一种具有生物活性的可生物降解水凝胶及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种水凝胶材料，特别涉及一种具有生物活性的可生物降解水凝胶及其制备方法。
【背景技术】
[0002]近年来神经损伤的发病率逐年上升，但目前临床上对周围神经损伤的修复仍不理想，对粗大、长段神经缺损和多发性神经损伤更是无计可施。人们一直都在探索并寻找能够有效取代自体移植神经的桥接物。
[0003]水凝胶因其独特的结构与特殊的性能使得其作为理想的支架材料越来越受到人们的重视，用于神经组织工程的水凝胶，按照制备水凝胶的高聚物的种类不同，分为天然高分子水凝胶(如透明质酸)，合成高分子水凝胶(如羟乙基甲基丙烯酸)，以及多肽自组装水凝胶。
[0004]在神经组织工程支架材料中，天然高分子水凝胶虽然生物相容性好，本身带有一定的生物活性，可与细胞相互作用，但是其机械性能往往差强人意，且容易变异。而合成高分子水凝胶一般化学性质稳定，并且可以通过改变某些条件来调节和控制水凝胶的机械性能，以满足使用要求，其最大缺点就是缺乏生物活性，不利于神经细胞选择性吸附和激活一些特异基因，因此需要将合成高分子水凝胶进行生物活性修饰，基于神经细胞外基质材料的仿生设计，利用材料的多组分复合技术，将一些具有生物活性的分子引入到合成高分子水凝胶的表面，以期改变合成高分子水凝胶对神经细胞的选择性吸附以及促神经轴突生长。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的上述不足，提供一种具有生物活性的可生物降解水凝胶及其制备方法，其表面修饰有生物活性基团，具有生物相容性好、机械强度高的特点。
[0006]为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是:
[0007]提供一种具有生物活性的可生物降解水凝胶，它由以下方法制备得到:
[0008]I)合成超低分子量聚乳酸:将丙交酯放入硅烷化的玻璃聚合管中，再加入辛酸亚锡和一缩二乙二醇，其中丙交酯与辛酸亚锡、一缩二乙二醇的摩尔比为12?28:0.02:1，用旋片真空泵抽真空后封管，置于140°C油浴锅中反应24小时，制得超低分子量聚乳酸(PLA)；
[0009]2)制备聚(丙交酯-Co-环氧乙烷-Co-富马酸):将聚乙二醇(PEG)和步骤I)所得超低分子量聚乳酸加入三口烧瓶中，其中聚乙二醇与超低分子量聚乳酸质量比为9:1，加入二氯甲烷为溶剂，然后置于_5°C的低温恒温反应浴中，搅拌的同时对体系充氮，待搅拌均匀形成溶液后依次滴加三乙胺的二氯甲烷溶液和富马酰氯的二氯甲烷溶液，溶液中聚乙二醇与所加入的三乙胺、富马酰氯摩尔比为2:5:3，滴加完毕后于-5°C继续反应6小时，然后将三口烧瓶置于室温下反应12小时，反应完成后，旋转蒸发移除溶剂，将剩余物溶解在无水乙酸乙酯中，过滤除去沉淀，将滤液旋转蒸发分离出乙酸乙酯，剩余物质采用乙醚沉淀，沉淀物后处理得到聚(丙交酯-Co-环氧乙烷-Co-富马酸)(PLEOF);
[0010]3)制备代巯基的Nogo-66:将2_巯基丙酸溶解于四氢呋喃中得到0.01?lg/mL的2-巯基丙酸溶液，加入二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，使2-巯基丙酸与二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺摩尔比为1:2.5:2.5，活化I?2小时后加入Nogo-66多肽和N，N- 二异丙基乙胺，其中2-巯基丙酸与Nogo-66多肽、N，N- 二异丙基乙胺的摩尔比为1:1.5:1.5，室温下反应2?6h后加入正己烷，沉淀物分离、干燥得到代巯基的Nogo-66 ;
[0011]4)制备具有生物活性的可生物降解水凝胶:将步骤2)所得聚(丙交酯-Co-环氧乙烷-Co-富马酸)、多肽交联剂(Ac)2-KYIGSRG、末端含双键的GIKAVAK-Ac多肽以及丙烯酸丙炔酯、甲叉双丙烯酰胺(BISAM)、4，4’ -偶氮双(4-氰基缬草酸)(ACP)和DMF置于反应容器中，各组分质量比为聚(丙交酯-Co-环氧乙烷-Co-富马酸):多肽交联剂(Ac)2-KYIGSRG:GIKAVAK-Ac多肽:丙烯酸丙炔酯:甲叉双丙烯酰胺:4，4’-偶氮双(4-氰基缬草酸)=945:120:0.23:0.0144 ?0.0433:90 ?240:9.25，其中聚(丙交酯-co_ 环氧乙烷-Co-富马酸)浓度为0.315g/mL，将反应装置抽真空后密封反应器，于80°C反应10小时，反应完成后加入步骤3)所得代巯基的Nogo-66，其中代巯基的Nogo-66与所述丙烯酸丙炔酯摩尔比为1:1，室温反应6?24小时得到凝胶，将所得凝胶浸泡在蒸馏水中，每隔2?12小时换一次水，2?5天后，将凝胶放在_20°C冰箱中冻冰处理12?24小时，然后真空冷冻干燥48小时，得到具有生物活性的可生物降解水凝胶。
[0012]按上述方案，步骤2)所述聚乙二醇数均分子量为4000。
[0013]按上述方案，步骤4)所述多肽交联剂(Ac)2-KYIGSRG的制备方法为:
[0014]a.将Fmoc-Gly-wang树脂浸泡于DMF(N, N-二甲基甲酰胺)中处理I小时，再用DMF充分洗涤，干燥后得到活化处理后的Fmoc-Gly-wang树脂；
[0015]b.将步骤a活化处理后的Fmoc-Gly-wang树脂与呢啶的DMF溶液混合，搅拌均匀后放入固相多肽合成仪中进行脱保护反应，反应完成后用DMF充分洗涤得到脱保护的Fmoc-Gly-wang 树脂；
[0016]c.将步骤b)所得脱保护的Fmoc-Gly-wang树脂与含Fmoc-氨基酸Fmoc-Arg(Pbf) -OH的缩合反应活化溶液混合，缩合反应活化溶液中溶剂为PyBOP (六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基)、HOBt (1-羟基苯并三唑)、DIEA (N，N- 二异丙基乙胺)的混合液，搅拌10分钟后移入固相多肽合成仪进行缩合反应，经茚三酮显色反应检测，Fmoc-氨基酸Fmoc-Arg (Pbf) -OH反应完全后，反应完成后产物用DMF洗涤；
[0017]d.将步骤c)所述洗涤后产物与含另一种Fmoc-氨基酸的缩合反应活化溶液混合，重复 c)操作，所述 Fmoc-氨基酸依次为 Fmoc-Gly-0H、Fmoc-1le-OH、Fmoc-Tyr (tBu) _0H、Fmoc-Tyr (tBu) _0H、Fmoc-Lys (Fmoc) -OH,最后与含丙稀酸的缩合反应活化溶液混合进行缩合反应，得到树脂产物，所述缩合反应活化溶液中溶剂为PyB0P、H0Bt、DIEA的混合液；
[0018]e.依次用DMF、二氯甲烷洗涤所得树脂产物，将树脂产物干燥后与切肽试剂混合，切肽试剂为三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(TIPS)和水的混合液，室温下搅拌反应2小时后抽滤，用三氟乙酸洗涤树脂，收集滤液后将滤液逐滴滴入乙醚中，离心收集沉淀，冷冻干燥，得到(Ac)2-KYIGSRG。
[0019]按上述方案，步骤4)所述末端含双键的GIKAVAK-Ac多肽的制备方法与多肽交联剂(Ac)2-KYIGSRG的制备方法相似，缩合反应过程中依次加入Fmoc-氨基酸Fmoc-1le-OH、Fmoc-Lys (Boc) -OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys (Boc) -OH,以及丙烯酸。
[0020]本发明还提供上述具有生物活性的可生物降解水凝胶的制备方法，其步骤如下:
[0021]I)合成超低分子量聚乳酸:将丙交酯放入硅烷化的玻璃聚合管中，再加入辛酸亚锡和一缩二乙二醇，其中丙交酯与辛酸亚锡、一缩二乙二醇的摩尔比为12?28:0.02:1，用旋片真空泵抽真空后封管，置于140°C油浴锅中反应24小时，制得超低分子量聚乳酸；
[0022]2)制备聚(丙交酯-Co-环氧乙烷-Co-富马酸):将聚乙二醇和步骤I)所得超低分子量聚乳酸加入三口烧瓶中，其中聚乙二醇与超低分子量聚乳酸质量比为9:1，加入二氯甲烷为溶剂，然后置于_5°C的低温恒温反应浴中，搅拌的同时对体系充氮，待搅拌均匀形成溶液后依次滴加三乙胺的二氯甲烷溶液和富马酰氯的二氯甲烷溶液，溶液中聚乙二醇与所加入的三乙胺、富马酰氯摩尔比为2:5:3，滴加完毕后于-5°C继续反应6小时，然后将三口烧瓶置于室温下反应1