多潜能和多能细胞在微载体上的培养的制作方法

专利名称：多潜能和多能细胞在微载体上的培养的制作方法
技术领域：
本发明涉及在存在ROCK抑制剂的情况下多潜能和多能细胞在微载体上的培养。
背景技术：
与分化的细胞不同，干细胞具有分裂和自我更新或分化成在表型和功能上不同的子细胞的能力(Keller, Genes Dev. 2005 ;19 :1129-1155 ;Wobus 和 Boheler，Physiol Rev. 2005 ；85 :635-678 ；Wiles, Methods in Enzymology· 1993 ；225 :900-918 ；Choi 等人， Methods Mol Med. 2005 ；105 :359-368)。人胚胎干细胞(hESC)是具有分化成多种干细胞类型的多潜能细胞。干细胞(如胚胎干细胞(ESC))的多潜能性和它们从所有三种胚层分化成细胞的能力使它们成为多种疾病和组织创伤的再生疗法的理想细胞来源(Keller, Genes Dev. 2005 ；19 :1129-1155 ； Wobus 和 Boheler, Physiol Rev. 2005 ；85 :635-678)。干细胞扩增至较大量需要传代一次或多次，这是细胞疗法的必要条件。目前，通常将作为集落生长的干细胞(包括人胚胎干细胞，hESC)以2维QD)生长的方式维持在塑料培养表面上。在2D培养中扩增至较大量将需要使用较大表面积。通过反复吸取使细胞传代的人工操作本质或酶促处理将这些2D集落破碎至较小尺寸将是不实际的。准备用于接种大表面积的众多平板可能经历操作错误。此外，将需要如(例如) Nunc托盘的极大的表面积。因此，当前以2D集落培养在涂覆的塑料表面上使干细胞生长的方法不适合于放大并且进行培养的实验条件一般不适合于进行良好控制。现有技术包括在三维(“3D”)环境中培养干细胞的多种尝试，如在悬浮培养中的微载体上。除了小鼠胚胎干细胞在微载体上(Fernandes 等人，2007 ；Abranches 等人，2007 ；King和 Miller，2007)以及在悬浮培养中使 hESC 作为拟胚体分化(Dang 等人，2004 ；Fok 和 Zandstra，2005 ；Cameron 等人，2006)的一些研究以外，在悬浮培养中尚没有长期、连续培养hESC的稳健方法。在本领域中，已知胚胎干细胞能够在悬浮培养中作为“拟胚体”分化。这些拟胚体包含大量已分化的细胞。例如，Gerecht Nir等人Q004)描述了使用旋转壁生物反应器来培养拟胚体。Zandstra等人000；3)、Dang等人Q004)和Wartenberg等人(1998)还显示了使用搅拌系统的拟胚体培养。Dang和Zandstra(2005)以及King和MilleH2007)还报道了拟胚体悬浮培养。这些技术适合于培养包含分化干细胞的这些组织样拟胚体聚集体， 但是不适合于未分化的干细胞。Fok和Zandstra(2005)描述了用于未分化小鼠胚胎干细胞(mESC)增殖的搅拌悬浮培养系统。该搅拌悬浮培养系统包含微载体和聚集体培养物。在玻璃微载体上培养的小鼠胚胎干细胞具有与组织培养瓶对照可比较的群体倍增时间。一旦除去白血病抑制因子， mESC聚集体将发育为能够多谱系分化的拟胚体(EB)。在King和MilleH20(^)中还描述了小鼠ESC的悬浮培养。然而，King和Miller (2005)说明“未分化人ESC(hESC)的扩增比 mESC更困难并且尚未在搅拌培养中有过报道”。
US2007/0264713 (Terstegge)公开了在微载体上培养人胚胎干细胞的尝试。将人胚胎干细胞与Cyt0dex3(Amersham)微载体一起引入到加入不同体积的条件培养基的旋转器或生物反应器中。在1小时中，以20-30rmp搅拌培养物30分钟。将该培养物维持10天至6周的不同时间。然而，任何培养物均从未进行传代或继代，而传代或继代是干细胞大规模连续生产的必要要求。在微载体上连续传代的表现以及以“优良”(指数)生长率进行继代的能力是干细胞大规模生产的必要要求。这一点在Terstegge等人的工作中未得到体现。W02008/004990描述了在不存在饲养细胞的情况下培养干细胞的尝试以及对微载体使用的考虑。它与其中未使用Matrigel的培养有关。W02008/004990描述了带正电荷的表面在抑制干细胞分化方面的作用。在Phillips 等人，2008 (Journal of Biotechnology 138(2008)24-32)的报道中报道了通过接种聚集体以及单细胞在微载体上培养hESC的尝试。开始，在5天内实现了 3 倍扩增，然而，随着每次连续传代，细胞扩增下降直至6周后细胞不能传代为止。使用可商购微载体(如Cytodex 1和3)放大培养人胚胎干细胞(hESC)的先前尝试是不成功的。hESC培养物在载体上死亡或分化并且不能增殖(Oh & Choo，2006)。Watanabe等人和Harb等人提议使用ROCK抑制剂Y-27632作为能够允许解离的人胚胎干细胞在2D培养中存活的因子(Watanabe等人，A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology Vol. 25 No. 6 P681-686 June 2007 ；WO 2008/035110 ；Harb^A,The Rho-Rock-myosin Signaling Axis Determines Cell-Cell Integrity of Self-Renewing Pluripotent Stem Cells. PLoS ONE 3(8) :e3001. doi :10 :1371/journal, pone. 0003001)。还研究了使用ROCK抑制剂作为可以改善人胚胎干细胞冷冻保存的试剂 (Xiangyun Li 等人’ ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/ feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction, Vol. 24, No. 3pp. 580-589,2009 ；Martin-Ibanez 等人，Novel cryopreservation method for dissociated human embryonic stem cells in the presence of a ROCK inhibitor. Human Reproduction. Vol. 23. No. 12 pp.2744-2754，2008 ;Claassen 等 A, ROCK Inhibition Enhances the Recovery and Growth of Cryopreserved Human Embryonic Stem Cells and Human Induced Pluripotent Stem Cells. Molecular Reproduction & Development 2009)。然而，在所有情况下，它均用于在Matrigel上的人胚胎干细胞的2D 培养的背景下使用。使用Matrigel涂覆的微载体，我们先前已通过连续传代在灵长类未分化的多潜能细胞(包括人胚胎干细胞和人诱导性多潜能细胞)的悬液中实现了稳定和连续的生长(在Oh等人，2009中有部分报道，并且在2009年3月17日提交的美国专利申请US 61/069694、2008 年 10 月 31 日提交的 US 61/110256、2009 年 1 月四日提交的 US 61/148064 和2009年2月27日提交的US 61/155940中进一步加以说明)。然而，迄今为止，使用不具有细胞外基质衍生材料的表面涂层的微载体尚未获得该结果。自此，Lock等人已说明了 hESC在Matrigel涂敷的微载体上的生长，但是没有iitil专代(Lock 等人，expansion and Differentiation of Human Embyronic StemCells to Endoderm Progeny in a Microcarrier Stirred-Suspension Culture. Tissue Engineering =Part A Vol. 15, No. 002009)而Nie等人研究了 hESC在具有基质涂层或饲养细胞层的微载体上的生长(Nie 等人，Scalable Culture and Cryopreservation of Human Embyronic Stem Cells on microcarriers. Biotechnol. Prog. ,2009, Vol.25, No. 1)。

发明内容
本发明人现已发现在存在ROCK的情况下在不具有基质涂层的微载体上可以成功培养和传代多潜能干细胞，并同时维持所培养和传代细胞的多潜能状态。本发明提供了在存在ROCK抑制剂的情况下，在体外培养中稳定并且长期培养多潜能和多能细胞的方法。使用这种方法，已经使人胚胎干细胞扩增并传代，并且所扩增和传代的人胚胎干细胞群体的多潜能性已维持超过了至少9次传代。因此，本发明的一个方面涉及在悬浮培养中多潜能或多能细胞在微载体上的生长和增殖。该方法可以包括通过一次或多次传代的培养，并同时保持细胞在培养中各自的多潜能或多能状态。在存在ROCK抑制剂的情况下进行培养，其中ROCK抑制剂可以作为培养补充剂或添加剂加入到培养基中。通过在培养中加入ROCK抑制剂，本发明人发现不是必须用基质(例如，细胞外基质材料)涂覆微载体表面。到目前为止，已经认为这是维持悬浮微载体培养的多潜能或多能细胞，特别是人或灵长类胚胎干细胞以及人或灵长类诱导性多潜能细胞的多潜能或多能状态的必要要求。用多潜能或多能细胞接种微载体。然后，在悬浮培养中培养微载体-细胞复合物， 优选地以扩增在培养中的多潜能或多能细胞的数目。培养的细胞可以传代，并且还可以将传代的细胞接种在微载体上，例如，用于进一步的培养或用于分化。以这种方式，可以通过多次传代，例如，至少2次传代来获得多潜能或多能细胞， 其中所培养和传代的细胞保持各自的多潜能或多能状态。使用这种方法，在每次传代之间的每个培养循环中，观察到了多潜能或多能细胞的增殖并且它可以维持多次传代(至少9 次)。这种培养法允许在体外培养中使多潜能或多能细胞连续生长和传代，借此提供了用于将多潜能或多能细胞扩增至治疗有用数目的方法。尽管多潜能或多能细胞在微载体上的连续传代通常将是优选的，但是作为本发明方法的一部分，可以将多潜能或多能细胞从微载体上的培养中转移到其它培养系统(例如，2D集落培养)中，然后返回悬浮微载体培养。在一些实施方式中，用基质涂覆微载体，优选地，用具有细胞外组分的基质。在一些实施方式中，所述微载体是带正电荷的。所述方法优选地包括在传代之前，在每个培养循环期间将多潜能或多能细胞连接至微载体的步骤。允许在未涂敷的微载体上进行一些培养循环，而在涂覆基质的微载体上进行其它循环。尽管多潜能或多能细胞在微载体上的连续传代通常将是优选的，但是作为本发明方法的一部分，可以将培养的细胞从微载体上的培养中转移到其它培养系统(例如，2D集落培养)中，然后返回悬浮微载体培养。
本发明的另一个方面涉及在存在ROCK抑制剂的情况下，悬浮培养中的连接到微载体上的多潜能或多能细胞的分化。在一些实施方式中，通过使用如上所述的微载体培养法可以使多潜能或多能细胞生长至分化所需的细胞密度。一旦获得所需的细胞密度，可以改变培养条件以诱导连接至微载体的多潜能或多能细胞的分化。对于分化来说，与用于多潜能或多能细胞生长的那些相比，可以使用相同或不同的微载体。类似地，在使用基质涂层的情况下，可以使用相同或不同的基质涂层。例如，具有第一涂层的第一微载体可以用于多潜能或多能细胞的生长和增殖而具有第二涂层的第二微载体可以用于那些细胞的分化。第二微载体可以是未涂覆的或可以是涂覆基质的表面。对于多潜能或多能细胞的增殖以及对于它们的分化来说，微载体培养的使用具有以下优势不再需要重新接种分化培养，增殖培养提供了大量用于分化的多潜能或多能细胞以及通过改变培养条件便于从增殖向分化转变。在其它实施方式中，通过其它培养法(例如，通过2D集落培养)，可以使用于分化的多潜能或多能细胞生长至所需的细胞密度。然后，将那些细胞连接到微载体上并在存在 ROCK抑制剂的情况下，在诱导多潜能或多能细胞分化的条件下，在悬浮培养中进行培养。在一些实施方式中，可以将已经历分化的多潜能或多能细胞(但优选地，未终末分化)连接到微载体上并且在存在ROCK抑制剂的情况下，在诱导细胞分化的条件下，在悬浮培养中进行培养。在本发明的方法中，优选地允许ROCK抑制剂接触正在培养或分化的细胞。还优选地允许ROCK抑制剂接触连接了或要连接细胞的微载体。为了允许这种接触，优选液体、流体、凝胶或其它可流动的培养基。在本发明的一个方面，提供了体外培养多潜能或多能细胞的方法，该方法包括(i)将多潜能或多能细胞连接到多个微载体上以形成微载体-细胞复合物，和(ii)在存在ROCK抑制剂的情况下，在悬浮培养中培养该微载体-细胞复合物。在一些实施方式中，该方法还包括使来自(ii)的培养的细胞传代，其中传代后的细胞是多潜能或多能的。在一些实施方式中，该方法还包括(iii)使来自(ii)的培养的细胞传代；和(iv)经过(through)至少2次传代，重复步骤(i)-(iii)，其中在步骤(iv)之后培养的细胞是多潜能或多能的。在一些实施方式中，在每个重复周期中，从先前重复周期的步骤(iii)的传代细胞中获得了步骤(i)的干细胞。在步骤(iv)中，可以经过下列之一重复步骤(i)-(iii)至少传代3次、至少传代 4次、至少传代5次、至少传代6次、至少传代7次、至少传代8次、至少传代9次、至少传代 10次、至少传代11次、至少传代12次、至少传代13次、至少传代14次、至少传代15次、至少传代16次、至少传代17次、至少传代18次、至少传代19次、至少传代20次、至少传代21 次、至少传代22次、至少传代23次、至少传代M次、至少传代25次、至少传代30次、至少传代40次、至少传代50次、至少传代60次、至少传代70次、至少传代80次、至少传代90 次、至少传代100次。在一些实施方式中，在步骤(ii)中，将细胞培养足以使培养中的细胞数目扩增的一段时间。在一些实施方式中，在步骤(iv)后，至少60%的培养的细胞是多潜能或多能的。 在一些实施方式中，在步骤(iv)后，至少60%的培养的细胞表达0ct4、SSEA4、TRA-l-60和 Mab84中的一种、两种、三种或全部。在一些实施方式中，在规定的传代次数后，增殖细胞优选地保留了多潜能或多能细胞的至少一种生物活性。该生物活性可以选自(i)多潜能标志物的表达、(ii)细胞存活率、(iii)正常染色体组型，(iv)分化为内胚层、外胚层或中胚层的能力。该生物活性可以包括多潜能标志物的表达，其选自0CT-4、SSEA-4、TRA-1-60和Mab84。在一些实施方式中，该方法包括在无血清培养基、或干细胞条件培养基(stem cell conditioned media)或无饲养细胞的条件下培养细胞。无饲养细胞的条件可以包括在悬浮培养中的微载体上不存在涂覆的饲养细胞和/或悬浮培养中完全不存在饲养细胞。在一些实施方式中，还将饲养细胞连接到微载体上。在一些实施方式中，培养还包括连接到与多潜能或多能细胞所连接的微载体不同的微载体上的饲养细胞(或，培养还包括将饲养细胞连接到与多潜能或多能细胞所连接的微载体不同的微载体上)。根据本发明的方法可以包括传代至替代培养系统(例如，2D培养)或从替代培养系统传代。细胞可以(例如)冻融储存以有利于在培养系统之间转移。在一些实施方式中，可以在其它颗粒/表面上将多潜能或多能细胞培养有限的一段时间。例如，在回到存在ROCK抑制剂的微载体上的培养之前，可以在替代培养系统(例如，在2D培养)中将来自步骤(ii)或(iii)的多潜能或多能细胞培养有限的传代次数(例如，小于5次，更优选地，小于3次，更优选地，1次)。在其它实施方式中，在回到根据本发明的悬浮培养之前，可以从该培养法中除去多潜能或多能细胞并(例如，作为冷冻细胞)保存。可以在存在ROCK抑制剂的情况下保存 (例如，冷冻)细胞。在这些实施方式中，回到根据本发明的悬浮培养中不需要回到相同的培养中。根据本发明的悬浮培养甚至可以在不同的地理位置上继续，例如，在细胞冷冻和运输后。根据本发明的方法还可以包括将人胚胎干细胞与微载体分离的步骤。在一些实施方式中，该方法包括诱导从培养中获得的多潜能或多能细胞分化的步骤。因此，在一些实施方式中，该方法包括将微载体-细胞复合物置于诱导这些细胞分化的条件下。在一些实施方式中，该方法包括将获自该培养法的多潜能或多能细胞与微载体分离并且在诱导这些细胞分化的条件下在非微载体培养中培养所述分离的细胞的步骤。在一些实施方式中，该方法还包括获自该培养法的多潜能或多能细胞的体外分化，其包括(a)将获自该培养法的多潜能或多能细胞连接到多个第二微载体上以形成微载体-细胞复合物，(b)在诱导细胞分化的条件下，在悬浮培养中培养来自(a)的微载体-细胞复合物。该方法还可以包括(c)将获自步骤(b)的分化的细胞连接到多个第三微载体上以形成微载体-细胞复合物；和
(d)在诱导已分化细胞再分化的条件下，在悬浮培养中培养来自(C)的微载体-细胞复合物。在一些实施方式中，分化培养条件包括在存在ROCK抑制剂的情况下培养细胞。在其它实施方式中，分化培养条件包括在不存在ROCK抑制剂的情况下培养细胞。提供了通过本发明方法获得的多潜能或多能细胞。还提供了通过本发明方法获得的分化细胞。在一些实施方式中，培养通过本发明方法获得的分化细胞以形成拟胚体。因此，还提供了由此所获得的拟胚体(embryoid body)。在本发明的一个方面，提供了使多潜能或多能细胞体外分化的方法，该方法包括将多潜能或多能细胞连接到多个微载体上以形成微载体-细胞复合物，其中微载体的表面未涂覆或涂覆了基质；和在存在ROCK抑制剂的情况下并且在诱导细胞分化的条件下，在悬浮培养中培养微载体-细胞复合物。在本发明的另一个方面，提供了多潜能或多能细胞的悬浮培养，其中将所述细胞连接到多个微载体上，借此形成了微载体-细胞复合物，并且所述悬浮培养基包含ROCK抑制剂。在一些实施方式中，提供了用于使多潜能或多能细胞增殖(包括悬浮培养)的容器(例如，生物反应器)或装置。所述悬浮培养可以是旋转悬浮培养(spinner suspension culture)。在一些实施方式中，ROCK抑制剂以下列一种浓度存在于培养基中至少1 μ Μ、至少2 μ Μ、至少3 μ Μ、至少4 μ Μ、至少5 μ Μ、至少6 μ Μ、至少7 μ Μ、至少8 μ Μ、至少9 μ Μ、至少 10 μ Μ、至少15 μ Μ、至少20 μ Μ、至少30 μ Μ、至少40 μ M或至少50 μ Mo ROCK抑制剂可以任选地以小于下列一种浓度存在于培养基中100 μ Μ、90 μ Μ、80 μ Μ、70 μ M或60 μ Μ。在本发明的其它方面，提供了 ROCK抑制剂在多潜能或多能细胞的体外悬浮培养中的应用，其中这些细胞处于微载体-细胞复合物的形式。在本发明的另一个方面，提供了 ROCK抑制剂在体外悬浮培养的多潜能或多能细胞的分化中的应用，其中这些细胞处于微载体-细胞复合物的形式。在本发明的其它方面，提供了使多潜能或多能细胞增殖的方法，该方法包括以下步骤(a)提供微载体；(b)使多潜能或多能细胞连接至所述微载体；和(c)使在其上连接有多潜能或多能细胞的微载体聚集以由此使多潜能或多能细胞增殖，其中在步骤(a)、(b)或(C)的一个或多个步骤中或全部步骤中，将微载体和/或细胞与ROCK抑制剂接触。在本发明的另一个方面，提供了使多潜能或多能细胞增殖的方法，该方法包括(a)提供连接至第一微载体的第一多潜能或多能细胞；(b)提供连接至第二微载体的第二多潜能或多能细胞；(c)使第一多潜能或多能细胞与第二多潜能或多能细胞接触以形成细胞聚集体； 和(d)在存在ROCK抑制剂的情况下，培养该聚集体以使多潜能或多能细胞增殖至少1代。在本发明的另一个方面，提供了使多潜能或多能细胞增殖的方法，该方法包括以下步骤(a)提供其上连接了多潜能或多能细胞的第一微载体；(b)使第一微载体与包含与其连接的第二多潜能或多能细胞的第二微载体接触以形成聚集体；和(c)在存在ROCK抑制剂的情况下，培养该聚集体。在本发明的另一个方面，提供了使多潜能或多能细胞增殖的方法，该方法包括以下步骤(a)提供具有与其连接的多潜能或多能细胞的多个微载体；(b)使所述多个微载体聚集以形成聚集体；和(c)在存在ROCK抑制剂的情况下，培养该聚集体。在本发明的方面和实施方式中，ROCK抑制剂优选地选自Y-27632、ΗΑ_1077(法舒地尔)、HA-1100 (羟基法舒地尔)、H-1152、3- (4-吡啶基)-IH-吲哚、N- (4-吡啶基)-N' _(2，4，6_三氯苯基)脲、金硫葡糖(Aurothioglucose)、LY^4002或其盐、碱、酯或前药。在优选的实施方式中，所述微载体不具有基质涂层。在其它实施方式中，微载体的表面可以涂覆基质。所述基质可以包括细胞外基质组分并且可以是MatrigelTm(BD Biosciences)、透明质酸、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、胶原、弹性蛋白、硫酸乙酰肝素(硫酸肝素，h印aran sulphate)、葡聚糖、硫酸葡聚糖、硫酸软骨素中的一种或多种。所述基质可以包括层粘连蛋白、I型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖和内功素Kentactin 1，内动蛋白1)的混合物。在一些实施方式中，多潜能或多能细胞是干细胞，并且可以是胚胎干细胞、诱导性多潜能干细胞或成体干细胞。所述细胞可以是哺乳动物(例如，兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它啮齿动物(包括来自啮齿目中任何动物的细胞)、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛、马、非人哺乳动物、非人灵长类)、灵长类或人。在本发明的方面和实施方式中，所述微载体可以包括纤维素、葡聚糖、羟基化甲基丙烯酸酯、胶原、明胶、聚苯乙烯、塑料、玻璃、陶瓷、硅酮中的一种或多种或者由其组成。可替换地，微载体可以是大孔或微孔Carboseed微载体。在一些实施方式中，微载体偶联了鱼精蛋白或聚赖氨酸。在一些实施方式中，微载体是带正电荷的。在一些实施方式中，微载体带有表面正电荷。在一些实施方式中，微载体是亲水性的。在一些实施方式中，微载体是杆状的。在其它实施方式中，微载体具有基本球形形状。根据本发明的方法可以包括细胞培养的连续或间歇搅拌，例如，从约5至约 200rpm、从约5至约150rpm、从约5至约lOOrpm、约30rpm或以上，或约50rpm或以上，或约 IOOrpm或以上。可替换地，这些方法可以包括静态培养。在一些实施方式中，搅拌速率或量的提高可以用于诱导细胞分化，然而较低的搅拌速率或量可以用于使多潜能或多能细胞群体扩增而不诱导显著分化。为了培养多潜能或多能细胞群体而不诱导显著分化，可以采用从约5rpm至约lOOrpm、从约5rpm至约50rpm、从约5rpm至约40rpm、从约5rpm至约30rpm、从约5rpm至约 25rpm、从约5rpm至约20rpm、从约5rpm至约15rpm、从约5rpm至约IOrpm的转速对培养物
进行搅拌。对于显著分化的诱导来说，可以采用从约25rpm至约200rpm或以上的转速对培养物进行搅拌，例如，从约30rpm至约200rpm或以上、从约35rpm至约200rpm或以上、从约 40rpm至约200rpm或以上、从约45rpm至约200rpm或以上、从约50rpm至约200rpm或以上、从约75rpm至约200rpm或以上、从约IOOrpm至约200rpm或以上。细胞的显著分化可以包括至少约10%的培养的细胞分化的情况。可替换地，这可以是其中约15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%中至少之一的培养(或在培养中)的细胞分化的情况。因此，本发明的方法可以包括以第一搅拌速率或量进行方法的第一部分以培养细胞并同时保持它们的多潜能或多能状态，然后进行其中以第二搅拌速率或量来培养细胞以使在培养中的细胞分化的第二部分。第一速率或量优选地小于第二速率或量。因此，该方法的第一部分可以使多潜能或多能细胞群体扩增而该方法的第二部分可以开始那些细胞的一些或全部向内胚层、外胚层或中胚层系分化的过程。在本发明的其它方面，提供了对需要治疗的个体中的疾病进行治疗的方法，该方法包括根据本文所述的方法使多潜能或多能细胞增殖，产生分化的细胞或拟胚体并且将该多潜能或多能干细胞、分化的细胞或拟胚体施用到所述个体中。
具体实施例方式在以下所附说明中说明了本发明的一个或多个实施方式的详细信息，举例来说， 包括本发明人对实施本发明所考虑的最佳方式的具体详细信息。对于本领域技术人员显而易见的是可以在不受这些具体详细信息的限制的情况下实践本发明。结果总结我们已开发了在不存在基质涂层(例如，Matrigel)的情况下，使用多种微载体 (DE53、QA52、Tosoh, Cytodex 1、Cytodex 3)在存在 ROCK 抑制剂补充剂(例如，Y27632、 HA1077 (法舒地尔)或金硫葡糖)的情况下在微载体上培养hESC连续传代超过5次的方法。传代5次或5次以上后，hESC保持了它们的生长、最终细胞密度、多潜能标志物0ct4、 Mab84和TRA-1-60的表达以及正常染色体组型。这改善了我们在使用一系列微载体涂层的情况下使用微载体培养多潜能和多能细胞的早期工作(在Oh等人，2009中有部分报道并且在2009年3月17日提交的美国专利申请US 61/069694,2008年10月31日提交的US 61/110256,2009年1月四日提交的US 61/148064和2009年2月27日提交的US 61/155940中进一步说明，所有文献作为参考并入本文)。由于不再需要用Matrigel、动物来源基质或其它细胞外基质组分涂覆微载体以实现多潜能hESC的扩增和分化，因此本发明方法是特别有前途的。这将有助于开发在研究、 治疗和诊断应用中使用的扩增和分化hESC以及其它多潜能和多能细胞的符合GMP的方法。具体地，我们已表明1、使用ROCK抑制剂Y-27632，在纤维素DE53微载体上将hESC长期培养9周(传
12代9次)(

图1)。2、使用ROCK抑制剂Y-27632，在球形Tosoh微载体上将hESC长期培养6周(传代 6次)(图4)。3、使用 ROCK 抑制剂 Y-27632，将 hESC 在纤维素 DE53、Tosoh、Cytodex 1 和 Cytodex 3微载体上长期培养5周(传代5次)之间的比较。4、使用ROCK抑制剂Y-27632，在5至10周之间在纤维素DE53、QA52、Tosoh和 Cytodex 3微载体上的hESC的正常染色体组型(图10和11)。5、使用替代ROCK抑制剂HA1077 (法舒地尔)和金硫葡糖，在纤维素DE53微载体上将hESC培养2周(图12-14)。干细胞的悬浮培养和传代我们先前已证明在具有基质涂层的颗粒上培养、增殖和传代灵长类和人干细胞和 iPS细胞是可能的。具体地，我们已表明干细胞可以在悬浮培养中在基质涂覆的微载体上连续生长和传代。我们现在描述了在存在ROCK抑制剂的情况下在悬液中使干细胞增殖的方法。所述增殖方法可以包括使干细胞生长、增殖、繁殖、培养、扩增或增加。如下所述，增殖的干细胞能够传代1次或以上。可以通过使用具有某些性质的微载体或颗粒实现这种增殖。微载体或颗粒可以包含电荷。微载体或颗粒可以任选地包含涂层。其它性质可以包括尺寸。增殖干细胞的方法可以包括提供颗粒的步骤。所述颗粒可以是未涂覆的或可以包含涂覆其上的基质。它们可以具有正电荷。颗粒可以具有允许与其连接的灵长类或人干细胞聚集的尺寸。允许干细胞连接到所述颗粒上。允许在不同颗粒上生长的细胞彼此接触并形成聚集体。培养物传代至少1个传代。可以使用与载体连接的干细胞或与它们分离或分开的干细胞。它们可以以未分化或多潜能状态或以两种状态使用，或者可以分化成所需的细胞类型。它们可以用于形成拟胚体。为了使颗粒支持连续生长，它们应具有与灵长类或人干细胞的尺寸相适应的尺寸， 如 10 μ m、20 μ m、30 μ m、40 μ m、50 μ m、60 μ m、70 μ m、80 μ m、90 μ m、100 μ m、110 μ m、 120 μ m、130 μ m、140 μ m、150 μ m、160 μ m、170 μ m、180 μ m、190 μ m、200 μ m、210 μ m、220 μ m、 230 μ m、240 μ m、250 μ m等。灵长类或人干细胞在具有这种尺寸水平的颗粒上的培养将能够使细胞在其上生长以彼此聚集并支持连续生长。以下进一步详细说明了颗粒的适合组合物、形状和尺寸。实施例显示可以将干细胞培养(如人胚胎干细胞2D集落培养)接种到微载体颗粒上并在存在ROCK抑制剂的情况下通过一次或多次传代来生长数代。可以通过如机械或酶促解离或两种方法组合的任何方式从表面移出而使干细胞传代。在颗粒上，微载体颗粒培养物可以世代生长。可替换地或另外，培养物可以在常规 2D培养上生长一代或多代。可以将在微载体上生长的人干细胞转移回到2D集落培养中，反之亦然。本发明所述的方法是未分化形式的干细胞的有效增殖的可用方法。可以通过机械或酶促解离以1 2至1 10的分种率(比常规2D培养可能的比值要高)将微载体培养传代到微载体上。这使得能够以更快速的扩大培养来更有效地利用生物材料。微载体培养中的细胞体积得率通常是2D集落对照的2至4倍。通过本发明所述的方法增殖的人干细胞的体积得率可以高达200万个细胞/毫升或以上。本发明所述的方法能够使人干细胞在颗粒之间传代9次或以上，如下文中将进一步详细说明的。本发明所述的方法能够使保持其多潜能特征的干细胞增殖。实施例显示根据本发明所述的方法和组合物所增殖的人胚胎干细胞能够维持干细胞的一种或多种生物学特征。 因此，增殖的干细胞显示了对于5次或以上的传代多潜能标志物(Oct-4、Tra-1-60和mAb 84)的表达，这与作为2D集落培养所生长的干细胞等同，并且增殖的干细胞保留了正常染色体组型。显著地，通过将干细胞锚定在微载体上，有可能在较大规模的转瓶中使细胞连续传代。可以使用本发明所述的方法使任何干细胞增殖。这些可以包括灵长类干细胞，如猴、猿或人干细胞。所述干细胞可以包括胚胎干细胞或成体干细胞。所述干细胞可以包括诱导性多潜能干细胞。例如，所述干细胞可以包括人胚胎干细胞(hESC)。在下文中将进一步详细说明适合在本发明所述方法和组合物中使用的这些和其它干细胞。与已知的“2D” 培养法相比，本发明所述的方法和组合物具有多种优势。所述颗粒在连接干细胞方面比2D 集落培养基底更有效。出于这种及其它原因，悬浮培养的细胞能够更有效地传代。本发明所述的方法能够使干细胞冻融(冷冻和解冻)几个循环。它们可以直接在微载体上冷冻并融化到生长培养基(无论是常规平板培养或是在颗粒微载体上)中。在微载体上增殖的干细胞可以在符合GMP的无血清培养基中生长。本发明所述的方法基本能够培养和维持未分化状态的干细胞，如胚胎干细胞。培养(例如，在微载体上)的或从其上分离的增殖的干细胞可以是部分或完全分化的。增殖的干细胞可以用于形成拟胚体以备今后使用。与需要在拟胚体形成之前从2D 生长表面上除去细胞的额外步骤的在先方法不同，可以简单地将在微载体上生长的干细胞转移到分化培养基中以直接形成拟胚体。因此，本发明所述的方法和组合物能够使生长表面或基底上的干细胞定向分化而不需要将干细胞从生长表面或基底中除去。本发明所述的方法和组合物能够使培养的干细胞扩增并放大至较大体积。放大至生物反应器或工业规模使得能够更高产地培养干细胞。在搅拌培养中，使干细胞能够在微载体上生长的能力意味着可以将培养放大至悬浮条件。可以使用如Wave生物反应器的可控生物反应器或搅拌培养。与当前锚定依赖性2维集落培养的限制相比，这使得细胞能够在较大的体积中扩增。在高达100升的生物反应器中进行大规模悬浮培养是有可能的。ROCK 抑制剂根据本发明的方法涉及在存在ROCK抑制剂的情况下，多潜能或多能细胞的培养、 生长、增殖、繁殖、群体扩增和/或分化。ρ激酶(P -相关卷曲螺旋激酶或ROCK ；GenBank登录号No. NM_005406)、丝氨酸 /苏氨酸激酶，用作P的靶蛋白(其中存在三种同种型PA、PB和PC)并且已被鉴定为形成PA诱导性应力纤维和局部粘附的介体。最初ROCK I (可替换地，称为ROK b)和ROCK II (还被称为P激酶或ROK a)被分离出来作为PA-GTP相互作用蛋白。这两种激酶在人中具有64%的整体同一性，其中催
14化激酶域中的同一性为89%。两种激酶均含有卷曲螺旋区(55%的同一性)和被Cl保守区分开的血小板-白细胞C激酶底物同源性(PH)域(80%的同一性)。有关ROCK激酶抑制的综述，参见 Olson 等人(Current Opinion in Cell Biology 2008，20 :242_248，其作为参考并入本文)。通过下游靶蛋白的磷酸化作用，ROCK促进肌动蛋白-肌球蛋白-介导的收缩力的产生。ROCK使LIM激酶-1和激酶-2 (LIMK1和LIMK2)在它们的激活环中的保守苏氨酸处发生磷酸化，从而提高了 LIMK活力，并且随后使丝切蛋白磷酸化，从而阻断了它们的纤维型肌动蛋白切割活力。ROCK还直接使MLC磷酸酶的调控肌球蛋白轻链(MLC)和肌球蛋白结合亚基(MYPTl)磷酸化以抑制催化活力。ROCK的激活导致发生了促进作用力产生和形态变化的一系列事件。这些事件直接促使多个肌动蛋白-肌球蛋白介导的过程，如细胞运动、粘附、平滑肌收缩、轴突回缩和噬菌作用。另外，ROCK激酶在繁殖、分化、细胞凋亡和致癌性转化中起作用，尽管这些应答可以是细胞类型依赖性的。在本说明书中，“ROCK抑制剂”是能够抑制ROCK I和/或ROCK II的分子、化合物、物质或组合物，并且优选地具有小于100 μ M的IC5tl，更优选地，小于10 μ Μ,更优选地，小于1 μ Μ，并且更优选地，小于900ηΜ或者小于或等于约800ηΜ、700ηΜ、600ηΜ或500ηΜ之一。 在本发明中有用的ROCK激酶的IC5tl可以与Υ-27632的基本相同或更优(S卩，更小)或者在 Υ-27632的IC5tl(500ηΜ)之内，如在相同ROCK激酶测定中所测量的。在本说明书中，“R0CK抑制剂”还指金硫葡糖和LY^4002，其主要已知是NFK B和 PI3激酶的抑制剂。照此，在本发明所述的方面和实施方式中的ROCK抑制剂的使用包括 NF κ B禾Π /或ΡΙ3激酶的抑制剂的使用。在本领域中，ROCK激酶抑制测定是熟知的。例如，HTScan R0CK2激酶测定试剂盒 #7508 (Cell Signalling Technology, Inc.)和 R0CK-II 测定试剂盒产物 No. R8163 和 R8164(Molecular Devices)。在本发明的方法中，加入到培养中的ROCK抑制剂的量通常将考虑生产商的说明书和培养规模。例如，ROCK抑制剂的典型浓度将在10-50 μ M的范围内。可以将ROCK抑制剂定期加入到培养基中(例如，每日一次)以维持所需的浓度。可以将ROCK抑制剂加入到培养基中从而使培养基中ROCK抑制剂的浓度为下列之一至少1 μ Μ、至少2 μ Μ、至少3 μ Μ、至少4 μ Μ、至少5 μ Μ、至少6 μ Μ、至少7 μ Μ、至少8 μ Μ、 至少9 μ Μ、至少10 μ Μ、至少15 μ Μ、至少20 μ Μ、至少30 μ Μ、至少40 μ M或至少50 μ Μ。ROCK 抑制剂可以任选地以小于下列之一的浓度存在于培养基中100 μ Μ、90 μ Μ、80 μ Μ、70 μ M 或 60 μ Μ。ROCK抑制剂可以作为活性剂的盐、碱、酯或前体药物提供。ROCK抑制剂的实例包括(A) Υ-27632Υ-27632是ROCK I和ROCK II的高效、细胞可渗透、选择性和ATP竞争性抑制剂， 其IC50为约SOOnM并且具有结构(1)，如下
Y-27632通常作为二盐酸化物[(R)_(+)_反式-N_(4-吡啶基)-4-(1-氨乙基)_环己烷羧酰胺.2HC1]生产和销售。在下列发表的论文中对Y-27632进行了综述，所有文献作为参考并入本文· Calcium sensitization of smooth muscle mediated by a Rho-associated protein kinase in hypertension :M. Uehata,et al. ；Nature 389,990(1997)· Molecular dissection of the Rho-associated protein kinase(pl60R0CK)-regulated neurite remodeling in neuroblastoma Nl E-115 cells M. Hirose, et al. J. Cell Biol.141，1625 (1998)· Signaling from Rho to the actin cytoskeleton through protein kinases ROCK and LIM-kinase :M. Maekawa,et al. ；Science 285,895(1999)· Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors :S. P. Davies, et al. ；Biochem. J. 351,95 (2000)· Use and properties of ROCK-specific inhibitor Y-27632 :S.Narumiya, et al. ；Meth. Enzymol. 325, 273 (2000)· Pharmacological properties of Y-27632, a specific inhibitor of rho-associated kinases :T.Ishizaki，et al. ；Mol· Pharmacol· 57,976(2000)·Α pl60R0CK_specific inhibitor,Y-27632,attenuates rat hepatic stellate cell growth :H. Iwamoto, et al. ； J. Hepatol. 32, 762 (2000)· Y-27632, an inhibitor of rho-associated protein kinase， suppresses tumor cell invasion via regulation of focal adhesion and focal adhesion kinase F. Imamura, et al. ；Jpn. J. Cancer Res. 91,811 (2000) · The effect of a Rho kinase inhibitor Y-27632 on superoxide production， aggregation and adhesion in human polymorphonuclear leukocytes :A. Kawaguchi，et al. ；Eur. J. Pharmacol. 403,203 (2000)· Antagonism of Rho-kinase stimulates rat penile erection via a nitric oxide-independent pathway :K.Chitaley,et al. ；Nat. Med. 7,119(2001)· Inhibition of intrahepatic metastasis of human hepatocellular carcinoma by Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632 :M. Takamura, et al. ；Hepatology 33,577(2001)· Inhibition of high K+_induced contraction by the ROCKs inhibitor Y-27632 in vascular smooth muscle :possible involvement of ROCKs in a signal transduction pathway :K.Sakamoto, et al. ； J. Pharmacol. Sci. 92,56(2003).Φ)ΗΑ_1077(法舒地尔)HA-1077是肌球蛋白轻链激酶和Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II的抑制剂。它抑制ΡΚ β Ι.ΡΚ β II和PKC(的易位并且是具有抗血管痉挛性质的细胞可渗透Ca2+拮抗剂。 它的分子量为约四1. 36。它通过与ATP竞争抑制R0CK。对于ROCK 1的IC5ci为1. 2_ol/ 1，而对于R0CK2的IC5ci为0. 82mmol/l0它还对其它丝氨酸/苏氨酸激酶具有非特异性抑制作用，例如，对于PKA的IC5ci为5.3mmol/l，对于I5KCa的IC5C)> 100mmol/l。该二盐酸化
物具有结构(2)，如下:
权利要求
1.体外培养多潜能或多能细胞的方法，所述方法包括(i)将多潜能或多能细胞连接至多个微载体上以形成微载体-细胞复合物，以及( )在存在ROCK抑制剂的情况下，在悬浮培养中培养所述微载体-细胞复合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述ROCK抑制剂选自Y-27632、HA-1077(法舒地尔)、HA-1100(羟基法舒地尔)、!1-1152、3-(4-吡啶基)-1!1-吲哚力44-吡啶基)4' -(2， 4，6-三氯苯基)脲、金硫葡糖、LY^4002或其盐、碱、酯或前药。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法还包括使来自(ii)的所述培养的细胞传代，其中传代后的细胞为多潜能或多能的。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法还包括(iii)使来自(ii)的所述培养的细胞传代；和(iv)经过至少2次传代，重复步骤(i)-(iii)，其中，在步骤(iv)之后培养的细胞是多潜能或多能的。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述微载体不具有基质涂层。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述微载体的表面涂覆有基质。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述基质包括细胞外基质组分。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述基质包括MatrigelTM(BDBiosciences)、透明质酸、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、胶原、弹性蛋白、硫酸乙酰肝素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、硫酸软骨素中的一种或多种。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述基质包括层粘连蛋白、I型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖和内功素1的混合物。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述细胞为干细胞。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述细胞为胚胎干细胞。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述细胞为诱导性多潜能干细胞。
13.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述细胞为成体干细胞。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物、灵长类或人。
15.根据权利要求4至14中任一项所述的方法，其中在步骤(iv)中，经过下列之一重复步骤(i)-(iii)至少传代3次、至少传代4次、至少传代5次、至少传代6次、至少传代7 次、至少传代8次、至少传代9次、至少传代10次、至少传代11次、至少传代12次、至少传代13次、至少传代14次、至少传代15次、至少传代16次、至少传代17次、至少传代18次、 至少传代19次、至少传代20次、至少传代21次、至少传代22次、至少传代23次、至少传代 24次、至少传代25次、至少传代30次、至少传代40次、至少传代50次、至少传代60次、至少传代70次、至少传代80次、至少传代90次、至少传代100次。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述微载体包含纤维素、葡聚糖、 羟基化甲基丙烯酸酯、胶原、明胶、聚苯乙烯、塑料、玻璃、陶瓷、硅酮中的一种或多种，或者由纤维素、葡聚糖、羟基化甲基丙烯酸酯、胶原、明胶、聚苯乙烯、塑料、玻璃、陶瓷、硅酮中的一种或多种组成。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述微载体为大孔或微孔 carboseed 微载体。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述微载体偶联有鱼精蛋白或聚赖氨酸。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述微载体带正电荷。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述微载体带正表面电荷。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述微载体是亲水性的。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述微载体是杆状的。
23.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述微载体具有基本球形形状。
24.根据权利要求1至M中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)中，将所述细胞培养足以使在培养中的细胞的数目扩增的一段时间。
25.根据权利要求4至M中任一项所述的方法，其中在步骤(iv)之后，至少60%的在培养中的细胞是多潜能或多能的。
26.根据权利要求4至25中任一项所述的方法，其中在步骤(iv)之后，至少60%的在培养中的细胞表达0ct4、SSEA4、TRA-1-60和Mab84中的一种、两种、三种或全部。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述方法包括在无血清培养基、或干细胞条件培养基或无饲养细胞条件下培养所述细胞。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中还将饲养细胞连接到所述微载体上。
29.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述培养还包括连接到与所述多潜能或多能细胞所连接的微载体不同的微载体上的饲养细胞。
30.根据权利要求1至四中任一项所述的方法，还包括诱导获自所述培养的多潜能或多能细胞的分化。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述方法包括将所述微载体-细胞复合物置于诱导所述细胞分化的条件下。
32.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述方法包括将获自所述培养法的多潜能或多能细胞与所述微载体分离，并且在诱导所述细胞分化的条件下在非微载体培养中培养所述分离的细胞的步骤。
33.根据权利要求1至四中任一项所述的方法，还包括获自所述培养法的多潜能或多能细胞的体外分化，其包括(a)将获自所述培养法的多潜能或多能细胞连接至多个第二微载体上以形成微载体-细胞复合物，(b)在诱导所述细胞分化的条件下，在悬浮培养中培养来自(a)的所述微载体-细胞复合物。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述方法还包括(c)将获自步骤(b)的分化的细胞连接至多个第三微载体上以形成微载体-细胞复合物；和(d)在诱导已分化细胞进一步分化的条件下，在悬浮培养中培养来自(c)的所述微载体-细胞复合物。
35.根据权利要求30至34中任一项所述的方法，其中所述分化培养条件包括在存在 ROCK抑制剂的情况下培养所述细胞。
36.根据权利要求30至34中任一项所述的方法，其中所述分化培养条件包括在没有 ROCK抑制剂的情况下培养所述细胞。
37.通过根据权利要求1至四中任一项所述的方法获得的多潜能或多能细胞。
38.通过根据权利要求30至36中任一项所述的方法获得的分化细胞。
39.根据权利要求30至36中任一项所述的方法，其中培养所述分化的细胞以形成拟胚体。
40.通过根据权利要求39所述的方法获得的拟胚体。
41.一种使多潜能或多能细胞体外分化的方法，所述方法包括将多潜能或多能细胞连接至多个微载体上以形成微载体-细胞复合物，其中所述微载体的表面未涂覆或涂覆有基质，以及在存在ROCK抑制剂的情况下和在诱导所述细胞分化的条件下，在悬浮培养中培养所述微载体-细胞复合物。
42.多潜能或多能细胞的悬浮培养，其中将所述细胞连接到多个微载体上，由此形成微载体-细胞复合物，并且所述悬浮培养基包含ROCK抑制剂。
43.根据权利要求42所述的悬浮培养，其中所述ROCK抑制剂以至少ΙμΜ的浓度存在于所述培养基中。
44.根据权利要求42所述的悬浮培养，其中所述ROCK抑制剂以至少ΙΟμΜ的浓度存在于所述培养基中。
45.根据权利要求42至44中任一项所述的悬浮培养，其中所述ROCK抑制剂选自 Υ-27632、ΗΑ-1077(法舒地尔)、ΗΑ-1100 (羟基法舒地尔)、Η_1152、3_(4-吡啶基)-IH-吲哚、N-(4-吡啶基)-N' -(2，4，6-三氯苯基)脲、金硫葡糖、LY^4002或其盐、碱、酯或前药。
46.ROCK抑制剂在多潜能或多能细胞体外悬浮培养中的应用，其中所述细胞处于微载体-细胞复合物的形式。
47.ROCK抑制剂在体外悬浮培养的多潜能或多能细胞的分化中的应用，其中所述细胞处于微载体-细胞复合物的形式。
48.根据权利要求46或权利要求47所述的应用，其中所述ROCK抑制剂选自Y_27632、 ΗΑ-1077 (法舒地尔)、ΗΑ-1100 (羟基法舒地尔)、Η_1152、3_ (4-吡啶基)-IH-吲哚、N- (4-吡啶基)-Ν' -(2，4，6-三氯苯基)脲、金硫葡糖、LY^4002或其盐、碱、酯或前药。
全文摘要
本发明公开了体外培养多潜能或多能细胞的方法，所述方法包括将多潜能或多能细胞连接到多个微载体上以形成微载体-细胞复合物，以及在存在ROCK抑制剂的情况下在悬浮培养中培养所述微载体-细胞复合物。
文档编号C12N5/074GK102428172SQ201080021929
公开日2012年4月25日 申请日期2010年3月12日 优先权日2009年3月20日
发明者史蒂文·侯, 安德烈·朔, 肖尔·鲁维尼, 陈冠良 申请人:新加坡科技研究局