专利名称：一种chd1l-tctp结合阻断剂以及包含该阻断剂的药物组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学分子生物学领域，具体涉及一种CHD1L-TCTP结合阻断剂以及包含该阻断剂的药物组合物及其应用
背景技术：
肝癌是世界第六大最常见的人类恶性肿瘤，预后极差。在肝癌的进展过程中，大约58% -78%的原发性肝癌患者中发现有染色体lq21位点的扩增，意味着一个或多个扩增的癌基因在肝癌的发展中发挥着重要的作用。过去的体内和体外研究证明，候选癌基因 CHD1L(也叫做ALC1)是一个重要的肝癌相关癌基因，CHDlL是一种新型癌基因，它在肝癌细胞中有高复制、高表达的特点，主要通过抑制肿瘤细胞的凋亡、增强肿瘤细胞的侵袭性而发挥致癌作用，并且能够诱导细胞恶性转变。TCTP是一个管家基因，它几乎在所有的哺乳动物组织中表达，同时在动物，植物和酵母中具有高度的保守性。按照它的氨基酸序列，TCTP也被称为P23，不能归类于已知的任何蛋白质家族。TCTP首先在艾氏腹水癌细胞中发现，在肝癌和结直肠癌中发现高表达。分析TCTP的第一个高表达实验显示，在细胞周期中，它能够与微管协同作用。据报道，TCTP也能够作为促生存因子，促进细胞周期和抑制凋亡。然而，TCTP在肿瘤中高表达的分子机制， 以及TCTP调控细胞周期进展的精确机理目前还不十分清楚，也没有TCTP相关的抗癌药物的报道。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种包含CHD1L-TCTP结合阻断剂的药物及其相关应用。通过CHD1L-TCTP结合阻断剂阻止CHDlL蛋白结合TCTP，以制备抗
肝癌药。为了实现上述目的，本发明的技术方案如下本发明的一种CHD1L-TCTP结合阻断剂阻断位点为CHDlL结合区域。所述CHDlL结合区域为TCTP5'端的_748bp和_851bp，TCTP5 ‘端上游CHDlL结合区域 nt-733/-1027，TCTP5 ‘端上游 CHDlL 结合区域 nt+91/_213。所述CHD1L-TCTP结合阻断剂为能封闭CHD1L-TCTP结合的抗体/配体，或能封闭 CHD1L-TCTP结合的多肽类物质，或能干扰/阻断CHD1L-TCTP结合的小干扰核糖核酸siRNA 或miRNA或shRNA中的一种或多种。本发明还提供了一种抗癌药物，所述药物包含治疗有效量上述的CHD1L-TCTP结合阻断剂。本发明的CHD1L-TCTP结合阻断剂可应用在制备用于抗癌药物中，特别是抗肝癌药物。新出现的证据指出在人肝细胞性肝癌中，CHDlL作为一种特异性的癌基因。为了更好的理解CHDlL在高表达的肝癌样本中(>50%)的分子机制，本发明确定了一个CHDlL 的靶向基因，翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)，同时研究TCTP在肝癌进展中的作用。在本发明中，我们还公开了 CHDlL蛋白直接结合在TCTP的启动子区域(范围为-733到-1027)，并且能够激活TCTP的转录。在所分析的肝癌样本中，有大约40. 7%的样本高表达TCTP，并且这些高表达TCTP的肝癌样本与CHDlL的高表达有正相关性。临床分析发现，TCTP的高表达与进展期肿瘤分期(P = 0. 037)和肝癌患者总生存时间(P = 0. 034)存在显著相关性。 在多因素分析中，TCTP成为差预后结果的独立因素。体外功能实验和体内裸鼠成瘤实验显示TCTP有成瘤能力，并且由于CHDlL引起TCTP的高表达而引起肿瘤细胞的有丝分裂缺失。 进一步研究证明，在有丝分裂过程中，TCTP促进Cdc25C的泛素化降解，也就造成了 Cdkl的 Tyrl5位点去磷酸化失败，从而降低了 Cdkl的活性。结果，在有丝分裂过程中，由于Cdkl的突然失活，引起更快的有丝分裂退出和染色体微分离。由于这些改变，引起染色体不稳定。 D印Ietion实验证明，TCTP的成瘤能力与它在有丝分裂缺失中的作用有关。总体来说，本发明揭露出了 CHDlL/TCTP/Cdc25C/Cdkl这一新的分子通路，它能够引起肝细胞的恶性转变， 伴有明显的快速有丝分裂过程和异倍体形成。本发明提供了一种新的抗癌药物。本发明抗癌药物通过抑制CHDlL/TCTP/Cdc25C/ Cdkl这一新的分子通路，能实现较好的抗癌效果，特别是肝癌。
图1是CHDlL激活TCTP的转录的确证及CHDlL结合区域定位的相关实验结果图；图IA是两个CHDlL结合区域定位在TCTP5'端具体位点图，图IB是染色质免疫共沉淀-聚合酶链反应的实验结果图，图IC是迁移实验的结果图，图ID是荧光素酶报告基因检测CHDlL可以激活TCTP的转录的结果图，图IE是定量PCR在Huh7和PLC80M两株细胞系中检测，经过混杂siRNA和SiCHDlL处理后的CHDlL以及TCTP的表达水平的结果图，图IF 是定量PCR的方法检测43例肝癌组织和它们相应的癌旁组织之间CHD1L，TCTP的表达水平，运用线性回归和Pearson相关性进行分析图；图2是TCTP在肝癌中表达的普遍性以及临床差异性相关实验结果图；图2A是运用定量PCR的方法检测TCTP的表达量结果图，图2B为6例I期肝癌标本中TCTP表达量的实验结果图，图2C为14例进展期肝癌组织(II&III期)中TCTP表达量的实验结果图，图 2D为TCTP的高表达与肝癌患者的总生存时间之间的差异结果，图2E是多因素回归分析结果；图3是TCTP成瘤能力及其机制研究相关实验的结果，图3A是TCTP转染细胞的克隆形成计数结果图，图3B是Vec-7703，TCTP-7703分别皮下注射到裸鼠的左侧和右侧的观察成瘤结果图，图3C是肿瘤平均体积比较曲线图，图3D，E是流式细胞仪分析TCTP在细胞周期进展中的作用的实验结果图，图3F是Vec-7703，TCTP-7703细胞的cyclinBl的相对表
达量结果图；图4是TCTP对有丝分裂退出的作用研究的相关实验结果图，图4A，B是TCTP-7703 相对于Vec-7703经过阻滞和租住释放对M期的影响，图4C是经过nocodazole处理2_3天， TCTP-7703细胞变化情况，图4D是两组细胞从前中期释放出来后，用α -tubulin抗体染色 1. 5小时后的结果图，图4E是TCTP-7703细胞的变化情况，图4E，F是在有丝分裂期，两组细胞含有落后染色体的量的比较及发生多核化以及微核化情况；图5是TCTP降解Cdc25C蛋白，导致了 Cdkl活性的突然丧失，造成更加快速的有丝分裂退出的机制相关实验结果图，图5A是在阻滞解除后的任意时间点上，TCTP-7703细胞相对于Vec-7703细胞的Cdkl_Tyrl5表达水平的情况，图5B，C是经过同步化处理后，与 Vec-7703细胞相比，TCTP-7703的Cdc25C在蛋白水平，而不是在mRNA水平发生下调，图5D 是蛋白酶体抑制剂MG132不存在时，TCTP下调Cdc25C的表达量，是当MG132存在时，Cdc25C 的表达量又能够恢复，图5E是TCTP在QGY-7703细胞中的高表达能够增强Cdc25C的泛素化实验结果图，图5F是在有丝分裂进展中，TCTP-7703细胞显示了更快的Cdc25C蛋白降解；图6是TCTP在肝癌的发展过程是必需的证明实验，图6A是相对于SOM-control 细胞，8024-shTCTP细胞中TCTP的表达量及克隆形成数的情况，图6B是裸鼠成瘤情况，图 6C是SOM-shTCTP显示了更慢的有丝分裂退出，特别是阻滞解除后两小时，图6D是相比较于80M-Controll6. 78%的超四倍体细胞数，8024-shTCTP超四倍体细胞数变化情况，图 6E，F是80M-shTCTP能够增加Cdc25C的表达量，从而增加Cdkl的活性的实验结果图；图7是TCTP的成瘤性与它在有丝分裂进程中的作用是否有相关性的相关实验结果图，图7A，B是相比较单细胞群体xeno-CTL，xeno-TCTP细胞的有丝分裂时间显著缩短，图 7C是xeno-TCTP细胞显示了更多的微核化和多核化，图7D，E是xeno_CTL与xeno_TCTP之间的染色体数量改变情况。图8是阻断CHDlL和TCTP的相互作用时，细胞增殖能力，软琼脂克隆形成能力和体外克隆形成能力的变化实验结果图，图8A是细胞增殖实验结果图，图8B是软琼脂克隆形成实验结果图，图8C是克隆形成实验结果图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。在以下实施例中所用到的患者与临床标本来源于中山大学肿瘤防治中心(中国广州)。从2001年到2010年，肝癌标本经肝切除术后立即收集。其中患者术前均未接受放疗或化疗。所有肝癌患者均给予书面正式同意，可以使用标本用于医学研究。本次研究中所使用的肝癌标本均已获得中山大学研究伦理审查委员会的批准。所用细胞系包括肝癌细胞系QGY-7703、BEL7402、PLC8024. H印3B、Huh7、HepG2 和正常肝脏永生化细胞系L0-2，以上所使用细胞系均从中国医学科学院(中国北京)病毒研究所获得。实施例1 :CHD1L激活TCTP的转录的确证及CHDlL结合区域定位的相关实验染色质免疫共沉淀(ChIP)-聚合酶链反应(PCR)按照制造商的说明，使用 EZ-Magna ChIPG试剂盒(Upstate Biotechnology，纽约)进行染色质免疫共沉淀实验。运用两种不同的抗GFP抗体(FL和B-2) (Santa-Cruz，加州)，将CHDlL结合的DNA片段沉淀出来。来源于鼠和兔的免疫球蛋白G(Santa Cruz，加州)作为阴性对照。迁移检测使用NucBuster蛋白提取试剂盒(Novagen，加州)准备核提取物。使用DIG标记的dUTP，加入到dNTP中，通过PCR方法将探针末端用地高辛标记，并将PCR产物纯化出来0!iagen，CA)。取IOug核提取物和50ngDIG标记的探针，以及未用DIG标记的探针共同置于结合缓冲液中进行迁移实验(Amersham Pharmacia, NJ)，同时加用抗CHDlL抗体(Abeam, ΜΑ)。双荧光素酶报告基因检测构建荧光素酶报告体，自己构建，常规克隆方法将TCTP克隆入萤光素酶报告体pGL3 (Promega,美国)(10 10 ITCTP荧光素酶复合体， pcDNA3. 1-CHDlLjRenilla荧光素酶载体，Prl-ΤΚ)，按照制造商的说明同时用脂质体将它转染到细胞中。根据产品制造商的要求，运用双荧光素酶检测法测定酶的活性。基于在PGL3 活性的基础上，对测定结果进行均一化处理。转录水平上，CHDlL能够提高TCTP的表达。基于以前研究的基础上，CHDlL能够按照假定存在的DNA结合区域(C/A)C(T/A)T(T/A/G)T，表现出DNA结合能力。因此， CHDlL可以通过蛋白质-DNA之间的相互作用，上调TCTP的表达水平。运用MatInspector Professional软件O^enomatrix)，去寻找CHDlL的结合区域，位置大约在TCTP转录起始点上游1.8kb以内。两个CHDlL结合区域定位在TCTP5'端的_748bp和_851bp (图 1A)这两个位点。运用染色质免疫共沉淀-聚合酶链反应的方法，我们发现仅仅只有 DNA片段C(nt-733/-1027)包含以上两个CHDlL结合区域。片段A(nt+91/_213)和片段 B(nt-195/-500)不能发现可以被CHDlL结合的区域(图1B)。如图IC所示，迁移信号仅仅只能在含有DIG标记的片段C中观察到。运用荧光素酶报告基因检测方法，以进一步明确CHDlL可以激活TCTP的转录。 结果可得，PGL3-TCTP-FD在pcDNA3. 1-CHD1L转染的细胞中，荧光素酶活性显著提高，但在pcDNA3. 1转染的细胞中活性却没有明显提高(*，P < 0. 05)。同时，pGL3_TCTP_FA和 PGL3-TCTP-FC在pcDNA3. 1-CHD1L转染的细胞中，荧光素酶活性没有明显提高(图1D)。这些结果证实，CHDlL能够结合到TCTP5'端上游CHDlL结合区域(nt-733/-1027)，并能激活 TCTP的转录。然而，5'端上游其他区域(片段A:nt+91/-213对TCTP转录的激活也是必需的。运用定量PCR的方法，在Huh7和PLC80M两株细胞系中检测，经过混杂siRNA和 SiCHDlL处理后的CHDlL以及TCTP的表达水平(图1E)。运用定量PCR的方法，检测43例肝癌组织和它们相应的癌旁组织之间CHD1L，TCTP 的表达水平，同时运用线性回归和Pearson相关性进行分析(P < 0. 0001, Pearson卡方检验)如图IF所示。实施例2 =TCTP在肝癌中表达的普遍性以及临床差异性相关实验为了明确TCTP在肝癌中表达是否普遍，以及是否有临床差异性。在118例肝癌患者群体中，TCTP高表达与临床病理特征之间的关联性进行回顾性研究。运用定量PCR的方法进检测，TCTP的高表达(超过2倍以上)在118例肝癌患者中有48例，阳性率为40.7%。 肝癌组织比其癌旁组织显示出更高的TCTP表达量(P = 0. 0336，Wilcoxon秩和检验；图 2A)。TCTP在肝癌组织中高表达与进展期肿瘤分期有显著相关性(P = 0. 037，表1)。为了证实我们的发现，TCTP的免疫组化染色，运用在20例具有不分肿瘤分期的肝癌组织切片上 (6例I期，6例II期，8例III期)。14例进展期肝癌组织(II&III期)中，有9例肿瘤组织比癌旁组织有更高的TCTP表达量，阳性率为57. (图2C)。同时6例I期肝癌标本中， 有5例肿瘤组织比癌旁组织有更高的TCTP表达量，阳性率为83. 8% (图2B)。TCTP高表达的预后差异在108例具有有效随访数据的肝癌患者中进行研究，结果，TCTP的高表达与肝癌患者的总生存时间之间有显著差异(Log rank = 4. 495，P = 0. 034 ；图2D)。更重要的是，多因素回归分析显示，TCTP成为肝癌患者总生存时间的独立预后因素(HR，2. 298 ；95% Cl，1. 095-6. 165 ；P = 0. 037，图2E)。统计分析是运用Pearson卡方检验对高表达TCTP的患者以及不表达TCTP的患者，他们之间的临床病理特征进行分类处理。依赖于TCTP的倍数变化值，运用Wilcoxon秩和检验分析TCTP在肝癌组织以及它们相应的癌旁组织的表达水平。Kaplain-Meier中的log rank法用来进行生存分析。使用Pearson卡方检验分析 CHDlL的mRNA表达水平与TCTP的mRNA表达水平之间的相关性。独立t检验方法用来比较两组之间的克隆形成数、肿瘤大小以及荧光素酶活性。P < 0. 05时认为有统计学差异。表 权利要求
1.一种CHD1L-TCTP结合阻断剂，其特征在于，所述CHD1L-TCTP结合阻断剂阻断位点为 CHDlL结合区域。
2.根据权利要求1所述的阻断剂，其特征在于，所述CHDlL结合区域为TCTP5'端的-748bp 和-851bp，TCTP5'端上游 CHDlL 结合区域 nt_733/-1027，TCTP5 ‘端上游 CHDlL 结合区域nt+91/-213。
3.根据权利要求1所述的阻断剂，其特征在于，所述CHD1L-TCTP结合阻断剂为能封闭 CHD1L-TCTP结合的抗体/配体，或能封闭CHD1L-TCTP结合的多肽类物质，或能干扰/阻断 CHDIL-TCTP结合的小干扰核糖核酸siRNA或miRNA或shRNA中的一种或多种。
4.一种抗癌药物，其特征在于，所述药物包含治疗有效量的权利要求1-3之一所述的 CHDIL-TCTP结合阻断剂。
5.权利要求1所述的CHD1L-TCTP结合阻断剂在制备用于抗癌药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗癌药物包括抗肝癌药物。
全文摘要
本发明提供了一种CHD1L-TCTP结合阻断剂的及其包含该阻断剂的药物组合物及其应用。本发明的阻断剂阻断位点为CHD1L结合区域。CHD1L结合区域为TCTP5′端的-748bp和-851bp，TCTP5′端上游CHD1L结合区域nt-733/-1027，TCTP5′端上游CHD1L结合区域nt+91/-213。本发明还提供了一种抗癌药物，包含治疗有效量上述阻断剂。本发明的CHD1L-TCTP结合阻断剂可应用在制备用于抗癌药物中，特别是抗肝癌药物。本发明提供了一种阻断剂及其新的抗癌药物，通过抑制CHD 1L/TCTP/Cdc25C/Cdk1这一新的分子通路，能实现较好的抗癌效果，特别是肝癌。
文档编号A61K39/395GK102336833SQ20111028860
公开日2012年2月1日 申请日期2011年9月26日 优先权日2011年9月26日
发明者关新元, 李炎, 陈汉文, 陈蕾蕾 申请人:中山大学