TGF-β1受体阻断剂在制备预防包虫病复发的药物中应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了TGF-β1受体阻断剂在制备预防包虫病复发的药物中应用。 申请人:的研究显示，细粒棘球蚴早期感染小鼠在应用TGF-β1受体阻断剂后下游分子Smad2/3磷酸化蛋白表达下降，NK细胞活性受体NKG2D表达增加，NK细胞对靶细胞的裂解率恢复，NK细胞的活性与其活性受体NKG2D的相关性分析的表达呈正相关，CD4+/CD8+T细胞比值升高，CD4+CD25+T细胞数量减少，因此利用TGF-β1受体阻断剂在临床上可有效用于预防包虫病的复发。
【专利说明】TGF-β 1受体阻断剂在制备预防包虫病复发的药物中应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于用于预防包虫病复发的方法，具体的是涉及TGF-β 1受体阻 断剂在制备预防包虫病复发的药物中应用，属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002] 包虫病，学名棘球蝴病（Ehcniocococsis)，是细粒棘球蝴绦虫幼虫寄生于人体 及某些动物体内所致的一种严重的人畜共患性寄生虫病，引起人体包虫病的棘球蝴绦虫 主要有细粒棘球缘虫（Echinococcus granulosus，E.g)和多房棘球缘虫（Echinococcus multilocularis，E. m)两种。囊性包虫病是由细粒棘球绦虫的幼虫寄生在人体肝、肺等脏 器引起的一种严重危害人类健康的寄生虫病，广泛分布于世界各地，因此包虫病己成为全 球性的影响公共健康的问题。
[0003] 针对包虫病的治疗，本领域已发展出了多种治疗方案，主要是以外科手术为主，内 科药物化疗为辅的方法。但此方法有许多弊端，如手术治疗对人体损伤较大，且易复发；内 科药物如甲苯咪唑或阿苯哒唑等药物进行化疗，可产生很多的毒副作用，有的患者不能耐 受，或产生耐药性。然而，包虫病与其他寄生虫病一样，是一个慢性感染过程，其对宿主的作 用也是慢性而持久的过程，两者之间的相互作用及其致病的免疫机制十分复杂，加之此病 发病隐匿，多数患者都是因包虫病的并发症而来医院就诊。
[0004] 综合目前的诊断和治疗现状来看，如何解决包虫病的复发问题已经是本领域亟待 解决的课题之一。
【发明内容】
[0005] 申请人:深入研宄了包虫病发病的生物学机理以及发病过程中人体免疫系统的免 疫机制，发现人或动物体在感染细粒棘球蝴后，包虫本身和其代谢产物可引起宿主体内一 系列的细胞免疫和体液免疫的改变，从而通过改变宿主的细胞因子产生数量和/或种类来 逃避宿主的免疫杀伤作用，因此如果能够有效阻止包虫虫体的免疫逃逸，将能够有效防止 包虫病的复发。
[0006] 具体地说，本发明是通过如下技术方案实现的：
[0007] TGF-β 1受体阻断剂在制备预防包虫病复发的药物中应用。
[0008] 具体地说，上述的TGF-M受体阻断剂用来阻断TGF-β的信号传导途径，包括 SB-431542、SB-505124 和 SB-525334 等，优选为 SB-525334。
[0009] 申请人:进行的实验显示，细粒棘球蝴早期感染小鼠在应用TGF-β 1受体阻断剂后 下游分子Smad2/3磷酸化蛋白表达下降，NK细胞活性受体NKG2D表达增加，NK细胞对靶细 胞的裂解率恢复，NK细胞的活性与其活性受体NKG2D的相关性分析的表达呈正相关，CD4+/ ⑶8+T细胞比值升高，⑶4+CD25+T细胞数量减少，因此利用TGF-β 1受体阻断剂在临床上可 有效用于预防包虫病的复发。
【专利附图】
【附图说明】
[0010] 图1为蛋白质印迹法检测SB-525334对E. g早期期感染小鼠 Smad2, P Smad2和 β-actin蛋白水平的表达的影响，A为电泳结果，B、C为吸光度数据；其中，PSC :原头节； SB :TGF-0 1 受体阻断剂（SB_525334)。
[0011] 图2为蛋白质印迹法检测SB-525334对E. g早期期感染小鼠 Smad3, p Smad3和 β-actin蛋白水平的表达的影响，A为电泳结果，B、C为吸光度数据；其中，PSC :原头节； SB :TGF-0 1 受体阻断剂（SB-525334)
[0012] 图3为流式细胞术检测SB-525334对E. g早期感染BALB/c小鼠 NK细胞的影响， 其中，A为流式细胞术检测NK细胞活性受体NKG2D的结果；B为流式检测各组NKG2D结果 统计分析，PSC+SB组的表达显著高于其它组；C为LDH法检测各组小鼠 NK细胞杀伤活性的 统计分析，PSC+SB组小鼠 NK细胞杀伤活性明显高于其它组；D为小鼠 NK细胞杀伤活性与 其活性受体NKG2D的相关性分析，R2 = 0. 751 ;其中，PSC :原头节；SB :TGF-f3 1受体阻断剂 (SB-525334) ;PSC+SB 组分别与 PSC、PBS+SB、PBS 组比较 * :P <0· 05, ** :P <0· 001。
[0013] 图4为FCM检测SB-525334对E. g早期感染BALB/c小鼠 T细胞亚群的影响，A :流 式细胞仪检测E. g早期感染BALB/c小鼠 CD4+/CD8+T细胞的1次流式结果；B :流式检测各 组⑶4+T细胞比率结果统计分析图，PSC+SB组均低于于其它组；C :流式检测各组⑶8+T细胞 比率结果统计分析图，PSC+SB组均高于其它组；D :各组⑶47⑶8+T细胞比值结果统计分析 图，PSC+SB组显著低于其它组；其中，PSC :原头节；SB !TGF-β 1受体阻断剂（SB-525334); PSC+SB 组分别与 PSC、PBS+SB、PBS 组比较 * :P < 0· 05, ** :P < 0· 001。
[0014] 图5为FCM检测SB-525334对E. g早期感染BALB/c小鼠 CD4+CD25+T细胞数量 的影响，A :流式细胞仪检测E. g早期感染BALB/c小鼠 CD4+CD25+T细胞的流式结果；B : ⑶4+CD25+T细胞流式结果统计分析，PSC+SB组⑶47⑶8+T细胞数量显著低于PSC组；PSC : 原头节；SB !TGF-β 1受体阻断剂（SB-525334) ; PSC+SB组分别与PSC、PBS+SB、PBS组比较 木：P < 0. 05, ** :P < 0. 001。
【具体实施方式】
[0015] 为了说明本发明受体阻断抑制剂的效果，进行了如下实验。
[0016] I. 1细粒棘球蝴原头节的制备
[0017] 从感染细粒棘球蝴病的羊肝上，无菌抽取无钙化、无感染、全整的单囊型细粒棘球 蝴包囊内容物置于无菌离心管内，原头节（Pr 〇t〇SC〇le，PSC)自然沉淀，再用含有100IU/ml 青霉素和链霉素双抗的无菌PBS (pH = 7. 3)中漂洗2-3次，除去育囊碎片使其自然沉淀， 0. 5%伊红染色5min，在显微镜下鉴定具有活性的虫体数（> 90% )，用含双抗的无菌PBS 稀释制成含有原头节10000个/ml的原头节悬液，备用。
[0018] 1. 2建立细粒棘球蝴感染小鼠动物模型，将16只健康BALB/c小鼠，随机分4组：
[0019] SB+PSC :腹腔接种浓度为10000个/ml原头节，加入100IU/ml青霉素和100IU/ ml链霉素0. 2ml/只；从接种前一天开始，到接种的第9天，每天灌胃TGF-β 1受体阻断剂 (SB-525334)，浓度为 200mg/L、灌胃量 10mg/Kg。
[0020] SB+PBS :腹腔接种PBS加入100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素0. 2ml/只；从接 种前一天开始，到接种的第9天，每天灌胃SB-525334,浓度为200mg/L、灌胃量10mg/Kg。
[0021] PBS :腹腔接种PBS加入lOOIU/ml青霉素和lOOIU/ml链霉素0· 2ml/只；
[0022] PSC :腹腔接种浓度10000个/ml原头节，加入100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉 素 0· 2ml/ 只；
[0023] 上述各实验组均在9天的时候颈椎脱白法处死小鼠，无菌摘取脾脏，制备脾细胞 悬液。
[0024] 1. 3流式细胞染色及检测
[0025] 首先按照试剂说明书，将荧光稀释10倍，DX-5、NKG2D原液浓度为0. 5mg/ml，吸取 5ul到EP管中，加入95ul PBS，配制成浓度为25ug/ml的抗体工作液。然后利用流式细胞 检测 NKG2D、DX-5 (或 CD4+CD25+T):
[0026] (1)将细胞用PBS调至IX IO7个/ml。
[0027] (2)取4个流式管，分别标上空白管、NKG2D、DX-5和NKG2D&DX-5(或空白，CD4、 CD25 和 CD4&CD25)等标记。
[0028] (3)分别向各管中加入50 μ 1浓度为IXioVml的脾细胞，再向个管中加入相应的 荧光抗体，其中空白管不加任何荧光抗体。
[0029] (4)室温避光孵育30min，加入约Iml PBS洗绦，1000转/分钟离心5分钟。以上 各组共培养后的细胞悬液收集起来，IOOOrpm离心5min。
[0030] (5)弃上清液，加入300 μ I PBS，混匀。
[0031] (6)上机检测。读取结果。
[0032] 1. 4流式细胞检测细粒棘球蝴早期感染小鼠 T亚群步骤如下所示：
[0033] (1)将细胞用PBS调至IX IO7个/ml。
[0034] (2)取5个流式管，分别标上空白管、⑶3、⑶4、⑶8和⑶3&CD4&CD8等标记。
[0035] (3)分别向各管中加入50 μ 1浓度为IXioVml的脾细胞，再向个管中加入相应的 荧光抗体，其中空白管不加任何荧光抗体。
[0036] (4)室温避光孵育30min，加入约1毫升PBS洗涤，1000转/分钟离心5min。以上 各组共培养后的细胞悬液收集起来，IOOOrpm离心5min，然后弃上清液，加入300 μ I PBS， 混匀。进行上机检测并读取结果。
[0037] I. 5ELISA法检测细粒棘球蝴早期感染小鼠外周血中TGF-β 1含量外周血中 TGF-β 1含量用ELSIA试剂盒检测，按照试剂盒说明书进行操作并设立复孔，建立标准曲线 法并进行计算。具体操作步骤如下：
[0038] (1)标本激活
[0039] 将320 μ 1样本稀释液加入到1只I. 5ml的PE管中，再加入40 μ 1样本血清。加 入20 μ I IN HCl，盖紧，上下颠倒混匀。4°C放置60分钟。加入20 μ I IN NaOH，盖紧盖子， 上下颠倒混匀。计算结果时乘以稀释的倍数10。
[0040] (2)稀释标准品：取7个干净的I. 5ml EP管并编号：1-7,都加入0. 5ml试剂缓冲 液，取0. 5ml标准品加入1号EP管中，盖好盖子，颠倒几次混匀；从1号管中吸取0. 5ml标 准品，并加入到2号EP管中，混匀后再吸取0. 5ml标准品至3号管中，后面依次向下一 EP管 中转移0· 5ml标准液直至7号EP管，停止。浓度依次为2000pg/ml、1000pg/ml、500pg/ml、 250pg/ml、125pg/ml、62. 5pg/ml、31. 25pg/ml ;
[0041] (3)留空白对照孔；
[0042] (4)取100 μ 1待测样和100 μ 1各浓度的标准品加入到待测样孔中（各待测样均 设有复孔）；贴上封板朔纸，室温孵育90min ;
[0043] (5)提前30min制备生物素化抗体工作液；
[0044] (7)洗板 5 次，每次 5min ;
[0045] (8)除空白孔外，每孔均加入生物素抗体工作液100 μ 1 ;贴好封板朔纸，并室温孵 育 60min ;
[0046] (9)提前半小时准备酶标结合物工作液；避光室温保存；
[0047] (10)洗板 5 次，每次 5min ;
[0048] (11)除空白孔外，每孔均加入酶标结合物工作液100 μ 1 ;贴好板朔纸封住，并室 温孵育半小时；洗板5次，每次5min ;
[0049] (12)加入底物显色液：向所有反应孔中加入100 μ 1的TMB底物显色溶液，37°C， 10 ?20min ;
[0050] (13)向各反应孔中加入IOOul终止液，终止反应。
[0051] (14)读取结果：用ELISA检测仪检测（在半小时之内），于450nm处，测各孔OD值； 绘制标准曲线并建立方程式。并通过标准曲线方程式计算出出待测样本的浓度。
[0052] 1. 6实时荧光定量PCR检测细粒棘球蝴早期感染小鼠脾细胞Foxp3基因和TGF-β 基因的表达
[0053] 利用SYBR Green法检测Foxp3基因和TGF-β基因的表达，操作步骤按照说明 书：实时荧光定量反应体系：cDNA 4 μ 1，SYBR GreenI 10 μ 1，上游引物0.5 μ 1，下游引物 0. 5μ 1，双蒸水5μ 1 ;具体反应条件：预变性95°C 5min ;变性95°C、15s ;Foxp3、TGF-β退 火60°C、30s，β-Actin退火56°C、30s，延伸72°C、30s ;共40个循环。相对定量计算拟采用 24 Aet，ACt = Ct待测基因-Ct内参基因。
[0054] 1. 7用LDH酶法检测细粒棘球蝴早期感染小鼠 NK细胞活性的影响
[0055] (1)试剂：1 % NP-40、LDH底物溶液、lmol/L柠檬酸终止液。
[0056] (2)靶细胞的预处理（Yac-Ι细胞）：Yac_l细胞（小鼠 NK细胞的靶细胞，其细胞表 面无 MHC-I类分子表达），实验前24h将靶细胞进行换液。用前计数并离心1000rmp、5min， 用1640培养液调整细胞浓度为I X IO5个/ml。
[0057] (3)效应细胞的制备：将细粒棘球蝴早期感染小鼠脾细胞用PBS洗涤3次，再用完 全RPMI-1640培养液重悬，调整细胞浓度：I X IO7个/ml。
[0058] (4)效-靶细胞作用（共培养）：(E/T = 100 : 1):分别取靶细胞和效应细胞各 0. Iml (E : T = IOO : 1)加入96孔细胞培养板中，设3复孔，并设靶细胞最大释放组（0.1ml 靶细胞+0. Iml 1 % NP40液），和自然释放组（0. Iml靶细胞+0. Iml 10 % FCSRPMI-1640培养 液）1000r/min，低速离心2分钟。置37°C、5% CO2孵育2h。1000r/min，离心5分钟。
[0059] (5)酶促反应：：取出96孔培养板，分别取0. Iml各孔上清夜，移入空白孔中，置 37°C预温10min，分别每孔加入底物溶液0. lml，室温避光反应10-15min。每孔加入柠檬酸 Imol/L 30 μ 1终止液，终止酶促反应。
[0060] (6)读取OD值：用酶联检测仪在570nm波长处读取各OD值。
[0061] (7)结果计算：根据下列公式计算NK细胞活性
[0062]
【权利要求】
1. TGF-M受体阻断剂在制备预防包虫病复发的药物中应用。
2. 根据权利要求1的应用，其特征在于所述TGF-M受体阻断剂为SB-525334。
【文档编号】A61K31/517GK104490886SQ201410571911
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年10月23日 优先权日:2014年10月23日
【发明者】陈雪玲, 吴向未, 印双红 申请人:陈雪玲