抗大豆球蛋白的单克隆抗体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗大豆球蛋白的单克隆抗体及其应用。本发明所提供的抗大豆球蛋白的单克隆抗体是由杂交瘤细胞3F5分泌产生的；所述杂交瘤细胞3F5在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC?No.8704。实验证明，该杂交瘤细胞株所稳定分泌的大豆球蛋白单克隆抗体，亲和常数达8.2×1010L/mol。以该大豆球蛋白单克隆抗体为检测抗体建立竞争性酶联免疫方法检测大豆球蛋白，检测限为200ng/mL。本发明所提供的大豆球蛋白单克隆抗体及其检测方法和试剂盒具有检测限低，检测范围广，且高效、准确的优点，可广泛应用于大豆、大豆制品中大豆球蛋白的定性和定量检测。
【专利说明】抗大豆球蛋白的单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种抗大豆球蛋白的单克隆抗体及其应用。
【背景技术】
[0002]大豆中含有丰富的蛋白质，由于其必需氨基酸(如赖氨酸、苏氨酸和色氨酸)组成比例适宜，是畜禽优质的植物性蛋白源。但大豆中含有的大豆抗原蛋白所导致的动物过敏反应越来越受到人们的关注。在幼龄动物饲料中添加豆柏作为蛋白质来源会导致仔猪、犊牛等的腹泻、生长性能下降、肠黏膜细胞增生以及免疫功能失调等一系列不良反应，严重的甚至导致死亡。
[0003]大豆球蛋白是大豆中主要的致敏蛋白质，占大豆籽实总蛋白的40%以上，其分子量为320-360kDa，有5个亚基。大豆球蛋白作为大豆中含量最高的抗原蛋白，在幼龄动物致过敏反应中充当着重要角色。
[0004]因此，定量检测不同大豆制品中的大豆球蛋白的含量具有重要的理论意义及应用价值。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种抗大豆球蛋白的单克隆抗体及其应用。
[0006]本发明所提供的抗大豆球蛋白的单克隆抗体，是由杂交瘤细胞3F5分泌产生的；所述杂交瘤细胞3F5在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为 CGMCC N0.8704。
[0007]所述的单克隆抗体可用于检测或辅助检测大豆球蛋白。
[0008]所述杂交瘤细胞3F5CGMCC N0.8704或所述单克隆抗体在制备检测或辅助检测大豆球蛋白的试剂或试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。
[0009]本发明的另一个目的是提供一种检测或辅助检测大豆球蛋白的试剂盒。
[0010]本发明所提供的试剂盒中含有独立包装的所述抗大豆球蛋白的单克隆抗体。
[0011]所述试剂盒中还含有独立包装的如下I) -7)试剂中的至少一种:
[0012]I)包被缓冲液:溶剂为水，溶质为Na2HPO4.12H20和NaH2PO4.2H20 ；所述Na2HPO4.12H20和所述NaH2PO4.2Η20在所述包被缓冲液中的终浓度分别为5.8g/L和0.59g/L，pH 值为 7.4 ；
[0013]2)封闭液:溶剂为水，溶质为牛血清白蛋白、小牛血清、吐温-20和蔗糖；所述牛血清白蛋白、所述小牛血清、所述吐温-20和所述蔗糖在所述封闭液中的终浓度分别为IOg/L、100ml/L、0.5ml/L 和 100g/L ；
[0014]3)洗涤液:溶剂为PBS缓冲液，溶质为吐温-20，所述吐温-20在所述洗涤液中的终浓度为50ml/L ；
[0015]所述PBS缓冲液的溶剂为水，溶质为NaCl、KCUKH2PO4和Na2HPO4 ;所述溶质NaCl、KCl、KH2PO4和Na2HPO4在所述PBS缓冲液中的浓度分别为8g/L、0.2g/L、0.2g/L和0.46g/L，pH 值为 7.4 ；
[0016]4)抗体稀释液:溶剂为所述PBS缓冲液，溶质为吐温-20和明胶；所述吐温_20和所述明胶在所述抗体稀释液中的终浓度分别为0.lml/L和lg/L ；
[0017]5 )终止液:2M的硫酸水溶液；
[0018]6)底物液A和底物液B;
[0019]所述底物液A:溶剂为水，溶质为过氧化氢脲、Na2HPO4.12H20、一水合柠檬酸和吐温-20 ;所述过氧化氢脲、所述Na2HPO4.12H20、所述一水合柠檬酸和所述吐温-20在所述底物液A中的终浓度分别为lg/L、35.8g/L、10.3g/L和0.lml/L ；
[0020]所述底物液B:溶剂为水，溶质为四甲基联苯胺、一水合柠檬酸和硫代硫酸钠；所述四甲基联苯胺、所述一水合柠檬酸和所述硫代硫酸钠在所述底物液B中的终浓度分别为
0.4g/L、2g/L 和 0.lg/L；
[0021]7)30X样品提取液:溶剂为水，溶质为Tris、HCl和β-巯基乙醇；所述TrisJf述HCl和所述β -巯基乙醇在所述30 X样品提取液中的终浓度分别为181.7g/L、73ml/L、21ml/L (所述HCl的浓度为37.5%质量分数)。
[0022]本发明的还一个目的是提供一种检测或辅助检测大豆球蛋白的方法。
[0023]本发明所提供的检测或辅助检测大豆球蛋白的方法，包括使用所述试剂盒对待测样品进行检测的步骤。
[0024]所述试剂盒在定性或定量检测大豆球蛋白中的应用也属于本发明的保护范围。
[0025]本发明还保护如下:将所述抗大豆球蛋白的单克隆抗体和固相载体相偶联得到的免疫亲和吸附剂；或以所述免疫亲和吸附剂为填料的免疫亲和色谱柱；或含有所述免疫亲和吸附剂或所述免疫亲和色谱柱的试剂盒。
[0026]所述免疫亲和吸附剂、所述免疫亲和色谱柱或所述试剂盒在分离纯化大豆球蛋白中的应用也属于本发明的保护范围。
[0027]实验证明，以大豆球蛋白为免疫原免疫小鼠，取脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合获得杂交瘤细胞3F5CGMCC N0.8704，该杂交瘤细胞株所稳定分泌的大豆球蛋白单克隆抗体，亲和常数达8.2X IOltlLAi0I。以该大豆球蛋白单克隆抗体为检测抗体建立竞争性酶联免疫方法检测大豆球蛋白，检测限为200ng/ml。本发明所提供的大豆球蛋白单克隆抗体及其检测方法和试剂盒具有检测限低，检测范围广，且高效、准确的优点，可广泛应用于大豆、大豆制品中大豆球蛋白的定性和定量检测。
[0028]保藏说明
[0029]参椐的生物材料(株):3F5
[0030]科学描述:杂交瘤细胞
[0031]保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0032]保藏机构简称:CGMCC
[0033]地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号
[0034]保藏日期:2013年12月31日
[0035]保藏中心登记入册编号:CGMCC N0.8704
【专利附图】
【附图说明】[0036]图1为竞争性ELISA试剂盒检测大豆球蛋白的标准曲线。其中，横坐标为各标准品溶液中大豆球蛋白浓度(μ g/mL)的Lg值，纵坐标为百分吸光度值(％)。
【具体实施方式】
[0037]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0038]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0039]下述实施例中所用的大豆球蛋白购自SIGMA公司，产品目录编号为G3171 ;雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；SP2/0细胞购自上海佳和生物科技有限公司。
[0040]下述实施例中蛋白质浓度测定使用的试剂盒为BCA蛋白定量试剂盒,购自pierce公司，产品目录编号为23227。
[0041]下述实施例中所涉及的试剂:四甲基联苯胺(TMB)、明胶、DMEM培养基(Sigma-Aldrich);青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺(L-G)、二甲基亚砜(DMSO, Amresco, USPgrade，上海生工分装);HEPES、Tris (Angus,北京宏宝达生物技术有限公司分装);HRP标记羊抗鼠IgG和HRP-streptoavidin (Jackson,中山金桥公司分装);福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、HAT、HT (GibcoBRL);胎牛血清(FBS) (Hyclone, USA) ;Mabs类及亚型检测试剂盒(ImmunoPure Monoclonal Antibody Isotyping Kit I, Pierce) ；HiTrapTM Protein A HP(Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden);其它常规试剂(国产分析纯)。
[0042]下述实施例中所用到的仪器:SW-2J-1F超净工作台，5410型CO2恒温培养箱(Napco),三用电热恒温水浴箱，倒置显微镜(Nikon)，台式高速冷冻离心机，连续波长酶标仪，Ultrospec3000型UV/Visible分光光度计，pH酸度计。
[0043]下述实施例中所用的溶液:
[0044]包被缓冲液:溶剂为水，溶质为Na2HPO4.12H20和NaH2PO4.2H20 ；所述Na2HPO4.12H20和所述NaH2PO4.2Η20在所述包被缓冲液中的终浓度分别为5.8g/L和0.59g/L，pH 值为 7.4 ；
[0045]封闭液:溶剂为水,溶质为牛血清白蛋白、小牛血清、吐温-20和蔗糖；所述牛血清白蛋白、所述小牛血清、所述吐温-20和所述蔗糖在所述封闭液中的终浓度分别为10g/L、100ml/L、0.5ml/L和 100g/L ；
[0046]PBS缓冲液:溶剂为水，溶质为NaCl、KCl、KH2PO4和Na2HPO4 ;所述溶质NaCl、KCl、KH2PO4和Na2HPO4在所述PBS缓冲液中的浓度分别为8g/L、0.2g/L、0.2g/L和0.46g/L，pH值为7.4 ;
[0047]洗涤液:溶剂为所述PBS缓冲液，溶质为吐温-20，所述吐温-20在所述洗涤液中的终浓度为50ml/L ；
[0048]抗体稀释液:溶剂为所述PBS缓冲液，溶质为吐温-20和明胶；所述吐温-20和所述明胶在所述抗体稀释液中的终浓度分别为0.lml/L和lg/L ；
[0049]终止液:2M的硫酸水溶液；
[0050] 底物液A:溶剂为水，溶质为过氧化氢脲、Na2HPO4* 12H20、一水合柠檬酸和吐温-20 ;所述过氧化氢脲、所述Na2HPO4.12H20、所述一水合柠檬酸和所述吐温-20在所述底物液A中的终浓度分别为lg/L、35.8g/L、10.3g/L和0.lml/L ；[0051]底物液B:溶剂为水，溶质为四甲基联苯胺、一水合柠檬酸和硫代硫酸钠；所述四甲基联苯胺、所述一水合柠檬酸和所述硫代硫酸钠在所述底物液B中的终浓度分别为
0.4g/L、2g/L 和 0.lg/L；
[0052]30X样品提取液:溶剂为水，溶质为Tris、HCl和β -巯基乙醇；所述Tris、所述HCl和所述β-巯基乙醇在所述30X样品提取液中的终浓度分别为181.7g/L、73ml/L、2lml/L (所述HCl的浓度为37.5%质量分数)。
[0053]不完全DMEM 培养基:DMEM (IL 包装)粉剂 I 袋，超纯水 1000ml，NaHC033.7g, lmol/L盐酸调节pH值到7.0~7.2，过滤除菌，分装4°C保存。
[0054]完全DMEM培养基:不完全DMEM培养基88ml，加小牛血清12ml，无菌条件下配制。
[0055]HT培养基:完全DMEM培养基99ml，加100XHT贮存液1ml，无菌条件下配制。
[0056]HAT培养基:完全DMEM培养基99ml，加100 X HAT贮存液1ml，无菌条件下配制。
[0057]100XHT 贮存液:购自 sigma，货号:H0137。
[0058]100XHAT 贮存液:购自 sigma，货号:H0262。
[0059]50%PEG溶液:称取PEG20002g，放入青霉素小瓶中，塞紧橡皮塞，塞上插一 9号针头(排气用)，8磅高压灭菌15min或水浴30min，使PEG融化并达到灭菌目的，待冷却至50~600C时(在此温度以上PEG仍为均匀的液体状态)，加入已在37°C预热的不完全培养液2ml，充分混匀，调pH，盖紧瓶塞，4°C保存，用前可置37°C加温助溶。
[0060]8-氮杂鸟嘌呤贮存液(100X):称取200mg8-氮杂鸟嘌呤(8-azayuanine, MW152.1),加入4N NaOHlml,待其溶解后,加三蒸水或去离子水99ml,过滤除菌，分装小瓶，_20°C冻存，使用时按1%浓度加入到培养液中(即终浓度为20μ g/ml)。[0061 ] 细胞冻存液:含10% (体积分数)DMSO的完全DMEM培养液。
[0062]实施例1、杂交瘤细胞株的获得及抗大豆球蛋白单克隆抗体的制备
[0063]一、杂交瘤细胞株的获得
[0064]1、动物免疫
[0065]实验动物:雌性BALB/c小鼠(体重约18~22g)，3只。
[0066]将大豆球蛋白(即免疫原)溶于0.5ml生理盐水中，加入等体积佐剂制成乳化剂，免疫雌性BALB/c小鼠。第三次免疫后7~IOd测定血清效价。免疫程序见表1。
[0067]表1动物免疫程序
[0068]
【权利要求】
1.杂交瘤细胞3F5，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为 CGMCC N0.8704。
2.抗大豆球蛋白的单克隆抗体，其特征在于:所述单克隆抗体是由权利要求1所述的杂交瘤细胞3F5C GMCC N0.8704分泌产生的。
3.权利要求2所述的单克隆抗体在检测或辅助检测大豆球蛋白中的应用。
4.权利要求1所述的杂交瘤细胞3F5CGMCCNo8704或权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测或辅助检测大豆球蛋白的试剂或试剂盒中的应用。
5.一种检测或辅助检测大豆球蛋白的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中含有独立包装的权利要求2所述的大豆球蛋白的单克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中还含有独立包装的如下I) -7)试剂中的至少一种: 1)包被缓冲液:溶剂为水，溶质为Na2HPO4.12H20和NaH2PO4.2Η20 ;所述Na2HPO4.12Η20和所述NaH2PO4.2Η20在所述包被缓冲液中的终浓度分别为5.8g/L和0.59g/L，pH值为7.4 ； 2)封闭液:溶剂为水,溶质为牛血清白蛋白、小牛血清、吐温-20和蔗糖；所述牛血清白蛋白、所述小牛血清、所述吐温-20和所述蔗糖在所述封闭液中的终浓度分别为10g/L、100ml/L、0.5ml/L 和 100g/L ； 3)洗涤液:溶剂为PBS缓冲液，溶质为吐温-20，所述吐温-20在所述洗涤液中的终浓度为 50ml/L ；
所述PBS缓冲液的溶剂为水，溶质为NaCl、KCUKH2PO4和Na2HPO4 ;所述溶质NaCl、KC1、KH2PO4和Na2HPO4在所述PBS缓冲液中的浓度为8g/L、0.2g/L、0.2g/L和0.46g/L，pH值为7.4； 4)抗体稀释液:溶剂为所述PBS缓冲液，溶质为吐温-20和明胶；所述吐温-20和所述明胶在所述抗体稀释液中的终浓度分别为0.lml/L和lg/L ； 5)终止液:2M的硫酸水溶液； 6)底物液A和底物液B; 所述底物液A:溶剂为水，溶质为过氧化氢脲、Na2HPO4.12H20、一水合柠檬酸和吐温-20 ;所述过氧化氢脲、所述Na2HPO4.12H20、所述一水合柠檬酸和所述吐温-20在所述底物液A中的终浓度分别为lg/L、35.8g/L、10.3g/L和0.lml/L ； 所述底物液B:溶剂为水，溶质为四甲基联苯胺、一水合柠檬酸和硫代硫酸钠；所述四甲基联苯胺、所述一水合柠檬酸和所述硫代硫酸钠在所述底物液B中的终浓度分别为0.4g/L、2g/L 和 0.lg/L ； 7)30X样品提取液:溶剂为水，溶质为Tris、HCl和β-巯基乙醇；所述Tris、所述HCl和所述β -巯基乙醇在所述30X样品提取液中的终浓度分别为181.7g/L、73ml/L、21ml/L。
7.—种检测或辅助检测大豆球蛋白的方法，包括使用权利要求5或6所述试剂盒对待测样品进行检测的步骤。
8.权利要求5或6所述试剂盒在定性或定量检测大豆球蛋白中的应用。
9.将权利要求2所述抗大豆球蛋白的单克隆抗体和固相载体相偶联得到的免疫亲和吸附剂；或 以所述免疫亲和吸附剂为填料的免疫亲和色谱柱；或含有所述免疫亲和吸附剂或所述免疫亲和色谱柱的试剂盒。
10.权利要求9所述的免疫亲和吸附剂、免疫亲和色谱柱或试剂盒在分离纯化大豆球蛋白中的 应用。
【文档编号】C07K1/22GK103937750SQ201410116476
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年3月26日 优先权日:2014年3月26日
【发明者】谯仕彦, 何涛, 宋青龙, 张海燕 申请人:北京龙科方舟生物工程技术有限公司