专利名称：使用Shh使星形胶质细胞去分化成为神经干细胞的制作方法
技术领域：
神经干细胞(NSCs)是神经系统的祖细胞的亚型，它具有分化为星形胶质细胞、少突 胶质细胞和神经元的能力。从中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)开始，神经干 细胞形成多细胞神经球，它们在各自的背景条件下分化为胶质系和神经系细胞(Sally Temple等人，2001)。这些神经干细胞被用于治疗不治之症，并且被研究其在细胞治疗 方法中的潜在用途。由于神经千细胞是几乎不会产生伦理问题的成体干细胞，所以对其 进行了广泛研究。近来进行的关于去分化的热点研究强化了成体干细胞的重要性。成体 干细胞比胚胎干细胞更容易获得，但是在其实际应用上仍有许多困难。此外，使用他人 的成体干细胞时，免疫排斥反应也是一个问题。因此，使用病人自身的细胞诱导去分化 可以解决当前的问题。为了这个目的，必须诱导已经分化了的细胞去分化。现在，使用 例如细胞融合和核移植的方法来诱导去分化正在进行广泛的研究。在使用不同方法的另 一个研究组中，Alexis J.报道了从皮肤中分离的细胞在神经干细胞培养条件下培养时具 有神经干细胞的特性(Lancet 2004)。此外，Toru K.成功地使少突胶质细胞前体去分化 成为神经干细胞(Genes & Development 2004)。这个研究组自2000年起已经发表了关于 此问题的文章，并且在2004年的一篇文章中报道了各阶段的基因表达与染色质重塑和 组蛋白修饰有关。
背景技术：
在本发明中，提出了 一种解决前述介绍方法的问题的途径，并且建立了 一种新的适 合的使用方法。在本发明中，使用Sonic Hedgehog (Shh), Shh是在发育中起重要作用 的hedgehog基因家族中一员，因为它起着对神经干细胞有较高影响的形态发生素的作 用。Shh是信号通路的增量调节因子，这条通路从Glil开始，Bmi-1和N-myc作为随 后的介质。在发育中，Shh在卯泡上皮的末端表达。此外，已知Shh促进了神经祖细胞 的增殖(Pleasantin Mill等人，2005)。
根据本发明，本发明者在此背景下进行了深入和彻底的研究，获得的发现是用Shh 处理会诱导已分化的星形胶质细胞去分化成为能够自我更新和分化为星形胶质细胞、神
经元和少突胶质细胞的神经干细胞样的细胞。
发明内容
本发明的目的是提供一种诱导星形胶质细胞去分化成为神经干细胞的组合物，该组 合物包含Shh蛋白质或含有编码Shh蛋白质的核苷酸序列的核酸材料。
本发明的另 一个目的是提供了 一种诱导星形胶质细胞去分化成为神经干细胞的方 法，该方法包括用Shh蛋白质或含有编码Shh蛋白质的核苷酸序列的核酸材料处理星 形胶质细胞。
本发明的另 一个目的是提供使用此方法制备的神经干细胞。
本发明的另一个目的是提供一种将去分化的神经千细胞分化成为星形胶质细胞、少 突胶质细胞和神经元的方法。
附图简述
本发明的上述和其它目的、特征和其它优点将从以下的详述并参考附图得到更清楚 地理解，其中
图1显示了通过用Shh蛋白质处理将星形胶质细胞去分化成为神经干细胞，其中将 Shh加入到鼠星形胶质细胞(A、 B)和神经干细胞(C)后形成了神经球；
图2显示了当通过免疫细胞化学分析时，神经干细胞标记物的表达；和 图3显示了神经干细胞(A-C)和神经干细胞样的细胞(D-G)分别体外去分化成为星 形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元。
实现本发明的最佳方式
本发明一方面涉及能够诱导星形胶质细胞去分化成为神经干细胞的组合物，该组合 物包含Shh蛋白质或含有编码Shh蛋白质的核苷酸序列的核酸材料。
如本文所用的术语"神经干细胞样的细胞"表示从体细胞去分化的和能够分化为星 形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元的多能干细胞。在本发明中，神经干细胞样的细胞 还描述为神经干细胞。
本发明最近公开了当星形胶质细胞中Shh过表达时，虽然已经分化，它们可以去分
化成为多能神经干细胞样的细胞。
在本发明中，Shh以蛋白质形式提供。
只要是来自于哺乳动物，例如人、马、绵羊、猪、山羊、骆驼、羚羊和狗，任何
Shh均可用于本发明的组合物中。此外，本发明的用于去分化成为神经细胞的Shh蛋白 质可以是野生型的或其变异体。
术语"Shh蛋白质变异体，，是指自然产生或人为制造的Shh蛋白质，它们由于氨基酸 的缺失、插入、非保守置换或保守置换或由于其组合在MS吏序列上与野生型不同。变 异体是具有与天然蛋白质相同生物活性的功能同等物，尽管其物理和/或化学性质有改 变。优选地，变异体增强了对物理和化学环境中的结构稳定性或生理活性。
本发明的組合物优选是Shh蛋白质。例如，用Shh蛋白质处理用于诱导星形胶质 细胞去分化成为神经干细胞的培养基。
Shh蛋白质使用的量足够诱导去分化。Shh蛋白质的有效量取决于本领域众所周知 的因素，包括培养基和培养方法。在本发明的一个应用实例中，Shh蛋白质用量为 500ng/ml。
在本发明的一个优选实施方案中，Shh是包含编码Shh蛋白质的核苷酸序列的核酸 材料的形式。
编码Shh蛋白质的核苷酸序列是野生型的或其变异体，其中自然产生的或人工合成 的变异体由于碱基的缺失、插入、非保守置换或保守置换或由于它们的组合在氨基酸序 列上与野生型不同。
编码Shh蛋白质的核苷酸序列既可以是包括DNA分子(基因组，cDNA)或RNA分 子的单链或双链。
在本发明的一个优选实施方案中，含有编码Shh蛋白质的核苷酸序列的核酸材料是 允许Shh蛋白质表达的载体。
如本文所用的术语"载体"是指含有DNA序列的DNA构建体，该DNA序列被可操 作地连接到能够影响所述DNA在适合的宿主细胞中表达的控制序列上。
如本文所用的术语"可操作地连接"是指核酸表达调控序列和编码靶蛋白质的第二 核酸序列间的功能性连接以能完成一般的功能。与重组载体的可操作地连接可使用本领 域众所周知的基因重组技术制备，并且位点特异性DNA的断裂和连接可使用本领域公
知的酶进行。
适合于本发明使用的载体包括信号序列或用于膜定向或分泌的《1导序列以及表达 调控元件，例如启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、多聚腺普酸化信号和增强 子，并且可根据它们的目的构建成多种形式。载体的启动子可以是组成型或是诱导型的。 此外，表达载体包括可选择标记物，所述标记物允许选择含有该载体的宿主细胞，并且 可复制的表达载体包括一个复制起始点。此载体可以是自我复制的，或者可以被整合至 宿主细胞的DNA上。
在本发明中有用的载体可以是质粒栽体、粘粒载体或病毒载体，优选病毒栽体。病 毒载体的实例包括但是不限制于来源于逆转录病毒例如HIV(人免疫缺陷病毒)、MLV(鼠 白血病病毒)、ASLV(禽肉瘤/白血病病毒)、SNV(脾坏死病毒)、RSV(劳斯肉瘤病毒)、 MMTV(小鼠乳腺瘤病毒)等等、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱务病毒的载体。
含有编码Shh蛋白质的核苦酸序列的核酸材料可以以载体的形式作为棵露DNA被 引入细胞(Wolff等人,Science, 247: 1465-8， 1990; Wolff等人，J. Cell Sci. 103: 1249-59， 1992),或在脂质体或阳离子聚合物的帮助下被引入细胞。为了在基因转染中使用，脂 质体是例如DOTMA和DOTAP的阳离子磷脂制成的磷脂膜。当与负电荷核苷酸以一定 比例混合时，阳离子脂质体形成核酸-脂质体复合物。
在本发明的另 一个优选实施方案中，含有编码Shh蛋白质的核苷酸序列的核酸材料 可以是表达其中的Shh蛋白质的病毒。
如本文所用的术语"病毒"是指用携带编码Shh蛋白质的核苷酸序列的病毒载体转 化或转染包装细胞来制备的Shh表达病毒。
根据本发明的Shh表达病毒的制备中所使用的病毒实例包括但是不限于逆转录病 毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱渗病毒。
本发明的另一方面涉及星形胶质细胞去分化成为神经干细胞的方法，包含用Shh 蛋白质或含有编码Shh蛋白质的核苷酸序列的核酸材料处理。
更详细地，该方法包含以下步骤(i)在培养基中培养星形胶质细胞；(ii)用Shh蛋 白质或含有编码Shh蛋白质的核苷酸序列的核酸材料处理培养基；和(iii)诱导星形胶质 细胞去分化成为神经干细胞。
任何用于培养神经千细胞的常规培养基都可以被用作在步骤(i)中培养星形胶质细
胞的培养基。通常，培养基含有碳源、氮源和微量元素组分。此外，所述培养基可包括 抗生素，例如青霉素、链霉素和庆大霉素。培养基优选含有bFGF。
步骤(ii)中用于处理细胞的Shh蛋白质或含有编码Shh蛋白质的核苷酸序列的核酸 材料如上所述。
本发明的另 一方面涉及如前所述方法制备的神经干细胞。
已证实通过根据本发明的去分化制备的神经干细胞可表达同样水平的神经千细胞 特异性标记物Nestin、 CD133和Sox2，并且具有与一4殳神经干细胞相同的分化能力。 通过根据本发明的去分化制备的神经干细胞还显示了自我更新能力。
本发明的另 一方面还涉及一种根据前述方法去分化得到的神经干细胞分化成为星 形胶质细胞、少突胶质细胞和(或)神经元的方法。
当使用本发明的组合物和方法去分化的神经干细胞被置于各自适合的分化条件下 时，分化成的星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞可通过检测特异于各自细胞的标记 物的表达来监测。
可通过以下实施例获得对本发明的更好的理解，这些实施例只是用于解释说明而不 应被解释为限制本发明。
实施例1:实验方法
1. 鼠星形胶质细胞和鼠神经干细胞的培养
分离自E13.5胎脑的鼠星形胶质细胞在补充了 10%FBS(HyClone)、 1%青霉素/链霉 素和1°/丄-谷氨酰胺1。/。(Cambrex)的Dulbecco，s modified Eagle's培养基(DMEM(高糖， HyClone))中培养。在补充了 B27无血清(Gibco)、人重组碱性FGF和人重组EGF(R&D)、 含有胰岛素(Sigma)、转铁蛋白(Sigma)、竭(Sigma)、孕酮(Sigma和青霉素/链霉素(Cambrex) 的Dulbecco，s modified Eagle's培养基/F12(DMEM/F12, Gibco)中培养神经干细胞作为 对照。
2. 诱导去分化
去分化在与用于神经千细胞相同的培养条件下被诱导。细胞培养使用两种不同的方 法来进行。细胞以lxl()S个细胞/孔的密度接种于6孔板上并培养12小时，随后用浓度 为500ng/ml的Shh(sonic hedgehog, R&D)处理。在培养条件变为适合于神经干细胞前，
细胞在Shh存在下在培养星形胶质细胞的条件下培养2、 4和6天。或者，即使培养条 件改变仍继续用Shh处理。
3. 通过免疫细胞化学确定各自的标记物
用4。/。多聚曱醛(EMS)在4"C固定1小时后，神经球在20%蔗糖中振动培养过夜。 然后，神经球使用OCT化合物超低温冷藏于8孔小室载玻片(Nunc)且在染色前切成8 ~ 10pm厚度。用含有10。/。正常山羊血清(Jackson ImmunoResearch) + 0.1 %BSA (Sigma) + 0.3%TritonX-100 (Sigma)的PBS封闭后，切片用抗-nestin (Chemicon)、抗-CD133 (MACS) 和抗-Sox2 (Sigma)在4。C培养过夜，然后用抗-鼠-cy3 (Jackson ImmunoResearch)、抗-兔 ^1丁((分子探针)和抗-山羊《乂3 (Zymed)室温培养，最后用DAPI(Sigma)核染色。蔡司聚 焦透镜(Zeiss confocal lens) (Carl Zeiss)被用于染色后的检查。分化的细胞以上述相同 方式染色。在这方面，抗-GFAP(Dako)、抗-S100p (Zymed)、抗-(3-微管蛋白III(Covance)、 抗-Map2a (Sigma)、抗-TH (Sigma)、抗-04 (R&D)和抗-CNPase (Chemicon)用作抗体。
4. 体外分化
用PLO (聚L-鸟氨酸)(Sigma)和层粘连蛋白或纤维连接蛋白(Sigma)包被后，细胞在 下面给出的分化条件下培养。
为了分化成为星形月交质细胞，细胞培养在补充10%FBS(HyClone)的 DMEM(HyClone,高糖)中在人重组bFGF和EGF(R&D)或CNTF(重组大鼠睫状神经营 养因子)(Upstate)存在下进行5 ~ 7天。
通过在含有N2和B27无血清、补充人重组FGF的培养基中培养细胞4天，然后 在无FGF培养基中培养8天诱导其分化为神经元。或者，细胞在1 ~ 10pm RA(维甲酸， Sigma)作为分化诱导剂存在下培养7-14天。作为其它选择，细胞在1 - 10mMVPA(丙 戊酸，Sigma)和1 ~ 10pm RA(维甲酸，Sigma)的共同存在下培养7-14天以诱导分化为 神经元。
通过在补充了 B27无血清的N2培养基中在PDGF-AA(血小板衍生的生长因子-AA, R&D)、 T3(3，3,5-三碘-L-曱腺原氨酸，Sigma)、人重组碱性FGF和EGF(R&D)的存在下 培养20天诱导分化为少突胶质细胞。
当在前述分化条件下培养时，监测细胞的形态学并进行使用特异于各自分化标记物 的抗体的免疫细胞化学以检测分化是否正确进行。
实施例2:结果
已分化的鼠星形胶质细胞用Shh处理，所述Shh起促进神经祖细胞增殖作用。每 日添加数量为500ng/ml的Shh至培养基中以培养鼠星形胶质细胞后，该培养基被替换 为培养神经干细胞的培养基。随着培养的进行，观察到细胞的形态学类似于神经干细胞。 形成神经球后，不再添加Shh。神经球一旦形成就持续存在(图1)。
鼠星形胶质细胞的去分化以同样方式诱导。用Shh处理2、 4和6天后，培养条件 变为适合于神经干细胞，且监测细胞去分化。从用Shh处理后第6天起，当培养条件变 为适合于神经干细胞时，神经球开始更好的形成。因此细胞持续去分化。
为了发现这些细胞是否具有与神经千细胞相同的特征，使用各自的标记物进行免疫 细胞化学。在这方面，主要大量表达于神经干细胞中的标记物nestin、 CD133和Sox2 也在染色后在神经干细胞样的细胞中被观察到。此外，因此形成的神经球的冰冻切片确 定了 nestin、 CD133和Sox2的表达(图2)。
为了检测神经干细胞样的细胞是否能够像神经干细胞一样进行分化，以与上迷相同 的方式在数种条件下被诱导分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元。当使用针对 各自特异于它们分化标记物的抗体分析时，发现神经千细胞样的细胞像神经干细胞一样 分化为数种细胞。分化为星形胶质细胞的鉴别用GFAP和S100的表达来进行，分化为 神经元的鉴别用P-孩i管蛋白III(Tujl)和Map2a的表达来进行，和分化为少突胶质细胞 的鉴别用04和CNPOase的表达来进行。
总之,通过此研究获得的数据说明Shh在鼠星形胶质细胞去分化成为神经干细胞样 的细胞中起着重要作用，并且这些去分化的神经干细胞样的细胞可以分化回星形胶质细 胞、少突"交质细胞和神经元。
工业应用
如前描述，Shh在诱导星形胶质细胞去分化成为神经干细胞中是有用的，并且去分 化的神经干细胞可用于多种疾病的治疗。
现有技术的文献目录
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权利要求
1. 一种诱导星形胶质细胞去分化成为神经干细胞的组合物，包含Shh(sonichedgehog)蛋白质或含有编码Shh蛋白质的核苷酸序列的核酸材料。
2. 如权利要求l所述的组合物，其特征在于，所述的含有编码Shh蛋白质的核苷酸 序列的核酸材料是允许Shh蛋白质表达的载体。
3. 如权利要求l所述的组合物，其特征在于，所述的含有编码Shh蛋白质的核苷酸 序列的核酸材料是表达Shh蛋白质的病毒。
4. 如权利要求l所述的组合物，其特征在于，所述的去分化的神经干细胞具有分化 为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的能力。
5. —种通过用Shh蛋白质或含有编码Shh蛋白质的核苷酸序列的核酸材料处理星形 胶质细胞诱导星形月交质细胞去分化成为神经干细胞的方法。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的去分化的神经干细胞具有分化为 星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的能力。
7. 如权利要求5所述的方法，包含以下步骤(i) 在培养基中培养星形胶质细胞；(ii) 用所述的Shh蛋白质或所述的核酸材料处理所述的星形胶质细胞；和(iii) 诱导所述的星形胶质细胞分化为神经干细胞。
8. 如权利要求7所述的培养基，其中步骤(i)的培养基中含有bFGF。
9. 一种使用权利要求5所述的方法制备的神经干细胞。
10. —种使用权利要求5所述的方法制备的神经干细胞分化成为星形胶质细胞、神 经元和少突"交质细J包的方法。
全文摘要
本发明公开了使用Shh诱导星形胶质细胞去分化为神经干细胞的组合物和方法。该去分化的神经干细胞具有分化为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的能力。
文档编号C12N15/10GK101389759SQ200680053480
公开日2009年3月18日 申请日期2006年4月12日 优先权日2006年2月27日
发明者全恩暻, 刘承权, 刘承骏, 孟萨克, 尹炳善, 文哉喜, 朴圭万, 郭成植, 金淇东, 金甫那 申请人:银怎株式会社