一种鼠疫耶尔森菌Pla?V抗原融合蛋白、制备方法及应用
【专利摘要】本发明公开了一种鼠疫耶尔森菌Pla?V抗原融合蛋白，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述鼠疫耶尔森菌Pla?V抗原融合蛋白的制备方法包括：根据鼠疫耶尔森菌Pla抗原蛋白核苷酸序列化学合成Pla cDNA，根据鼠疫耶尔森菌V抗原蛋白核苷酸序列化学合成V cDNA；连接Pla cDNA和V cDNA，并在Pla cDNA和V cDNA之间插入柔性连接肽，得到鼠疫耶尔森菌Pla?V cDNA融合基因；将鼠疫耶尔森菌Pla?V cDNA融合基因整合到宿主表达系统的染色体中表达，获取鼠疫耶尔森菌Pla?V抗原融合蛋白。本发明的鼠疫耶尔森菌Pla?V抗原融合蛋白提高了鼠疫耶尔森菌Pla抗原和V抗原对动物机体的联合免疫作用，也提高了融合蛋白对动物细胞的渗透能力，在动物对鼠疫的免疫和诊断方面有良好的应用前景。
【专利说明】
一种鼠疫耶尔森菌PIa-v抗原融合蛋白、制备方法及应用
技术领域
[0001 ]本发明属于生物免疫融合蛋白技术领域，具体涉及一种鼠疫耶尔森菌Pla-v抗原 融合蛋白、制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 鼠疫耶尔森菌Pla抗原蛋白，又称纤溶酶原激活剂蛋白，鼠疫菌素的一种，是鼠疫 菌素中对致病性贡献最大的一种抗原蛋白，它有两种生物活性:28°C时表现凝固酶活性，可 结合在完整的细菌细胞的外膜上;37°C时，表现纤溶活性，可以将宿主的血浆酶原裂解活化 为血浆酶，裂解宿主体内纤维蛋白、基膜和胞外基质。研究表明，一段939bp的DNA片段就可 表达具有活性的Pla残基，Pla蛋白长312氨基酸，分子量为34.7kDa。由于在兔和黄鼠体内发 现了 Pla蛋白抗体，说明Pla蛋白具有免疫原性，Pla抗原蛋白对鼠疫耶尔森菌有高度的特异 性，并且表达不受温度的影响，所以可用于直接鉴别鼠疫耶尔森菌，也可以作为一种良好的 鼠疫耶尔森菌免疫保护抗原。
[0003] 鼠疫耶尔森菌V抗原蛋白，又称低钙反应蛋白V抗原，具有多种生物活性，它可以与 其它抗原蛋白共同形成转运通道，允许鼠疫耶尔森菌效应蛋白的通过;可以调节其它效应 蛋白的表达;可以抑制宿主细胞因子的分泌，在抑制宿主免疫反应方面发挥着作用；可以抑 制粒细胞的化学趋向性，抑制宿主早期的炎症反应和炎症因子的合成，从而实现抵抗吞噬 的作用。V抗原表达基因长度为981bp，编码326个氨基酸，分子量为381Λ &(3ν抗原是一种保护 性抗原，V抗原的抗体可以阻止鼠疫耶尔森菌的效应蛋白进入宿主细胞内，从而有利于中性 粒细胞来阻止细菌的早期生长。
[0004] 目前常见的鼠疫免疫诊断方法研究，是将V抗原和F1抗原联合，或以二者融合蛋白 的形式共同使用，用于诊断或防治鼠疫耶尔森菌，但是由于V抗原与F1抗原在鼠疫耶尔森菌 中的表达都受到温度的影响，如果没有达到适合温度等表达条件，即使是鼠疫耶尔森菌，也 可能并未表达携带V抗原和F1抗原，这就可能使以V抗原与F1抗原为靶目标的联合诊断方法 失败，不能成功准确的鉴定所有的鼠疫耶尔森菌，或不能成功的免疫防治所有的鼠疫耶尔 森菌，致使鉴定结果或免疫防治效果不稳定，所以探寻新的鼠疫耶尔森菌特异性的抗原蛋 白，用于更加准确全面的诊断及防治，十分有必要。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白、制备方法及应用，解 决了现有的用于诊断或防治鼠疫耶尔森菌的方法，不能成功准确的鉴定所有的鼠疫耶尔森 菌，或不能成功的免疫防治所有的鼠疫耶尔森菌，致使鉴定结果或免疫防治效果不稳定的 问题。
[0006] 本发明提供了一种鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白，所述鼠疫耶尔森菌Pla-V抗 原融合蛋白的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0007] 本发明还提供了一种鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白的制备方法，包括以下步 骤：
[0008] 获取Pla cDNA，包括：以DNA序列数据库中公布的鼠疫耶尔森菌Pla抗原蛋白的核 苷酸序列为模板，按酵母氨基酸密码子偏嗜性，去除起始密码子、信号肽序列、终止密码子， 化学合成初始Pla cDNA，在化学合成初始Pla cDNA时分别改变Pla抗原蛋白核苷酸序列第 117位的Bgl II限制性内切酶位点、第607位的Sac I限制性内切酶位点、第731位的EcoR I 限制性内切酶位点，使酶切反应均不能发生在Pla抗原蛋白核苷酸序列的第117位、第607位 和第731位;然后在初始Pla cDNA的5 ' -N端引入EcoR I限制性内切酶位点，3 ' -C端引入Not I限制性内切酶位点，最终获得Pla cDNA;
[0009] 获取V cDNA，包括：以DNA序列数据库中公布的鼠疫耶尔森菌V抗原蛋白核苷酸序 列为模板，按酵母氨基酸密码子偏嗜性，去除起始密码子，化学合成初始V cDNA，在化学合 成初始V cDNA时分别改变V抗原蛋白核苷酸序列第216位、第446位、第492位、第639位各自 的Bgl II限制性内切酶位点，以及V抗原蛋白核苷酸序列第305位的EcoR I限制性内切酶位 点，使酶切反应均不能发生在V抗原蛋白核苷酸序列的第216位、第305位、第446位、第492位 和第639位;然后在初始V cDNA的5'-N端引入EcoR I限制性内切酶位点，3'-C端引入Not I 限制性内切酶位点，最终获得V cDNA;
[0010] 通过PCR法，在Pla cDNA的3 ' -C末端连入柔性连接肽基因 GGTGGTGGTGGTTCT，再利 用重叠 PCR方法，将V cDNA和连入柔性连接肽基因的Pla cDNA连接，得到中间插入柔性连接 肽基因的鼠疫耶尔森菌Pla-V cDNA融合基因，并制备含有鼠疫耶尔森菌Pla-V cDNA融合基 因的重组质粒；
[0011] 将重组质粒整合到宿主表达系统的染色体中进行表达，获得鼠疫耶尔森菌Pla-V 抗原融合蛋白。
[0012] 优选的，所述宿主系统是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞或植物细胞的表达系统。
[0013] 优选的，所述酵母是毕赤酵母。
[0014] 优选的，所述毕赤酵母是毕赤酵母SMD1168。
[0015]优选的，所述将重组质粒整合到宿主表达系统的染色体中进行表达，具体按照以 下步骤实施：
[0016] 步骤1)，构建鼠疫耶尔森菌Pla-V酵母表达系统，包括：
[0017] 将重组质粒经EcoR I和Not I双酶切，并回收含有Pla-v融合蛋白cDNA片段的重组 质粒酶切产物；
[0018] 将酵母表达载体经EcoR I和Not I双酶切，并回收线性化的酵母表达载体；
[0019]用T4连接酶连接重组质粒酶切产物和线性化的酵母表达载体，得到连接产物； [0020]将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，得到大肠杆菌DH5a阳性重组子，然后 提取大肠杆菌DH5a阳性重组子中的质粒，并经Sail酶切后，电击转化毕赤酵母SMD1168,获 得转化物；
[0021]将转化物涂布于含有lmol/L山梨醇的MD培养基平板上，30°C培养6天，之后将MD培 养基平板用水洗涤，收集洗涤液；
[0022] 将洗涤液涂布于含有4mg/ml G418的YH)培养基平板上，30°C培养3-6天；
[0023]挑取YPD培养基平板上长出的菌落，接种于MD培养基中，30 °C培养24小时，获得转 化酵母，然后提取转化酵母的基因组DNA，并利用通用引物进行PCR，获得毕赤酵母SMD1168 阳性重组子，所述毕赤酵母SMD1168的阳性重组子即为鼠疫耶尔森菌Pla-V酵母表达系统； [0024] 步骤2)，在鼠疫耶尔森菌Pla-V酵母表达系统中表达鼠疫耶尔森菌Pla-V融合蛋 白，并收集鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白，包括：
[0025] 将毕赤酵母SMD1168阳性重组子接种于装有BMGY培养基的三角瓶中，300rpm，29°C 培养至A6QQnm为2-6，离心收集毕赤酵母SMD1168的阳性重组子菌体；
[0026] 将毕赤酵母SMD1168阳性重组子菌体接种于装有BMMY培养基的三角瓶中，每24小 时补加一次甲醇，且使BMMY培养基中甲醇的最终体积百分比为0.5%，29°C培养7天，离心收 集上清液，并将上清液过滤除菌，然后按常规提取方法收集鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋 白。
[0027] 本发明还提供了一种鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白在诊断或防治鼠疫耶尔森 菌的应用。
[0028] 本发明提供的一种鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白，与鼠疫病原菌比较，鼠疫耶 尔森菌Pla-V抗原融合蛋白可不受任何温度等条件的制约，同时具备鼠疫耶尔森菌Pla、V抗 原的两种免疫原性，由鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白制备的免疫、诊断相关制剂，可以 对不同成长条件下、携带不同抗原的鼠耶尔森菌进行免疫或检测，防止不同生长背景条件 下不同鼠疫耶尔森菌的漏检事件发生，更加有效全面的对鼠疫耶尔森菌做出防治应对工 作，制备方法中利用化学合成方法，连接Pla cDNA和V cDNA，并在Pla cDNA和V cDNA中间插 入柔性连接肽基因，可以避免鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白的空间构象改变而影响其 免疫原性等蛋白活性。
[0029] 此外，本发明的鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白提高了鼠疫耶尔森菌Pla抗原和 V抗原对动物机体的联合免疫作用，也提高了融合蛋白对动物细胞的渗透能力，在动物对鼠 疫的免疫和诊断方面有良好的应用前景。
[0030] 优选的酵母表达系统除了具备原核表达系统的易操作、生长迅速、营养要求简单、 易工业放大的特点外，还具有真核细胞的蛋白后修饰系统，有利于大量生产高质量的重组 蛋白。更优选的是毕赤酵母表达系统，与酿酒酵母表达系统相比，毕赤酵母表达系统在蛋白 分泌和糖基化方面具有明显的优势。毕赤酵母自身分泌的蛋白少，十分有利于纯化;糖基化 程度低，避免了酿酒酵母超糖基化带来的免疫源性问题。
【附图说明】
[0031] 图1是本发明中PPIC9K-Pla-V质粒的构建示意图；
[0032] 图2是本发明中Western杂交法检测鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白中融合蛋白 Pla亚基的免疫源性的结果的western blot电泳图；
[0033] 图3是本发明中Western杂交法检测鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白中融合蛋白 V亚基的免疫源性的结果的western blot电泳图。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护 范围并不受【具体实施方式】的限制。
[0035] 一种鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白，其碱基序列如SEQ ID NO. 1所示，其氨基 酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白包括第一区与第二区， 其中第一区与鼠疫耶尔森菌Pla抗原序列同源，第二区与鼠疫耶尔森菌V抗原序列同源，并 且第一区与第二区之间通过柔性连接肽连接。
[0036] 优选的，鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白的第一区与鼠疫耶尔森菌Pla抗原基因 经酵母密码子偏嗜性优化后的序列，至少有95%的序列同源；鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合 蛋白的第二区与鼠疫耶尔森菌V抗原基因经酵母密码子偏嗜性优化后的序列，至少有95% 的序列同源。
[0037] 优选的，鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白的第一区由鼠疫耶尔森菌Pla抗原蛋白 去除信号肽的部分结构域组成，或经结构域重排后的鼠疫耶尔森菌Pla抗原蛋白组成。
[0038] 优选的，鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白，包括与鼠疫耶尔森菌Pla抗原氨基酸 残基序列相同的第一区，和与鼠疫耶尔森菌V抗原氨基酸残基序列相同的第二区，或上述二 区的功能等同物。
[0039] 所述功能等同物是指在不改变鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白生物功能的前提 下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或加入得到的多肽。也就是说，鼠疫耶尔森菌 Pla-V抗原融合蛋白主要具备的是Pla蛋白亚基的抗原性和V蛋白亚基的抗原性，所以本发 明仅用Pla或V两种抗原蛋白亚基做阐述，但实际目的是无论将Pla或V两种抗原蛋白亚基如 何重组，只要满足可以让鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白两个亚基的抗原性分别与Pla蛋 白亚基和V蛋白亚基相同即可。
[0040] 基于同一种发明构思，本发明还提供了一种鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白的 制备方法，包括:根据鼠疫耶尔森菌Pla抗原蛋白核苷酸序列化学合成Pla cDNA，根据鼠疫 耶尔森菌V抗原蛋白核苷酸序列化学合成V cDNA;连接Pla cDNA和V cDNA，并在Pla cDNA和 V cDNA之间插入柔性连接肽，得到鼠疫耶尔森菌Pla-V cDNA融合基因；将鼠疫耶尔森菌 Pla-V cDNA融合基因整合到宿主表达系统的染色体中表达，获取鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原 融合蛋白。具体按照以下步骤实施：
[0041] 步骤 1，获取Pla cDNA
[0042] 步骤1.1，以DNA序列数据库(GenBank)中公布的鼠疫耶尔森菌Pla抗原蛋白的核苷 酸序列为模板，登录号为KM880025.1 (GenBank:KM880025.1)，按酵母氨基酸密码子偏嗜性， 去除起始密码子、信号肽、终止密码子，化学合成初始Pla cDNA，在化学合成初始Pla cDNA 时分别改变Pla抗原蛋白核苷酸序列第117位的Bgl II限制性内切酶位点、第607位的Sac I 限制性内切酶位点、第731位的EcoR I限制性内切酶位点，使酶切反应均不能发生在Pla抗 原蛋白核苷酸序列的第117位、第607位和第731位；
[0043] 步骤1.2,在初始Pla cDNA的5'-N端引入EcoR I限制性内切酶位点，3，-C端引入 Not I限制性内切酶位点，最终获得Pla cDNA。
[0044] 需要说明的是，本发明采用的是人工化学合成的方法获得的Pla cDNA，在化学合 成Pla cDNA的同时跨过了起始密码子、信号肽和终止密码子，达到去除起始密码子、信号 肽、终止密码子的目的；同时在化学合成Pla cDNA的时候直接根据实际需要改变第117位、 第607位和第731位的碱基。
[0045] 步骤2,获取V cDNA
[0046] 步骤2.1，以DNA序列数据库(GenBank)中公布的鼠疫耶尔森菌V抗原的核苷酸序列 为模板，登录号为KF682423.1 (GenBank :KF682423.1)，按酵母氨基酸密码子偏嗜性，去除起 始密码子，化学合成初始V cDNA，在化学合成初始V cDNA时分别改变V抗原蛋白核苷酸序列 第216位、第446位、第492位、第639位各自的Bg 1 II限制性内切酶位点，以及V抗原蛋白核苷 酸序列第305位的EcoR I限制性内切酶位点，使酶切反应均不能发生在V抗原蛋白核苷酸序 列的第216位、第305位、第446位、第492位和第639位；
[0047] 步骤2.2,在初始V cDNA的5'-N端引入EcoR I限制性内切酶位点，3'-C端引入Not I限制性内切酶位点，最终获得V cDNA。
[0048] 需要说明的是，本发明采用的是人工化学合成的方法获得的V cDNA，在化学合成V cDNA的同时跨过了起始密码子，达到去除起始密码子的目的；同时在化学合成Pla cDNA的 时候直接根据实际需要改变第216位、第305位、第446位、第492位和第639位的碱基。
[0049] 步骤3，通过PCR法，在Pla cDNA的3 ' -C末端连入柔性连接肽基因 GGTGGTGGTGGTTCT (其对应的氨基酸序列为Gly Gly Gly Gly Ser)，再利用重叠 PCR方法，将V cDNA和连入柔 性连接肽基因的Pla cDNA连接，得到中间插入柔性连接肽的鼠疫耶尔森菌Pla-V cDNA融合 基因，并制备含有鼠疫耶尔森菌Pla-V cDNA融合基因的重组质粒pMD18T-Pla-V。
[0050] 需要说明的是，在Pla cDNA的3 ' -c末端插入柔性连接肽基因 GGTGGTGGTGGTTCT，具 体按照以下步骤实施：
[0051 ] 步骤3.1，以Pla cDNA为模板，以F1为上游引物，以F2为下游引物，进行PCR扩增，获 得的3 ' -C连入柔性连接肽基因的Pla基因。
[0052] 其中，PCR扩增的反应程序为:94°C预变性5min，94°C变性lmin，78°C退火lmin，72 °C延伸lmin，共30个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0053] 其中，F1的碱基序列如SEQIDN0.3所示，为5'-GCAGAGAGATTAAGG-3'，F2的碱基序 列如SEQ ID NO · 4所示，为5 ' -AGAACCACCACCACCGATATGATCTGTATTT-3 '。
[0054] 步骤3.2,利用现有的重叠 PCR技术，将V cDNA和连入柔性连接肽基因的Pla cDNA 连接，得到中间插入柔性连接肽的鼠疫耶尔森菌Pla-V cDNA融合基因，并制备含有鼠疫耶 尔森菌Pla-V cDNA融合基因的重组质粒pMD18T-Pla-V，具体按照以下步骤实施：
[0055] 将V cDNA和已经连入柔性连接肽基因的Pla cDNA以体积比1:1的比例混合作为模 板，在50μ1的PCR反应体系中加入：2.5mmol的dNTP 4yl，10XpfuBuffer 5yl，5U/yL pfu DNA聚合酶1 μ 1，混合好的模板2μ 1，双蒸水3 6μ 1，PCR的条件为：9 5 °C变性10m i η，6 5 °C退火 lmin，72°C延伸5min，94°C变性lmin，循环8次后，向反应体系中加 ΙΟμ mol/L的引物F1和F2各 ΙμL，再循环30次；
[0056]通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应的产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段 胶回收试剂盒纯化出1.9kb的目标条带，所述目标条带即为Pla-V融合蛋白基因片段；将 Pla-V融合蛋白基因片段经EcoR 1和Not 1双酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化，并用PCR片段胶回 收试剂盒回收，获得纯化好的Pla-V融合蛋白基因片段;将载体pMD18T经EcoR 1和Not 1双 酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化，并用PCR片段胶回收试剂盒回收，获得PMD18I1酶切产物;取双酶 切后纯化好的Pla-V融合蛋白基因片段SyUpMDlSI 1酶切产物5μ1，加入10 X ligation buffer 2μ1，T4连接酶0.4μ1，加双蒸水补齐20yL，15 °C反应过夜，获得连接产物;连接产物 转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，转化物涂布于含有lOOμg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37 °(：培养过夜，然后提取大肠杆菌DH5a中的质粒;通过PCR，及EcoR 1和Not 1双酶切，琼脂糖 凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒EcoR 1和Not 1酶切位点间区域进行DNA测序；阳性 重组子保存在含有20%甘油的LB中，冻存于-80°C ;阳性的重组质粒命名为pMD18T-Pla-V。
[0057] 需要说明的是，将鼠疫耶尔森菌Pla-V cDNA融合基因插入pMD18-T Simple Vector载体，获得重组质粒pMD18T-Pla-V，以保存鼠疫耶尔森菌Pla-V cDNA融合基因，也可 以将含有鼠疫耶尔森菌Pla-V cDNA融合基因的重组质粒pMD18T-Pla-V整合到宿主系统的 染色体进行表达，其中所用的PMD18-T Simple Vector载体购自宝生物(大连)有限公司。 [0058]步骤4,将重组质粒pMD18T-Pla_V整合到宿主表达系统的染色体中进行表达，获得 鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白（流程参见图1)，具体按照一下步骤实施：
[0059] 步骤4.1，构建鼠疫耶尔森菌Pla-V酵母表达系统，包括：
[0060] 将重组质粒pMD18T-Pla-V经EcoR I和Not I双酶切，并回收含有Pla-v融合蛋白 cDNA片段的重组质粒酶切产物；
[0061 ] 将酵母表达载体PPIC9K经EcoR I和Not I双酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化，回收线性 化的酵母表达载体；
[0062]用T4连接酶连接重组质粒酶切产物和线性化的酵母表达载体，得到连接产物； [0063]用T4连接酶连接的反应包括:取含有Pla-V融合蛋白cDNA片段的重组质粒酶切产 物5μ1，线性化的酵母表达载体5μ1，加入2μ1 lOXligation buffer，0.4yl T4连接酶，加双 蒸水补齐20μ1，15°C反应过夜，得到连接产物；
[0064]将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，该感受态细胞购自北京全式金生物技 术有限公司，转化后的产物涂布于含有l〇〇μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37°C培养过 夜，直至LB琼脂平板上长出菌落；
[0065]挑取长出菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37°C培养过夜， 收集细胞，然后用常规方法提取细胞中的质粒，并将细胞中的质粒进行EcoR I和Not I双酶 切，之后经琼脂糖凝胶电泳鉴定大肠杆菌DH5a中的阳性重组子，将大肠杆菌DH5a中的阳性 重组子保存在含有20%甘油的LB中，冻于-80°C保存，重组质粒命名为pPIC9K-Pla-V，阳性 重组子命名为DH5a/pPIC9K-Pla-V;
[0066] 提取大肠杆菌DH5a中的阳性重组子DH5a/pPIC9K-Pla_V中的质粒，经Sal頂每切 后，电击转化毕赤酵母SMD1168，获得转化物，该毕赤酵母SMD1168菌株购自Invi trogen公 司；
[0067]将转化物涂布于含有lmol/L山梨醇的MD培养基平板上，于30°C培养6天，之后将MD 培养基平板用2ml水洗涤，收集洗涤液；
[0068] 将洗涤液，分别涂布含有lmg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml G418的YH)平板上，且均 于30 °C培养3-6天；
[0069] 挑取在4mg/ml G418的YH)培养基平板上长出的菌落，接种于20ml MD培养基中，30 °C培养24小时，获得转化酵母，然后提取转化酵母的基因组DNA，利用通用引物进行PCR，该 通用引物包括上游引物5，A0X1 (5 ' -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3 '）和下游引物3，A0X1 (5 ' -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3 '），最后经琼脂糖凝胶电泳鉴定毕赤酵母SMD1168中的阳性重组 子，毕赤酵母 SMD1168 中阳性重组子命名为 SMD1168/pPIC9K-Pla-V，SMD1168/pPIC9K-Pla-V 即为鼠疫耶尔森菌Pla-V酵母表达系统。
[0070] 步骤4.2,在鼠疫耶尔森菌Pla-V酵母表达系统中表达鼠疫耶尔森菌Pla-V融合蛋 白，并收集鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白，包括：
[0071] 将毕赤酵母SMD1168中的阳性重组子SMD1168/pPIC9K-Pla-V接种于装有100ml BMGY培养基的500ml三角瓶中，300rpm，29°C培养至4_^为2-6,离离心收集毕赤酵母 SMD1168的阳性重组子菌体，其中，BMGY培养基中包含100mM的磷酸钾、1.34g/100ml的无氨 基酸的酵母氮基、4X10- 5g/100ml的生物素、linL/100mL的甘油，ρΗ6·0。
[0072] 将毕赤酵母SMD1168的阳性重组子菌体接种于装有20ml ΒΜΜΥ的100ml三角瓶中， 每24小时补加一次甲醇，且使BMMY培养基中甲醇的最终体积百分比为0.5%，29°C培养7天， 离心收集上清液，并将上清液过滤除菌，然后按常规提取方法收集鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原 融合蛋白。
[0073] Western杂交法检测鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白中融合蛋白Pla亚基的免疫 源性，结果如图2所示，图2中左列为mark的电泳条带，右列为P1 a亚基的电泳条带，右列中在 73kDa处可见到清晰的条带;Western杂交法检测鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白中融合 蛋白V亚基的免疫源性，结果如图3所示，图3中左列为mark的电泳条带，右列为V亚基的电泳 条带，右列中在73kDa处可见到清晰的条带，图2和图3的结果可以说明鼠疫耶尔森菌Pla-V 抗原融合蛋白已经融合成功。
[0074] 需要说明的是，由于鼠疫耶尔森菌属原核微生物，基因中不含内含子，鼠疫耶尔森 菌Pla抗原基因位于鼠疫耶尔森菌pPCPl质粒上，鼠疫耶尔森菌V抗原基因位于鼠疫耶尔森 菌pCDl质粒上；鼠疫耶尔森菌质粒DNA可以利用质粒DNA纯化试剂盒直接从鼠疫耶尔森菌中 提取；鼠疫耶尔森菌Pla抗原cDNA可以通过PCR法从提取的鼠疫耶尔森菌质粒基因组DNA中 直接扩增得到；鼠疫耶尔森菌V抗原cDNA可以通过PCR法从提取的鼠疫耶尔森菌质粒基因组 DNA中直接扩增得到；鼠疫耶尔森菌Pla抗原cDNA和V抗原cDNA也可以通过人工合成的方法 获得;人工合成法可以人为地选择宿主偏好的密码子，以使目的基因高效表达;并且可将获 得的鼠疫耶尔森菌Pla-V融合蛋白cDNA插入到克隆载体中保存。
[0075] 鼠疫耶尔森菌Pla-V融合基因可以在多个系统中表达，如细菌、酵母、昆虫细胞、动 物细胞、植物细胞，及生物体(如脊椎动物、昆虫等)等。在这些表达系统中目的基因被整合 到宿主的染色体中或插入到质粒中。本发明优选的是酵母表达系统，该系统除了具备原核 表达系统的易操作、生长迅速、营养要求简单、易于工业放大的特点外，还具有真核细胞的 蛋白后修饰系统，有利于大量生产高质量的重组蛋白。更优选的是毕赤酵母表达系统，和酿 酒酵母表达系统相比，毕赤酵母表达系统在蛋白分泌和糖基化方面具有明显的优势。毕赤 酵母自身分泌的蛋白少，十分有利于纯化;糖基化程度低，避免了酿酒酵母超糖基化带来的 免疫源性问题。
[0076] 毕赤酵母表达系统分泌型表达载体主要有pPIC9K，pHIL-Sl，pPICZa，pYAM75P6;胞 内型表达载体主要有:pPIC3.5K，pPICZ，pHWO 10，pGAPZ，pGAPZa等，优选的是毕赤酵母分泌 型表达载体PPIC9K，它是酵母整合载体，带有His缺陷型的选择性标记基因 HIS4、A0X1启动 子、afactor分泌信号肽和G418抗性基因等元件。
[0077]带有融合cDNA的表达载体可以通过转化锂盐法、PEG法、原生质体法或电穿孔法转 化宿主细胞。成功转化的细胞，即带有本发明构建的DNA的细胞，可以通过本领域熟知的方 法加以鉴定，如收集细胞，裂解后提取DNA，然后进行Southern杂交和PCR鉴定，也可在诱导 表达后用鼠疫耶尔森菌Pla抗原抗体和/或V抗原抗体检测培养液上清。
[0078]可以通过培养带有本发明构建的鼠疫耶尔森菌Pla-V cDNA融合基因的宿主细胞， 来生产本发明的融合蛋白。宿主细胞培养优选在生物反应器上进行，培养分两个阶段，第一 阶段主要用于宿主细胞生长，第二阶段主要用于产物合成。可以用各种蛋白分离的方法自 含有本发明DNA构建体的细胞培养物中分离、纯化融合蛋白。如盐纯析、沉淀、超滤、层析、制 备电泳等技术及这些技术的组合。
[0079]尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造 性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优 选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0080]显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精 神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围 之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
【主权项】
1. 一种鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白，其特征在于，所述鼠疫耶尔森菌Pla-v抗原 融合蛋白的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2. 根据权利要求1所述的鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白的制备方法，其特征在于， 包括以下步骤： 获取Pla cDNA，包括：以DNA序列数据库中公布的鼠疫耶尔森菌Pla抗原蛋白的核苷酸 序列为模板，按酵母氨基酸密码子偏嗜性，去除起始密码子、信号肽序列、终止密码子，化学 合成初始Pla cDNA，在化学合成初始Pla cDNA时分别改变Pla抗原蛋白核苷酸序列第117位 的Bgl II限制性内切酶位点、第607位的Sac I限制性内切酶位点、第731位的EcoR I限制性 内切酶位点，使酶切反应均不能发生在Pla抗原蛋白核苷酸序列的第117位、第607位和第 731位;然后在初始Pla cDNA的5'-N端引入EcoR I限制性内切酶位点，3'-C端引入Not I限 制性内切酶位点，最终获得Pla cDNA; 获取V cDNA，包括：以DNA序列数据库中公布的鼠疫耶尔森菌V抗原蛋白核苷酸序列为 模板，按酵母氨基酸密码子偏嗜性，去除起始密码子，化学合成初始V cDNA，在化学合成初 始V cDNA时分别改变V抗原蛋白核苷酸序列第216位、第446位、第492位、第639位各自的Bgl II限制性内切酶位点，以及V抗原蛋白核苷酸序列第305位的EcoR I限制性内切酶位点，使 酶切反应均不能发生在V抗原蛋白核苷酸序列的第216位、第305位、第446位、第492位和第 639位;然后在初始V cDNA的5'-N端引入EcoR I限制性内切酶位点，3，-C端引入Not I限制 性内切酶位点，最终获得V cDNA; 通过PCR法，在Pla cDNA的3 ' -C末端连入柔性连接肽基因 GGTGGTGGTGGTTCT，再利用重 叠 PCR方法，将V cDNA和连入柔性连接肽基因的Pla cDNA连接，得到中间插入柔性连接肽基 因的鼠疫耶尔森菌Pla-V cDNA融合基因，并制备含有鼠疫耶尔森菌Pla-V cDNA融合基因的 重组质粒； 将重组质粒整合到宿主表达系统的染色体中进行表达，获得鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原 融合蛋白。3. 根据权利要求2所述的鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白的制备方法，其特征在于， 所述宿主表达系统是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞或植物细胞的表达系统。4. 根据权利要求3所述的鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白的制备方法，其特征在于， 所述酵母是毕赤酵母。5. 根据权利要求4所述的鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白的制备方法，其特征在于， 所述毕赤酵母是毕赤酵母SMD1168。6. 根据权利要求4或5所述的鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白的制备方法，其特征在 于，所述将重组质粒整合到宿主表达系统的染色体中进行表达，具体按照以下步骤实施： 步骤1 )，构建鼠疫耶尔森菌Pla-V酵母表达系统，包括： 将重组质粒经EcoR I和Not I双酶切，并回收含有Pla-V融合蛋白cDNA片段的重组质粒 酶切产物； 将酵母表达载体经EcoR I和Not I双酶切，并回收线性化的酵母表达载体； 用T4连接酶连接重组质粒酶切产物和线性化的酵母表达载体，得到连接产物； 将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，得到大肠杆菌DH5a阳性重组子，然后提取 大肠杆菌DH5a阳性重组子中的质粒，并经Sal I酶切后，电击转化毕赤酵母SMD1168，获得转 化物； 将转化物涂布于含有lmol/L山梨醇的MD培养基平板上，30°C培养6天，之后将MD培养基 平板用水洗涤，收集洗涤液； 将洗涤液涂布于含有4mg/ml G418的YPD培养基平板上，30 °C培养3-6天； 挑取YPD培养基平板上长出的菌落，接种于MD培养基中，30°C培养24小时，获得转化酵 母，然后提取转化酵母的基因组DNA，并利用通用引物进行PCR，获得毕赤酵母SMD1168阳性 重组子，所述毕赤酵母SMD1168的阳性重组子即为鼠疫耶尔森菌Pla-V酵母表达系统； 步骤2)，在鼠疫耶尔森菌Pla-V酵母表达系统中表达鼠疫耶尔森菌Pla-V融合蛋白，并 收集鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白，包括： 将毕赤酵母SMD1168阳性重组子接种于装有BMGY培养基的三角瓶中，300rpm，29°C培养 至A6QQnm为2-6，离心收集毕赤酵母SMD1168的阳性重组子菌体； 将毕赤酵母SMD1168阳性重组子菌体接种于装有BMMY培养基的三角瓶中，每24小时补 加一次甲醇，且使BMMY培养基中甲醇的最终体积百分比为0.5%，29°C培养7天，离心收集上 清液，并将上清液过滤除菌，然后按常规提取方法收集鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白。7.根据权利要求1所述的鼠疫耶尔森菌Pla-V抗原融合蛋白在诊断或防治鼠疫耶尔森 菌的应用。
【文档编号】G01N33/68GK106084064SQ201610365098
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】王照, 王铁峰, 丛显斌, 邵奎东, 吕景生
【申请人】吉林省地方病第防治研究所, 吉林省地方病第一防治研究所