SQ200680052679
公开日2009年2月18日 申请日期2006年12月21日 优先权日2005年12月22日
发明者亚当·马丁·博加, 希利亚·拉蒂安宁亚斯, 菲利普·克雷格·怀特 申请人:谢菲尔德大学